Système nerveux

698 souris vont être utilisées, une majorité tuée sans réveil, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Des nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées puis tuées pour prélever une partie du système nerveux central, tandis que des adultes reçoivent des solutions par aérosol ou par voie intranasale sous anesthésie. Le porteur souligne que ces souris mutantes, modèles du syndrome d'Ondine, présentent une sensibilité accrue à l'anesthésie et un risque de défaillance respiratoire, l'arrêt cardiorespiratoire figurant parmi les points limites. Il teste des agents pharmacologiques sur des canaux respiratoires et affirme que cette fonction ne peut être étudiée que sur des souris vivantes.

Objectifs

Les syndromes d’hypoventilation alvéolaire centrale (SHAC) sont des pathologies associées à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux autonome. Ces SHAC sont associées à une altération de la respiration, ils surviennent dès la naissance. Ces pathologies s’accompagnent d’une réduction voire d’une absence de réponse respiratoire à l’hypercapnie (trop de CO2 dans l’air inspiré), cette réponse est vitale et nécessaire pour éliminer le CO2 de l’organisme. L’endormissement et le sommeil s’accompagnent d’irrégularités respiratoires pouvant conduire à une situation d’hypercapnie, ainsi, les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide ventilatoire dès qu’elles s’endorment. Des cellules du système nerveux sont sensibles à l’hypercapnie, par le biais de canaux présents à la surface de leur membrane. Ces canaux sont sensibles aux variations d’acidité (trop de CO2). Les expérimentations seront réalisées chez des souris mutantes modèle d’un SHAC et leurs congénères sauvages. L’approche utilisée chez des souris nouveau-nées et juvéniles permettra d’identifier l’agent pharmacologique des canaux sensibles à l’acidité le plus efficace, elle nécessitera une chirurgie permettant d’isoler la partie du système nerveux central comportant la commande respiratoire. Chez les souris adultes, l’approche utilisée est non invasive, elle permettra de déterminer l’effet bénéfique d’un agent pharmacologique des canaux sensibles à l’acidité sur la respiration. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment ces canaux sensibles à l’acidité peuvent moduler la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) permettront le développement de nouvelles pistes thérapeutiques dans le cadre des SHAC.

Bénéfices attendus

Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur un gène dont la protéine est exprimée dans une population de neurones indispensables à la réponse respiratoire à l’hypercapnie (chémosensibilité au CO2/H+). A la naissance, ces souris ne présentent pas de réponse respiratoire à l’hypercapnie, cette dernière est partiellement restaurée chez les souris adultes. Le blocage des canaux sensibles aux protons pourrait potentiellement 1/améliorer la respiration des souris nouveau-nées, juvéniles ou adultes, 2/restaurer une réponse respiratoire à l’hypercapnie chez les souris nouveau-nées ou juvéniles et 3/restaurer ou potentialiser la réponse respiratoire à l’hypercapnie des souris adultes. De plus, nous souhaitons 1/identifier les cibles cellulaires et moléculaires des canaux sensibles aux protons au niveau de la commande centrale respiratoire et 2/déterminer si ces cibles évoluent selon l’âge des souris mutantes dont certaines récupèrent naturellement une faible réponse respiratoire à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre comment les canaux sensibles aux protons peuvent moduler la commande centrale respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques chez les patients.

Procédures

L’identification par tatouages et les prélèvements de bout de queue pour identification génétique des souris juvéniles mutantes et contrôles sont réalisés par un personnel formé et ne dure que quelques secondes. Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité du modèle animal à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. Les souris mutantes et contrôles nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées (quelques minutes) puis euthanasiées par une méthode réglementaire afin d’isoler rapidement une partie du système nerveux central. Les souris adultes seront exposées via un système d’aérosol à une solution contrôle et une solution contenant un agent bloquant (10 minutes à chaque fois) avant la mesure non invasive des variables ventilatoires. 48h séparent l’administration de la solution contrôle par aérosol de celle de l’agent pharmacologique. Les autres souris adultes seront anesthésiées grâce à un gaz anesthésiant (pendant 10 minutes maximum) et dès l'anesthésie installée, l'administration par voie nasale de la solution contrôle et de l’agent bloquant (faible volume) sera réalisée. 48 heures séparent les 2 anesthésies. La mesure des variables ventilatoires chez les souris adultes sera réalisée de façon non invasive pendant 70min (1 fois par jour pendant 2 jours) dans une enceinte hermétiquement fermée et alimentée par un flux d’air en continu.

Impact sur les animaux

L’identification et le prélèvement caudal réalisé une unique fois chez l’animal pour la détermination de son génotype apparaît comme une source de douleur et de stress. Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité exacerbée à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. L’administration intranasale du solvant ou de l’agent bloquant, peut entraîner une altération de la ventilation par obstruction des voies aériennes supérieures, sous anesthésie générale.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des actes en vue des prélèvements et analyses nécessaires.

Remplacement

L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèles murins ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail sur des souris vivantes. L’étude de l’influence des canaux sensibles aux protons sur la commande centrale respiratoire nécessite de conserver ex vivo un réseau vivant et fonctionnel de neurones et donc l’utilisation de souriceaux. L’étude des corrections des variables respiratoires par des agents bloquants des canaux sensibles aux protons ne peut être réalisée que sur des souris adultes vigiles, non contraintes et non anesthésiées.

Réduction

Nous utilisons aussi bien les souris mâles que les femelles dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux impliqués sera de 698 (349 souris mutantes utilisés). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Ainsi, 23 souris nouveau-nées et 25 souris adultes mutantes par groupe sont nécessaires pour mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Des tests statistiques seront réalisés a posteriori pour procéder à une interprétation fiable des résultats. Les mêmes animaux seront engagés dans l’analyse de la commande respiratoire et dans l’analyse des populations cellulaires impliquées.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. La température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’habituation aux enceintes de pléthysmographie (technique permettant de mesurer de manière non invasive la ventilation de la souris in vivo) se traduit par la disparition des épisodes d’augmentation anormale de la fréquence respiratoire et de toilettages des souris lorsqu’elles sont dans un nouvel environnement. Après 5 jours d’habituation, les souris sont calmes et leur respiration est régulière dès le placement dans l’enceinte. Les souris mutantes présentent une sensibilité exacerbée à l’anesthésie ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des injections intranasales sous anesthésie. De ce fait, lors des injections intranasales de l’agent bloquant des canaux sensibles aux protons ou du solvant sous anesthésie, une surveillance accrue et en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris. En cas de défaillance cardiorespiratoire, l’anesthésie est stoppée, la souris est réanimée si nécessaire par l’expérimentateur. Les points suivants seront considérés comme des points limites : -tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire -modification du comportement caractéristique d’une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et ou terne, prostration, dos vouté) -anomalies pouvant entrainer une douleur intense ou une souffrance, par exemple une perte de la masse corporelle supérieure ou égale à 20 pour cent de la masse initiale de l’animal, plaies et ulcères, tumeurs, fractures… -Lors des injections intranasales de l’agent bloquant des canaux sensibles aux protons ou du solvant sous anesthésie, une surveillance accrue et en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris du fait d’une sensibilité accrue des souris mutantes à l’anesthésie. L’arrêt cardiorespiratoire est considéré comme le point limite associés à ces injections.

Choix des espèces

Les rongeurs (rats et souris) sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la respiration par la commande centrale respiratoire. Le modèle animal du syndrome d’Ondine n’existe, de nos jours, que sur modèle de souris mutées pour un gène sur des neurones impliquées dans la sensibilité au dioxyde de carbone. Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues que par un travail sur les souris mutantes ; étude de l’influence par les canaux sensibles aux protons/dioxyde de carbone sur la commande centrale respiratoire ex vivo ; étude sur des tranches de tissu des propriétés électriques des neurones avec l’âge ; étude de la ventilation chez l’animal adulte vigil et de l’influence de l’agent bloquant des canaux sensibles aux protons/dioxyde de carbone appliqués par aérosol ou par administration intranasale.

17 480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Elles reçoivent des injections répétées de composés, de vecteurs viraux ou d'anticorps, parfois par voie intracérébroventriculaire sur animal vigile, subissent un régime obésogène de vingt semaines, des prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien, des biopsies de queue et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur annonce qu'aucun animal ne sera réutilisé ni adopté. Il étudie des modèles de la maladie d'Alzheimer et des tauopathies et qualifie le recours à l'animal de "stricte nécessité".

Objectifs

L’objectif général des projets de notre laboratoire et de la présente demande vise à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de la MA. L’objectif de nos études est d’une part d’appréhender les mécanismes cellulaires et moléculaires contribuant au développement de la pathologie Tau dans la MA et les tauopathies ; et d’autre part, de définir des preuves de concepts permettant une translation vers le patient tant sur le plan diagnostic (biomarqueurs) que thérapeutique. Cette stratégie expérimentale a fait ses preuves par le passé avec le développement de start-up, de transfert de nouveaux biomarqueurs vers le CHU ainsi que la mise en place de différents essais thérapeutiques chez patients atteints de maladie d’Alzheimer et de tauopathies. Ainsi, notre projet permet non seulement de lever des interrogations fondamentales quant aux processus pathologiques mis en jeu dans la MA mais répond également à des besoins cliniques en terme de diagnostic, pronostic et thérapeutique.

Bénéfices attendus

Notre projet va permettre différentes avancées scientifiques permettant de faire progresser la connaissance de la physiopathologie de la MA et des tauopathies. Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes conduisant au développement séquentiel de la pathologie Tau dans la MA et les possibilités de les bloquer par des approches à bases d’anticorps et de nanobodies. Ces études se doublent d’approches visant à développer les nanobodies en tant que biomarqueurs en imagerie cérébrale. Le laboratoire a également découvert de nouvelles formes pathogéniques de la protéine Tau qui semblent précocement impliquées dans la maladie d’Alzheimer vs. d’autres tauopathies. Notre projet vise donc à mieux comprendre les mécanismes conduisant aux espèces pathogénique de Tau et à développer des outils immunothérapeutiques permettant leur clairance et des stratégies améliorant ces immunothérapies avec à terme, la possibilité d’initier des essais cliniques. Par ailleurs, notre projet s’intéresse également au rôle de Tau dans la régulation de l’homéostasie glucidique, dont la dérégulation augmente le risque de développer la MA. Enfin, notre projet s’intéresse aux effets de la caféinede mieux comprendre le rôle respectif de ses récepteurs centraux dans ses effets bénéfiques. Là encore l’intérêt clinique est évident. La compréhension de l’impact de drogues approuvées par la FDA sur le développement de la pathologie Tau mais également du passage d’anticorps thérapeutiques dans le cerveau est de nature à implémenter les approches cliniques existantes et de susciter des essais cliniques ultérieurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes injections de composés pharmacologiques, de vecteurs viraux ou d’anticorps réalisées entre 1 à 6 fois pour des durées variant de 1 à 10 minutes. Dans certains protocoles les animaux seront soumis à un régime obésogène pour une durée de 20 semaines et leur caractéristiques métaboliques évalués (glycémie, tolérances au glucose et à l’insuline). Des prélèvements de sang ou de liquide céphalorachidien seront réalisés entre 1 et 4 fois pour des durées de 1 à 30 min); de même que des biopsies de queue, réalisées 1 fois durant moins d’une minute. Le cerveau de certains animaux sera prélevé à des ages précoces afin de réaliser des cultures cellulaires ou de cultiver des tranches de cerveaux, procédure unique durant moins de 5 secondes. Nous réaliserons également des tests de comportement (entre 1 et 2 fois avec des durées variant de 10 min à 8 jours) afin d’évaluer les performances cognitives des animaux ainsi que de l’imagerie cérébrale par IRM (1 fois durant 30 min) et PET (1 fois durant 30 min) pour évaluer la morphologie et l’activité cérébrale.

Impact sur les animaux

Nuisances possibles suite aux différentes manipulations de animaux : -Douleur associé à la biopsie de queue -Stress associé aux investigations comportementales et aux injections intracérébroventriculaires d’oligomères réalisées sur animal vigile en contention -Douleurs opératoires associées aux injections stéréotaxiques/prélèvements de LCR et douleurs/infections post-opératoires -Impact oculaire suite aux injections dans le plexus retro-orbital -Douleur associée aux prélèvements à la veine caudale -Stress métabolique suite au traitement par un régime riche en graisse -Stress hypoglycémique dans le test de tolérance à l’insuline -Douleur lors de la perfusion intracardiaque Toutes ces nuisances possibles seront prises en charge de manière adéquate.

Devenir

En dehors de la procédure de génération et de génotypage, l'ensemble des animaux sera mis à mort en fonction des objectifs annoncés. Aucun animal ne sera réutilisé ni adopté.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie de la MA et des tauopathies, le lien complexe entre neurones et cellules gliales, en lien avec les performances cognitives des animaux. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches neurobiologiques intégrées. Ces évaluations ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux. Le laboratoire est néanmoins conscient de l’aspect nécessaire de recourir à des méthodes alternatives quand cela est possible, ce qui est effectivement fait pour un certain nombre d’études cellulaires et moléculaires ne nécessitant pas de modèles animaux.

Réduction

Le nombre total d’animaux concernant les procédures de l’ensemble des protocoles de notre laboratoire sur les 5 ans à venir est estimé à 17480. Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombre d’animaux, lorsque cela sera possible une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera réalisée. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours, pesés régulièrement, par du personnel spécialement formé. Durant les différents protocoles, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition, par exemple coton pour la confection de nids... Les animaux seront suivis précisément pour chaque protocole, pour lesquels des points limites adaptés ont été définis. Toute souffrance, angoisse ou comportement inhabituel sera pris en charge par des approches appropriées. Les procédures expérimentales de chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale par une combinaison de kétamine et de xylazine par voie intrapéritonéale. En cas de douleur, un analgésique sera administré. Les animaux présentant un des points limites spécifiés pour chaque approche expérimentale seront euthanasiés dans une salle dédiée; le tout en lien avec le responsable du bien être animal.

Choix des espèces

Dans toutes nos études, nous utilisons des souris, la plupart étant génétiquement modifiées afin de reproduire des caractéristiques pathologiques reproduisant un certain nombre d’altérations retrouvées dans la MA et les tauopathies (lésions amyloïdes, pathologie Tau, perte de fonction de Tau…). Le phénotype de ces animaux est modulé par l’administration de drogues, l’injections de préparations humaines, l’expression cérébrale de différents gènes via différents vecteurs viraux ou le croisement avec d’autres lignées permettant de faire varier les phénotypes pathologiques et d’apporter des preuves de concept précliniques importantes pour des approches biomarqueurs et thérapeutiques futures. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 1 mois à 12 mois. Certaines expérimentations se feront aux stades embryonnaires ou jeune après la naissance.

45 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Quinze d'entre eux sont opérés puis tués sans reprise de conscience, les trente autres sont réveillés puis reçoivent des injections de produits radioactifs et des acquisitions répétées. Chaque implantation de sonde intracérébrale dure jusqu'à deux heures, et le porteur indique qu'elle peut provoquer une hémorragie cérébrale, une hypothermie et une douleur, les rats réveillés étant isolés à cause du dispositif fixé sur leur tête. Il cherche à valider une nouvelle sonde de détection radioactive et qualifie le passage in vivo de "nécessaire" après des essais sur des crânes imprimés en 3D.

Objectifs

En neurosciences, la Tomographie par Émissions de Positons (TEP) est une modalité d’imagerie majeure pour étudier les processus cérébraux in vivo, comme les mécanismes de communication des neurones ou l'occupation des récepteurs, grâce aux émissions produites par un produit radioactif injecté au préalable. Par son caractère non invasif, elle permet de réaliser des études longitudinales chez l’animal dans différentes conditions et à différents temps. Cependant, les acquisitions TEP nécessitent une anesthésie ou une contention importante pour maintenir le rongeur dans une position fixe afin d’assurer une bonne qualité d’image. Ainsi, il n’est pas envisageable de combiner cette technique d’imagerie avec des études comportementales sur animaux éveillés. Les sondes intracérébrales apparaissent alors comme un outil complémentaire pour explorer la distribution des produits radioactifs injectés. Elles peuvent être implantées dans des régions cérébrales cibles et permettre l'enregistrement local de cinétiques radioactives. Une fois la sonde implantée, il est alors possible d’étudier l’animal éveillé et de répéter des mesures, sur plusieurs jours, en les associant à des tâches comportementales. Les premiers modèles de sondes étaient très simplifiés, ce qui limitait la qualité de l’information spatiale fournie, et très fins, ce qui les rendait fragiles et difficiles à manipuler. Fort de ces observations, ce nouveau projet a pour objectif de développer, de produire et de tester, in vivo chez le rat, de nouvelles sondes biocompatibles, plus résolues spatialement et plus robustes. Grâce à une liaison sans fil entre la sonde et le dispositif d’enregistrement, les animaux auront une liberté totale de mouvement et donc un stress moindre. L’objectif de ce projet est donc de valider biologiquement cette nouvelle sonde radiosensible avec différents produits radioactifs et cela en deux phases : une phase aiguë en réalisant des enregistrements comparés et simultanés sonde/TEP chez le rat anesthésié et une phase chronique chez le rat éveillé.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de valider une nouvelle sonde intracérébrale radiosensible dédiée à l’imagerie chez le rat. Cet outil de détection permettra des mesures locales de la concentration de molécules radiomarquées chez l’animal éveillé et libre de ses mouvements. Cette technique permettra de coupler des acquisitions de cinétiques radioactives chez l’animal vigile avec des études comportementales ou de répéter des acquisitions dans des conditions expérimentales différentes. Comparée à la TEP, cette sonde offrira une meilleure résolution spatiale (en fournissant des données locales dans la zone cérébrale cible implantée) et une plus haute résolution temporelle.

Procédures

Tous les animaux du projet (45 rats) seront soumis à une chirurgie ayant pour but l'implantation de sondes de détection radioactive dans des régions cibles du cerveau (opération d'une durée de 1h30 à 2h s'il y a réalisation d'un chapeau de protection des cartes électroniques reliées aux sondes, étape nécessaire quand il y a réveil de l'animal). Une partie des animaux (15 rats), aura, dans la foulée, un examen d'imagerie comprenant une acquisition couplée sonde/TEP d'une durée de 1h10 à 1h40 selon le produit radioactif injecté. L'autre partie des animaux (30 rats) sera réveillée à l'issue de la chirurgie et recevra, une semaine plus tard minimum, une injection de produit radioactif en vue d'acquérir des cinétiques et cela en condition vigile (durée : 1h10 à 1h40 selon le produit injecté). Cette acquisition sera répétée une semaine plus tard exactement dans les mêmes conditions.

Impact sur les animaux

Stress physique / thermique : Pour les chirurgies intracérébrales, les nuisances peuvent être l’apparition d’hémorragie intra-cérébrale ou d’une hypothermie. Douleur : À la suite de la chirurgie, les animaux peuvent présenter une douleur, une inflammation ou une mauvaise cicatrisation. Faim : Pour les acquisitions avec le glucose radioactif, les animaux devront être mis à jeun 4h avant l’injection, afin de minimiser les variations de métabolisme glucidique non spécifiques. Isolement : Pour la procédure chez l'animal vigile, un chapeau (poids du dispositif : 2 grammes) sera réalisé sur la tête de l’animal pour protéger les sondes implantées. La présence de ce chapeau, après le réveil de l’animal, représente également des nuisances, non seulement par l’encombrement sur la tête, mais aussi par le fait que cela nous oblige à isoler les rats afin d’éviter qu’ils se détruisent leur chapeau mutuellement. La cicatrisation peut également entraîner des grattages au niveau du scalp. Lors des acquisitions vigiles, les rats porteront un gilet où sera fixé le dispositif d’enregistrement et qui sera relié aux câbles de la sonde.

Devenir

A l’issue des expérimentations, les animaux seront mis à mort par injection d’euthanasiant après anesthésie gazeuse.

Remplacement

Plusieurs étapes préliminaires de validation de la sonde ont été effectuées avant le passage à l’animal. Pour contrôler la sonde, des tests électroniques et l’acquisition de cinétiques dans des solutions contenant de la radioactivité ont été faits en laboratoire. Parallèlement, afin de s’exercer à la chirurgie, des simulations d’implantations stéréotaxiques ont été faites avec des sondes fictives et sur des crânes de rat imprimés en 3D. Maintenant, l’étape suivante est le passage in vivo. Cette étape est nécessaire pour vérifier différents points. Tout d’abord, il faut s’assurer de la biocompatibilité des sondes lorsqu’elles sont implantées dans le tissu cérébral et tester leur résistance quand elles sont fixées et placées dans le chapeau sur la tête d’un rat qui va se déplacer dans sa cage ou lors de tests comportementaux. De plus, ces sondes permettent d’acquérir des cinétiques radioactives, c’est-à-dire la distribution tissulaire du radiotraceur dans l’organisme et nécessite donc une circulation sanguine ainsi que des processus actifs pour avoir une barrière hématoencéphalique active.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum. Cependant, ce protocole est très exploratoire et il est donc difficile de définir un nombre d’animaux à partir de tests statistiques. Concernant les premières expérimentations, les acquisitions de cinétiques et de déplacement du produit radioactif i jecté seront réalisées chez le même animal, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Pour les expérimentations chez l’animal vigile, qui ne seront faites que si les cinétiques obtenues lors des premières expérimentations sont satisfaisantes, le nombre d’animaux a été fixé à 10 maximum, ce qui représente un nombre classique d’animaux pour des études d’imagerie.

Raffinement

En amont des chirurgies stéréotaxiques, les animaux recevront une unjection d'analgésique et / ou d'anti inflammatoire selon si l’animal est réveillé ou non en fin de chirurgie ainsi qu'une injection d'anesthésique local avant l’incision du scalp. Durant la chirurgie, les rats seront placés sur un tapis chauffant. Pour les expérimentations vigiles, les animaux seront opérés en début de semaine afin de mettre en place une observation étroite et quotidienne lors du réveil et les jours suivants, jusqu’à complète récupération (utilisation d’une grille de score). Des doses supplémentaires d'analgésique et d'anti inflammatoire seront pratiquées en fin de chirurgie et le lendemain matin. Afin d’éviter tout grattage de la cicatrice, les griffes seront coupées lors de l’anesthésie. La présence du chapeau fixé sur la tête (implant nécessaire pour protéger les cartes électroniques), nécessitera l’isolement des rats. Lors de cette période, l’enrichissement dans les cages sera renforcé et les cages placées côte à côte afin que les animaux gardent un contact (visuel, olfactif…) avec leurs congénères. Les animaux seront stabulés dans des cages à couvercle plat afin d’éviter qu’ils se heurtent ou s’accrochent avec leur chapeau.

Choix des espèces

Le rat est un animal couramment utilisé pour modéliser les pathologies du système nerveux central et de nombreuses données précliniques existent pour cette espèce. Les animaux utilisés seront des animaux jeunes adultes, pesant au moins 250 grammes afin que la taille du cerveau soit compatible avec la résolution de la caméra micro-TEP préclinique (1,5 mm) et assez importante pour permettre l’implantation des sondes.