Système nerveux

21 macaques rhésus vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ce volet couvrant l'imagerie cérébrale d'un projet mené sur deux établissements. Ils subissent une ou deux neurochirurgies pour implanter des électrodes et injecter des virus, des séances d'imagerie sous anesthésie et un contrôle de leur accès à l'eau qui peut provoquer la soif, pour étudier le cortex préfrontal. Le porteur décrit un entraînement par renforcement positif et un suivi de la douleur, tout en prévoyant la mise à mort de chaque singe pour analyser son cerveau. Il affirme que le primate est le "seul choix possible" et que les modèles informatiques restent "rudimentaires".

Objectifs

Le cortex préfrontal est une région cérébrale très développée chez les primates. Il gère des fonctions qui permettent la flexibilité comportementale. La perte de ces fonctions caractérise plusieurs maladies psychiatriques. Les mécanismes du cortex préfrontal dans ces fonctions et de ces maladies sont peu connus – il semble notamment important de comprendre comment le cortex préfrontal fonctionne en interaction avec d’autres régions du cerveau. Nous étudierons ces interactions dans ce projet qui se déroule dans deux établissements utilisateurs – EU1/2 pour la majorité du protocole, et EU2/2 pour l'imagerie cérébrale. Tout d'abord, nous étudierons le dynamique de ces interactions par enregistrement électrophysiologique des neurones du cortex pendant des comportements adaptatifs. Puis nous caractériserons l’impact de perturbations des interactions du cortex préfrontal sur l’activité neuronal et sur les comportements adaptatifs. Nous utiliserons la technique émergente de pharmacogénétique qui permet de modifier l’activité des neurones impliqués dans les interactions, tandis que nous enregistrons cette même activité pour comprendre ce qui change dans le cerveau. Ces techniques invasives nécessitent des sujets animaux, ici des macaques - contrairement à d’autres espèces modèles les macaques partagent plusieurs des zones préfrontales ciblées avec l’espèce humaine. Les connaissances fondamentales acquises par ce projet contribueront à notre compréhension du fonctionnement cérébral et, à long terme, à élucider les mécanismes pathologiques des dysfonctions exécutives.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu sera donc la connaissance scientifique qui résultera de ces études, comme le projet nous permettra de mieux décrire les mécanismes physiologiques du cortex préfrontal et les mécanismes dans le cerveau des comportements adaptifs. En plus le projet nous permettra de comprendre comment le perturbation des interactions du cortex préfrontal modifient son fonctionnement. Plus largement la compréhension de ces perturbations nous approche à des mécanismes spécifiques des maladies qui en sont liées. Le projet avancera notre compréhension des approches pharmacogénétiques chez les primates, étape essentielle au développement du pharmacogénétique comme traitement médicale chez l’humain.

Procédures

Tous les animaux recevront un entrainement cognitif avec renforcement positif, dans leur hébergement et dans une salle de test. Les sessions sont de 1–5 heures, 5 jours par semaine, pour la durée du protocole. Après chirurgie, les singes fourniront des enregistrements intracérébraux pendant ses sessions d’entrainement cognitif. Les singes passeront également l’imagerie cérébrale - des IRM, des TEP et des CT sous anesthésie. Chaque séance dur 1-3 heures. Tous les singes passeront une ou deux neurochirurgies - pour l'implantation de dispositifs d'enregistrement neurophysiologique et pour l'injection de vecteurs viraux pour la pharmacogénétique. Les singes recevront des injections intramusculaires d'un ligand pour la pharmacogénétique ou d'une substance de contrôle. Jusqu’à 50 injections par animal, pendant le session de travail. À la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera extrait pour analyse histologique.

Impact sur les animaux

Au cours du projet, les animaux auront plusieurs anesthésies générales, dont au moins une pour une neurochirurgie. Les anesthésies sont réalisées pour les différentes formes d'imagerie cérébrale nécessaires au projet, et pour la chirurgie destinée à l'implantation d'électrodes, de chambres d'enregistrement, et/ou à l'injection de vecteurs viraux. La chirurgie pourra susciter un inconfort post-opératoire temporaire, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens. L'anesthésie générale provoquera également en elle-même un inconfort au réveil. Les animaux du groupe 5 travailleront dans un environnement d'entraînement en accès libre. Ils seront brièvement maintenus en contention légère, de manière à équiper les implants de carte mémoire et à effectuer les inspections et les soins pour les implants. Les animaux des groupes 1-4 et 6 travailleront dans le cadre traditionnel d'un box expérimental. Ils seront assis dans une chaise à primate, la tête fixée par le plot implanté. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et bien tolérée, mais les animaux éprouveront un léger inconfort lors de l’apprentissage de la procédure. Les animaux seront formés dans le cadre d'un protocole de contrôle hydrique. Ce protocole est progressivement mis en œuvre et, dans la grande majorité des cas, les animaux reçoivent leur dose normale de liquide. Cependant il est possible pendant l'adaptation au processus, une certaine sensation de soif puisse se manifester entre les sessions.

Devenir

À la fin du protocole les animaux, ayant reçu des injections pour le pharmacogénétique, seront euthanasiés et leur cerveau sera extrait pour analyse histologique, afin d'analyser et de confirmer l'expression des récepteurs pharmacogénétique dans leur cerveau. La validation de l'expression de ces récepteurs dans le tissu post mortem est une étape critique dans la justification des résultats de l'expérience. Le travail histologique, et donc l'euthanasie des animaux, fait donc partie intégrante de l'expérience.

Remplacement

La nécessité scientifique de ce programme de recherche est décrite dans les objectifs de ce projet et est soutenue par les financements accordé. Le projet est spécifiquement axé sur la dynamique neuronale du cortex préfrontal et ses interactions. Cette spécificité rend les alternatives non animales impossibles à mettre en œuvre pour atteindre les objectifs du projet. Les modèles in silico du cortex préfrontal restent rudimentaires pour les questions de dynamique neuronale - en effet, un résultat de ce projet pourrait être l'amélioration de ces modèles. En outre, le projet se concentre sur les interactions du cortex préfrontal avec d'autres régions du cerveau. Non seulement les modèles in silico du cortex préfrontal sont rudimentaires pour l'étude de la dynamique neuronale, mais ils sont rarement connectés à des versions modélisées d'autres régions du cerveau, et jamais avec toute la complexité des connexions dans le cerveau parce que nous ne connaissons ni ne comprenons la forme et la nature de ces connexions. Les assemblages de cellules in vitro peuvent être utilisés pour étudier la dynamique neuronale de base, mais jamais avec les interactions cortico-corticales, cortico-sous-corticales et neuromodulatrices que nous examinerons ici - les préparations in vitro manquent de ces éléments, et l'objectif de ce projet est de rendre compte de l'ensemble des systèmes du cortex préfrontal, ce qui n'est pas possible in vitro. L'étude ex-vivo est impossible pour ce projet car la dynamique neuronale n'est produite que par un cerveau vivant. Pour atteindre les objectifs scientifiques décrits, les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal, sur la base de critères anatomiques et cognitifs. Seules les espèces de primates possèdent la région du cortex préfrontal latéral granulaire qui est la cible de notre étude. Parmi les animaux de laboratoire acceptés, seules certaines espèces de primates sont capables d'accomplir les tâches cognitives que nous étudions ici. En conséquence de ce qui précède, il n'y a aucune forme de progrès scientifique ou technique dans un avenir prévisible qui permette d'obtenir les informations que nous recherchons ici à partir d'expériences n'impliquant pas d'animaux, et donc nous ne pouvons pas aborder la question du remplacement de ces expériences.

Réduction

La taille estimée de la cohorte pour cette étude a été définie en prenant en compte l'impératif éthique d'utiliser le moins d'animaux possible et l’impératif scientifique et éthique d’utiliser le nombre suffisant pour obtenir des données scientifiques robustes, des résultats significatifs et généralisables. Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et une reproductibilité des observations. En général, l'approche consiste à concevoir toutes les expériences pour les contrastes et les tests statistiques intra-individuel, puis à tester un deuxième animal pour confirmer les résultats du premier. Cela signifie qu’un singe sert comme son propre contrôle et que le "n" de l'expérience est constitué de sessions ou de neurones. C'est le minimum absolu pour une expérience scientifique correctement réalisée, et notre travail pour réaliser ces expériences de cette manière représente un effort maximal de réduction. Pour toutes les procédures, l’utilisation des interventions pharmacogénétique DREADD pour modifier l’activité des neurones relèvent du raffinement ce qui porte la réduction à son maximum. C’est une intervention réversible qui ne nécessitent pas de lésion et n’impliquent pas de perturbation à long terme. La procédure étant réversible, l'animal peut également agir comme son propre contrôle. Dans chaque groupe principal, deux animaux seront utilisés si les deux fournissent la puissance statistique requise pour l'étude. Un troisième animal a été noté, mais il ne sera inclus que si l'un des deux premiers n'est pas en mesure de fournir des données répondant à ces critères. Nous souhaitons souligner ici que le critère important est, une fois que nous commençons l'expérimentation sur des sujets macaques, de s'assurer que des résultats scientifiques solides et fiables découlent du projet.

Raffinement

Nos approches expérimentales font l'objet de raffinements constants. Nous appliquons depuis plusieurs années des protocoles de surveillance accrue de nos animaux, à la fois dans les protocoles et autour des procédures chirurgicales ; nous fournissons des soins péri-opératoires au niveau qui serait attendu en chirurgie humaine dans la mesure du possible ; nous suivons la douleur post-opératoire avec notation et points limites; et tous nos animaux sont entrainés avec un renforcement positif pour chaque élément du protocole. Chaque élément du protocole est suivi avec des points limites gradés adaptés à chaque animal et le protocole et les interventions sont effectués en fonction des discussions régulières avec les vétérinaires et le personnel chargé des soins aux animaux. Notamment, le contrôle hydrique est opéré ici avec un suivi renforcé et un ensemble gradué de points d'intervention et de points d'arrêt, comme décrit par les recommandations nationales du CNREEA. Les techniques et les matériaux d'implantation font l'objet de raffinements réguliers, tout comme le soin des implants et leur suivi à long terme. Les interventions pharmacogénétiques permettent une intervention neuronale directe plus ciblée que les approches précédentes et ne nécessite pas d'injection intra-cérébrale à chaque séance. À terme la validation des injections pharmacogénétiques par TEP et IRM devrait permettre de valider les expériences sans sacrifier les animaux pour une validation histologique. Le travail réalisé ici contribuera à cet objectif, mais une validation post mortem reste nécessaire pour le moment. Le travail des singes testés en "libre accès" représente un raffinement significatif pour l'acquisition de données neurophysiologiques et pour les conditions de travail pour l’animal. Plus précisément, il s'agit d’un raffinement majeur de l'hébergement conformément au protocole, car les animaux sont beaucoup moins fréquemment contraints ou retirés de leur hébergement pour les besoins de l'expérience. Le projet entre autres fournira une base de données pour indiquer dans quels cas ce raffinement spécifique est approprié dans l’avenir.

Choix des espèces

Les expériences chez les primates non-humains sont directement pertinentes pour la compréhension de la cognition humaine, en raison des capacités cognitives du macaque, et des similarités de cerveau. Nos questions scientifiques nécessitent des études chez le singe en raison des proximités anatomiques et biochimiques entre les espèces primates, et de la capacité unique des primates à réaliser des tâches cognitives complexes qui permettent de manipuler, comme chez l'Homme, les capacités comportementales complexes. Nos études sont centrées sur le cortex préfrontal, un cortex granulaire qui parmi les espèces modèles n’a été identifié que chez les primates. L'utilisation du modèle primate permet un transfert direct vers la compréhension du cerveau chez l'Homme. Ceci est renforcé par les connaissances que nous avons acquises, et par nos études comparatives Humain-Macaque. Les animaux sont adultes – les procédures d'implantation sont réalisées à 5-6 ans lorsque le développement crânien se stabilise pour éviter de fortes modifications morphologiques après implantation et des problèmes de localisation stéréotaxique.

324 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie pour poser un cathéter dans une veine, parfois des fibres optiques dans le cerveau, et une restriction d'eau destinée à renforcer leur motivation, pour s'auto-administrer de la cocaïne et étudier le choix sous influence de la drogue. Le porteur écarte l'humain en invoquant l'"éthique spéciste actuelle" qui interdit ces approches invasives, et retient le rat comme un "compromis phylogénétique" jugé éthiquement moins sensible que le primate. Il annonce des retombées surtout théoriques, une redéfinition de l'addiction et des modèles pour la recherche future.

Objectifs

L’objectif majeur de notre projet de recherche est premièrement de mieux caractériser le comportement de choix sous influence (durée, persistance à long terme du phénomène, modulation de ce phénomène par certains paramètres altérant normalement le choix tels que le coût, le prix de la récompense ou la punition…). Ensuite, notre projet aura pour but d’étudier le rôle causal des interneurones du cortex orbitofrontal dans la consommation compulsive de cocaïne chez les individus sous influence de drogue. Notre hypothèse générale est que la perte de contrôle chez les individus ayant développé une addiction ne serait pas un trait constitutif ou inconditionnel des sujets mais plutôt une caractéristique comportementale dépendante de la drogue. Si tel est le cas, la perte de contrôle devrait exister mais principalement lorsque ces individus sont intoxiqués par la drogue et donc sous son influence. Ce projet est par essence mécanistique et nécessite une approche invasive qui n’est pas envisageable chez le sujet humain. Sa bonne réalisation repose donc sur le développement et l’utilisation d’un modèle animal - le rat de laboratoire – qui permet de reproduire de façon valide la distinction établie chez l’homme entre individus vulnérables et individus non-vulnérables face à l’addiction. Il s’agira de placer une population de rats face à un choix entre prendre de la cocaïne ou s’engager dans une activité alternative (boire une boisson édulcorée avec de la saccharine) et, ensuite, de tester l’influence d’une administration passive de cocaïne sur le choix des individus.

Bénéfices attendus

Ces recherches devraient permettre de résoudre un long débat théorique sur la nature de l’addiction en redéfinissant la perte de contrôle en tant qu’état induit par l’influence de la drogue et non en tant que trait constitutif. Sur le plan pratique, ce changement conceptuel devrait contribuer à réorienter les efforts de recherche vers des interventions permettant d’isoler et de protéger la prise de décision de cette influence de la drogue. Notre paradigme de recherche servira également de base aux recherches futures sur la neurobiologie et la neuropharmacologie de la prise compulsive de cocaïne. Enfin, les données générées par ce programme de recherche pourraient être utilisées pour affiner ou redéfinir les modèles théoriques ou computationnels actuels de l’addiction à la cocaïne.

Procédures

Tous les rats seront soumis à une chirurgie intraveineuse de courte durée (30 min en moyenne) pour la pose d'un cathéter intraveineux à demeure. Certains animaux seront aussi soumis à une chrirugie intracérébrale (60 min en moyenne) pour la pose de fibres optiques. Ces chirurgies sont effectuées sur couverture chauffante en conditions aseptiques alors que les animaux sont sous anesthésie chimique ou gaseuze et sous analgésie. Certains rats seront soumis à une restriction hydrique avec un accès à l'eau de 5h30 par jour. Cette restriction hydrique aura pour effet d’augmenter le besoin physiologique et donc la motivation pour la récompense hydrique pendant le choix tout en couvrant le besoin quotidien en eau pour s’hydrater normalement. La restriction hydrique sera introduite graduellement.

Impact sur les animaux

Les animaux seront testés dans des procédures dont le degré de gravité principal est léger et qui ne dépassera pas le degré modéré. Bien que toutes les précautions soient prises afin de prévenir ou de minimiser les nuisances au maximum (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi post-opératoire…), il est possible que certaines nuisances ou effets indésirables puissent survenir suite à la chirurgie ou pendant l’auto-administration de cocaïne. Les nuisances attendues après la chirurgie comprennent : un possible risque d'inflammation ou d'infection ; une apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée ; une perte des points de suture cicatrisation complète. Nous n’anticipons pas de nuisances particulières pendant l’auto-administration de cocaïne, hormis un possible risque d’infection lié à l’utilisation chronique de la voie d’administration intraveineuse.

Devenir

Les animaux seront mis à mort parce qu'ils auront complété les expériences programmées et pour prélever leurs cerveaux afin de procéder à des vérifications histologiques post-mortem.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs) ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; 3) l’addiction, contrairement à la dépendance physique, est un trouble du comportement et, en tant que telle, ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Notre projet nécessite au total l'utilisation de 324 rats mâles sur une période de 5 ans. Le nombre d'animaux nécessaire au projet est réduit au minimum. Ce nombre représente un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet scientifique proposé.

Raffinement

Les animaux seront logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies (30 min en moyenne par animal) seront réalisées sous analgésie (anti-inflammatoire non-stéroïdien), sous anesthésie chimique (mélange de kétamine et de xylazine) et en conditions aseptiques sur couverture chauffante. En fin de chirurgie, l’animal recevra une injection sous-cutanée de sérum physiologique (NaCl) pour favoriser la réhydratation. L’animal sera ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal sera relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère. Les animaux seront sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter d’éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et y remédier rapidement (voir la grille des différents signes en annexe). Nos méthodes d’interventions pour réduire ou supprimer l’inconfort ou la douleur seront gradées. Quand nous constaterons les premiers signes d'inconfort chez un animal, nous mettrons en place des mesures de nursing avec un accès facilité à l’aliment (nourriture posée sur le sol de la cage). Si cela ne suffit pas, l’animal recevra plusieurs doses d’analgésique (anti-inflammatoire non-stéroïdien). L'animal sera aussi réhydraté par injection sous-cutanée de sérum physiologique (NaCl). Enfin, si cela ne suffit pas au bon rétablissement de l'animal, celui-ci sera mis à mort sans souffrance.

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche de l’homme d’un point de vue phylogénétique (même classe [Mammalia], divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 millions d'années) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (e.g., primates non-humains). Les espèces invertébrées (e.g., C. Elegans, D. Melanogaster, A. Californica) peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux de la cocaïne mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés sont tous de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (i.e., âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction.

7 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un régime gras pendant douze semaines, des injections, des périodes de jeûne, une chirurgie abdominale et une perfusion dans le cœur, pour étudier des cellules immunitaires des îlots du pancréas. Le porteur indique que 3 630 souris sont tuées d'emblée parce que leur génotype est inutilisable, avant toute procédure. Il affirme que les modèles animaux sont "nécessaires" et rattache l'étude au diabète, sans bénéfice thérapeutique précis annoncé.

Objectifs

Dans le pancreas, les ilots de Langherans sont centraux dans la régulation de la glycémie. Ces micro-organes ont pour fonction de produire les hormones permettant de réguler la glycémie. Les macrophages jouent une rôle important dans la fonction des ilots. Comme tous les tissus, les ilots sont reliés au cerveau par le système nerveux périphériques. Cependant, leur rôle dans la fonction des ilots pancréatiques n’est pas bien connu. En particulier, l’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux n’a jamais été étudié. Dans ce projet nous proposons d’étudier les mécanismes d’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux des ilots pancréatiques ainsi que le rôle de ces interactions dans la fonction des ilots en condition normal, ainsi que dans trois contextes de stress glycémique: le jeun, l’altération des ilots et le diabète, une maladie caractérisée par une dérégulation de la glycémie. Ce projet se déroulera dans deux établissement utilisateurs.

Bénéfices attendus

Il est aujourd'hui admis que les macrophages jouent un rôle primordial dans la régulation de la glycémie par le gras et le foie. Les macrophages résidant dans les ilots pancréatiques n'ont eux été décrits que tardivement et les contraintes liées à leurs techniques d'analyse font qu'ils restent encore largement ignorés. L'interaction entre les macrophages et le système nerveux a été montré comme primordiale dans la fonction de multiples organes. Cependant de part la difficulté d'étudier les macrophages des ilots pancréatiques, cette interaction n'est pas encore décrit dans les ilots. Ce projet permettra de mieux comprendre les interaction macrophage/réseau nerveux dans la fonction ilots pancréatiques et leurs implication dans le stress glycémique.

Procédures

Etablissement utilisateur 1: 1 biopsie de queue, 1 prélèvement de sang à la joue (10s), 1 régime riche en gras (12 semaines), 9 injection intra-péritonéale (20s), 1 injection sous-cutanée, 1 jeun (6h ou 16h) , 1 injection intra-veineuse, 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 anesthésies gazeuses (10min), 1 perfusion intra-cardiaque. Etablissement utilisateur 2: 1 anesthésie gazeuse (2h), 1 chirurgie abdominale (2h).

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéale (ip) : douleur légère due à la piqure. -Injection iv rétro-orbitale (iv) : gêne, douleur légère au point de prélèvement. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment du prélèvement. -Injection sous-cutanée (sc) : douleur légère due à la piqure. -Diabète : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Le souris urinent plus souvent. -Chirurgie abdominale : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Prélèvement de sang à la joue : douleur légère. -Biopsie de queue : douleur modérée.

Devenir

Procédure 1 : 3630 souris seront mises à mort car leur génotype ne sera pas utilisable. 2280 souris auront le génpotype requis et seront utlisées dans les procédures 2 à 5. Procédure 2 à 5 : Toutes les souris seront mises à mort pour permettre le prélèvement des organes d'intérêts.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier l'interaction des macrophages avec le système nerveux des ilots pancréatiques en condition normale et de stress glycémique, tels que le diabète. Les ilots pancréatiques répondent à la prise de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Des tests in vitro ainsi que des études pilotes avec des petits nombres d’animaux ont été inclues pour mettre en place des protocole adaptés et réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum). Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’opioïdes et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours et 22 semaines.

1 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies du cerveau pour implanter des électrodes et injecter des virus, puis des enregistrements de leurs neurones pendant l'éveil et le sommeil, pour étudier un récepteur au glutamate. Le porteur indique que les souris implantées sont maintenues isolées, une autre souris pouvant endommager les électrodes, et signale une douleur post-opératoire de 48 heures et des risques liés à l'anesthésie. Il renvoie au long terme les retombées, des traitements des troubles anxieux liés au sommeil, et affirme qu'aucune alternative au rongeur ne préserve un réseau neuronal intact.

Objectifs

La présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons effectuer une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est ajouté à ce projet par rapport au projet principal déjà autorisé. Le projet a pour but d’étudier des récepteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le système nerveux central des vertébrés. Ces récepteurs jouent un rôle central dans la communication et le fonctionnement de nos neurones, ainsi que dans les mécanismes associés à l’apprentissage et la mémoire. Ces récepteurs étant également impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), ils constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’un des récepteurs au glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux, à la fois dans un cadre physiologique et pathologique. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à l’activation et au dialogue de différentes structures du cerveau durant la veille et le sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements de l’activités des neurones chez des souris libres de leurs mouvements et endormies.

Bénéfices attendus

Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.

Procédures

Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones ; 2) injection de virus ; 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui permet les prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes est réalisés sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : Chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h) ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement (stress modéré) ; 2 transports entre les établissements utilisateurs (source de stress)

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem). Elle sera pratiquée au sein de l'établissement d'origine des animaux. Il s'agit d'un projet déjà autorisé, réalisé sur deux établissements et n'ajoutant aucun animal supplémentaire.

Remplacement

Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.

Réduction

Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 1360 animaux : dont 1120 impliqués sur ce site.

Raffinement

Après leur réception, les animaux sont habitués à l’animalerie de l’Institut pendant une semaine avant de débuter toute procédure. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux sont stabulés dans les conditions d'hébergements standards (enrichissement de nidification) comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux implantés seront maintenus en isolation: la présence d'une autre souris pourrait ralentir la cicatrisation et endommager les électrodes implantées chroniquement (grattage, rognage) entraînant l’euthanasie de l’animal et ne permettant pas de récolter des données. Le maintien en isolation permet donc de maximiser la quantité de données récoltées sur chaque animal et ainsi de minimiser le nombre total d'animaux pour le projet. Les animaux non-implantés servent de groupe contrôle et doivent donc être logés dans les mêmes conditions que les animaux implantés. Cependant, pour diminuer le stress lié à l’isolement les animaux sont maintenus dans des cages contenant 2 compartiments séparés par une cloison transparente percée de trous permettant ainsi à l’animal d’avoir des interactions avec l’animal isolé dans le second compartiment (contiguïté visuelle, olfactive, auditive). Afin de garantir la taille minimale réglementaire au sein d'un compartiment une fois la cloison installée, les cages utilisées sont des cages prévues pour des rats. Pour éviter toutes blessures et d’endommager les électrodes, la nourriture sera directement dispersée dans la sciure. Cette démarche aura pour avantage d’enrichir l’environnement de l’animal puisqu’il sera obligé de fouiller la sciure pour trouver les croquettes et facilitera l’accès à la nourriture. Cet enrichissement sera également complété par le dépôt de morceaux de bois dans la cage de l’animal. Une construction de lego sera mise en-dessous du biberon d’eau pour réduire la hauteur et faciliter l’accès à l’eau. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur (utilisation de l’échelle de grimace), les animaux seront exclus du protocole.

Choix des espèces

Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une forme de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, elles reçoivent des injections dans le péritoine six jours sur sept pendant deux mois, subissent des tests de locomotion, de démarche et de sensibilité à un filament appliqué sur la patte, puis une chirurgie terminale. Le porteur indique que ses données in vitro montrent déjà un effet du composé testé, mais qu'un passage in vivo reste une étape "indispensable" avant un essai chez l'humain. Les retombées annoncées pour d'autres formes de la maladie sont renvoyées au long terme.

Objectifs

La maladie de Charcot Marie Tooth (CMT) est une maladie génétique touchant le système nerveux périphérique (SNP). Les patients souffrant de CMT présentent une faiblesse et atrophie musculaire prédominante aux membres inférieurs, des déformations squelettiques des extrémités, ce qui entraine une difficulté pour se mouvoir et pour les formes de CMT les plus sévères, la nécessité d'un fauteuil roulant. Contrairement à la maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique), la CMT ne réduit pas l’espérance de vie des patients, mais affecte fortement leur qualité de vie. Une des formes les plus fréquente de CMT est la forme CMT2A. Les motoneurones des souris modèles de la CMT2A présentent des défauts dans les interactions entre la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (RE) ainsi que dans la dynamique et le transport des mitochondries. Le composé Pre-084 promeut les interactions entre le RE et les mitochondries en favorisant notamment le transfert de calcium. Le Pre-084 a déjà montré un effet thérapeutique dans de nombreuses maladies neurologiques liées à des défauts de contacts RE-mitochondries, telle que la maladie d’Alzheimer, la Sclérose latérale amyotrophique ou encore le syndrome Wolfram. Ce projet a pour but de tester une approche thérapeutique basée sur l'administration du composé Pre-084 dans un modèle murin modélisant de la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A (CMT2A).

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si le traitement Pre-084 représente une possibilité thérapeutique pertinente pour la CMT2A. A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT et déboucher sur des essais cliniques pour la CMT.

Procédures

160 animaux subiront un traitement par injection dans le péritoine 6 jours sur 7. Les animaux seront contentionnés quelques secondes pour permettre ces injections. 320 animaux seront évalués par des tests de comportement pour mesurer la locomotion, démarche et réponse sensitive. Chaque test sera réalisé sur deux jours (entrainement et test) en incluant des moments de récupération pour les animaux entre chaque essais et entre chaque test (au moins deux jours). 160 animaux subiront une chirurgie terminale ayant pour objectif de réaliser une perfusion de paraformalédhyde.

Impact sur les animaux

Dans le cas de l'approche par voie intrapéritonée, les animaux subiront à l’âge adulte (soit avant soit après apparition des premiers symptômes) des injections dans le péritoine 6 jours par semaine pendant deux mois. Ces injections seront réalisées en quelques secondes (contention et piqûre compris) au moyen de fines seringues à insuline . Ces injections répétées sont généralement bien tolérées, néanmoins il peut apparaitre de petites inflammations locales ou légères irritations. Dans la suite de l'étude, le traitement dans l'eau de boisson ne devrait pas générer d’inconfort. Ce traitement a déjà été utilisé dans plusieurs études et ne provoquent pas d’effets indésirables chez l’animal. Au cours du traitement, les animaux subiront trois tests comportementaux à trois temps (avant, pendant et à la fin du traitement) qui permettent d'analyser la locomotion, la démarche et la réponse sensitive des souris. Seule la mesure de la réponse sensitive entraîne un inconfort de courte durée suite à l’exposition à un filament de 0.5 mm qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris.

Devenir

A l'issu des études comportementales l'ensemble des animaux seront euthanasiés afin de déterminer l'effet bénéfique des thérapies proposés au niveau cellulaire sur les tisssus atteints dans la pathologie de Charcot Marie Tooth (CMT)

Remplacement

Il est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann). Les neurones moteurs et sensitifs de patients peuvent être différentiés à partir de cellules pluripotentes humaines induites et constituer ainsi un modèle humain de la pathologie CMT pour les formes axonales. Nos données préliminaires ont déjà montré un effet bénéfique du Pre-084 sur un modèle in vitro de la CMT2A. Néanmoins le passage in vivo est une étape indispensable pour établir la preuve de concept et la mise au point de la dose du traitement, sa biodisponibilité, afin d'envisager par la suite un essai thérapeutique chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au minimum nécessaire (= 20 animaux par groupe) pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion et de sensibilité en se basant sur nos travaux précédents et en prenant en compte un risque alpha inférieur ou égal à 0.05, une puissance de test de 80% et un effet modéré de 30%. Afin de réduire le nombre d'animaux, nous privilégions une étude longitudinale c'est-à-dire que les mêmes groupes d'animaux seront suivis à différents stades (3,4 et 5 mois ou 6,7 et 8 mois selon le début du traitement) afin de suivre à long terme l'effet bénéfique des thérapies. Au total nous utiliserons 320 animaux répartis de la manière suivante selon deux études: Pour l'approche 1 (traitement par injections intra-péritonéale), qui sera réalisée à deux temps: début du traitement (en pré-symptomatique de 3 mois à 5 mois) et début du traitement (en symptomatique de 6 mois à 8 mois). Il y aura (20 animauxX4groupes)X2temps=160 animaux. Le même nombre d’animaux (160) sera utilisé pour l’approche 2. A noter que l’étude 2 (traitement per os) ne sera mise en place que si on obtient un effet bénéfique du traitement dans l’étude 1

Raffinement

Afin d’améliorer le bienêtre animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture à volonté, enrichissement, stabulation en petit groupe). L’environnement est enrichi à l’aide de maisonnettes en carton. Nous nous assurerons de diminuer le stress des souris en les manipulant en coupe ou en tunnel. Dans le cas du maintien de la lignée, les gestes de biopsies (perçage d’oreille) seront couplés à l’identification afin de limiter leur manipulation et gestes invasifs. Dans le cas d'apparition des petites inflammations locales ou légères irritations suite aux injections intra-péritonéales répétées, nous privilégierons soit une injection du côté opposé de l’abdomen, soit nous laisserons l’animal sans traitement quelques jours le temps de récupérer ou d’être soigné au besoin (Povidone Iodée- Vétédine®). Au cours des tests, nous mettons en place des temps de repos entre chaque essai pour limiter l’inconfort de l’animal. Des points limites seront définis et les animaux seront mis à mort lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption.

Choix des espèces

La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont homologues). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neurodégénératives ou neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, la lignée utilisée pour la CMT2A reproduit une partie des anomalies histologiques et comportementales observés chez les patients souffrant de CMT2A telles qu'une dénervation musculaire et des défauts locomoteurs et sensitifs modérés. Pour les deux études, les traitements seront réalisés à deux temps: avant (3mois) et après le déclenchement de la maladie (5mois) afin de déterminer si l'effet du traitement permettra d'empêcher le développement de la maladie et/ou de la ralentir une fois celle-ci déclarée. L'ensemble des groupes de souris de ces études seront suivis pendant les deux mois de traitement (soit de 3 à 5 mois ou de 6 à 8 mois).