Système nerveux

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'un traceur radioactif, par voie intrapéritonéale à l'état vigile et par voie intraveineuse sous anesthésie, suivies de séances d'imagerie jusqu'à huit fois par animal. L'objet du projet n'est pas thérapeutique mais consiste à comparer deux appareils d'imagerie, dont un prototype de TEP haute résolution dédié à la souris. Le porteur affirme qu'un tel appareil doit être testé sur l'"organisme entier" et que la modélisation mathématique ne peut remplacer la "vérité terrain" sur le cerveau.

Objectifs

Le projet vise à comparer 2 systèmes d’imagerie : le système d’imagerie actuellement utilisé au sein du département d’imagerie préclinique dédié rats et souris versus un prototype d’imagerie TEP (Tomographie d'émission de positons), Haute résolution dédié exclusivement à la souris. Le prototype est en développement et des études in vitro ont été réalisées. Les résultats sont très encourageants, il est donc nécessaire de le tester sur l’animal vivant (organisme entier) pour objectiver l’impact du gain en résolution et en sensibilité des images. En effet, l’optimisation de la qualité des images est un enjeu majeur dans la compréhension des mécanismes sains et pathologiques associés au système nerveux central. Un système d’imagerie plus performant nous permettra de raffiner nos connaissances sur l'étiologie de certaines pathologies cérébrales et ainsi d’ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans la prise en charge de ces pathologies.

Bénéfices attendus

Ce projet qui consiste en la validation d’un nouveau système d’imagerie haute résolution chez la souris nous permettra d’obtenir des résolutions optimales dans le cadre de nos activités de recherche relative à l’exploration cérébrale. En effet, nos thématiques de recherche ciblent en majeur partie des études portant sur le système nerveux central des rongeurs. Actuellement, nous travaillons sur des modèles rats et souris avec un système d’imagerie dont la résolution est autour du millimètre, il est donc plus aisé de travailler sur des modèles rats de par la taille. Cependant, une grande partie des modèles animaux de pathologie du système nerveux central sont des modèles souris. L’optimisation de la résolution mais aussi de la sensibilité et de la qualité des images fournies par nos systèmes d’imagerie est un enjeu majeur dans la compréhension des mécanismes impliqués dans les différentes pathologies du système nerveux central. En effet, un système d’imagerie plus performant nous permettrait de raffiner nos connaissances sur l'étiologie de certaines pathologies cérébrales. Nous espérons que ce système nous apportera des informations complémentaires pour mieux comprendre le métabolisme cérébral basal (animal sain), les mécanismes pathologiques impliqués dans la neuroinflammation et appréhender la sensibilité de ce nouveau système en terme de quantification des images. Ceci, nous permettra de raffiner nos connaissances sur ces pathologies cérébrales et, potentiellement, d’ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans la prise en charge des pathologies du système nerveux central.

Procédures

Etape 1: Injection intrapéritonéale en vigile: 8 fois en tout, 2 min/souris – injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse: 6 fois – Imagerie 30 min sous anesthésie gazeuse, 8 fois/animal Etape 2: Injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse: suivi d’une imagerie de 60 min, 8 fois/animal Etape 3: Injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse suivi d’une imagerie de 60 min, 3 fois/animal injection intrapéritoneale, vigile, 1 fois/par animal.

Impact sur les animaux

La contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute un stress supplémentaire. Une douleur au point d’injection du traceur radioactif ou des traitements pharmacologiques en intrapéritonéal peut être ressentie quelques heures. Un hématome associé avec une douleur au niveau de la queue à la pose ou au retrait du cathéter peut apparaitre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue du projet et les cerveaux seront prélevés pour des analyses immunohistochimie et métabolomiques.

Remplacement

Les études réalisées in vitro sont très encourageants. A ce stade, il est impératif d’étudier ce nouveau système d’imagerie sur l’organisme vivant entier. Ce type d’étude ne peut être substitué par une modélisation mathématique car l’objectif final est d’obtenir la vérité terrain sur le cerveau qui intègre l’environnement vasculaire cérébral et ainsi la distribution systémique du radiotraceur au sein du système nerveux central.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux, les animaux seront imagés plusieurs fois. A partir des images individuelles acquises pour chaque radiotraceur, les images seront générées afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques appropriées pour ce projet pour comparer les différents groupes. Le nombre d’animaux dans cette étude est dictée par des études antérieures menées au sein de notre laboratoire qui ont montré qu’un effectif de n=12 par groupe et par imageur est nécessaire pour répondre à nos objectifs. Nous prévoyons d’inclure un effectif de 15 animaux/groupe de chaque sexe (afin d’assurer un minimum de 12 animaux à exploiter).

Raffinement

Après la phase d’acclimatation, les animaux seront habitués à la salle d’expérimentation pour diminuer leur stress. Ils seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les souris seront observées une à deux fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. Une protection oculaire sera appliquée. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations d’imagerie sur tapis chauffant. Nous assurerons une surveillance accrue du rythme respiratoire et de la température corporelle de l’animal chaque jour d’expérimentation jusqu’au réveil complet.

Choix des espèces

L’objectif étant de caractériser un système d’imagerie haute résolution, la souris est l’espèce adaptée pour cette étude. De plus, la taille du cerveau de la souris est compatible avec la sensibilité et la résolution spatiale des 2 imageurs qui seront utilisés. Nous utiliserons des souris adultes afin d'avoir une taille de cerveau compatible avec la technique d'imagerie utilisée dans ce protocole.

4 000 rongeurs, 2 000 souris et 2 000 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de la tête reproduisant un accident vasculaire cérébral, occlusion d'une artère, ischémie-reperfusion ou hémorragie, suivie d'une IRM, de tests comportementaux puis d'une ouverture terminale du thorax pour prélever le cerveau. Ces interventions ne visent pas à produire des connaissances mais à entraîner des chirurgiens aux gestes des modèles d'AVC. Le porteur affirme que les techniques d'apprentissage de substitution ne permettent pas d'acquérir ces gestes et attend de cette formation une meilleure reproductibilité réduisant le nombre d'animaux des projets futurs.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Cette stratégie d'apprentissage a pour but d'améliorer les résultats des projets précliniques sur les AVC. Le nombre d'animaux utilisés dans les projets scientifiques ultérieurs sera réduit du fait de la meilleure reproductibilité des gestes des expérimentateurs. La prise en charge des animaux sera également améliorée (soins pré, per et post-opératoire), ce qui participera à l'amélioration du bien-être des animaux.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin que le personnel puisse s’entraîner sur les différents modèles. Le modèle d’ischémie par injection de murine alpha-thrombine ou par application de FeCl3, provoquant ainsi l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM) durera 1.5 heure. La pose d’un cathéter en veine caudale sera nécessaire. Une moyenne de 20 minutes est à prévoir pour l’entraînement à cette pose. Le modèle d’ischémie-reperfusion durera 1 heure. 1 heure plus tard, une seconde chirurgie sur le même site sera réalisée afin d’extraire le monofilament et ainsi permettre une reperfusion. Cet acte chirurgical durera 30 minutes. Les deux modèles d’hémorragie dureront 1 heure. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 11 minutes et suiveront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+14 post AVC. Nous comptons un total de 10 minutes pour la prise du neuroscore, 25 à 30 minutes pour la réalisation du test de force d’agrippement. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 20 minutes minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Ce projet à titre d'apprentissage sera soumis à une attention et un encadrement strict pour garantir le bien-être des animaux pendant cette phase d'entraînement. Le stress de l'experimentateur qui manipule l'animal (préhension de l'animal dans sa cage) et la douleur occasionnée lors des procédures (gestes chirurgicaux) sont pris en charge par une couverture analgésiante, anesthésiante, du contrôle de la température des animaux et d'un encadrement supplémentaire. Un environnement contrôlé par des conditions d'hébergements réglementaires et une surveillance strict pallient également aux nuisances attendus sur les animaux.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques d'apprentissage de chirurgies actuelles de substitution ne permettent pas d'acquérir les gestes techniques. Nous avons sélectionné les modèles expérimentaux les plus utilisés dans la thématique. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend ces espèces (souris et rat) particulièrement intéressantes dans le cadre des études portant sur l'AVC.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction tout en aquérant un certain niveau d'expertise technique. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon l'expertise nécessaire à la bonne réalisation des gestes techniques. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaire dans chaque procédure a été calculé par l'expérience de plus de vingt ans de formation aux gestes chirurgicaux des personnels dans l'établissement. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre de 50 animaux par modèle pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. L'utilisation d'un animal pour un enchainement de procédures légères et modérées réduit également le nombre total d'animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les animaux seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et demi-sphère de cellulose et bûchettes de bois pour les rats), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Sur le cadre stéréotaxique, pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles au niveau du conduit auditif, une anesthésie locale est appliquée. La température corporelle de l’animal est maintenue grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Chaque site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, puis à une désinfection. Le choix de la technique de sutures se porte sur la méthode des points séparés, limitant ainsi le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Lors de la phase de réveil, la concentration d’isoflurane et le débit de N2O sont ramenés à zéro, et le débit d’O2 est élevé à 1 L/min pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 1 heure avant d’être remis en cage par 5 pour les souris, par 2 pour les rats. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu'à la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Le rat (Rattus norvegicus) reprend les caractéristiques de la pertinence de l'utilisation de la souris citées ci-dessus. Sa morphologie suscite son intérêt pour l'imagerie grâce à plus grande taille et à sa palette comportementale plus grande que la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend ces espèces particulièrement intéressantes pour étudier la protection, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par un AVC. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 35g pour les SWISS, de 25g pour les C57BL6J et d’environ 300g pour les Wistar ou Sprague-Dawley âgés de 8 semaines. Nous effectuerons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de ce projet avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris dont le gène ARNTL2 est inactivé, elles passent jusqu'à onze tests comportementaux répartis sur cinq semaines, évaluant mémoire, motricité, sociabilité, anxiété, dépression et sensibilité à la douleur, avec un jeûne de vingt-quatre heures pour l'un des tests. Le porteur indique que ces tests peuvent induire un stress léger à modéré et révéler de l'anxiété ou de la dépression, et prévoit la mort de toutes les souris pour analyser leurs tissus cérébraux. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne convient, l'évaluation comportementale exigeant l'animal vigile.

Objectifs

Le gène Arntl2 a été montré dans une précédente étude comme impliqué dans la régulation des rythmes biologiques circadiens. Dans ce projet, nous voulons voir si ce gène a aussi un impact sur les fonctions cérébrales, et notamment sur les capacités mnésiques. C’est pourquoi nous testerons des souris transgéniques pour lesquelles ce gène a été inactivé dans un large éventail de tests comportementaux. En comparant ces souris transgéniques à des souris contrôles, nous évaluerons les performances motrices, mnésiques, cognitives, émotionnelles, mais aussi de sociabilité, ou l’état de bien-être, d’anxiété ou à d’état dépressif et de susceptibilité à la douleur. Les souris adultes mâles et les femelles seront utilisées pour éventuellement mettre en évidence des effets dépendants du sexe.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’implication des horloges cérébrales dans les processus de mémoire mais également dans d’autres fonctions telles que la nociception, la coordination motrice ou les troubles de l’humeur. Il pourrait aussi permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques (chronothérapeutiques en se basant sur les rythmes circadiens) dans la prévention et le traitement des troubles de la mémoire et/ou de l’humeur chez l’humain, voir dans les processus douloureux.

Procédures

Les animaux sont soumis à des tests comportementaux servant à évaluer les performances mnésiques, motrices, senosrielles, sociales et émotionnelles. Chaque test dure durant de 3 à 10 minutes par jour répartis sur 1 à 4 jours. 24h au minimum sépareront ces tests. Certaines cohortes d' animaux réaliseront aux maximum 11 tests répartis sur 5 semaines alors que d'autres effectueront 6 tests répartis sur 4 semaines.

Impact sur les animaux

D’après les premières études préliminaires, l’inhibition génétique du gène ARNTL2 ne semble pas induire d’effet délétère. Les tests comportementaux peuvent induire des stress légers à modérés et de l’anxiété ou de la dépression pourraient être révélées potentiellement. Pour l’un des tests, les animaux réaliseront un jeûne préalable de 24h.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des analyses post-mortem des tissus cérébraux.

Remplacement

Nous ne pouvons pas avoir recours à des méthodes alternatives pour réaliser un tel projet. Il est nécessaire d’évaluer les différents paramètres comportementaux sur l’animal vigile. En effet la plupart des tests comportementaux réalisés dans le cadre d'un criblage comportemental impliquent une réponse motrice et mais également intégrée de l’animal. Il nous est donc impossible pour cette étape de travailler sur un modèle autre que l’animal.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats fiables et robustes tenant compte de la variabilité interindividuelle, de l'inactivation ou non du gène ARTNL2 et du sexe. Un maximum de test est réalisé sur un même groupe d'animaux tant que cela n'entrave pas la fiabilité des résultats expérimentaux et le bien-être animal.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées groupées. Elles font l’objet d’observations régulières tout au long de l'expérience. De l'enrichissement (carrés de coton pour favoriser la nidation, barreaux de bois à ronger et tunnel) est systématiquement disposé dans toutes les cages. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux entreront en procédure doucement après habituation à l'expérimentateur et à la manipulation. Des points limites ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance. En cas de signe de mal- être, des décisions seront prises en accord avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique.

Choix des espèces

Nous ne pouvons pas utiliser un autre modèle que la souris car le gène d’intérêt ARTNL2 dont nous voulons connaître les caractéristiques comportementales physiologiques et/ou éventuellement physiopathologiques n’est inhibé actuellement que chez la souris. Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte (âge au moins 8 semaines) avec un système nerveux ayant atteint sa pleine maturité fonctionnelle.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de maladies neurodégénératives et neuromusculaires, elles reçoivent des injections de virus AAV, passent des tests de locomotion et de force musculaire répétés chaque mois pendant dix-huit mois, puis reçoivent une injection de pentylènetétrazole destinée à déclencher des crises d'épilepsie. Le porteur indique qu'une crise dépassant dix secondes entraîne une mise à mort immédiate et prévoit la mort de toutes les souris pour analyser leurs tissus. Il affirme qu'il est "indispensable" de disposer d'un modèle animal pour observer ces troubles à l'échelle de l'"organisme entier", hors de portée d'un modèle cellulaire.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier le phénotype locomoteur, la force musculaire et la survenue de crises d'épilepsie dans des souris modèles de maladies humaines neurodégénératives et neuromusculaires. Ces maladies sont dues à des anomalies de l’ADN qui entrainent une perturbation du fonctionnement des neurones et des muscles squelettiques des patients, conduisant à des altérations de leur locomotion et de leur mouvements (perte d’équilibre, tremblements, faiblesse musculaire, etc.), ainsi qu’à des crises d‘épilepsies. Nous souhaitons donc générer des modèles de souris pour ces maladies pour ainsi étudier leur phénotype locomoteur, leur force musculaire ainsi que leur susceptibilité à l’épilepsie. Pour cela nous effectueront une batterie de test non invasif de leur locomotion et de leur force musculaire, ainsi qu’un test de susceptibilité à l’épilepsie par injection d’une dose modérée de l’agent pro-convulsivant pentylènetétrazole (PTZ). La compréhension de l’effet de ces mutations sur le fonctionnement du cerveau et des muscles squelettiques nous permettra ainsi de mieux comprendre ce type de maladie chez l’homme et ainsi espérer découvrir des pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Nous avons besoin de modèles animaux pour reproduire et étudier les maladies à inclusion intranucléaire car il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier les symptômes neurodégénératifs, la faiblesse musculaire et les altérations de la locomotion caractéristiques de ces pathologies. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour étudier des altérations de la locomotion, de la force musculaire et des troubles neurodégénératifs (ataxie, tremblements, épilepsies, etc.). Enfin, l’expression de mutation humaine et la création de modèle de maladie est très bien maitrisée chez la souris. Nous souhaitons donc analyser l’altération de la locomotion et de la force musculaire et l’apparition de troubles neurodégénératifs, notamment d’épilepsie par un test de sensibilité à l’agent pro-convulsivant pentylènetétrazole (PTZ), dans des souris porteuses des mutations responsables de pathologies neuromusculaires et/ou neurodégénératives : les maladies à inclusions intranucléaires. En conclusion, le développement et l’analyse de ces nouveaux modèles murins nous permettront de mieux comprendre les mécanismes pathologiques de ces mutations. De plus, à l’avenir ces modèles animaux seront essentiels pour tester la pertinence de pistes thérapeutique pour le traitement de ces patients.

Procédures

1 – L’injection de produits anesthésiques (xylazine/kétamine) en intrapéritonéale requiert moins d'une minute. 2 – Les injections intramusculaires ou rétro-orbitaires de constructions adénovirales (AAV) requièrent entre 30 secondes et 1 minute par animal. 3 – L’analyse de la locomotion se fait par une batterie de tests non invasifs réalisés chaque mois et ceci sur une période de 18 mois. Ces tests s’étalent sur une durée de 2 semaines selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal. 4 – La mesure de la force musculaire est réalisée en 4 à 8 minutes sous anesthésie gazeuse par inhalation d’isoflurane (0,5 à 1,5% mélangé à de l’oxygène). Cette mesure est répétée chaque mois (mais en décalage de 15 jours avec les tests locomoteurs) et ceci sur une période de 18 mois. 5 – L’injection du pentylenetetrazole (PTZ) en intrapéritonéale requiert moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier des maladies neurodégénératives et neuromusculaires touchant les adultes, et ceci en utilisant un modèle animal, nous nous attendons donc à l’éventuelle apparition d’altérations locomotrices, de faiblesse musculaire et/ ou de signes neurodégénératifs (épilepsie, tremblements, etc.) chez ces souris. Toutefois, afin de limiter la douleur induite par les symptômes, nous n’étudierons que les premières étapes de l’apparition de ces symptômes et les animaux seront euthanasiés avant que la phase terminale de la maladie n’apparaisse. De plus, les tests locomoteurs que nous utiliserons pour évaluer l’apparition de ces altérations sont classiques, non invasifs et sans douleur. De même, il est à noter que la mesure de la force musculaire se fait tous sous anesthésie. Enfin, concernant le test de susceptibilité à l’épilepsie, suite à l’injection d’une dose modérée de pentylènetétrazole (PTZ), des crises myocloniques, myocloniques (contractions rapides et brutales des muscles), cloniques (spasmes rythmés) ou toniques (augmentation accrue du tonus musculaire ou raideur) peuvent éventuellement survenir. Toutefois, si une crise durait exceptionnellement plus de 10 secondes, l’animal serait immédiatement mis à mort pour éviter toute souffrance.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus (muscle, cerveaux, etc.) pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but l'étude de maladies neuromusculaires et/ou neurodégénératives causées par des mutations génétiques. Nous souhaitons comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de ces mutations et notamment leurs effets sur la locomotion, la force musculaire et l’apparition de troubles neurodégénératifs (ataxie, tremblements, etc.) avec notamment l’apparition d’éventuelles crises épileptiques typiques de ces maladies. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces mutations à l’échelle de l’organisme entier ; des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire ces troubles de la locomotion, de la force musculaire et/ou des crises épileptiques et apporter un même niveau d’information. De plus, nous avons établi précédemment que le modèle souris est un bon modèle animal d'étude de ces maladies.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents nous ont permis d’établir les doses de virus à injecter, les temps d'analyses et que l’étude de groupes de 10 animaux chacun permettait d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la présence de la mutation (comparaison des souris exprimant la mutation génétique versus des souris contrôles). Compte tenu de notre projet d’analyser les conséquences de mutations responsables de plusieurs maladies à inclusions intranucléaires à la fois sur les muscles squelettiques et les neurones du système nerveux central, nous estimons que l’étude d’environ 320 animaux sur 5 ans est nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. De plus, afin de limiter d’éventuelles douleur induite par l’apparition de symptômes locomoteurs, nous n’étudierons que les premières étapes de l’apparition de ces symptômes et les animaux seront euthanasiés avant que la phase terminale de la maladie n’apparaisse. Toutefois, si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. De plus, de la nourriture gélifiée sera de plus mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. Enfin, en cas de douleur forte (isolement, immobilité, automutilation, cachexie, etc.) et/ou d’échec des traitements précèdent ; les animaux seront euthanasiés rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience stoppée.

Choix des espèces

La souris est l'animal de choix pour l'études de mutations génétiques responsables de pathologies à l’échelle de l’organisme entier. Notre objectif est d'étudier l’importance de mutations responsables de maladies neuromusculaires et/ou neurodégénératives et plus précisément sur l’apparition d’altérations locomotrices, d’une faiblesse musculaire et/ou de crises d'épilepsies. Aucun modèle d’expérimentation in vitro ou cellulaire ne peut mimer ou refléter toute la complexité de ces mécanismes biologiques. Nous allons étudier le comportement locomoteur et la force musculaire chez des souris adultes, en effet les mutations que nous étudions s’expriment vers l’âge de deux mois, donc des souris sevrée et adultes. Enfin, nous suivrons le comportement locomoteur et la force musculaire de ces animaux sur une période de 18 mois suivie par un test de sensibilité au pentylènetétrazole (PTZ). Ce protocole a été choisi d’après l’étude de la littérature et afin de reproduire l’aspect progressif et neurodégénératif des maladies étudiées.

346 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 336 tuées à l'issue et 10 réutilisées comme femelles-stimulus. Elles sont soumises à un régime obésogène et à un mélange de phtalates, à des suivis de glycémie, à une ablation des ovaires puis à des tests comportementaux de cycle œstral, de lordose, de locomotion et de préférence olfactive. Le porteur indique que l'ablation des ovaires entraîne des douleurs post-opératoires et que gavages et injections provoquent un inconfort. Il précise que des mâles intacts sont utilisés pour les tests sans être comptés dans les effectifs, et conclut qu'aucune méthode alternative ne permet ces analyses comportementales et physiologiques.

Objectifs

Les facteurs externes ou environnementaux, tels que l'exposition à des perturbateurs endocriniens ou le régime alimentaire peuvent interférer avec les effets liés aux stéroïdes sexuels, issus des gonades, sur différents comportements et notamment avec les comportements de reproduction. Les phtalates, dont le principal est le DEHP (Di (2-éthylhexyl) phtalate), sont des perturbateurs endocriniens entrant dans la composition des plastiques et qui contaminent ainsi les aliments ou les produits d’hygiène et de cosmétique. L’exposition orale à l’âge adulte de souris femelles au DEHP, à des doses correspondant à une contamination environnementale, provoque une altération des comportements de reproduction. Ces effets sont associés à une modification des réseaux neuraux de l’hypothalamus impliqués dans le contrôle de ces comportements. Les données concernant l’influence du régime alimentaire, et plus particulièrement de l’obésité, sur les comportements de reproduction sont moins nombreuses bien que l’obésité soit souvent associée à un dysfonctionnement de l’axe hypothalamus-hypophyse-gonades. L’objectif de ce travail s’inscrit dans la perspective de créer un nouveau modèle de « malbouffe » des pays occidentaux en y intégrant les interactions entre le contenant (récipient plastique contenant des phtalates) et le contenu (alimentation riche en lipides et en sucres). Il s’agit d’explorer les effets comportementaux, moléculaires et cellulaires de l’association de ces deux types de perturbation environnementale : l’exposition à des perturbateurs endocriniens et le régime alimentaire obésogène/diabétogène.

Bénéfices attendus

Le projet se place dans la perspective d’étudier les conséquences d’une des caractéristiques du mode de vie occidental, les effets combinés de l'alimentation et des phtalates, sur la santé reproductive et son contrôle, dans un modèle murin adulte. Il permettra ainsi de faire émerger de nouvelles hypothèses concernant l’origine des altérations de la santé reproductive auxquelles sont confrontées les sociétés occidentales en combinant deux facteurs de l’exposome (régime alimentaire et exposition aux polluants chimiques).

Procédures

336 femelles seront soumises pendant 16 semaines à un régime obésogène/diabétogène et une exposition à un mélange environnementale de phtalates. Ce régime n’induit pas de nuisance particulière si l’accès à la nourriture et à la boisson n’est pas restreint. Ces souris seront soumises à des suivis de glycémie effectués par prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la queue (durée du suivi : 180 minutes maximum et 4 tests de tolérance au glucose et 4 tests de sensibilité à l’insuline répartis sur les 16 semaines de traitement). Parmi ces souris (240), ainsi que pour un groupe-stimulus (10), subiront une ovariectomie et une supplémentation en oestradiol et progestérone. La durée de la chirurgie est au maximum de 10 minutes et elle est pratiquée une seule fois. Les femelles d’étude sont soumises à différents tests comportementaux afin de suivre leur cycle oestral (1 frottis par jour de la semaine 12 à la semaine 16), et d’étudier les paramètres de leur comportement d’accouplement (2 tests de lordose de 30 minutes en semaines 12 et 14, 1 test de locomotion de 2h en semaine 13 et 1 test de préférence olfactive de 3 fois 10 minutes en semaine 15) avant d’examiner les modifications des structures cérébrales les contrôlant.

Impact sur les animaux

Lors des tests de tolérance au glucose le gavage oral peut engendrer un inconfort, tout comme l’administration d’insuline IP (douleur au point de piqure) lors des tests de sensibilité à l’insuline. Le suivi de la glycémie se fait par prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la queue qui peut engendrer une douleur légère et passagère au moment de l’incision. La procédure d’ovariectomie donne lieu à des douleurs post-opératoires. L’administration sous-cutanée de progestérone peut entrainer une légère douleur au point de piqure. Les souris-stimulus utilisées pour les expériences de comportement peuvent subir une légère douleur au point de piqure lors de l’anesthésie par voie IP.

Devenir

souris euthanasiées pour prélèvement de tissus et dosages biologiques (total : 336).

Remplacement

Il s'agit d'un projet comportant des analyses comportementales et des mesures de paramètres physiologiques : il n'est pas possible de le développer par des méthodes alternatives et/ou substitutives.

Réduction

Les effectifs (total : 346 femelles) ont été calculés au plus juste afin de pouvoir obtenir une analyse statistique significative le cas échéant, compte tenu de la variabilité interindividuelle. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide de tests pertinents. Cohorte 1 : 4 groupes de 8 femelles, expériences répétées 3 fois soit un total de 96 femelles Cohorte 2 : 4 groupes de 10 femelles, expériences répétées 3 fois pour l’étude des modifications protéiques et 4 groupes de 10 femelles, expériences répétées 3 fois pour l’étude des modifications des acides nucléiques, soit un total de 240 femelles. A ces deux cohortes expérimentales, s’ajoute un groupe supplémentaire constitué de femelles-stimuli (femelles ovariectomisées et supplémentées en œstradiol et progestérone) nécessaires au test de préférence olfactive : 10 femelles. Les procédures de comportement sexuel et de préférence olfactive nécessitent d'utiliser des mâles intacts : ce sont des mâles qui ne subissent aucune contrainte ; ils n’ont donc pas été inclus dans le décompte des animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des locaux ad hoc, respectant la Directive 2010/63/UE. Les animaux sont surveillés quotidiennement et tout signe de mal-être est immédiatement signalé aux responsables du projet qui prennent la décision sur leur devenir, en accord avec le vétérinaire référent si nécessaire. Dès leur arrivée, les animaux sont manipulés régulièrement. La durée du jeûne lors des tests de glycémie a été réduite afin de limiter l’hypoglycémie. Pour les animaux subissant une procédure chirurgicale, des points limites adaptés permettent de gérer la douleur post-opératoire.

Choix des espèces

La souris est le modèle choisi pour ces études : c'est un des modèles les mieux caractérisés pour les études métaboliques et il existe de nombreux outils biotechniques disponibles pour ce modèle animal (anticorps, lignées transgéniques...). Cela permet ainsi de comparer les résultats obtenus avec la littérature et d'affiner nos hypothèses de travail. Il s’agit d’une étude chez l’adulte.

504 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de sclérose latérale amyotrophique et de démence fronto-temporale par mutation de la protéine FUS, elles reçoivent des gavages et passent des tests moteurs et cognitifs répétés à quatre, huit, douze et seize mois, puis un examen des muscles sous anesthésie en fin de procédure. Le porteur indique que le gavage peut provoquer des fausses routes suivies d'une mise à mort immédiate, et prévoit la mort de toutes les souris pour analyser leurs tissus. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité comportementale et structurelle du système nerveux nécessaire à l'étude.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la démence fronto temporale (DFT) sont deux maladies neurodégénératives incurables encore mal comprises à ce jour. Nous avons dans notre laboratoire un modèle de souris qui mime ces maladies en reproduisant la mutation d’une protéine mutée (la protéine FUS) chez les patients. Après avoir valider notre nouveau modèle (objectif 1), nous voulons analyser l’effet de la mutation de FUS aussi bien sur la perte des neurones dans le temps (objectif 2) que son impact à l’échelle comportementale (objectif 3)..

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, un seul traitement est proposé aux patients atteints de SLA. Il s’agit du Riluzole, dont l’efficacité est très faible puisqu’il ne permet d’augmenter la durée de vie des patients que de quelques mois. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes en œuvre dans le développement et la progression de la SLA et de la DFT afin d’élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques qui pourraient aider à la mise en place de nouveaux traitements.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure d’administration par gavage à raison d’un gavage par jour, d’une durée maximale de 1 minute, durant une période de 5 jours. Les animaux suivront des tests moteurs (3 session de 3 minutes maximum, entrecoupées de phases de repos de 5 minutes) et des tests cognitifs. Le premier test dure 5 minutes, le second est composé de 4 sessions 5 minutes (entrecoupées de 8 minutes). Un troisième test est réalisé sur une période de 4 jours consécutifs, à raison de 4 essais par jour (durant maximum 1 minute chacun). Un quatrième sera réalisé sur une nuit et enfin le cinquième, sur une période de 5 jours, à raison d’un essai unique de 10 minutes par jour. Nous réaliserons ces différents tests de manière successive, en respectant des pauses d’un moins un jour entre chacun aux âges de 4 mois, 8 mois, 12 mois et 16 mois. L’examen du fonctionnement des muscles (EMG) durera environ 20 minutes et sera réalisée en fin de procédure, sur les souris endormies afin d’éviter toute souffrance.

Impact sur les animaux

Nous pourrions observer chez les souris traitées des fausses routes liées à l’administration du traitement par gavage mais aussi des signes de stress liés à la contention obligatoire pour réaliser ce geste de gavage. Nous pourrions également observer un léger stress causé par la passation des tests comportementaux. Nous avons mis en place des points précis et spécifique à chacun de ses risques pour sortir les animaux de la procédure en cas de besoin. Ainsi, après l’administration par gavage du traitement, nous réaliserons une évaluation scorée de l’état de la souris en remplissant la grille présentée en annexe 7. Nous évaluerons les items suivants (+ 1 point / - 1 point) : Prise/perte de poids, poils propres/sales, interaction/isolement, déplacement/prostration, respiration normale/sifflement. Si la somme des points est comprise entre 3 et 5, la souris sera replacée dans sa cage sans surveillance particulière, si la somme est comprise entre 1 et 3 points, nous demanderons un avis vétérinaire, si la somme est inférieure à 1, la souris sera mise à mort. En cas de fausse route, l’animal sera mis à mort immédiatement.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures car nous avons besoin d’étudier les tissus prélevés afin d’étudier les impacts au niveau microscopique (moléculaire, cellulaire et biologique) de notre intervention.

Remplacement

Ce projet a pour but de déterminer si le changement de la localisation de la protéine FUS dans la cellule (qui sort du noyau pour aller dans le cytoplasme chez les patients souffrant de SLA et de DFT) entraine 1) une perte des neurones dans le temps et 2) des troubles cognitifs et moteurs. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui récapitule à la fois la complexité comportementale (des comportementaux sociaux, des processus cognitifs) mais aussi celle structurelle du système nerveux (les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central) que l’on retrouve chez les patients atteints de ces maladies. Les modèles cellulaires ne nous permettraient de réaliser des études comportementales ni de reproduire cette complexité structurelle.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les études sur les muscles sur les mêmes animaux que ceux prévus pour réaliser les expériences histologiques et moléculaires. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude afin de valider les groupes expérimentaux et potentiellement réduite le nombre de groupes contrôles que nous utiliserons. Si cette étude pilote est validée sur ces deux aspects, nous pourrons réduire de plus de la moitié les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet.

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Les expérimentateurs en charge sont formés à chaque procédure et nous avons une très bonne connaissance du modèle utilisé. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal. Toutes les approches expérimentales que nous souhaitons utiliser dans ce projet sont couramment réalisées dans notre laboratoire, ce qui limite fortement les risques de perte de tissus pour des raisons purement techniques. Par ailleurs, la procédure d’étude du muscle sera réalisée sous anesthésie gazeuse afin de réduire toute souffrance de l’animal et de réduire le stress lié à la manipulation.

Choix des espèces

Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau et de la moelle épinière adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives et motrices qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes (début de l’expérience à 2 moi et fin prévue à 17 mois) car les patients souffrant de SLA liée à FUS présentent très rarement des formes juvéniles. Nous avons décidé d’étudier aussi bien les femelles que les mâles car les deux maladies qui nous intéressent touchent de la même manière les hommes et les femmes.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris SAMP8 modèles de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent une supplémentation en butyrate, des gavages, des prélèvements de sang à la queue et des mesures du transit digestif, puis des tests comportementaux de mémoire visuelle et de motricité. Le porteur signale une perte de poids propre à cette lignée et indique que gavages, prises de sang et tests peuvent générer stress et douleur. Il affirme que l'étude du lien intestin-cerveau au cours du vieillissement ne peut aujourd'hui se faire que sur un modèle animal, faute de reproduire cette complexité in vitro.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) touche plus de 40 millions de personnes dans le monde. Il n’existe aucun traitement efficace pour prévenir, ralentir ou guérir la maladie. Elle est invalidante et mortelle, entraînant une perte progressive des neurones au niveau du cerveau, notamment des régions impliquées dans la mémoire. Un des signes majeurs de la maladie d'Alzheimer est l’accumulation dans le cerveau d’un bout de protéine appelé Abeta qui à la longue empêche une bonne communication entre les neurones. Plusieurs études montrent que les patients atteints de la MA ont également des altérations digestives (eg. constipation) pouvant se manifester de façon très précoce, longtemps avant qu’apparaissent les premiers signes affectant le cerveau. Ces défauts de transit gastro-intestinal suggèrent que la MA toucherait aussi bien le cerveau que l’intestin. L’intestin est composé de neurones régulant les fonctions digestives. Par ailleurs, il a également été montré que les atteintes intestinales augmentent le risque de développer une forme sévère de la maladie. Il a aussi été mis en évidence que les patients atteints de la MA souffrent de manière fréquente d’une altération du tapis microbien tapissant l’intestin et d’une baisse associée de métabolites provenant de ces microbes tel que le butyrate. De plus, le butyrate a été montré comme étant bénéfique au bon fonctionnement des neurones de l’intestin et du cerveau. Dans ce contexte, améliorer le fonctionnement des neurones de l’intestin pourrait améliorer la fonction de transit intestinal et ainsi prévenir des formes graves de MA. De nombreuses études ont mis en évidence le rôle important de la nutrition dans les processus de mémoire. Au vu de tous ces éléments, améliorer le tapis microbien de l’intestin ou des métabolites qu’il produit, tel que le butyrate, peux avoir un impact positif sur les fonctions de l’intestin et la mémoire dans la MA.

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif lié à l’âge représente un véritable enjeu pour améliorer la santé et la qualité de vie des personnes âgées. De plus, améliorer les capacités cognitives est reconnu comme une stratégie visant à réduire le risque de développer des pathologies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer. Favoriser la communication des neurones du cerveau par l’alimentation peut avoir des effets bénéfiques sur le vieillissement normal ou pathologique (Maladie d’Alzheimer) du cerveau. D’autre part, le vieillissement du cerveau est aussi associé à des altérations au niveau intestinal dont la cause pourrait être le vieillissement/ altération des neurones. Dans ce contexte, améliorer les mécanismes de communication neuronale dans le cerveau pourrait aussi impacter ceux de l’intestin et vice-versa. De plus, de nombreuses études ont mis en évidence le rôle important de la nutrition dans la régulation des performances cognitives (AGCCs : acides gras à courte chaine, acides aminés, vitamines). De manière intéressante, la flore intestinale et ses métabolites peuvent eux aussi impacter ces fonctions. Les AGCC sont naturellement synthétisés par le microbiote, principalement dans le colon et leur rôle central non seulement dans le métabolisme neuronal mais aussi la modulation de gènes impliqués dans la connectivité neuronale. De plus, d’autres études ont mis en évidence les effets bénéfiques du butyrate sur la communication des neurones du cerveau avec amélioration de la mémoire. Néanmoins, leur capacité à prévenir les altérations au niveau intestinal et leur mode d’action reste inconnu à ce jour et fait l’objet de cette étude.

Procédures

Après 4 mois et 6 mois de traitement, pour tous les animaux, nous effectuerons des études des fonctions digestives en évaluant le temps de transit colique (durée max 30 min) et total jusqu’à 6 heures avec addition d’eau (temps de transit total) , ainsi que la perméabilité intestinale in vivo et le nombre de fèces émises. L’objectif est de mesurer le temps de transit oro-anal et de calculer le nombre de fèces émises sur 2 heures. Ainsi les fèces émises seront collectées toutes les 15 minutes sur deux premières heures pour le temps de transit colique. Deux heures après gavage, un prélèvement d’un échantillon de sang à la queue (sur animal vigile) est réalisé (durée 30 sec). Après 6 mois, tous les animaux réaliseront des tests comportementaux (mémoire visuelle et motricité d’une durée de 10 à 30 min individuellement).

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effets indésirables n’est reporté dans la littérature concernant la supplémentation alimentaire en butyrate ou l’Inuline. Il est cependant important de noter une perte de poids des souris SAMP8 par rapport aux contrôles qui est indépendant de la supplémentation envisagée. Cette perte serait liée à une altération du métabolisme chez ces souris et qui est observable dès la naissance. Stress et douleur peuvent être générés par différentes expérimentations (gavage, prélèvements de sang ou tests comportementaux).

Devenir

Mise à mort de toutes les souris à l’issue des procédures. Des prélèvements terminaux seront réalisés pour des études sur des protéines, des ARN et des marquages sur des tissus.

Remplacement

L’étude du lien entre les systèmes nerveux central et entérique, dans un contexte de vieillissement physiopathologique, nécessite une étude comportementale qui ne peut, à ce jour, se réaliser que sur un modèle animal. De plus, le vieillissement et le développement de la maladie d’Alzheimer mettent en jeu différents systèmes cellulaires (neurones de l’intestin, neurones du cerveau, flore microbienne intestinal, système immunitaire ...) dont la complexité d’interaction ne peut être modélisée par une approche in vitro et justifie l’utilisation de modèles animaux afin de disséquer cette complexité d’interaction des acteurs impliqués et d’identifier les mécanismes sous-jacents associés.

Réduction

Les travaux réalisés in vitro sur des cultures de neurones de l’intestin nous ont permis d’identifier le butyrate comme métabolite d’intérêt et de réduire significativement le nombre d’animaux qu’il aurait fallu pour examiner les effets potentiellement bénéfiques de plusieurs métabolites bactériens. Parallèlement, des expérimentations similaires menés chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de faire des calculs de puissance statistique et ainsi de sélectionner le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir une significativité avec une erreur de 0,05 et une puissance de 80%.

Raffinement

Les animaux seront hébergés collectivement dans des cages avec frisottis et tunnels ou dômes plastiques transparents rouges. Ils seront observés quotidiennement. Le poids et l’état d’hydratation seront surveillés 3 fois par semaine si le score reste inférieur à 1 Si, selon les tables des points limites, le score venait à augmenter, la surveillance du poids et de l’hydratation seraient quotidienne voir 2 fois par jour pour des scores de 1 à 2. Si le score devait être de 3, les souris recevraient un analgésique par voie sous-cutanée, 1 fois par jour. Pour un score de 4 les souris seraient mises à mort

Choix des espèces

Les souris SAMP8 sont un bon modèle de la maladie d’Alzheimer car ne présentant aucune introduction de nouveaux gènes pour induire des signes de la maladie. De plus, étant un modèle naturel/spontané sans surexpression de gènes, il se prête mieux à des expériences de traitement à but thérapeutique comme la supplémentation avec du butyrate et/Inuline envisagé dans le projet. Les travaux menés au sein du laboratoire ont également montré qu’il est pertinent pour l’étude du rôle de l’intestin dans la MA. Les souris SAMP8 et leur modèles contrôles (SAMR1) seront utilisées dès l’âge de 3 semaines et supplémentées de façon quotidienne avec de l’eau sans supplémentation ou de l’eau contenant du butyrate (supplémentée ou non avec de l’Inuline) jusqu’à l’âge de 6 mois. Ces âges ont été retenus au vu de la littérature scientifique concernant la cinétique d’apparition des altérations au niveau de l’intestin ou du cerveau. Les souris SAMP8 et SAMR1 seront utilisées à l’âge de 3 semaines et hydratées de façon journalière avec de l’eau sans supplément (contrôle) ou de l’eau contenant du butyrate jusqu’à l’âge de 6 mois. Ces âges ont été retenus pour nos expériences car des études montrent que les symptômes intestinaux commencent vers 1-2 mois et les symptômes cérébraux vers l’âge de 6 mois. Etant donné que le projet vise à évaluer l’effet préventif du butyrate, les âges retenus permettent de baliser l’apparition de ces symptômes.

100 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des approches anti-inflammatoires sur le cerveau par microscopie à deux photons. Chaque animal subit une chirurgie crânienne de deux heures puis trois séances d'imagerie sous anesthésie, certaines recevant une lésion inflammatoire au cortex, un implant délivrant du dihydrogène ou une stimulation magnétique transcrânienne. Le porteur indique que la stimulation peut causer de petites hémorragies cérébrales, que les chirurgies présentent un risque infectieux et que les souris peuvent aggraver leurs plaies, avant d'être tuées pour les analyses. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro d'un "cerveau complexe vivant" pour ces mécanismes.

Objectifs

Objectif 1 : Analyser les effets anti-inflammatoires du dihydrogène sur la neuro-inflammation. Objectif 2 : Valider un ciblage spécifique sur les sites de neuro-inflammation. Objectif 3 : Analyser les effets de la stimulation magnétique transcrânienne sur le cerveau.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus des projets sont multiples : objectif 1, valider ou pas l'effet du dihydrogène sur la diminution de la neuro-inflammation. La neuro-inflammation est associée a beaucoup de neuropatologies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson. Pour cette derniere , il a déjà été observé une ameliorations de symptomes chez les rats Parkinsoniens. Objectif 2 ,valider un ciblage spécifique sur les sites de neuro-inflammation. Objectif 3: analyser les effets de la stimulation magnétique transcrânienne sur le cerveau. Ces effets sont à eviter chez l'homme, sauf dans le cas ou nous avons besoin transitoirement du passage d'un médicament.

Procédures

Toutes les souris subiront une chirurgie cérébrale sous anesthésie générale pendant 2 heures. Et, également sous anesthésie générale, 3 séances d'imagerie cérébrale sous microscope précédées d'une injection intra-veineuse d'agent de contraste, durant un maximum de 3 heures. Lors de leur chirurgie, pendant quelques secondes, certaines souris subiront une induction inflammatoire à l'aide d'une aiguille de biopsie à la surface du cortex cérébral. Certaines souris se verront implanter en sous-cutané dans le dos d'un électrolyseur délivrant du dihydrogène (chirurgie implantatoire de quelques minutes sous anesthésie générale). Enfin, quelques souris seront soumises pendant 30 minutes à un champ magnétique en disposant une bobine électrique au-dessus de leur tête.

Impact sur les animaux

Nous pouvons causer des petites hemoragies cérébrales lors de la stimulation magnétique transcrânienne. Les chirurgies présentent un risque infectieux. Les souris peuvent agraver leurs plaies en se blessant.

Devenir

La mise à mort des animaux est necessaire pour faire les analyses immunohistochimiques quantitatives de la neuroinflammation.

Remplacement

Il n'y a pas de remplacement possible avec des modèles in vitro ou in silico. La complexité des reactions neuro-inflammatoires in vivo ne permet pas de les étudier in vitro . Il n'existe pas de modèle in vitro d'un cerveau complexe avec les interactions intercellulaires et cellulaires-vasculaires en place. De ce fait, les mécanismes étudiés dans un cerveau vivant ne peuvent être analysés que dans un organisme complexe vivant.

Réduction

Les animaux sont suivis dans le temps par imagerie pour reduire leur nombre par groupe expérimental. Les nombres d’animaux par groupe ont été fixés en tenant compte d'une part de la complexité de la chirurgie et des implantations et d'autre part de la variabilité inter-individuelle. On utilisera les tests statistiques pour le calcul du nombre d'animaux minimum permettant l'obtention de résultats significatifs.

Raffinement

Le projet est mis en oeuvre en suivant toutes les règlementations en vigueur : animalerie agréée, personnel formé et autorisation de projet validée. Les animaux seront hébergés individuellement dans un environnement enrichi et contrôlé et observés régulièrement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. La fréquence de surveillance des animaux sera adaptée à la temporalité de l'expérience, impliquant si nécessaire l'arrêt des expérimentations. Si les points limites sont atteints : 1) Perte de poids , Perte de poids 5% > 10%> 20%, score 1/2/3 2) Etat du pelage, de la peau et des yeux, manque de soins / lesions, score 1/2, Grattage/ infection/ Ulcération / inflammation chronique, score 1/2/3/, adminstration d'une crême apaisante. 3) Mobilité anormale: claudication/ inactivité/ prostration , score 1/2/3. 4) Fèces liquides, score 1 5) respiration , anomalies, score 2. Score limit = 3, adminstration d'un antalgique dans le biberon systématique en post-chirurgie. S'il n'y a pas d'amélioration de l'état de la souris en 24h , elle sera sacrifiée sans demande d'autorisation au responsable scientifique du projet. Les différents gestes chirurgicaux et toutes les séances d'imagerie sont réalisés sous anesthésie et analgésie générale et locale. La méthode chirurgicale la moins invasive sera retenue pour le bien-être animal, comprenant la sévérité des suites opératoires. Il y a un traitement antalgique (Carprofène) suite aux chirurgies dans toutes les procédures expérimentales selon les conseils de notre vétérinaire référent. Les animaux pourront être vidéosurveillés en continue si nécessaire (surtout en post-opératoire) grâce à la mise au point d'une caméra infra-rouge. Bien que génétiquement modifiée, le transgène étant transmis de façon systématique et stable, les souris seront identifiées par tatouage sans geste plus invasif.

Choix des espèces

L'espèce animale retenue correspond au modèle le plus pertinent pour la modalité d'imagerie utilisée : la microscopie intra-vitale. De plus, nous avons besoin d'un modèle in vivo qui exprime des cellules immunitaires rendues fluorescentes telles que chez une souris transgénique existante. Nous utilisons les souris adultes (> 6 mois ) pour faire une chirurgie osseuse sur la boîte cranienne. Ces operations ne sont pas possibles sur une souris en croissance pour laquelle la bôite cranienne n'est pas à sa taille definitive.

210 rats et 24 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur provoque une douleur inflammatoire de la patte par des stimulations thermiques ou mécaniques répétées, ou une douleur post-opératoire par incision et sutures, avec un risque d'automutilation de la plaie. L'objectif est de tester des nanomédicaments à base d'enképhalines contre la douleur, une partie des animaux étant tuée pour doser les substances dans le sang. Le porteur affirme que la complexité de la douleur rend le recours à l'animal "incontournable" et présente le rat comme l'espèce "de référence".

Objectifs

La morphine et les opioïdes synthétiques apparentés sont les analgésiques les plus largement utilisés mais leur utilisation est associée à des effets secondaires graves, tels que la dépression respiratoire, l'accoutumance et la dépendance. Dans ce contexte, les enképhalines, qui sont des opioïdes existant naturellement dans le corps humain, sont une option intéressante car elles jouent le rôle d’une morphine endogène, inhibitrice de la douleur mais sans effets secondaires. Cependant, l'utilisation des enképhalines a toujours été limitée car elles sont rapidement dégradées après leur injection dans la circulation sanguine. Ainsi, la conception de systèmes d'administration les protégeant de la dégradation et leur permettant d'atteindre leur cible pour délivrer leur action est un objectif ambitieux. Notre équipe a développé une nouvelle approche de nanomédecine permettant la protection des enképhalines. La preuve de concept a été faite sur un modèle classique de douleur inflammatoire chez le rat et l’étude a montré que les nanomédicaments contenant les enképhalines ont protégé la substance active qui s’est accumulé au site de la douleur et a montré une action analgésique périphérique. Cette étude préliminaire est très encourageante et une des voies d’amélioration de l’activité analgésique des enképhalines repose sur l’augmentation de leur stabilité par l’utilisation de médicaments qui empêche leur dégradation (appelés inhibiteurs d’enképhalinases) et ainsi prolonger encore leur durée de vie et donc leur action anti-douleur. Notre objectif est de tester cette piste d’amélioration en développant de nouveaux médicaments à base d’inhibiteurs des enképhalinases pour booster la concentration en enképhalines et traiter efficacement et durablement la douleur.

Bénéfices attendus

La douleur représente un important défi sanitaire mondial en raison de l'absence relative de traitement efficace, en particulier pour soulager la douleur neuropathique. Actuellement, les médicaments les plus puissants et les plus fréquemment utilisés pour soulager la douleur sont la morphine et les opioïdes de synthèse. Toutefois, leur utilisation chronique est associée à de graves inconvénients, tels que la dépression respiratoire, la tolérance et la dépendance. Chaque jour, plus de 130 personnes aux États-Unis meurent après une surdose d'opioïdes. Il existe donc un besoin important de médicaments antidouleur efficaces dépourvus d’effets secondaires. L’objectif de ce projet est le développement de nouveaux traitements innovants de la douleur. Les enképhalines qui sont des opioïdes naturellement existants dans le corps humain représentent un moyen prometteur d'atténuer la sensation de douleur, sans les effets secondaires de la morphine. Cependant, leur dégradation rapide une fois administrés limite leur utilisation clinique. Ainsi, la conception de nanosystèmes d'administration de médicaments protégeant les enképhalines de la dégradation et leur permettant d'atteindre les récepteurs opioïdes situés dans le système nerveux périphérique (effet local et non central) est un objectif majeur. Cette nouvelle approche permettrait de lutter contre la crise des opioïdes qui a englouti l'Amérique, et d’autres pays dans une moindre mesure, dans une vague d'addiction et de décès par overdose.

Procédures

Pour le modèle de douleur inflammatoire au niveau de la patte, le rat subira 2 injections, d’une durée de quelques secondes, sous anesthésie générale. La voute plantaire des pattes arrière du rat sera soumise une douzaine de fois (toutes les 30 minutes environ) à un stimulus thermique ou mécanique, qui va déclencher le retrait spontané de la patte, l’animal n’étant pas contraint. La procédure durera au maximum 24h. Pour le modèle de douleur post-opératoire, le rat ou la souris subira une incision qui sera refermée avec 2 points de suture sous anesthésie générale (durée de l’intervention : 5 minutes). Pour la pharmacocinétique, chaque rat sera soumis à une injection et à 4 ou 5 prélèvements de sang sur 24 ou 48 h. Ces gestes seront réalisés sous anesthésie à l’isoflurane et dureront moins d’une minute. Pour la biodistribution, chaque souris sera soumise à une injection unique de traitement et sera suivi en imagerie à différents temps sur une période de 24h. Les injections et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale et dureront moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Le modèle d’inflammation de la patte induira une douleur locale modérée pendant 3 à 8 h avec une réduction de la motricité mais sans autres manifestations comportementales notables. La voute plantaire des pattes arrière du rat sera soumise à un stimulus thermique, qui va déclencher le retrait de la patte. La douleur reste modérée car les animaux ont la possibilité d'échapper à la stimulation en retirant leur patte, l’animal n’étant pas contraint. Le modèle de douleur post-opératoire, équivalent à la suture d’une plaie superficielle aux urgences de l’hôpital sous anesthésie locale, induira une douleur locale pendant 2 à 3 jours avec un pic de douleur à 24h. Une éventuelle infection au site d’incision ou une désunion de la cicatrice seront à surveiller ainsi que des comportements d’automutilation au niveau de la plaie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures, soit parce que l’étude est terminée et qu’ils ne pourront pas être ré-utulisés dans une autre procédure, soit pour réaliser des prélèvements sanguins pour doser les substances actives dans le plasma.

Remplacement

La douleur est un phénomène très complexe. C’est une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, associée à une lésion tissulaire. Le stimulus générant la douleur va activer les terminaisons nerveuses de neurones spécialisés dans la perception de la douleur. Ce signal se propage ensuite le long des fibres nerveuses jusqu’à la moelle épinière et le cerveau. Il existe dans le cerveau et la moelle un puissant système de contrôle de la douleur qui fait notamment intervenir des endorphines et régule le transfert des informations douloureuses en provenance de la périphérie. Cette complexité est actuellement impossible à modéliser in vitro ou in silico et le recours à l’animal est incontournable pour évaluer nos nanomédicaments sur la douleur. Le rat constitue un bon modèle d’étude de la douleur car il possède une organisation nerveuse comparable à celle de l’homme. Les modèles de douleur inflammatoire sont validés par la communauté internationale (International Association for the Study of Pain, IASP)

Réduction

Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé à l’aide d’un logiciel de statistique qui permet de déterminer le nombre juste et minimal d’animaux qui garantira la validité statistique de l’étude. Un plan d’expérience a été construit afin de réduire au maximum le nombre d’animaux. Les animaux seront répartis dans les groupes expérimentaux de manière aléatoire. L’attribution des traitements se fera en simple aveugle pour éviter les biais expérimentaux. Si les traitements innovants testés ne présentent pas l’effet analgésique escompté l’étude s’arrêtera là. Pour l’étude de pharmacocinétique, afin de réduire le nombre d’animaux, plusieurs prélèvements sanguins seront réalisés sur le même animal dans la limite du volume maximal prélevable en 24h. L’étude de biodistribution se fera en imagerie par fluorescence ce qui permettra un suivi longitudinal des animaux et de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La semaine précédent la mise en place du modèle, les rats seront manipulés tous les jours et habitués aux gestes de la procédure afin de minimiser le stress le jour de la procédure expérimentale. Les injections, lesprélèvements et la chirurgie se feront sous anesthésie générale associée quand cela est possible à une anesthésie locale (quand pas d’interférence entre le traitement et l’anesthésique). Notre modèle de douleur inflammatoire et post-opératoire induit une douleur modérée dans la patte qui est raisonablement bien supportée par l’animal. Dans les tests utilisés pour évaluer la sensibilité nociceptive, l’animal n’est pas contraint pendant les mesures et l’intensité de la stimulation est progressivement augmentée jusqu’à une valeur minimale seuil pour déclencher la réaction nociceptive et donc le retrait de la patte. La stimulation n’est jamais poursuivie au-delà. Pour des raisons scientifiques évidentes, les anti-douleurs et les anti-inflammatoires ne peuvent pas être utilisés. Toutefois, une grille de score permettra de suivre l’état général des animaux et de définir des points limites qui seront strictement appliqués. Les animaux seront stabulés en groupes sociaux, dans un environnement enrichi afin de favoriser un comportement naturel.

Choix des espèces

Cette étude sera effectuée sur des rats car c’est l’espèce de référence dans la littérature pour les études sur la douleur. Les rats sont calmes, faciles à manipuler et s’acclimatent progressivement à l’expérimentateur. L’étude de biodistribution sera menée sur des souris afin de pouvoir réaliser une étude longitudinale en imagerie de fluorescence, les rats étant trop grands pour être imagés en entier dans l’appareil d’imagerie. Nous utiliserons des rats et des souris adultes car la population cible est adulte.