Système nerveux

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées de paclitaxel, un anticancéreux, pour leur induire une neuropathie douloureuse, puis des injections d'une molécule candidate, et subissent des tests comportementaux d'allodynie tactile et thermique au froid. Le porteur décrit l'induction de la neuropathie comme une 'nuisance à part entière' mais 'indispensable' à l'étude, et prévoit de tuer tous les rats pour des prélèvements. Il affirme que ce type d'étude sur la douleur n'est pas encore remplaçable par des modèles in vitro.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite (CIPN) est un effet indésirable classique et dose limitant des anticancéreux neurotoxiques (sels de platine, taxanes, vinca alcaloïdes, bortézomib), qui touche environ 60% des patients, et altère profondément la qualité de vie des patients et dont la prise en charge thérapeutique reste très limitée. Aucun traitement préventif ne peut être recommandé et seule la duloxétine est modérément recommandée sur les douleurs associées. En conséquence, les oncologues sont fréquemment contraints de diminuer voire d’arrêter les anticancéreux neurotoxiques lors de l’apparition des premiers symptômes de CIPN. Des travaux récents ont montré l’intérêt d’une molécule, le CARBA1, pour améliorer l'action anticancéreuse du paclitaxel (taxane) et avec des propriétés antioxydantes laissant penser que le CARBA1 pourrait limiter la neurotoxicité du paclitaxel. Ainsi, l’objectif de ce projet sera d’évaluer l’effet préventif du CARBA1 sur la CIPN associé au paclitaxel sur un modèle animal (rat). Ces effets préventifs seront notamment mesurés par des tests comportementaux (allodynie tactile et thermique).

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier une nouvelle stratégie thérapeutique de prévention de la CIPN associée au paclitaxel. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des CIPN est très limitée (aucun traitement préventif et seule la duloxétine modérément recommandée sur les douleurs). L’objectif ultime sera de proposer un nouvel agent capable de prévenir la CIPN qui devra faire l’objet d’une preuve de concept dans le cadre d’une étude clinique impliquant la personne humaine.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections de paclitaxel ou de son véhicule associées à des injections de CARBA1 ou de son véhicule. Le nombre d’injections pour le paclitaxel sera de 4 (J0, J2, J4, et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) et de 6 pour le CARBA1 (J-2, J-1, J0, J2, J4, et J7) par voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max). Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à 3 semaines après la fin des injections : 1. Mesure de l'allodynie tactile : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal (stabulation dans des portoirs (box) individuel pour 24 rats); 2. Mesure de l'allodynie thermique au froid : durée du test pour un animal 5 minutes (max).

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (allodynie tactile et thermique). Les administrations répétées de paclitaxel pourront être responsables d’une diminution du gain de poids des animaux, mais ce phénomène est très limité voire absent avec les doses de paclitaxel utilisées (nb. Nous ne l’avons jamais observé avec ce modèle animal, mais cet effet est retrouvé plus fréquemment avec les autres anticancéreux neurotoxiques). Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations de paclitaxel, et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre la CIPN nécessitent un bon état général des animaux, car l’altération de l’état général des animaux est un biais important à la pertinence des analyses conduites.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des 2 expérimentations afin d’effectuer des prélèvements.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie des CIPN, qui n'est-elle même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur (troubles nociceptifs neuropathiques), l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nous devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits (pour des raisons de faisabilité des tests comportementaux) et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire.

Choix des espèces

Le rat Sprague-Dawley est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les CIPN. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat Sprague-Dawley possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.

185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage pour une transplantation de microbiote fécal, des prélèvements de fèces et des tests comportementaux de recherche compulsive d'alcool incluant des impulsions électriques aux pattes. Le porteur indique un risque de lésions mécaniques lors du gavage et prévoit de tuer les souris pour analyser leur cerveau et séquencer leur microbiote. Il affirme que modéliser ces troubles compulsifs in vitro ou in silico n'est pas possible et que le recours à l'animal est 'nécessaire'.

Objectifs

Ces dernières années, des efforts scientifiques croissants ont été consacrés à l'étude de l'axe microbiote-intestin-cerveau, une voie bidirectionnelle complexe reliant notre intestin au cerveau. Le microbiote regroupe l'ensemble des microorganismes, bactéries et levures qui peuplent notre tube digestif et qui participent à la santé de l'hôte. Ce domaine en pleine expansion suggère que le microbiote pourrait jouer un rôle potentiel dans l'apparition et/ou le développement de troubles psychiatriques dont les addictions. Parmi ceux-ci, nous nous intéressons à la consommation d’alcool. En effet, différentes études chez l'homme ont montré une altération du microbiote intestinal chez les patients alcooliques. Notre hypothèse est que le microbiote intestinal peut jouer un rôle central dans le développement de la psychopathologie de l'addiction à l'alcool et donc être une cible intéressante pour améliorer l'abstinence face à l’alcool. Pour tester cette hypothèse, nous utiliserons un modèle de souris qui repose sur la recherche compulsive d'alcool, qui est une caractéristique pathologique essentielle de l'alcoolodépendance.

Bénéfices attendus

Si notre hypothèse est confirmée, elle ouvrira la possibilité d'un rôle causal du microbiote dans les aspects psychopathologiques de la consommation d'alcool. Nos données permettront, à long terme, de transposer les résultats à une cohorte clinique et potentiellement développer de nouvelles stratégies ciblant le microbiote intestinal, telles que des prébiotiques ou probiotiques, pour la gestion des addictions.

Procédures

Toutes les souris (N=185) recevront un gavage. Nous effectuerons des prélèvements fécaux sur animal vigil (3 crottes) le matin vers 9h. Des tests comportementaux seront effectués sur les animaux afin d’evaluer le comportement de type compulsif lié à la consommation d’alcool.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour ces animaux sont modérées. La punition sous forme de impulsions électriques au niveau des pattes est très faible et de courte durée et le gavage pour la transplantation de microbiote fécal sera fait par des chercheurs expérimentés, réduisant donc le risque d’une fausse route ou de lésion mécanique. Néanmoins, bien que le geste technique soit maitrisé par les expérimentateurs, il peut y avoir exceptionnellement des lésions mécaniques.

Devenir

Suite au dernier test comportemental, les souris seront euthanasiés pour analyse post mortem des cerveaux et le séquençage du microbiote.

Remplacement

Dans l’état actuel des connaissances modéliser in vitro ou in silico les mécanismes biologiques des troubles compulsifs n’est pas possible. En effet, il s’agit de relier, une consommation compulsive aux désordres centraux qui peuvent associés. Par ailleurs, dans le cadre de ce présent projet, il s’agit d’évaluer également la participation des bactéries intestinales et de la barrière digestive dont le système nerveux entérique. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire pour étudier les interactions entre ces différents organes, le microbiote intestinal et le comportement compulsif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique, en se basant sur la littérature précédente dans le même domaine. L'élément le plus important pour la réduction est l'utilisations des mêmes animaux pour faire une cross-transplantation fécale.

Raffinement

Au cours des semaines une surveillance quotidienne sera entreprise pour veiller au bien-être des animaux (quantité de boisson et de nourriture adéquats). Un suivi du poids des animaux, de la qualité de la fourrure des animaux et de la quantité de boisson ingérée sera pratiqué de façon hebdomadaire (poids, fourrure) ou tous les trois jours (prise de boisson). Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués tout au long du projet.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans la pathologie compulsive sont proches de ceux observés chez l’homme. Cette espèce est largement utilisé dans la littérature comme modèle de consommation d’alcool liée à un comportement compulsif. Dans un premier temps, les souris seront reçues à 5 semaines et seront inclues dans le protocole à 6 semaines, comme nous sommes intéressés aux effets comportementaux à l'âge adulte. Dans la deuxième partie du projet, les souris seront reçues à l’âge de 3 semaines, comme il a été démontré que la transplantation fécale est plus efficace lorsqu’elle est réalisée chez des jeunes souris.

3 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques d'autisme, elles reçoivent des injections répétées, certaines une chirurgie stéréotaxique pour implanter une fibre optique ou une canule, puis passent des tests de comportement social, moteur et d'anxiété, le porteur reconnaissant des douleurs post-opératoires et des risques d'hémorragie ou d'infection. Les tissus sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que l'autisme ne peut être modélisé qu'au niveau de l'"animal entier" et présente les bénéfices thérapeutiques comme une perspective.

Objectifs

La prise en charge des patients souffrant de troubles autistiques nécessite le développement de nouveaux traitements pharmacologiques visant à soulager leurs déficits comportementaux. Le projet proposé a pour objectif (1) une meilleure compréhension des substrats biologiques de ces pathologies, (2) la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles animaux des troubles autistiques présentant une bonne homologie avec les conditions cliniques, et (3) l'évaluation in vivo, dans ces modèles, de nouvelles stratégies thérapeutiques, le tout à des fins strictement scientifiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension des gènes impliqués dans le développement de l'autisme et proposera de nouvelles solutions thérapeutiques pour soulager la pathologie.

Procédures

Une partie des animaux de nos procédures expérimentales seront soumis à des injections chroniques (14 jours) de composés par voie intrapéritonéale et per-nasale. Nous allons également étudier des animaux qui recevront une administration unique de composés par voie intracerebroventriculaire. Enfin, un groupe d’animaux subira une chirurgie stéréotaxique dans le but d’implanter une fibre optique ou une canule d’injection. Les composés seront ensuite injectés, soit via la canule d’injection, soit par voie intrapéritonéale dans le cadre des souris implantées avec une fibre optique. Nous allons évaluer les compétences sociales des animaux ainsi que leurs compétences motrices et leur niveau d'anxiété. Chaque test sera réalisé une fois, avec une durée maximale de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Pour le groupe d’animaux soumis à des administrations répétées d’agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale, on ne peut pas exclure une inflammation au niveau du site d’injection. Pour les animaux subissant une administration per-nasale, à l’exception d’un inconfort, ce type d’injection n’est pas connu pour générer d’effets indésirables. L’administration de composés par voie intracérébroventriculaire sera réalisée sous anesthésie gazeuse. On peut donc s’attendre à une douleur modérée au niveau du site d’injection ainsi qu’à un inconfort au réveil de l’anesthésie. Les animaux subissant une chirurgie stéréotaxique présenteront une douleur post-opératoire, les conséquences d’une anesthésie, et un risque de complication post-opératoire (hémorragie, infection).

Devenir

À la fin de chaque expérience, les animaux seront euthanasiés et les tissus seront prélevés en vue d'expériences ex-vivo ultérieures.

Remplacement

La compréhension des mécanismes causaux de l'autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du comportement des animaux modèles permet de valider l'existence de la pathologie autistique et, le cas échéant, l'efficacité d'une approche thérapeutique. L'évaluation des effets bénéfiques d'un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu'au niveau comportemental : en effet, il n'existe pas de marqueur biologique pour l'autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu'au niveau de l'animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.

Réduction

Nous avons ajusté nos effectifs de manière à les réduire au maximum sur la durée totale du projet, tout en assurant la significativité des résultats.

Raffinement

Nous prendrons en charge l’ensemble des contraintes subies par les animaux au cours des expériences. En ce qui concerne l’hébergement, les souris seront regroupées en sociaux de 2 à 4 individus, avec mise à leur disposition du matériel nécessaire pour construire un nid (ouate et cabane en carton), et manipulation quotidienne par le même expérimentateur. Afin de réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons des individus des deux sexes, les testerons dans différentes tâches, et appliquerons les tests statistiques appropriés. Tout au long des expériences, nous surveillerons quotidiennement le bien-être des animaux, en particulier leur poids, leur posture et leur point d'injection. Pour les chirurgies, nous mettrons en place une procédure d’anesthésie adéquate (anesthésique associé à un analgésique), ainsi qu'un suivi post-opératoire renforcé. En effet, nous administrerons un traitement anti-inflammatoire aux animaux pour réduire la douleur et effectuerons un suivi quotidien de la cicatrisation de la plaie, du poids et de la posture des animaux. Des points limites appropriés seront définis pour éviter de causer des souffrances inutiles aux animaux. Nous ne pouvons toutefois pas nous passer du modèle animal, car l’autisme est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant tout son répertoire comportemental.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique. Plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées sont disponibles pour modéliser cette pathologie au niveau préclinique. Les déficits comportementaux détectés chez ces souris modèles sont suffisamment importants et robustes pour permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les éventuels déficits comportementaux fixés.

816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation du gène Kcnq2 reproduisant une épilepsie infantile, elles reçoivent jusqu'à vingt molécules candidates par gavage, injection ou alimentation, certaines étant implantées d'une puce sous anesthésie, et le porteur indique que des crises spontanées peuvent provoquer leur mort. Le système nerveux central est prélevé en fin de procédure. Le porteur revendique un modèle "premier et seul" disponible pour tester des traitements sur "organisme entier", les bénéfices pour les enfants restant renvoyés à une éventuelle demande d'essai clinique.

Objectifs

Des variants pathogènes dans le gène KCNQ2 provoquent une épilepsie dans l'espèce humaine. Cette épilepsie se manifeste par de fréquentes crises survenant durant les tous premiers mois de vie (avant l'âge de 3 mois). Cette activité épileptique est accompagnée d'une détérioration des fonctions cognitives et motrices. Il n'existe pas de traitement et les anti-épileptiques classiques sont inefficaces. Nous étudions une souris modèle knock-in porteuse d'un variant récurrent du gène KCNQ2 (T274M). La souris hétérozygote pour ce variant reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine. Ce modèle permet de mieux comprendre la pathophysiologie de la maladie et de tester de nouvelles approches thérapeutiques. Ce modèle est le premier (et le seul pour le moment) qui puisse permettre de tester des approches thérapeutiques sur organisme entier dans un contexte valide par rapport à la pathologie humaine. Le projet comporte la stabulation d'animaux à phénotype dommageable, leur traitement par des candidats médicaments et l'évaluation de leur phénotype sur le plan des crises d'épilepsie et des capacités cognitives. A l'heure actuelle, il existe des molécules qui vont atténuer les crises d'épilepsie chez les enfants présentant une épilepsie liée au gène KCNQ2 (par exemple la carbamazépine). La multiplicité des traitements subis par ces enfants et leur hétérogénéité (clinique et génétique) ne permet cependant pas d'établir clairement si les traitements efficaces sur les crises le sont aussi sur le développement neurologique. Il s'agit pourtant d'une question essentielle. Pour l'ensemble de ce projet, nous envisageons de tester 20 molécules. Nous avons pour objectif d'identifier des molécules qui apporteront un bénéfice en terme de neurodéveloppement. Si le traitement est efficace, nos souris modèle devront présenter moins de crise mais aussi avoir un neurodéveloppement le plus normal possible.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments dans un modèle unique d'encéphalopathie épileptique. Si un candidat médicament s'avère efficace pour diminuer les crises d'épilepsie et pour améliorer les déficits cognitifs dans le modèle, les résultats serviront de base à une demande d'essai clinique dans l'espèce humaine.

Procédures

Traitements pharmacologiques par l'alimentation, par gavage ou injection intrapéritonéale en fonction des candidats médicaments. Traitements aigus (1 à 3 jours) ou chroniques (entre P25 et P90) en fonction de la pharmacocinétique des composés testés. Les animaux qui passent dans le test LMT seront anesthésiés et implantés avec une puce RFID. Prélèvements sanguins en fin de protocole pour estimer la biodisponibilité des composés ou de leurs métabolites et confirmer l'exposition.

Impact sur les animaux

Etant donné que les molécules administrées sont censées avoir un effet antiépileptique, nous attendons une amélioration du phénoptype des animaux (moins de crises, meilleures capacités d'apprentissage). Aucun effet indésirable particulier n'est attendu. Dans le pire des cas, les candidats médicaments n'auront pas d'efficacité. S'ils aggravent le phénotype (voir suivi des animaux ci-dessous), les traitements seront alors immédiatement interrompus. Dans ce modèle, il est également possible que les animaux présentent une crise spontannée conduisant à la mort de l'animal.

Devenir

Les animaux sont conservés pendant la durée de la procédure (traitement, évaluation des améliorations phénotypiques, prélèvement sanguin) puis euthanasiés en fin de procédure afin de prélever le système nerveux central pour réaliser des analyses histologiques, transcriptomiques et protéomiques.

Remplacement

Les épilepsies sont provoquées par des décharges inadaptées de cellules excitables en réseau. Les crises ainsi générées se traduisent, le plus souvent, par des mouvements anormaux. Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l'espèce humaine, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier. Le gène Kcnq2 est très conservé entre la souris et l'Homme. Les tests phénotypiques sont bien développés dans cette espèce. Le modèle que nous utilisons est le premier et le seul disponible pour le moment pour cette pathologie. Avant que le modèle vivant ne soit utilisé, les médicaments candidats ont été testés sur des modèles cellulaires in vitro et dans des neurones dérivés de modèles iPS avant d'en préciser les caractères de d'efficacité et de toxicité éventuelle. L'étude des capacités d'apprentissage et de mémorisation ne peut être effectuée que sur l'animal vivant.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera optimisé et calculé de façon à ce que les effets attendus puissent être détectés avec un niveau de significativité suffisant tout en garantissant la sécurité des résultats s'ils doivent être utilisés ultérieurement pour justifier un essai clinique pédiatrique.

Raffinement

L'hébergement est adapté aux besoins physiologiques des animaux et permet l'expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées dans des cages de 530cm2 (5 souris maximum), avec 2 enrichissement différents (dôme et bandelettes de cartons), eau et nourriture ad libitum. La méthode d'administration des traitements la moins contraignante possible sera utilisée (dans les croquettes servant d'alimentation à chaque fois que cela est possible). Nous réalisons une anesthésie profonde des animaux avant l'implantation des puces RFID. Des points limite clairs sont définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu'ils atteindront les critères d'interruption.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées sont un modèle qui permet de modéliser une pathologie humaine car il s'agit de mammifères disposant d'un répertoire génétique très similaire à celui de l'espèce humaine. La technologie de recombinaison homologue utilisée pour générer le modèle utilisé est parfaitement au point dans cette espèce et a permis de générer des centaines de modèles pertinents pour étudier les maladies humaines et pour développer des traitements spécifiques. Les souris seront traitées au moment où apparaissent les crises d'épilepsie spontanées dans ce modèle et uniquement chez des animaux sevrés (entre P25 et P30). La suppression des crises d'épilepsie est le premier critère de jugement d'efficacité de la molécule testée. Le traitement pourra se poursuivre quotidiennement jusqu'à P90 où l'évaluation finale de leur comportement sera effectuée (tests d'apprentissage et mémorisation). Dans l'espèce humaine, la maladie est sporadique (sans histoire familiale) et n'est donc détectée chez un nourrisson qu'au moment où les premières crises apparaissent. Nous nous placerons donc dans ce même cas de figure avec les animaux modèles étudiés ici, traités au moment où leur pathologie se manifeste.

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections directement dans le cerveau sous anesthésie et des prélèvements de sang, avant d'être tuées pour prélever leurs organes, afin de valider des vecteurs censés faire passer des médicaments vers le système nerveux. Une lignée de souris est génétiquement humanisée pour le récepteur ciblé. Le porteur, une société, met en avant un "gain de temps considérable" et "donc économique", à côté de l'argument scientifique.

Objectifs

-Introduction : Les maladies neurodégénératives (pathologies affectant les neurones), et maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde. A l’heure actuelle, les besoins médicaux restent malheureusement sans solutions, traitements curatifs, ou palliatifs (qualité de vie). Ainsi, ces neuropathies sont de très bons exemples d’enjeux de santé publiques. C’est dans ce contexte scientifique que notre société a développé un savoir-faire qui consiste à attacher des protéines ou peptides avec un fragment d’anticorps (aussi appelé VHH), l’ensemble couplé à un médicament afin de passer plus efficacement les barrières physiologies, notamment la Barrière Hémato-Encéphalique du cerveau (BHE). Ces molécules ou vecteurs, appelés VHH pourront ainsi atteindre le tissu cible du système nerveux central et traiter les cellules malades. Pour l’instant, la plupart des médicaments utilisés en thérapie restent inefficaces par manque de passage de ces barrières sélectives et donc d’accès aux tissus à traiter. Concept général : L’objectif principal de notre société sera donc de proposer de nouvelles formulations capables de reconnaître spécifiquement leurs partenaires naturellement exprimés (endogènes), au niveau des barrières cellulaires de l’organisme et d’utiliser leurs mécanismes naturels de passage pour ainsi, délivrer les médicaments au niveau central (cérébral). Par cette technique du cheval de Troie, nous faciliterons le passage de médicaments du sang vers le système nerveux central (SNC). -Objectif du projet : Les études pharmacologiques passent par différentes étapes de validation avant tout développement pré-clinique, elles utiliseront des voies d’administrations simplifiées pour qu’elles puissent être facilement applicables à grandes échelles et moins contraignantes pour les patients. Ces traitements sont généralement administrés par voie périphérique, sous-cutanée, intra-veineuse ou par voie orale. L’optimisation de nos vecteurs (VHH) devra avant tout développement périphérique passer par une étape de validation et confirmation de l'efficacité au niveau central. A travers cette demande de projet et la réalisation d’injections intra-cérébrales, nous tenterons d’améliorer l'action de nos molécules VHH-médicaments sur souris consanguines, dites « standards », puis, de le confirmer ces résultats sur ce même fond, humanisé pour le récepteur cible.

Bénéfices attendus

-Validation de l'efficacité pharmacologique de nos molécules VHH pour améliorer les traitements actuels et apporter des solutions thérapeutiques contre les pathologies à enjeux de santé publique. Ce nouvel axe de recherche pré-clinique pourrait ainsi servir de levier dans le traitement des maladies du système nerveux, au même titre que les derniers vaccins innovants développés pour la lutte contre la COVID-19. -Choix d’une lignée de souris humanisée pour le récepteur ciblé : La transposition de nos recherches sur un modèle murin pour lequel nous avons humanisé le récepteur cible permet, non seulement d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos vecteurs (VHH), mais aussi d’anticiper les possibles effets secondaires ou toxicités associées. Son utilisation assure de développer au maximum les études sur le modèle murin (souris) avant d’engager la phase préclinique et la transposition à l’homme, lesquelles auraient certainement nécessité des séries de tests supplémentaires sur divers modèles animaux de plus grandes tailles. De plus, cela constitue un excellent outil stratégique et scientifique, permettant in fine, une réduction importante du nombre d’animaux au sein des cohortes, sans parler du gain de temps considérable pour la société, et donc économique.

Procédures

Au cours de cette procédure, nous allons avoir une étape d'anesthésie et analgésie pour réaliser les administrations centrales : -Analgésie : Anti-douleur administré 30 minutes avant le début de l’anesthésie (durée 1h) -Anesthésie générale : Anesthésie gazeuse (voie aérienne) par induction en chambre (5 minutes), puis relais au masque (durée 15-20 minutes maximum) pour réaliser les administrations. Puis, au cours de la cinétique, nous aurons trois étapes de prélèvements : -Un premier prélèvement de sang sur des temps intermédiaires en cours de cinétique (maximum X3 espacés de minimum 24h). Réalisés sur animal éveillé et immobilisé dans une contention spécialisée (durée 2 minutes), par une micro incision de l'extrémité de la queue. Cette étape très rapide et peu invasive se fait sans trop de contraintes, ni stress pour l’animal. Le saignement est ensuite stoppé par un point de pression à l’aide d’un papier absorbant stérile pour une cicatrisation rapide. -Un deuxième avec le prélèvement sanguin en point final en toute fin de cinétique (durée 3 minutes), en post-mortem. -La troisième étape consiste à récupérer les organes et tissus d’intérêts, toujours en post-mortem (durée 5 à 10 minutes en fonctions de la quantité de tissus à prélever pour les tests post-expérimentaux) .

Impact sur les animaux

Dans ce projet nous chercherons à limiter au maximum le stress induit aux animaux. Les possibles sources de stress, angoisse et/ou douleurs sont ici listées avec une description des principaux actes engagés afin d’éviter leurs apparitions qui seront détaillés ci-après dans la partie procédure correspondante. -Transport et adaptation : Arrivée des animaux et stabulation qui peuvent engendrer du stress et un impact sur l’alimentation et le comportement -Tonte avant chirurgie et constitution des groupes : manipulation qui pourrait générer une source de stress -Chirurgie et injection (infusion lente) : Pas de risques notables avec une bonne maîtrise des antalgiques et anesthésiques. -La pose de points et période de cicatrisation : Pas de risques par une bonne réalisation de points individuels. -Effets secondaires toxiques et immunogènes des composés en suivi post-administration : Pas de risques majeurs pour les animaux (et études) car ces paramètres sont anticipés. -Nettoyage et traitement des plaies à la vétédine savon : Source de stress. -Prélèvements sanguins intermédiaires sur animaux éveillés : Source de stress, qui sera considérablement réduite par le geste expert du manipulateur. -sacrifice par injection létale : Source de stress au moment de l'injection intrapéritonéale.

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires en post-mortem (voir 5.6.1).

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien de la liaison avec le récepteur cellulaire cible, mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos vecteurs conjugués. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique, ou suffisamment informel tel que les organoïdes (micro-tissus en culture chargés de reproduire le fonctionnement d'un organe). Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Dans notre cas, le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit alors de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. L’utilisation de faibles cohortes d'animaux permettra d’aller en ce sens, tout en allant exploiter un maximum de résultats et par l’obtention de données statistiques significatives.

Réduction

L’optimisation de nos molécules et l’injection intra-cérébrale permettent d'envisager une médication optimisée et réduite (dose infime par animal), de limiter les possibles effets secondaires, mais aussi le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 8 groupes par étude et 5 études par an, sur le fond standard et sur la lignée humanisée, nous n’aurons besoin que de 320 animaux par an, soit un total de 1600 souris sur 5 ans. Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus), sera suffisant et nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes, ou encore une analyse de variance. En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile des souris et permettra d’optimiser la procédure sur plusieurs types de post-expérimentations. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires en cours de cinétique permet d'obtenir des données de stabilités pharmacologiques supplémentaires, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires pour appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal. Nous porterons une attention particulière à la préparation amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux, laquelle sera au minimum de 7 jours (fond standard) voire 14 jours (lignée humanisée) dès réception. 48h à 72h avant les administrations, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce spécialisée. Elles sont ainsi maintenues dans un contexte familier. Par la suite, les animaux seront tondus (partie supérieure du crâne) la veille des administrations (sous anesthésie gazeuse) pour éviter l’accumulation des anesthésies le jour même (J0) et le stress associé. A J0, les administrations intra-cérébrales seront réalisées sous anesthésie. Les manipulations sur animal éveillé, en cours d’étude, seront précises et rapides (≤ 2min). Une couveuse chauffante (env.37°C) sera utilisée pour assurer le bon réveil lors de la phase post-opératoire et une attention quotidienne (nettoyage vétédine savon) sera portée durant 72h à 1 semaine (fonction avancement cicatrisations) pour assurer une bonne cicatrisation et récupération des animaux. Des points limites seront malgré tout établis en cours de chirurgie, puis lors du réveil et tout au long de la cinétique. Tout comme son contrôle standard, la lignée humanisée utilisée n’a jusqu’alors jamais présenté d’apparitions de phénotypes dommageables.

Choix des espèces

-Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études précliniques. A l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur, ici la souris, reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, Il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques) et une diminution des posologies. Notre modèle de transposition sur la lignée humanisée est particulièrement avantageux car il présente une cible endogène humanisée (récepteurs) tout en gardant les avantages cités précédemment. Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Les animaux seront utilisés pour réaliser des validations pharmacologiques centrales et des échantillonnages de sang et tissus. -Pour notre procédure et nos deux lignées utilisées, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 10 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Cet âge présente un poids moyen de 27-30g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

Les 210 rats subissent une chirurgie du cerveau de deux heures sous anesthésie générale pour implanter un dispositif de mesure par fibre optique, et 120 d'entre eux une seconde chirurgie pour poser un cathéter dans une veine, après quoi ils restent seuls dans leur cage jusqu'à la fin du projet. Ces 120 rats s'administrent de la cocaïne pendant 25 sessions quotidiennes de six heures, suivies de deux mois d'abstinence, et tous passent trois séances d'une heure d'enregistrement de leurs neurones, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur cite chez les rats rendus dépendants un poil hérissé, de l'irritabilité et une agressivité envers l'expérimentateur, et annonce des tests comportementaux sans les nommer. Le projet vise d'abord à mettre au point cette technique d'enregistrement, par groupes de trois rats et dix conditions au plus. Tous sont tués à la fin de l'expérience pour analyser leur cerveau.

Objectifs

Le projet présenté ici s’inscrit dans un projet plus large visant à évaluer si le métabolisme du cholestérol cérébral représente une cible thérapeutique potentielle pour prévenir les rechutes et traiter l’addiction. En effet, quelques études ont montré que l’expression de protéines impliquées dans ce métabolisme était modifiée aussi bien chez l’homme, que dans des modèles animaux d’addiction, en réponse à la cocaïne ou à l’alcool. Pour cela, nous avons besoin dans un premier temps de mettre au point une technique d'enregistrement par fibre optique afin de déterminer les conditions optimales d’enregistrement de l'activité des neurones puis de valider ces conditions expérimentales avec l'étude de cette activité chez des rats en situation de rechute après une période d’addiction volontaire à la cocaïne puis une phase d'abstinence.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la mise au point d’une technique innovante pour mesurer l’activité neuronale chez l’animal vigile. Cette technique, réalisée sur animal vigile, couplée à des mesures comportementales, nous permettra de mieux comprendre les processus neuronaux sous-tendant les phénomènes de rechute afin de mieux les combattre et promouvoir l’abstinence.

Procédures

Tous les rats (210) suivront une chirurgie sous anesthésie générale (durée : 2h00) afin d'implanter un dispositif pour mesurer l'activité neuronale. 120 rats seront soumis à une seconde procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée 15 min) pour implanter un cathéter veineux. Après leur chirurgie et jusqu'à la fin du projet, ces 120 rats seront hébergés seuls dans leur cage. L'auto-administration de drogue se fera avec ces 120 rats pendant 25 sessions, 1 session par jour (durée d'une session : 6 heures) en plaçant les animaux dans des cages spéciales dans lesquelles les animaux sont libres de leur mouvement. Les sessions d'auto-administration sont suivies d'une période d'abstinence d'une durée de 2 mois. Pour mesurer l'activité neuronale, tous les rats vigiles (210) seront placés pendant 1 heure dans une cage spéciale ; dans cette cage les rats sont libres de leur mouvement. Chaque rat aura 3 sessions de mesure de l'activité neuronale (repartis sur 40 jours). Tous les rats (210) seront pesés (2 fois par semaine, 15 semaines maximum, 10 secondes par pesée).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : -Chirurgies : douleurs soulagées par l'administration d'antalgiques et inconfort transitoire au réveil. - Dispositif de mesure de l'activité cérébrale : gène légère pendant la durée de l’expérience. - Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience. - Auto-administration : La prise de drogue chronique peut causer un stress modéré chez certains individus, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « addict » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. Cet état peut se révéler par le poil hérissé, par une certaine irritabilité et agressivité envers l’expérimentateur mais pas envers ses congénères. Dans la plupart des cas, cet état est transitoire et l’état du pelage et les niveaux d’agressivité reviennent à la normale après quelques jours. - Période d’abstinence : peut causer un léger stress. - Isolement : peut causer un stress modéré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses sur le cerveau.

Remplacement

Ce type de recherche, vise à mettre au point une technique d’enregistrement de l’activité des neurones in vivo chez l’animal vigile au cours de tests comportementaux, ce qui implique d’utiliser des animaux vivants. L’étude de ce processus nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des animaux intègres et donc vivants. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Dans la première phase du projet, pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous progresserons pas à pas avec des groupes de 3 animaux. Nous testerons une condition à la fois, jusqu’à l’obtention de résultats satisfaisants. Nous avons fixé une limite maximale de 30 animaux par lot pour trouver les conditions optimales pour la mise au point de la technique d’enregistrement des neurones, soit 10 conditions expérimentales maximum. Dans la seconde phase de mesure de l'activité cérébrale chez les rats addicts, nous estimons à 20 rats par lot le nombre d’animaux nécessaire pour pouvoir faire les analyses statistiques de nos résultats.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ces points limites gradés précis et spécifiques sont définis de façon suffisamment précoces sont définis dans une grille de suivi. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, avec un recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques ainsi que d’un maintien de la température par un tapis chauffant et d’une hydratation régulière des tissus lors des procédures de chirurgie. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie. A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec une autre espèce, pour laquelle la réalisation de tâches opérantes modélisant l’addiction est plus difficile à obtenir. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est-à-dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur confondant de déclin cognitif lié au vieillissement.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau, subit une biopsie de la queue et des tests de mémoire en labyrinthe, pour étudier le lien entre un récepteur et les lésions de la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique des douleurs liées à la biopsie et aux injections stéréotaxiques et un stress lié aux tests. Il qualifie de "stricte nécessité" le recours à des animaux vivants pour relier comportement cognitif et lésions du cerveau.

Objectifs

L’objectif général de ce projet et de la présente demande vise à mieux comprendre le lien entre le récepteur FXR (et son rôle dans l'insulinosensibilité centrale) et les mécanismes physiopathologiques de la maladie d'Alzheimer et ce, en appréhendant les mécanismes cellulaires et moléculaires contribuant au développement des lésions dans la maladie d'Ahzheimer et les tauopathies (pathologies caractérisée une agrégation intraneurale de la proteine Tau) et pouvant être influencer par le récepteur FXR. Ainsi, notre projet permet non seulement de lever des interrogations fondamentales quant aux processus pathologiques mis en jeu dans la MA pouvant in fine aboutir de nouvelles startégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Notre projet va apporter la preuve de concept selon laquelle le récepteur FXR pourrait influencer la pathlogie Tau physiopathologie de la MA et des tauopathies.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de vecteurs viraux (voies intracraniale: 1x, moins de 5min,procédure entière moins de 60 min). Nous réaliserons également des tests de comportement afin d’évaluer les performances cognitives des animaux (actimétrie: 1x, 10 min; labyrinthe: 1x, 10min, 130 moin en cage d'hébergement (phase de retention) et 5 min soit 45 min). Les animaux subiront une biopsie de queue (moins de 5 min, 1X).

Impact sur les animaux

Nuisances possibles suite aux différentes manipulations de animaux : -Douleur associé à la biopsie de queue (douleur modéré; 1x) -Stress associé aux investigations comportementales -Douleurs opératoires associées aux injections stéréotaxiquesdouleurs/infections post-opératoires

Devenir

En dehors de la procédure de génération et de génotypage, l'ensemble des animaux sera mis à mort en fonction des objectifs annoncés; à savoir mettre en lien le comportement cognitif et les lésions histopathologiques et l'insulinosensibilité centrale. Ce lien nécessitant l amise à mort de tous les animaux pour pouvoir réaliser des marquages histologiques, immunomarquages et/ou western blot. De ce fait, aucun animal ne sera réutilisé ni adopté.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie de la MA et des tauopathies, le lien complexe entre neurones et cellules gliales, en lien avec les performances cognitives des animaux. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches neurobiologiques intégrées. Ces évaluations ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux. Le laboratoire est néanmoins conscient de l’aspect nécessaire de recourir à des méthodes alternatives quand cela est possible, ce qui est effectivement fait pour un certain nombre d’études cellulaires et moléculaires ne nécessitant pas de modèles animaux.

Réduction

Le nombre total d’animaux concernant les procédures de l’ensemble des protocoles de ce projet sur les 5 ans à venir est estimé à 360. Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout enpermettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombred’animaux, lorsque cela sera possible une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera réalisée. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R.

Raffinement

LES ANIMAUX SERONT OBSERVES TOUS LES JOURS, PESES REGULIEREMENT, PAR DU PERSONNEL SPECIALEMENT FORME. DURANT LES DIFFERENTS PROTOCOLES, TOUT SERA MIS EN OEUVRE POUR MINIMISER LE STRESS AUQUEL LES ANIMAUX SONT SOUMIS. LES ANIMAUX SERONT HEBERGES EN GROUPE, ET DES ELEMENTS D'ENRICHISSEMENT DU MILIEU SERONT MIS A DISPOSITION, PAR EXEMPLE COTON POUR LA CONFECTION DE NIDS... LES ANIMAUX SERONT SUIVIS PRECISEMENT POUR CHAQUE PROTOCOLE, POUR LESQUELS DES POINTS LIMITES ADAPTES ONT ETE DEFINIS. TOUTE SOUFFRANCE, ANGOISSE OU COMPORTEMENT INHABITUEL SERA PRIS EN CHARGE PAR DES APPROCHES APPROPRIEES. LES PROCEDURES EXPERIMENTALES DE CHIRURGIES SERONT REALISEES SOUS ANESTHESIE GENERALE PAR VOIE INTRAPERITONEALE. EN CAS DE DOULEUR, UN ANALGESIQUE SERA ADMINISTRE. LES ANIMAUX PRESENTANT UN DES POINTS LIMITES SPECIFIES POUR CHAQUE APPROCHE EXPERIMENTALE SERONT SACRIFIES DANS UNE SALLE DEDIEE; LE TOUT EN LIEN AVEC LE RESPONSABLE DU BIEN ETRE ANIMAL.

Choix des espèces

Dans toutes nos études, nous utilisons des souris, la plupart étant génétiquement modifiées afin de reproduire des caractéristiques pathologiques reproduisant un certain nombre d’altérations retrouvées dans la MA et les tauopathies (pathologie Tau). Le phénotype de ces animaux est modulé par l’expression cérébrale de FXR via l'usage de vecteurs viraux et d’apporter des preuves de concept précliniques importantes pour des approches biomarqueurs et thérapeutiques futures. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 4 mois à 12 mois. Nos modèles ne présentent pas de phénotypes dommageables connus à ces âges, si ce n'est une perte de mémoire. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 4 mois à 12 mois. Nos modèles ne présentent pas de phénotypes dommageables connus à ces âges, si ce n'est une perte de mémoire.

84 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du cerveau provoquant une lésion du cortex moteur, la pose d'une électrode sur le nerf vague et des séances de stimulation et de tests moteurs. Le porteur indique que la lésion peut réduire la préhension de la patte avant droite et que la pose de l'électrode peut gêner la nuque. L'étude vise à savoir si la stimulation du nerf vague améliore la récupération après une lésion cérébrale, en vue d'une transposition "à plus long terme" chez l'humain.

Objectifs

Chaque année en France, environ 150 000 personnes sont victimes d’un traumatisme crânien. Un tier d’entre elles sont hospitalisées pour des lésions cérébrales consécutives à un choc. Par sa position anatomique, le cortex moteur est plus exposé aux lésions traumatiques que d’autres régions corticales. Les dommages dans cette région vont entrainer des déficits moteurs avec une récupération fonctionnelle limitée. Comme nous l’avons montré depuis plusieurs années chez la souris ayant subi une lésion cérébrale traumatique dans le cortex moteur, la transplantation cellulaire est une approche thérapeutique prometteuse. Néanmoins, l’efficacité de la greffe et la survie des neurones greffés nécessitent d’être optimisés. De plus, durant ces 10 dernières années, la stimulation du nerf vague (utilisée depuis plus de 20 ans en tant que traitement de l’épilepsie chez l’Homme) est également apparue comme une thérapeutique prometteuse pour le traumatisme crânien. Elle permet une récupération des fonctions motrices et une modulation bénéfique de molécules de l’inflammation et du stress oxydatif. La question est donc de savoir si une stimulation du nerf vague permet d’améliorer l’efficacité de la thérapie cellulaire dans un modèle de lésion cérébrale afin d’envisager une transposition de cette approche chez l’Homme. . Les objectifs de ce projet sont donc (1) de développer les techniques de lésion cérébrale et stimulation du nerf vague et (2) de tester les effets de la stimulation du nerf vague sur la lésion.

Bénéfices attendus

La mise en place de ces techniques de lésion cérébrale et de stimulation du nerf vague chez le rat permettra de conclure sur les effets de la stimulation du nerf vague après une lésion cérébrale qui est une étape cruciale dans la recherche d’optimisation de la thérapie cellulaire pour la lésion cérébrale. En effet, les effets bénéfiques attendus de la stimulation du nerf vague sur la lésion cérébrale pourront être évalués à court terme dans le cadre de la thérapie cellulaire pour optimiser les conditions de greffe et ainsi mieux prendre en charge la réparation cérébrale après une lésion chez l’animal. Le but à plus long terme étant d’appliquer ces deux approches thérapeutiques (transplantation + stimulation) chez l’Homme ayant subi une lésion cérébrale.

Procédures

Une chirurgie sous anesthésie générale en présence d'antalgiques pour tous les animaux, durée de 10 min pour 84 rats ou 40 min pour 24 rats. Pour tous les animaux: 2 ( 84 rats) ou 3 ( 24 rats) sessions de tests du comportementaux moteur en condition vigile, durée 10 min par session. Pour ces 24 rats: stimulations du nerf vague en condition vigile, durée 30 min: 1 session pour 12 animaux et sessions répétées quotidiennes, 5 jours par semaine pendant 4 semaines pour 12 autres animaux. Pesées en condition vigile: 1 fois par jour en suivi post-chirurgie pour tous les animaux, puis 1 fois par semaine pendant 5 semaines pour 24 animaux.

Impact sur les animaux

L’anesthésie générale pourra entrainer un inconfort transitoire au réveil, et une légère perte de poids ponctuelle pourrait également apparaitre. La lésion du cortex moteur entraine potentiellement une légère diminution de la capacité de préhension de la patte antérieure droite. Le placement de l’électrode pourra entrainer une gêne et un inconfort au niveau de la nuque. Lors des pesées individuelles des animaux, ou des tests de motricité, les animaux seront placés seuls dans ces dispositifs, ce qui pourrait générer un léger stress transitoire pendant maximum 10 minutes. Pour la stimulation du nerf vague les animaux seront placés individuellement dans une boite transparente sans contention dans laquelle ils pourront se retourner ou se mettre sur les pattes-arrières pendant toute la durée de la stimulation (30min) puis ils seront replacés dans sa cage d’hébergement avec leur congénère. La stimulation est indolore. La stimulation aiguë pourra engendrer un léger stress lors du placement de l’animal dans le dispositif. Les animaux stimulés de manière chronique s’habitueront au dispositif, le stress devrait donc diminuer au cours des jours d’expérimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de récupérer le cerveau pour des études neuroanatomiques.

Remplacement

L’objectif du projet est d’analyser les effets in vivo d’une stimulation du nerf vague sur une lésion cérébrale du cortex moteur afin d’optimiser l’efficacité de la thérapie cellulaire dans le cadre de la lésion cérébrale chez l’Homme. Ceci ne peut être actuellement modélisé ni in vitro ou ni in silico. De ce fait, cette étude pourra être réalisée uniquement sur l’animal entier et vivant afin de visualiser l’effet bénéfique de cette approche thérapeutique.

Réduction

Cette étude est une mise au point technique avec une procédure de type go, no go. Elle permet, de fait, la réduction du nombre d’animaux utilisés. Dans un premier temps 3 groupes de 12 animaux seront utilisés et si les résultats sont validés les expériences sur 4 autres groupes de 12 animaux seront menées. Des tests statistiques nous ont permis de déterminer le nombre minimal d'animaux pour avoir des résultats significatifs. De plus, cette étude sera réalisée sur les 2 sexes, les mâles et les femelles car le traumatisme crânien concerne aussi bien les hommes que les femmes, mais nous serons attentifs à l’éventuel impact du sexe sur nos résultats. Les mâles et femelles ne peuvent être hébergés dans la même cage et l’isolement étant un stress pour les rongeurs, nous aurons besoin de 12 animaux (6 mâles et 6 femelles) par groupe, afin que chaque rat ait un congénère dans sa cage. L’ensemble du projet prévoit donc minimum 3 groupes de 12 animaux et maximum 7 groupes de 12 animaux. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Avant l’expérimentation les animaux seront acclimatés à l’animalerie et à l’expérimentateur afin de réduire le stress le jour de l’expérimentation. En effet, les animaux seront placés dans leur cage d’hébergement par 2 de même sexe, 10 jours avant les expérimentations. L’expérimentateur manipulera les animaux les jours précédant l’expérimentation. Puis, durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou le stress. Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe de 2 dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : stick de bois à ronger et tunnel). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec analgésie et monitoring de la température corporelle et utilisation d’un coussin chauffant. De plus, les chirurgies seront réalisées par des expérimentateurs compétents et expérimentés à la fois pour la lésion et la stimulation afin que les gestes soient précis et efficaces permettant une chirurgie dans les meilleures conditions possibles pour l’animal. Un traitement antalgique sera poursuivi en post-opératoire. Durant toute la procédure, le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière selon une grille de score (évaluation journalière durant les 7 jours post-chirurgie, évaluation hebdomadaire en pré-chirurgie et 7 jours après la chirurgie) qui permet le suivi des points limites gradés, stricts et précis et qui définit également des critères d’intervention et d’arrêt suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention sera pris en charge sans délai.

Choix des espèces

Le rat est le meilleur modèle de rongeurs pour l’implantation d’une électrode de stimulation dans le nerf vague. En effet, la plupart des études de stimulation du nerf vague ont été réalisées chez cette espèce pour des raisons techniques de localisation et d’isolement du nerf vague (. De part sa taille et sa stabilité cardiovasculaire plus importante par rapport à la souris, les résultats obtenus varient peu d’un individu à l’autre, ce qui permet de réduire le nombre d’individus à utiliser pour les études statistiques. Les animaux utilisés seront des rats adultes de souche non-consanguine Sprague-Dawley (âgées de 8 semaines) car l’intérêt scientifique concerne la lésion corticale traumatique chez l’adulte. A 8 semaines la différence de poids entre mâle (320-380g) et femelle (210-260g) est importante mais ne gênera pas l’expérimentation, nous utiliserons donc des rats mâles et femelles agés de minimum 8 semaines (adultes) car le traumatisme crânien est aussi fréquent chez les femmes que les hommes.