Système nerveux
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Rôle de l’activité électrique dans la maladie de Charcot
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
511 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, la plupart tuées à l'issue et vingt-sept gardées en vie pour la reproduction. Porteuses d'un modèle de maladie de Charcot, elles reçoivent une injection de vecteur viral dans le cerveau ou la moelle et subissent deux tests moteurs mesurant force et coordination. Le porteur indique que les animaux perdent du poids et de la mobilité, et sont mis à mort avant la paralysie totale des membres. Il affirme que le modèle murin reproduit les traits de la maladie et qu'une approche sur cellules souches humaines est "à ce jour impossible".
Objectifs
La maladie de Charcot ou sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative rare caractérisée par la dégénérescence des motoneurones de la moelle épinière qui innervent les muscles. La perte des motoneurones conduit à la paralysie des membres, puis au décès par détresse respiratoire. Au cours de la progression de la maladie, les premiers motoneurones touchés sont ceux impliqués dans l’effort intense (motoneurones vulnérables) alors que les posturaux résistent à la maladie (motoneurones résistants). Un des enjeux majeurs est de comprendre les mécanismes responsables de la perte sélective des motoneurones. Pour aborder cette question, nous avons séquencé l’ARN des motoneurones impliqués dans la posture et de ceux impliqués dans l’effort bref et intense. A partir des banques d’ARN, nous avons sélectionné un gène dont l’expression est spécifique des motoneurones impliqués dans les efforts musculaires intenses. Ce gène contribue au transfert d’information entre neurones et neurones-muscles : la neurotransmission Sa délétion chez la souris n’induit pas de phénotype locomoteur. La souris modèle de la maladie de Charcot utilisée dans le projet est très bien caractérisée et reproduit les traits cliniques de la pathologie. L’effet de la perte du gène candidat sera évalué sur la progression de la maladie. Ce projet a une pertinence médicale directe en abordant la question de la vulnérabilité et la résistance dans les maladies des motoneurones.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d’explorer de nouvelles pistes thérapeutiques en ciblant les acteurs responsables de la vulnérabilité des motoneurones vis-à-vis de la maliadie de Charcot. Notamment, réduire spécifiquement l’excitabilité des motoneurones est une approche qui permettrait de prolonger et/ou d’améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Afin de suivre l’évolution des capacités motrices des souris atteintes de la maladie de Charcot, les animaux seront suivis par des tests comportementaux simples, non invasifs, ne nécessitant pas de déprivation de nourriture. Deux tests comportementaux moteurs seront ici utilisés pour définir les capacités motrices et les propriétés de coordination motrice. Chaque test prend moins de 5 min par souris. Notre étudions l’expression de gènes candidats participant au processus de dysfonctionnement des neurones moteurs. A cette fin, une préparation des tissus est nécessaire avant de procéder à la biopsie. Nous procédons donc à une perfusion intra-cardiaque sur des animaux anesthésiés ayant reçu une dose léthale d’anesthésique/analgésique chimique. Cette procédure prend moins de 5 min par animal. Les souriceaux recevront une seule injection de vecteur viral en intracerébroventriculaire et les souris agées de 30 jours recevront une seule injection virale en intrathécal.
Impact sur les animaux
Le modèle rongeur de la maladie de Charcot que nous utilisons récapitule les principaux traits de la pathologie humaine et a fait l’objet de nombreuses études nous permettant de connaître très précisément leur tableau clinique. Les nuisances attendues sont une perte de poids, une mobilité réduite .Les animaux sont euthanasiés avant la paralysie totale des membres (quand le temps de retourment de l'animal mis sur le dos est supérieur à 15 secondes) et donc avant la détresse respiratoire (qui n'a jamais été observée dans le modèle rongeur).
Devenir
27 animaux seront en utilisation continue pour la reproduction. Tous les autres seront euthanasiés pour répondre à deux nécessités du projet : 1) prélever des tissus afin d’étudier des paramètres histologiques. 2) l’autre nécessité est liée à la pathologie elle-même, qui est fatale chez l’homme et également dans le modèle murin de la maladie de Charcot utilisé ici, et rentre dans le cadre de l’étude de l’approche thérapeutique sur l’espérance de vie des souris qui auront reçu ou non le traitement.
Remplacement
Le modèle murin de la maladie de Charcot mime l’ensemble des traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques de la maladie humaine et la validation fonctionnelle et le protocole thérapeutique pré-clinique que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles animaux de la maladie. De même notre stratégie ciblée sur les sous population de motoneurones spinaux est à ce jour impossible sur des cellules souches humaines pluripotentes induites, car ce modèle in vitro ne permet pas de reproduire la diversité fonctionelle électrique et synaptique des populations de motoneurones de la moelle épinière.
Réduction
Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes d’animaux. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et limiter les faux-positifs. Pour les cohortes de suivi de la progression de la maladie : N= 24 souris par condition (12 males et 12 femelles). Pour les analyses histopathologiques, N = 8 souris par condition (4 males et 4 femelles) .
Raffinement
Une connaissance extensive du modèle murin de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différentes étapes de la maladie et donc de normaliser le suivi des animaux. Une surveillance régulière est mise en place et assurée par les expérimentateurs et nous travaillons étroitement avec la structure du bien-être animal. L’enrichissement du milieu avec des copeaux dans les litières, igloo, PVC et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à fournir un environnement non stressant propice au repos. Les points limites sont définis par le suivi régulier du poids des souris et leur capacité à effectuer une tache motrice reflexe simple. Un arbre décisionnel spécifique est défini et suivi par les expérimentateurs associés au projet. De plus une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse ou de douleur est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée. Une grille d’évaluation définie par la structure du bien-être animal nous permet de suivre les animaux ainsi identifiés et de prendre rapidement des mesures adaptées.
Choix des espèces
La lignée de souris transgénique modèle de la maladie de Charcot qui est utilisée dans ce projet récapitule la progression rapide de la pathologie, ce qui est le plus souvent observée en clinique. De plus ce modèle reproduit les traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie, à savoir la perte précoce des motoneurones impliqués dans les efforts musculaires intenses. Nous avons identifié un gène marqueur des motoneurones vulnérables dans la maladie de Charcot et qui pourrait intervenir dans les fonctions d’effort musculaire. Nous allons induire la perte de fonction de ce gène chez la souris modèle de la maladie de Charcot et suivre l’effet sur la progression de la maladie. Les cohortes utilisées pour l’analyse de la progression de la maladie sont suivies à différentes étapes de la maladie (non symptomatique, début de la maladie et symtomatique) jusqu’au point limite défini pour ce modèle de la maladie de Charcot (environ 4.5 mois pour des animaux sans traitement).
Neuroimagerie moléculaire et fonctionnelle d’oligonucléotides antisens chez le rat et la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 281
588 animaux non-humains, 307 souris et 281 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart reçoivent une injection d'oligonucléotides antisens dans le liquide céphalo-rachidien ou le cerveau, suivie de séances d'imagerie TEP ou ultrasonore sous anesthésie et, pour certains, d'une chirurgie d'amincissement du crâne. Le porteur mentionne des tests comportementaux chez soixante rats sans en préciser la nature, et signale des risques de paralysie, d'œdème et d'ataxie. Il justifie l'usage de deux espèces par le besoin de disposer de données chez le rat comme chez la souris pour de futurs candidats-médicaments.
Objectifs
Il existe aujourd’hui plus de 5 000 maladies neurologiques rares qui touchent près de 350 millions de personnes dans le monde. 70% d’entre elles se manifestent pendant l’enfance et la majorité ne dispose d’aucun traitement. La plupart de ces maladies orphelines présentant une origine génétique, il est envisageable d’utiliser des traitements ciblant la cause génétique de ces maladies. Les oligonucléotides antisens (ASOs), qui sont capables d’interagir spécifiquement avec l’ARN messager, ont montré des résultats prometteurs pour certaines de ces maladies, mais atteignent très difficilement le système nerveux central. La voie intrathécale (consistant à injecter ces agents directement dans le liquide céphalo-rachidien) a montré de meilleurs résultats, mais cette voie reste encore méconnue. Il est nécessaire de réaliser des études dédiées afin de mieux comprendre comment obtenir une diffusion dans le cerveau et un effet thérapeutique optimal des ASOs après injection intrathécale. Afin de répondre à cette problématique, nous souhaitons développer et évaluer chez le rat et la souris des techniques d’imagerie qui permettront de mesurer la distribution et l’effet d’ASOs dans le cerveau par voie intrathécale. La mise en place de tels outils est cruciale pour guider le développement préclinique et clinique de futurs candidats-médicaments ciblant l’ARN dans les maladies neurologiques. Nous évaluerons la possibilité de marquer directement des ASOs à l’aide d’isotopes radioactifs ou de groupements chimiques fluorescents, permettant leur visualisation directe, respectivement en imagerie par tomographie par émission de positons (TEP) ou par microscopie. Nous utiliserons également des approches d’imagerie indirectes qui permettront d’étudier l’intensité et la durée des effets spécifiques des ASOs sur des cibles et mécanismes moléculaires.
Bénéfices attendus
Les besoins thérapeutiques liés aux maladies du système nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels, en particulier les maladies orphelines génétiques. Les oligonucléotides antisens ont le potentiel de traiter efficacement ces maladies mais leurs propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques ne sont pas suffisamment connues, en particulier par voie intrathécale. Cette étude sera donc très importante à la fois pour le développement préclinique (et à plus long terme, clinique) des ASOs en apportant des informations inédites.
Procédures
La quasi-totalité des animaux (237 rats sur 281 et 249 sur 307 souris) recevra une injection intrathécale (au niveau des lombaires, entre les méninges dites de l’arachnoïde et de la dure-mère, afin d’atteindre le liquide céphalo-rachidien), sous anesthésie et analgésie locale (10 minutes). Les autres animaux (44 rats et 58 souris) recevront une injection intracérébrale, également sous anesthésie et analgésie générale et locale (1h). Ensuite, les animaux pourront : - soit n’être exposés à aucune autre nuisance à part une anesthésie terminale nécessaire au prélèvement du cerveau (total de 179 rats et 115 souris), - soit être utilisés pour une ou plusieurs sessions d’imagerie de TEP sous anesthésie d’une durée d’une heure (total de 72 rats, dont 60 recevront également des tests comportementaux pendant 70 minutes le lendemain de chaque imagerie, et 36 souris) ou de 2 à 6 heures (30 rats et 30 souris) - soit être utilisés pour une ou plusieurs sessions d’imagerie ultrasonore sous anesthésie (1h), la première session étant précédée la veille par une chirurgie d’amincissement du crâne (30 min) sous anesthésie et analgésie (96 souris) - soit être utilisés pour plusieurs sessions d’imagerie fUS éveillée (30 min) puis imagerie TEP sous anesthésie (20 min), avec une première chirurgie (30 min) sous anesthésie et analgésie de pose d’un chapeau nécessaire à l’imagerie éveillée (quelques jours avant la première session), suivie d’une période d’habituation progressive aux sessions d’imagerie en tête-fixée sur une à deux semaines (sessions d’habituation de 5 minutes les premiers jours à 1 heure le dernier jour), puis d’une seconde chirurgie d’amincissement du crâne (30 min) sous anesthésie et analgésie la veille de la première session (30 souris).
Impact sur les animaux
La procédure d’injection par voie intrathécale peut s’accompagner d’effets indésirables tels une paralysie ou une fuite de liquide céphalo-rachidien entraînant un œdème. Certains ASOs sont susceptibles d’entraîner des symptômes d’anxiété, ou des troubles moteurs de type ataxie, voire une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux à la fin de la procédure seront mis-à-mort afin de permettre diverses analyses histologiques ou moléculaires du tissu cérébral.
Remplacement
L’objectif de l’étude est de mieux comprendre la biodisponibilité et l’effet d’oligonucléotides antisens administrés par la voie intrathécale, et ne peut donc pas être atteint avec des modèles in vitro. La voie intrathécale étant assez invasive et peu d’ASOs étant à ce jour validés pour une utilisation clinique, il est nécessaire de réaliser cette étude chez l’animal.
Réduction
Selon notre expérience en termes de variabilité et de taille d’effet sur ces données d’imagerie, le nombre d’animaux par groupe pour les techniques d’imagerie in vivo a été estimé à 8 sur la base d’un calcul de puissance statistique. Nous prévoyons 2 animaux supplémentaires par groupe en prenant en compte la possibilité d’échec de l’injection dans le liquide céphalo-rachidien (le taux de succès de l’injection étant rapporté autour de 80% dans la littérature). Pour les groupes de validation préliminaire des ASOs par stéréotaxie ou les approches ex vivo telles que l’autoradiographie ou la microscopie, les groupes de 3 à 6 animaux seront constitués étant donné les besoins statistiques plus limités pour ces analyses et la meilleure résolution spatiale de ces techniques. Concrètement, les données expérimentales générées seront traitées à l’aide de tests de Student ou d’analyse de variance à deux dimensions (two-way ANOVAs), selon les paramètres évalués, ou de tests non paramétriques équivalents, en fonction de la distribution normale ou non de nos données. Dès lors que la question expérimentale le permet, les mêmes animaux seront étudiés pour plusieurs sessions d’imagerie, permettant une réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les injections seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie locale. Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille de score et des points limites adaptés prenant en compte les éventuels troubles liés à l’injection intrathécale, voire aux troubles liés à la baisse d’expression des protéines étudiées dans les procédures 2 et 3. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et la mise à mort de l’animal serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boites ou cylindres et nourriture en pâtée après la chirurgie.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont deux espèces utilisées très régulièrement dans le développement préclinique de médicaments en général, et pour modéliser des pathologies du système nerveux central. Nous souhaitons donc obtenir des informations pertinentes chez les deux espèces qui seront utiles par la suite lors de l’évaluation de candidats-médicaments ASOs dans des modèles rongeurs d’intérêt, qui pourront être le rat ou la souris en fonction des pathologies. Adulte, afin d’étudier les mécanismes de biodistribution des ASOs sur des cerveaux pleinement développés.
Etude de l’effet de la pollution par les plastiques comme facteur de risque d’une maladie du cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intra-nasales d'un dérivé de plastique, le DEHP, jusqu'à quarante-quatre injections par animal sur cinq mois, puis passent des tests de locomotion, de mémoire de reconnaissance et de localisation d'objets et de mémoire spatiale. Le projet cherche à établir si ce phtalate aggrave une maladie du cerveau modélisée chez la souris. Le porteur qualifie l'inconfort de léger et affirme qu'aucune alternative cellulaire ne peut remplacer le recours à l'"animal entier".
Objectifs
Les molécules comme le DEHP (phtalate) sont des produits chimiques synthétiques largement utilisés dans de nombreux produits plastiques de consommation courante. Ils ne sont pas chimiquement liés aux polymères plastiques et sont facilement libérés dans l'environnement. Des études récentes rapportent pour la première fois une contribution potentielle du DEHP à une maladie du cerveau chez l’Homme (la maladie à corps de Lewy). L’objectif de ce projet est de déterminer si les dérivés de plastiques (comme le DEHP) représentent un facteur de risque d’une maladie du cerveau, en tant que polluants environnementaux. Cette maladie est modélisée chez le rongeur (souris), et ce projet vise à tester l’effet du DEHP sur le comportement des animaux et d’étudier les mécanismes mis en jeu. Nous avons choisi le mode d'administration intra-nasal car nous pensons que l'entrée par la voie respiratoire imitera mieux l'influence environnementale de la toxicité du DEHP chez les humains. De plus, il a été démontré que ce mode d'administration permet d'obtenir une délivrance rapide et concentrée au cerveau. Une étude pilote visera tout d’abord à définir la dose de phtalate qui sera administrée aux souris saines ou modèles de la maladie, permettant la détection cérébrale de ces produits (et dérivés) dans le cerveau après injection. Un phénotypage comportemental et un phénotypage moléculaire et cellulaire seront ensuite réalisés suite à l’administration chronique de DEHP. Les objectifs sont de comprendre si le DEHP aggrave la maladie en touchant des paramètres impliqués dans la progression de la pathologie, ainsi que les fonctions de mémoire.
Bénéfices attendus
En utilisant des modèles animaux de pathologies humaines, cette étude permettra de mettre en évidence si l’administration d’une molécule dérivée de plastique présent dans de nombreux produits usuels, le DEHP, représente un facteur de risque dans une maladie du cerveau (maladie à Corps de Lewy). De plus, nos études montreront également si cette molécule affecte le cerveau de l’animal sain. La mise en évidence d’un lien de cause à effet permettra de comprendre certains aspects cliniques chez l’Homme. Ainsi, ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles permettront d’adapter de nouvelles thérapeutiques chez l’Homme. En apportant des bases mécanistiques à leur mode d’action, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales de l’effet toxique de ces molécules sur le cerveau. Ainsi, ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles dévoileront des pistes pour la mise en garde contre certaines toxicités environnementales. Elles permettront de mettre en place des politiques de prévention. Enfin, ce projet comprend les analyses sur les souris mâles et femelles. Le DEHP est un perturbateur endocrinien et a des effets différents sur les deux sexes, avec notamment une baisse de la testostérone chez le mâle. En apportant une analyse complète des différences entre mâles et femelles, ce projet apportera donc un bénéfice sur la compréhension de mécanismes spécifiquement liés au sexe, dans la toxicité cérébrale de DEHP, mais aussi dans les facteurs de risque de la maladie.
Procédures
72 souris vigiles adultes (6 mois) recevront des injections (5 secondes) à raison de 1X/jour pendant 6 jours. 216 animaux vigiles recevront des injections (5 secondes) à raison de 2X/semaine pendant 5 mois (22 semaines), soient 44 injections par animal. Comportement réalisé sur 72 animaux vigiles sur une période de 41 jours/animal, période durant laquelle les animaux sont hébergés en cage individuelle pour tester leur locomotion (2 nuits et 3 jours), leur mémoire de reconnaissance et de localisation d’objets (15 minutes par essais, 2 essais/jours, 5 jours) et enfin test de mémoire spatiale à long terme (1 minute/essai, 4 essais/jours, 6 jours) suivis d’1 test après 24h (1 minute/animal) et 21 jours (1 minute/animal). Les souris transgéniques modèle de maladie développent des déficits mnésiques à l’âge de 12 mois.
Impact sur les animaux
Les procédures exécutées ne provoqueront qu'un inconfort léger liées au stress de la contention des souris au moment de l’administration de molécule. L’inconfort ne durera que très peu de temps, juste pendant et après l’injection. Selon notre hypothèse que le DEHP représente un facteur de risque de la MCL, nous attendons une aggravation de la pathologie. Les animaux pourraient présenter des signes de détresse si une forte toxicité du DEHP devait se répercuter au niveau systémique. Cependant, la littérature ne documente pas ce type d’effet aux doses testées dans ce projet chez des souris adultes. Les études de comportement pourront induire du stess aux animaux.
Devenir
Tous les animaux (288) seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un traitement pharmacologique, il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes incluant mâles et femelles, soit 18 souris/groupe (9 mâles et 9 femelles) pour le comportement et 12 souris/groupe (soit 6 mâles et 6 femelles) pour les approches moléculaires et 24 souris/groupe (soit 12 mâles et 12 femelles) pour l’imagerie cérébrale. L’efficacité de chaque traitement sera effectuée à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs fait tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, pour toutes nos analyses, nous utiliserons à la fois des animaux mâles et femelles dans nos expériences de manière à ne pas biaiser nos résultats, et les sexe ratios seront conservés entre les différents groupes.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des animaux, ceux-ci bénéficieront de soins appropriés pour optimiser le bien-être des souris, tels que des éléments d’enrichissement (matériel de construction du nid, barre à ronger) et d’un suivi quotidien. De plus, ils seront maintenus en groupe sociaux, sauf pour la durée des tests de comportement où ils seront isolés (1/cage). Dans ce cas, plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation. Les souris seront manipulées à l’aide de tubes spécifiques pour réduire le stress lors des changes (permet de nettoyer les cages sans toucher la souris). Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance si un problème devait survenir après l’administration de molécule DEHP: la surveillance des souris se fait à chaque instillation, soit 2X par semaine (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture) et elles sont pesées avant chaque administration de molécule, permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors de l’administration des molécules. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie.
Choix des espèces
Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront utilisés à l'âge de 7 mois au début du projet et seront analysés à l'âge adulte de 12 mois, ce qui correspond environ à la moitié de la vie d’une souris en laboratoire. Nos études antérieures ont montré que cela correspond au moment où les premiers signes de déficits mnésiques apparaissent dans ces modèles. De plus, ces modèles permettent de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuro-anatomiques comparables à celles du cerveau humain.
Etudes préliminaires des mécanismes d’action sous-tendant l’effet anti-épileptique de GAO-3-02
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
730 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur déclenche pharmacologiquement, sur animal vigile, soit une crise convulsive généralisée suivie pendant trente minutes puis interrompue par la mise à mort, soit un état de mal épileptique arrêté au bout de trente minutes. Tous les rats sont tués pour prélever leur cerveau et mener des analyses ex vivo. Le porteur revendique un "besoin fort" de nouveaux antiépileptiques et affirme que ni les modèles in vitro ni in silico ne peuvent reproduire les crises et les comportements associés.
Objectifs
Les épilepsies regroupent un ensemble de syndromes neurologiques se caractérisant par des crises pouvant se manifester sous des formes diverses, allant des absences aux convulsions. Leur origine peut être génétique mais le plus souvent elle est associée à une agression cérébrale sévère initiale, telle qu'un traumatisme crânien, une infection, ou un état de mal épileptique (EME). Bien qu’une épilepsie puisse se manifester à tout moment de la vie, les pics d’occurrence sont observés avant l’âge de 20 ans et après 60 ans. Plus de 20 médicaments sont disponibles pour contrôler les crises. Toutefois, un patient sur trois continue d’en faire malgré la prise de médicaments, et un grand nombre de ceux dont les crises sont contrôlées par ces médicaments se plaint de comorbidités affectant gravement leur qualité de vie. Il existe donc un besoin fort et urgent de développer de nouveaux candidats médicaments permettant non seulement de contrôler les crises pour ceux qui ne répondent pas aux médicaments, mais aussi de réduire le degré d’inconfort qui compromet une bonne observance thérapeutique. Le candidat médicament CM1 a été récemment développé pour répondre aux besoins non satisfaits des patients. Il s’agit d’un candidat-médicament de nature lipidique, dont le mode d’action diffère totalement des anti-épileptiques classiques. Il possède des effets anti-crises d’épilepsie (occurrence d’une seule crise) et des effets anti-épileptiques (occurrence de plusieurs crises spontanées), tout en protégeant certaines fonctions cognitives. Ces observations ont été réalisées dans le cadre d'un projet précédent. Des études in vitro et ex vivo ont montré : 1) que les effets anti-crises pouvaient passer par une augmentation des processus réduisant l’activité cérébrale ; 2) que l’activation d’un récepteur particulier, appelé ici CM1-R1, pouvait potentiellement être responsable des effets bénéfiques du CM1 ; et 3) que le CM1 pouvait modifier le profil lipidique cérébral. Les objectifs de ce projet sont d'apporter des réponses: 1) quant aux mécanismes par lesquels le CM1 augmente la réduction de l’activité neuronale ; 2) sur l’implication du récepteur CM1-R1 et d’un homologue R2 sur les mécanismes décrits en (1) ; 3) quant aux effets du CM1 sur les mécanismes de neurotransmission GABAergique et Glutamatergique, et l’implication de 2 récepteurs dans ces effets ; et enfin 4) sur les modifications de la composition lipidique cérébrale induites par le CM1.
Bénéfices attendus
Les épilepsies constitutent la seconde maladie neurologique après la migraine, et affectent près de 70 millions de personnes dans le monde. De nombreux traitements existent, mais malgré cela, près d’un tiers de patients continuent de faire de crises malgré la prise de ces traitements. En outre, parmi les personnes qui répondent aux traitements existants, le ralentissement de l’activité cérébrale qu’ils entrainent constitue un effet secondaire fortement handicapant pour une grande part d’entre elles, réduisant de ce fait l’observance du traitement. II est donc impératif de poursuivre le développement de nouveaux traitements, capables non seulement de réduire le nombre de crises ou leur sévérité, mais aussi de maintenir, voire même d’améliorer les capacités cognitives (mémoire). Le projet s’appuie sur le développement d’un potentiel candidat médicament, CM1, dont il a été montré qu’il exerce une activité anti-crise, anti-épileptique et cela sans altérer, voire même en améliorant, les capacités cognitives. L’objectif de ce projet est d’apporter des premiers mécanismes d’action in vivo de cette molécule, étape indispensable à la poursuite du développement de ce potentiel candidat médicament.
Procédures
Dans la procédure n°1, les animaux utilisés seront des rats soumis à un processus de déclenchement unique d’une crise convulsivante généralisée aiguë, induite pharmacologiquement. Les rats sont obligatoirement vigiles, car dans le cas contraire, aucune crise ne pourrait être induite. Dans les procédures 2 à 4, les animaux utilisés seront des jeunes rats soumis à un état de mal épileptique induit pharmacologiquement. Cette induction pharmacologique se fait sur animal vigile. L’état de mal est stoppé au bout de 30 min. Dans les procédures 2 et 4, il est important de chasser le sang des capillaires sanguins de tout l’organisme, en particulier le cerveau.
Impact sur les animaux
Le projet repose sur 4 procédures, réalisées sur le rat. Pour la procédure n°1, les crises d’épilepsies généralisées, de classe sévère, seront suivies sur une période n’excédant pas 30 minutes, au-delà desquelles les rats seront euthanasiés. Les rats développent en général les premières crises tonico-cloniques généralisées (GTCS) dans les 10-20 minutes qui suivent l’administration de l'agent convulsivant. Si le traitement testé a un effet pro-convulsivant, les rats développeront en moyenne les GTCS avant les 10 premières minutes. Au contraire, si le traitement a un effet anti-crise, les GTCS apparaitront après 20 minutes. Ce modèle, très bien standardisé au niveau international, n’excède pas 30 minutes ; en effet, on considère que l’effet protecteur est total quand aucune GTCS n'est observée dans les 30 minutes qui suivent l’administration de l'agent convulsivant. Les procédures 2 à 4 seront réalisées chez le rat après un état de mal épileptique (EME, série de crises convulsivantes en continu sur 30 minutes) induit pharmacologiquement à l’âge de 21 jours. A l’issue des 30 min d’EME, il sera stoppé pharmacologiquement. L’EME induit une douleur de type sévère pendant 3 à 5 jours, pendant laquelle aucun analgésique ne peut être administré en raison du blocage provoqué sur le processus même de développement d’une épilepsie. Sur ces 3 à 5 jours, durant lesquels le poids est contrôlé quotidiennement, les ratons ont une activité réduite, avec dos voussé.
Devenir
Pour la procédure n°1, les rats auront tous été soumis à un protocole d’induction d’une crise convulsivante généralisée. Ils seront tous mis à mort pour éviter de prolonger un état épileptique. Pour les procédures n°2 à 4, les cerveaux de tous les animaux seront prélevés, soit pour des études histologiques, biochimiques ou électrophysiologiques ex vivo.
Remplacement
Compte tenu du fait que les épilepsies regroupent une diversité de syndromes, il existe à ce jour très peu d’alternatives permettant d’évaluer les différents aspects de la pathologie sur des modèles in vitro ou ex vivo. De plus, l’analyse de comportements complexes, comme ceux de l’anxiété et de l’apprentissage spatial, et de surcroît la manifestation de crises épileptiques ne peuvent être appréhendées au niveau préclinique autrement qu’in vivo chez des vertébrés, et ne peut aujourd’hui être remplacée par des méthodes alternatives in vitro ou in silico.
Réduction
Ce projet impliquera l’utilisation d’un total de 730 rats sur une durée de 5 ans. Ce nombre d’animaux a été réduit au minimum tout en ne compromettant pas l’atteinte des objectifs de l’étude. Il a été déterminé à l’aide d’outils statistiques, en tenant compte des résultats d’études antérieures (notamment de la variabilité observée) dans le laboratoire sur ces mêmes modèles. Pour les procédures 1 et 2, des étapes GO/NOGO ont été mises en place. En effet, elles ont pour objectifs d’évaluer l’implication de 2 récepteurs potentiels du candidat médicament testé dans les effets observés. Nous commencerons par tester l’effet du récepteur R1. Si tout l’effet du candidat médicament passe par ce récepteur R1, alors les expérimentations visant à étudier l’implications de R2 ne seront pas réalisées.
Raffinement
Les animaux mâles arriveront suffisamment tôt pour permettre une semaine d'acclimatation avant le début des procédures. Leur poids sera suivi hebdomadairement, et les animaux seront soumis à une surveillance attentive à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être, pour limiter au maximum stress et douleur, et apporter des soins adaptés, le cas échéant. Plus spécifiquement, pour la procédure n°1, qui dure au maximum 30 minutes, la mise à mort de l’animal sera réalisée dès qu’il a atteint la première crise convulsivante généralisée. Pour les procédures n°2 à 4, l’état de mal épileptique induit par la pilocarpine (Pilo-EME) entraîne une souffrance sévère sur les 3 à 5 premiers jours, avec perte de poids pouvant atteindre 25%. Afin de favoriser le recouvrement, nous maintenons les ratons avec la femelle nourricière jusqu’au terme de ces 5 jours (26 jours d’âge). En outre, nous massons quotidiennement l’abdomen des ratons pour stimuler à nouveau le transit intestinal, temporairement interrompu par l’administration de scopolamine (antagoniste des récepteurs muscariniques centraux et périphériques). Depuis que nous avons introduit ces deux améliorations, le taux de survie des ratons est passé de 75% à 95%.
Choix des espèces
L’ensemble des données antérieures de l’équipe a été obtenu sur des rats Sprague-Dawley. L’utilisation de la même souche de rat nous permettra de comparer les données de ce projet avec celles des études antérieures de l’équipe. Enfin, chaque fois que cela est possible, le rat est choisi à la souris du fait qu’il est physiologiquement, génétiquement et morphologiquement plus proche de l’humain. En outre, son répertoire comportemental, notamment au regard de certaines compétences cognitives, le rend plus pertinent que la souris. Nous travaillons sur des ratons jeunes (3 semaines), car la grande majorité des cas d’épilepsie acquise (non génétique) chez l’humain se déclare chez le jeune de moins de 20 ans.
Rôle des interneurones corticaux de la couche 1 chez la souris (Mus musculus)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par voie intrapéritonéale cinq jours durant, des vecteurs viraux insérant des gènes, des chirurgies crâniennes sous anesthésie, puis sont fixées environ une heure, vigiles, pour des enregistrements électrophysiologiques pendant des stimulations. Le porteur mentionne des complications rares comme infections, douleurs chroniques ou baisse de température, et tue toutes les souris pour des prélèvements post-mortem. Cette recherche fondamentale sur les circuits du cortex vise à éclairer des maladies comme la schizophrénie ou l'autisme, le porteur affirmant qu'aucune lignée cellulaire ne reproduit la physiologie des neurones.
Objectifs
Les déficits cellulaires, les connexions et les circuits du cerveau sont responsables de nombreuses maladies graves telles que l'épilepsie, la schizophrénie, l'autisme et la dépression. Le cortex cérébral, qui est la partie du cerveau responsable des fonctions cognitives complexes, intègre les informations sensorielles. Cela se fait grâce à des interactions précises entre différents types de cellules du cerveau. Notre projet de recherche vise à comprendre comment ces cellules du cortex cérébral se connectent les unes aux autres et comment ces connexions contribuent aux changements dans le fonctionnement du cerveau, qui sont perturbés dans les maladies cérébrales. Nous nous concentrons en particulier sur une couche spécifique du cortex appelée couche superficielle 1 (L1), qui joue un rôle clé dans l'intégration des informations sensorielles et contextuelles. Les cellules spécifiques de cette couche, appelées interneurones L1, ont différentes caractéristiques structurelles et fonctionnelles. Cependant, nous ne savons pas encore comment ces différentes populations de cellules interneuronales contribuent à l'intégration des informations contextuelles avec les stimuli sensoriels. Nous avons découvert que de nombreux neurones de la couche L1 expriment un récepteur appelé récepteur cannabinoïde de type 1 (CB1), qui joue un rôle important dans les changements des connexions inhibitrices entre les cellules du cerveau. Ces changements pourraient avoir un rôle clé dans la transmission des informations contextuelles vers la couche L1 lors du traitement sensoriel. Nous supposons que les sous-groupes de neurones CB1-positifs et CB1-négatifs dans la couche L1 sont activés de manière différente par des informations contextuelles provenant de différentes voies du cerveau, ce qui influence la flexibilité du traitement sensoriel. Notre projet se concentre sur le cortex visuel des souris. Nous espérons que cette recherche nous aidera à mieux comprendre les mécanismes spécifiques des circuits neuronaux impliqués dans la perception sensorielle, ce qui pourrait conduire au développement de nouvelles thérapies pour le traitement des maladies cérébrales.
Bénéfices attendus
Les maladies du cerveau ont un impact important sur la santé, l'autonomie, l'éducation, l'emploi, la mobilité et les relations personnelles des individus, ce qui représente un fardeau considérable sur le plan social et économique. Il est crucial de comprendre les caractéristiques de base qui régissent les connexions entre les différents types de neurones dans le cerveau, tant dans des états normaux que pathologiques. En particulier, les problèmes liés au développement des circuits inhibiteurs du cortex cérébral sont impliqués dans des troubles neurologiques tels que la schizophrénie, la dépression et l'autisme. Cependant, nous avons encore beaucoup à apprendre sur l'organisation des microcircuits inhibiteurs, notamment dans la couche L1, aussi bien dans des conditions normales que dans des troubles. Nous espérons que ces études nous aideront à découvrir de nouvelles approches thérapeutiques pour ces maladies. En utilisant des souris génétiquement modifiées, nous pourrons cibler des types spécifiques de cellules et de réseaux, ce qui nous permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques des maladies du cerveau.
Procédures
Toutes les souris seront injectées avec du tamofixen par voie intrapéritonéale (IP) au stade adulte (3 min/animal) pendant 5 jours. Une partie des souris transgéniques recevra une insertion de gènes au stade adulte en utilisant des vecteurs viraux. Toutes les souris seront recevront un traitement anti-douleur (3 min/animal). Les souris sont anesthésiées pour les chirurgies (30-40 min/animal). Une autre partie des souris recevra une insertion de gènes en utilisant des vecteurs viraux couplé à un système qui permettra soit l’imagerie soit les enregistrement électrophysiologiques (40 à 60 min /animal). Pour les enregistrements en électrophysiologie, les souris seront préparées sous anesthésie (pendant 15 min) puis réveillées pour être vigiles au moment des stimulations qui engendrent des activités neuronales, sujets de nos études. Les enregistrements nécessitent la fixation de l’animal pendant environ 1h, des séances d’habituation sont prévues pour préparer l’animal (1h). Toutes les souris seront injectées avec une injection d’un anti-inflammatoire par voie sous-cutanée (3 min/animal) et anti-douleur (3 min/animal), 30 min après seront anesthésiées pendant toute la durée de la chirurgie (30-40 min/animal). Une autre partie de souris transgéniques adultes subiront insertion de gènes par vecteurs viraux, et couplé à un système qui permettra soit l’imagerie soit les enregistrement électrophysiologiques. Toutes les souris seront injectées avec une injection d’un anti-inflammatoire par voie sous-cutanée (3 min/animal) et anti-douleur (3 min/animal), 30 min après seront anesthésiées pendant toute la durée de la chirurgie (30-40 min/animal). Pour les enregistrements électrophysiologiques, le jour de l'expérience, les souris seront brièvement anesthésiées (15 min/animal) et une électrode à haute densité sera descendu pour permettre l'enregistrement électrophysiologique. Le jour de l’euthanasie tous les souris seront injectées avec l’analgésique (3 min/animal) 10 min avant l’euthanasie (3 min/animal).
Impact sur les animaux
Le génotype des souris que nous utilisons n'a pas été associé à des effets indésirables connus sur les animaux. En général, nos interventions sont bien tolérées par les souris et n'affectent pas leur apparence ou leur comportement général. Cependant, il peut arriver très rarement que certaines complications se produisent, telles que des infections, des douleurs chroniques (visibles par une prostration, un mauvais ou un manque de toilette, une posture voutée), des saignements pendant les chirurgies ou une baisse de température pendant la procédure. Bien que beaucoup plus rares, il est également possible que les fils utilisés lors des chirurgies se détachent. L'injection intrapéritonéale de tamoxifène doit être réalisée sur une période de 5 jours. Ces injections sur 5 jours peuvent provoquer un certain stress lié à la manipulation de l'animal et des réactions locales possibles. Il est possible que l'administration d'injections pendant 5 jours consécutifs entraîne une légère perte de poids chez l'animal. Cependant, dans les heures qui suivent la chirurgie, il est possible que l'animal présente une réduction de l'activité spontanée. L'expérience de stimulation visuelle nécessite que l'animal soit éveillé et maintenu immobile, tandis que plusieurs essais de stimulations visuelles lui sont présentés. Cela nécessite une période d'adaptation à l'environnement d'enregistrement. Lors des deux premières séances, les animaux peuvent présenter des signes de stress tels que la présence de déjections sur le tapis roulant circulaire. Cependant, ces signes diminuent au fur et à mesure des séances à mesure que l'animal s'habitue à son environnement. Il est important de surveiller attentivement les souris tout au long de ces procédures et de signaler tout problème ou changement anormal à l'équipe de recherche.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasies en fin d’experience. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Il n’y a pas d’autres alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car des modèles adéquats du circuit cortical contenant le nombre, les types et la localisation appropriés de récepteurs dans les réseaux excitateurs et inhibiteurs ne sont pas disponibles. L'objectif de nos expériences est de découvrir les actions des gènes, des neuromodulateurs et des médicaments sur les circuits neuronaux dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie des neurones des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, De plus, il n'existe aucun modèle remplaçant l'utilisation d'animaux qui permettrait d'étudier les propriétés du reseau dans le cerveau entier d’un animal vigile.
Réduction
Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (n = 1650) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux recevront les injections virales seront implantés pour l'électrophysiologie ou l’imagerie simultanément afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur le même animal. Toutefois, les avantages de la réutilisation des animaux seront mis en balance avec les effets négatifs sur leur bien-être, en tenant compte du cumul sur toute une vie de l'animal. En outre, notre expertise dans l'entraînement des souris à être fixé par la tête dans l'installation d'imagerie ou d'électrophysiologie réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon, et donc la signification statistique, dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton, kraft et maisonnettes) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront suivies, auprès du comité interne de l'institution, chargé de la prise en charge du Bien-être animal (strutucture chargée du bien-etre animal) . Les animaux auront à manger et à boire à volonté. Des croquettes adaptées à la gestation et à l’allaitement seront mise à disposition pour les animaux en accouplement. Des points limites sont mis en place et sont respectés pour limiter toute souffrance aux souris utilisées
Choix des espèces
Les propriétés de base des microcircuits neuronaux chez la souris sont similaires à celles d’autres mammifères. Actuellement seulement les modeles murins nous permettent de visualiser les types d’interneurones que nous voulons étudier. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et les portées sont importantes, permettant de produire suffisamment d’animaux pour plusieurs expériences à partir de peu de fondateurs. Le développement du cerveau est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Nous maitrisons suffisamment les techniques proposées dans ce projet pour réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour nos expériences. Les lignees que nous utiliserons ne présentent pas de phenotype dommageable. Des animaux adultes seront utilisés pour toutes les procédures (entre P35 et P150). Toutes les procédures nécessitent des interventions chirurgicales qui ne peuvent être pratiquées que sur des animaux adultes. Nos animaux sont identifiables par tatouage des phalanges et un petit prélèvement de l’extrémité de la queue est nécessaire à leur génotypage.
Evaluation de nouveaux traceurs d’imagerie dans un modèle murin de glioblastome sous-cutané chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une tumeur de glioblastome est greffée sous leur peau, puis elles reçoivent un traceur d'imagerie par voie intraveineuse sous anesthésie avant une séance d'imagerie de trois heures. Le porteur signale que la tumeur peut entraîner une perte de poids et des signes de souffrance comme le poil hérissé ou la prostration, une perte de plus de 15 % du poids déclenchant la mise à mort. Toutes sont tuées pour des analyses d'immunohistochimie, le porteur affirmant qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'"animal entier" pour étudier la biodistribution.
Objectifs
Nous travaillons sur le développement de nouveaux traceurs d’imagerie qui permettront d’explorer in vivo les 2 enzymes clés intervenant dans le métabolisme du tryptophane. Chez l’humain des perturbations de ce métabolisme, présent dans un grand nombre de tissus et cellules, sont associées à une très large diversité de pathologies, du cancer aux affections du système nerveux central. Ces perturbations se traduisent le plus souvent par une augmentation de l’expression de ces enzymes. Leur détection in vivo a donc un fort potentiel d’applications cliniques telles que la détection de tumeurs ou le développement de stratégies thérapeutiques visant à moduler cette expression. Des radiotraceurs dérivés du tryptophane utilisables en imagerie ont déjà été proposés pour de telles applications, mais leur utilisation est limitée notamment pour des raisons de complexité du radiomarquage. Une alternative est de développer de nouveaux traceurs issus non pas du tryptophane mais de composés (petites molécules) se liant aux enzymes impliquées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier de nouveaux traceurs d’imagerie capables de se lier spécifiquement à deux enzymes majeures du métabolisme du tryptophane. Après une caractérisation plus précise de leurs propriétés, ces traceurs pourraient être proposés pour le diagnostic, le suivi et le traitement de nombreuses affections cancéreuses ou neurologiques.
Procédures
injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse suivi d’une imagerie de 3h, 1 fois par animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables peuvent être des dommages liés au développement de la tumeur sous-cutanée, soit une perte de poids de 15% , soit une modification de la physiologie ou du comportement . Dommages pouvant être liés à l’imagerie : chute de la température corporelle (diminution de 2°C et inférieur à 35°C), la respiration, les battements cardiaques des animaux. Un hématome peut se former suite à la cathéterisation de la veine caudale de l'animal. Des signes de souffrance (poils hérissés, prostration, …).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des études d'immunohistochimie complémentaires aux études d'imagerie.
Remplacement
L’objectif du projet étant de développer un traceur d’imagerie utilisable chez l’humain, aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donnée la complexité des processus mis en jeu, et ne permet d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable pour l'étude de la biodistribution/ciblage de nouvelles sondes d'imagerie.
Réduction
L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo au cours de ce protocole va permettre de réduire le nombre d’animaux utilisé qui est néanmmoins dicté par les groupes expérimentaux réquis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. La première étude permet grâce à l’imagerie d’évaluer la cinétique du radiotraceur de manière continue. Les moyennes de captation du traceur dans la tumeur et les différents tissus seront comparés entre les 3 groupes d’animaux en utilisant des tests statistiques appropriés au projet . Nous prévoyons d’inclure un total de 14 animaux/groupe (3 groupes), afin de garantir un nombre minimum exploitable de 10/groupe en raison de la probable hétérogénéité de la taille des tumeurs entre les animaux au sein d’un même groupe, et les difficultés imprévues pouvant survenir au cours des sessions d’imagerie (par exemple injection i.v. du traceur, problème d’anesthésie). Nous envisageons donc d'inclure 8 animaux/ traceur pour définir la cinétique puis 50 animaux/ traceur pour mesurer l'accumulation dans les tumeurs. Nous estimons à 5 le nombre de traceurs testés au cours de ce projet soit un total de 250 animaux.
Raffinement
Dès leur arrivée, les souris seront hébergées en portoir ventilé afin d’empêcher le phénotype dommageable lié à l’immunodéficience. Elles seront hébergées en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Elles seront observées une à 2 fois par jour et des points limites prédictifs (perte de poids >15% du poids initial, nécrose de la tumeur, détérioration de l'aspect général, de la physiologie clinique ou de la locomotion) nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance avant la session d’imagerie. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort. Avant l'imagerie, les animaux auront une phase d'habituation à l'environnement de la pièce pour éviter le stress lors de l'imagerie. Pour l’imagerie, les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse: cuve d’induction puis maintien pendant toute la durée de l'imagerie . Une protection occulaire sera appliquée pendant toute la durée de l’imagerie (3 h). Nous appliqerons également une crème anesthésiante sur la queue de l’animal lors de l’installation du cathéter à la veine caudale. L’animal sera maintenu durant toute l’expérimentation sur un tapis chauffant. Nous assurerons une surveillance continue du rythme respiratoire et de la température corporelle de l’animal et le surveillerons jusqu’à son réveil complet.
Choix des espèces
Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imagerie in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la biodistribution/le ciblage de nouvelles sondes d'imagerie. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.
Effet de la Fluoroethylnormemantine (FENM) à long terme sur un modèle pharmacologique de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur induit une maladie d'Alzheimer par injection intracérébrale d'un peptide amyloïde, administre une molécule chaque jour par voie intrapéritonéale, puis évalue la mémoire par le labyrinthe en Y, le test d'évitement passif avec un stimulus aux pattes, la reconnaissance du nouvel objet et le test du Hamlet. Toutes les souris sont ensuite tuées pour des analyses biochimiques post-mortem. Le porteur affirme le modèle murin "indispensable" et "seul recours in vivo" pour observer l'effet de la molécule sur la mémoire.
Objectifs
Ce projet a pour but d'évaluer l'effet de la Fluoroethylnormemantine (FENM) à long terme sur des modèles de rongeurs de la maladie d'Alzheimer (MA). Une étude préliminaire a démontré l'efficacité supérieure de la FENM en comparaison de la Mémantine (médicament utilisé pour la prise en charge des patients atteints par la MA). Cependant l'effet de la Mémantine est connu pour son manque d'éfficacité dans le temps et ses nombreux effets secondaires. C'est pourquoi la FENM a été testée en comparaison de la Mémantine dans un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer sur 2 mois de traitement. Contrairement à la Mémantine où après 1 mois de traitement son efficacité est nulle, la FENM maintient le processus de mémorisation des animaux traités et cela même après un arrêt de traitement. Afin de compléter ses résultats et dans l'objectif d'un développement clinique de la molécule, la FENM sera administrée sur deux modèles de rongeurs de la MA après un traitement à la mémantine pour juger de sa supériorité dans le temps par rapport au médicament de référence. De plus l'efficacité de la FENM sera évaluée après un traitement à long terme dans un milieu reproduisant les comportements naturels des animaux afin cette fois-ci d'évaluer la mémoire spatiale et topographique des animaux (mémoire faisant appel à notre orientation dans un environnement) des animaux, expérience jamais encore étudiée.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de préciser les effets pharmacologiques "in vivo" à long terme d'une molécule neuroprotectrice très efficace sur les modèles précliniques de la maladie d'Alzheimer. Ces informations apporteront des précisions importante quant au futur développement clinique de cette molécule de nouvelle génération.
Procédures
3 procédures au sein de ce projet concerneront une administration d'un peptide, ou de l'eau distillée, dans le ventricule droit des animaux par injection intra-cerébro-ventriculaire (ICV). Cette procédure sous anesthésie générale ne dure pas plus d'une minute, et se réalise une seule fois sur les animaux en début de procédure. Pour les tests de comportement, le labyrinthe en Y (8 min) (procédures 1-4), le test d'évitement passif (2 fois 5 min), le test du nouvel objet (3 fois 10 min) (procédures 1 à 3) et le test du Hamlet (2 semaines d’entrainement à 4h/jour pendant 10 jours et 2 fois 10 min pour le probe test (test de mémoire topographique, procédure 4 seulement)) seront réalisés au cours des procédures. Lors de l'apprentissage dans le test d'évitement passif les animaux reçoivent un stimulus non douloureux au niveau des pattes. Toute variation importante de la sensibilité aux stimulus conduit à l'arrêt de la procédure. Afin de traiter ces animaux, une injection intrapéritonéale quotidienne (tous les jours, 24h d'intervalle) sera réalisée sur la durée de la procédure expérimentale (ne dépassant pas 2 mois). En fin d'expérience les animauxseront euthanasiés et les échantillons seront prélevés pour analyses biochimiques.
Impact sur les animaux
Concernant le modèle pharmacologique induit par l'injection intra-cérébro-ventriculaire de peptide amyloide, la procédure d'injection peut induire du stress chez l'animal. Les animaux utilisés subiront deux autres types de stress modéré : une injection intrapéritonéale quotidienne et, un test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme. Pour cela, un léger stimulus non douloureux sera produit au niveau des pattes de la souris. Les effets attendus sont un retardement des effets néfastes de la MA notamment sur les différents types de mémoires (court terme, long terme, spatiale et orientation dans un environnement soit topographique) sans effet secondaire.
Devenir
A la fin de chaque procédures les animaux seront euthanasiés afin de recupérer le matériel biologique permettant des analyses biochimiques post-mortem.
Remplacement
Afin de déterminer l'efficacité de la FENM, les tests doivent se faire « in vivo » en vue d’un éventuel développement clinique. De plus, l’utilisation de modèles murins de la MA pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la MA. Les approches in silico ou in vitro ou ex vivo ne permettent pas d’étudier l’effet de la molécule FENM sur le comportement des animaux notamment sur la mémoire spatiale de travail ou mémoire topographique ou de reconnaissance. Il est aussi impossible de voir les potentiels effets indésirables de la molécule. A ce jour, afin d’envisager un développement clinique aucune autre alternative que l’animal ne peut être envisagé.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux les doses administrées aux animaux se baseront sur les doses efficaces observées sur un modèle aigu de la MA précédemment obtenus au laboratoire. Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe) sauf pour l'une des procédure où nous pensons reproduire les résultats obtenus précédemment sur un fond génétique différent . Pour cela 6 souris/groupe sont nécessaires à l'étude. Une veille bibliographique sera également prise en compte tout au long du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.
Raffinement
De la naissance jusqu’à la fin de vie des animaux les procédures d’injections seront peu douloureuses avec une administration par voie intra-péritonéale. Pour les injections intra-cérébro-ventriculaires, une injection d'analgésique sera administrée afin de palier la douleur. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. Afin de suivre les animaux une feuille de bien-être, avec des points limites sera accessible à l’animalerie et complété par l’expérimentateur lorsque tout comportement suspect (plaie, lésions cutanées, agressivité, stéréotypie, apathie, convulsions, …) sera remarqué par celui-ci. Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des copeaux de coton et des bâtons en bois et des cabanes en carton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid.
Choix des espèces
Le modèle souris est adapté aux protocoles comportementaux et déja utilisé dans les expériences antérieures au laboratoire. Les doses et mode d'administration sont donc connus. Les animaux seront étudiés à l'âge de 5 semaines qui correspond à l'âge adulte pour le modèle pharmacologique et aussi à partir de l'âge de 4 mois, âge auxquels les symptômes de la MA apparaissent dans le modèle transgénique.
Mise au point d’un modèle de migraine par injection de PACAP-38 chez des animaux mâles et femelles
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur induit une migraine par injection d'un neuropeptide, le PACAP-38, puis mesure la sensibilité de la face au moyen de filaments de Von Frey et de jets d'air répétés pendant quatre heures après chaque injection. Il décrit une douleur modérée dont l'animal peut s'écarter faute de contention, et tue tous les rats pour prélever leur cerveau. Le projet vise à mettre au point un modèle de migraine chez mâles et femelles, le porteur affirmant qu'aucune méthode ne peut remplacer l'observation in vivo de l'intégration de la douleur.
Objectifs
L’objectif du projet est de développer un nouveau modèle de migraine en se basant sur les derniers résultats scientifiques. Nous étudierons un nouveau neuropeptide présent dans le système trigémino-vasculaire mais également dans l’hypothalamus et la vascularisation des méninges. Ce composé jouerait un rôle dans l’inflammation neurogène ainsi que la modulation et la sensibilisation des neurones nociceptifs trigémino-vasculaires. Des étude récentes chez l’homme ont montré que l’administration de ce produit induit des crises de migraine chez des patients souffrant de migraine sans aura. Ainsi pour mimer les conditions cliniques, nous souhaitons utiliser l’administration systémique du neuropeptide pour provoquer l’activation du système trigémino-vasculaire chez le rat. Nous évaluerons les effets de ce neuropeptide sur le comportement de l’animal, mais également sur l’excitabilité du complexe trigémino-vasculaire en utilisant des marqueurs d’activation neuronale chez le mâle et la femelle. Nous souhaitons comparer d’une part l’activation des régions du système nerveux central chez les mâles et les femelles pour voir s’il y a des différences entre les mâles et les femelles, mais aussi en fonction des variations hormonales qui ont lieu pendant le cycle sexuel chez la femelle.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet nous permettra de développer un modèle animal plus proche de la clinique et des dernières études scientifiques. Ceci devrait nous aider par la suite à mieux comprendre les mécanismes de la crise de migraine, caractériser ses spécificités chez le mâle et la femelle et identifier de nouvelles thérapeutiques. En effet, la migraine est plus fréquente chez les femmes que les hommes, mais les études ont été majoritairement réalisées chez les mâles. Pourtant, il est connu qu’il existe des différences d’intégration inhérentes au sexe et au cycle hormonal. Ainsi à moyen terme, identifier les différences ainsi que le rôle des différentes régions cérébrales dans ce nouveau modèle murin de migraine nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. Par ailleurs, on sait que les triptans sont les médicaments spécifiques de la migraine, malheureusement ces molécules ne sont efficaces que chez environ 60% des personnes suggérant que d’autres mécanismes triptan-indépendants sous-tendent la crise de migraine. Ainsi les découvertes récentes chez l’homme montrant que les triptans et les antagonistes du CGRP sont moins efficaces sur les céphalées induites, suggèrent que l’inhibition de la voie du neuropeptide étudié constitue une cible de choix pour développer de nouveaux traitements antimigraineux.
Procédures
Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal et par l’envoi d’un jet d’air toutes les 30 min pendant 4 h après l'injection des molécules en sous cutané (chaque application dure 3 secondes). Les jours entre les injections, la mesure se fait une fois.
Impact sur les animaux
Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Enfin, les stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey ou les jets d’air avec l’AirPuff induisent un retrait de la face signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention. Cette stimulation dure au maximum 3 secondes.
Devenir
La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. Il est donc nécessaire de réaliser les observations chez l’animal in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux (logiciel statistique dédié). Par ailleurs pour rendre compte des mécanismes sans doute différents chez l'homme et la femme (hormones différentes), nous avons besoin de réaliser l'étude à la fois chez les mâles et les femelles.
Raffinement
La nuisance identifiée sur le bien-être des animaux est la douleur engendrée dans le cadre du modèle. Concernant la douleur générée par l’application des stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique ) , nous respectons les recommandations de l'International Association for the Study of Pain. Nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les stimulations mécaniques ne dépassent pas les point limite fixés. Pour améliorer le bien-être des animaux , les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher. La chirurgie et la mise à mort de l'animal sont realisées sous anesthésie generale.
Choix des espèces
La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires . C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.
Évaluation des vésicules sur la protection du cerveau du nouveau-né lors d’un accouchement avec complications
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
286 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. À 12 jours de vie, les ratons sont séparés de leur mère, subissent une incision au cou pour isoler la carotide puis 90 minutes d'hypoxie qui provoque une hyperactivité proche de crises d'épilepsie, avant une injection de vésicules extracellulaires, le porteur signalant 10 % de mortalité. Tous sont ensuite tués pour prélever leur cerveau. L'effet neuroprotecteur espéré chez le nouveau-né humain reste une hypothèse à démontrer, et le porteur affirme qu'un organoïde cérébral in vitro, mené en parallèle, ne peut pas remplacer l'animal in vivo.
Objectifs
Deux nouveau-nés pour mille présentent des lésions cérébrales d’origine vasculaires induites lors de leur naissance difficile. Ces affections sont à l’origine de troubles neurologiques moteurs et cognitifs complexes à traiter. Des prises en charge sont connues, comme l’abaissement de la température cérébrale du nouveau-né. Ce procédé n’est que partiellement efficace, 50% des nourrissons traités développent encore des troubles neurologiques. Il y a aussi l’utilisation de cellules souches fœtales. Mais cette prise en charge présente certains obstacles : variabilité des cellules lors de leur préparation au laboratoire, rejet de greffe possible, problèmes de sécurité et d’éthiques liés à l’injection de cellules souches fœtales vivantes provenant de prélèvement en fin de grossesse. Il existe des cellules souches générées au laboratoire, qui lèvent ces obstacles. Elles sont dotées de qualités similaires aux cellules souches embryonnaires, elles peuvent être produites en grande quantité et sont immortelles. En plus, il est possible de récolter les vésicules extracellulaires des cellules souches. Ces vésicules extracellulaires sont de très petits sacs contenant des molécules thérapeutiques intéressantes pour soigner les lésions cérébrales, elles servent à communiquer avec des cellules cibles présentes dans leur microenvironnement pour en moduler le fonctionnement, de plus, leur contenu peut être modifié en incorporant des protéines connues pour leur effet bénéfiques. Les vésicules extracellulaires sont connues pour favoriser la récupération fonctionnelle notamment dans un modèle d’hémorragie intra-cellulaire chez le rat, ou lors de la protection des fonctions cérébrales dans un modèle chez le mouton. L’objectif de ce projet est de tester la neuro-protection des vésicules extracellulaires grâce à un modèle de lésion cérébrale chez le raton à 12 jours de vie (correspondant à un nouveau-né humain). Le contenu des vésicules extracellulaires sera modifié par l’enrichissement ou l’appauvrissement de la protéine d’intérêt connue pour contrôler l’inflammation et atténuer les lésions cérébrales. Nous montrerons que la protéine d’intérêt est plus efficace lorsqu’elle est administrée avec les vésicules extracellulaires. Nous procéderons à un ensemble de technique permettant d’évaluer les lésions cérébrales ainsi que les différentes populations de cellules du cerveau.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons montrer dans ce projet que l’injection de vésicules extracellulaires naïves (c’est à dire naturelle, sans ajout de molécules) peuvent diminuer les lésions cérébrales, et donc avoir un effet neuro-protecteur. Les vésicules extracellulaires représentent une alternative sûre à l’injection de cellules souches vivantes et permettent d’éliminer les risques liés à la transplantation de cellules vivantes, tels que les rejets immunitaires, les problèmes éthiques, la transformation des cellules souches en diverses cellules non cérébrales. Par ailleurs, nous allons montrer, qu’en modifiant le contenu des vésicules extracellulaires en leur ajoutant la protéine d’intérêt, que l’effet neuro-protecteur des vésicules extracellulaires naïves peut être augmenté. Comme le suggèrent des données pilotes, il est peu probable que la protéine d’intérêt soit le seul facteur naturel responsable des effets bénéfiques des vésicules extracellulaires. Cependant, les effets de l'injection de la protéine d’intérêt seule détermineront si la protéine d’intérêt doit être dans des vésicules pour être active. Les résultats obtenus vont permettre de valider l’effet neuro-protecteur des vésicules extracellulaires enrichies en protéine d’intérêt dans un modèle de lésion cérébrale chez le rongeur avant d’être validé dans un modèle plus gros (cochon), en tant que données préliminaires pour une étude clinique chez l’humain.
Procédures
La chirurgie des ratons se fera à 12 jours de vie sous anesthésie générale. Cette intervention dure 10 minutes. Puis l’hypoxie se fera pendant 90min. Vingt-quatre heures après la chirurgie, les ratons recevront une injection de vésicules extracellulaires, cette administration dure quelques secondes. L’ensemble du projet se fera donc sur 4 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : - Le jour de la chirurgie : du stress, de la faim et de l’hypothermie sont causés par l’isolement d’avec la mère. Une douleur au niveau de l’incision du cou pour isoler la carotide. Au moment de l’hypoxie on observe une hyperactivité ressemblant à des crises d’épilepsie. - Nous observons une stagnation de la prise de poids pendant 24h après la chirurgie - Les ratons peuvent avoir une douleur locale lors des injections intra-péritonéal ou sous-cutanées - La mortalité observée dans ce modèle est de 10% - Les ratons des groupes hypoxie ischémie prennent moins de poids que ceux des groupes contrôle (SHAM).
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à la fin du projet pour prélever leurs cerveaux afin de réaliser des analyses histologiques, ce qui correspond à l’analyse du tissu cérébral.
Remplacement
En parallèle de ce projet, une méthode alternative sera menée avec un modèle validé de cevreau humain fabriqué in vitro (appelé organoïde cérébral). Le but est de réaliser les mêmes traitements que sur les ratons pour ainsi comparer les résultats et d’élucider avec précision les mécanismes d’action des vésicules dans un contexte cellulaire humain. Toutefois, ce modèle récent a ses limites et ne peut remplacer totalement le modèle animal. Il n’y a pas d’alternative parfaite à un modèle in vivo pour étudier les effets de la réduction du flux sanguin/oxygène cérébral sur le cerveau et les anomalies du développement qui en découlent. La relation poumon/cerveau/circulation sanguine ne peut être modélisable in vitro. L’effet potentiellement neuro-protecteur des vésicules ne peut se faire que sur un organisme entier car il est difficile de reproduire in vitro la diminution du flux sanguin et une diminution de l’oxygène circulant.
Réduction
Nous utiliserons des données publiées dans les revues scientifiques afin de ne pas reproduire des expériences non utiles. Nous savons que la mortalité du modèle est de 10% nous compenserons en conséquence. Par ailleurs, compte tenu de l’hétérogénéité du modèle (réaction différentes selon les ratons), les groupes seront de 20 individus (10 mâles et 10 femelles pour mettre en évidence un éventuel effet sexe) pour obtenir des données analysables pour chaque point d’analyse (à quatorze et quinze jours de vie). Vingt animaux sont prévus pour transmettre le modèle à 2 nouvelles personnes. Si l’apprentissage se fait bien, nous en utiliserons moins. Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux utilisés.Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux utilisés. En conséquence, le nombre d’animaux dans notre étude sera maintenu au minimum nécessaire (286 ratons) afin d’obtenir des résultats analysables par les tests statistiques.
Raffinement
Afin de limiter le stress d’un nouvel environnement, nous procéderons à l’apprivoisement de la rate avant la mise bas. Nous l’habituerons à nous et aux bruits de déplacement dans la salle de chirurgie. Nous procéderons à l’enrichissement de l’hébergement avec du papier doux absorbant pour la fabrication du nid. Au moment de la naissance, si le comportement de la rate est anormal, c’est à dire qu’elle n’a pas fabriqué de nid et qu’elle ne s’occupe pas des petits, nous procéderons à une adoption par une autre rate. L’adoption se fera avec une rate qui pourra recevoir un nombre de ratons de manière raisonnable. L’adoption se fera en frottant doucement le raton avec la sciure de la nouvelle cage. Trente minutes avant la chirurgie, les ratons recevront une dose d’antidouleur, puis les ratons seront séparés de leur mère par groupe de 5 afin d’éviter un isolement trop long de toute la portée. Cinq ratons seront hébergés dans un environnement enrichi (sciure de la cage d’hébergement, papier doux absorbant et température contrôlée) pendant 1h. La chirurgie se fera sous anesthésie générale ainsi qu’une anesthésie locale sur un coussin chauffant. Dès que les ratons seront réveillés ils seront remis à leur mère pour recevoir ses soins et se nourrir. Pour finir, les ratons seront mis dans la couveuse reliée à la bouteille de mélange gazeux à 8% d’oxygène. On surveillera l’état général des ratons dans le nid à l’aide d’un document appelé « arbre décisionnel ». Il permet d’observer les ratons dans la portée sans les déranger à nouveau car le jour de la chirurgie les soins apportés par la mère sont importants. Dès qu’un animal ne va pas bien il est vite repéré car il est blanchâtre et/ou immobile. Une surveillance sera effectuée à +24h après la chirurgie afin de s’assurer de la bonne cicatrisation de la plaie et de la prise de poids. On surveillera la mobilité, la présence de lait dans l’estomac du raton. Les injections intra-péritonéales et sous cutanées seront réalisées avec une aiguille adaptée au raton (courte et fine) et par du personnel formé. Elles seront réalisées en même temps que la surveillance des points limites à 13 jours de vie afin de ne pas déranger plusieurs fois la portée.
Choix des espèces
Les revues scientifiques indiquent que les rats fournissent des informations pertinentes et qu’ils se remettent bien de la chirurgie. Le raton de 12 jours correspond à un nouveau-né à terme, au développement du cerveau et la maturation des cellules du système nerveux.
Evaluation de l’effet de la neurostimulation transcrânienne par ultrasons focalisés chez le singe Cynomolgus mâle et femelle : procédure d’IRM
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
16 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés en vie pour être réutilisés dans un projet lié. Ils sont anesthésiés à plusieurs reprises pour des IRM, des scanners et une imagerie au produit radioactif, immobilisés en chaise de contention et transportés entre deux sites, avec un stress et des douleurs aux sites d'injection et d'intubation. Ce volet évalue une neurostimulation cérébrale par ultrasons en vue d'un essai chez l'humain, chaque animal servant de son propre témoin. Le porteur justifie le recours au singe par sa proximité phylogénétique avec l'espèce humaine.
Objectifs
Dans une première approche expérimentale, nous avons testé et validé des séquences ultrasonores et un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore sur rongeurs. Dans la continuité de ce projet, en raison des limitations physiologiques des rongeurs et des contraintes physiologiques liés au crâne et au cerveau humain, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore chez le singe dans la perspective d’un essai clinique chez l’Homme. Pour cela, nous devons faire des IRMs cérébrales de nos animaux en dehors du site d’hébergement. Nous devons transporter et manipuler les animaux sur le site d’imagerie. Le projet d’origine est évalué par une autre DAP pour les procédures d’habituation, d’imagerie CT/TEP-18FDG et de neurostimulation qui seront réalisées au sein de l'établissement d'hébergement.
Bénéfices attendus
Dans le cadre des troubles neuropsychiatriques (autisme, dépression), notre méthode de stimulation permettrait d'avoir une alternative thérapeutique aux traitements pharmacologiques classiques. De plus, cette méthode de neurostimulation serait plus précise et/ou moins invasive que les méthodes de stimulation actuelles (stimulation magnétique transcrânienne et stimulation cérébrale profonde).
Procédures
Sur l'ensemble du projet les animaux seront soumis aux interventions suivantes : *Habituation – renforcement positif : 2 à 5 fois par semaine ; durée : entre 15 minutes et 1 heure par animal ; pendant au moins 1 mois et jusqu’à l’obtention d’une bonne coopération de l’animal vigile. *IRM cérébrale sous anesthésie générale : 1 seule fois par animal ; injection d’anesthésique intramusculaire puis anesthésie gazeuse. Durée d’anesthésie : environ 60min. *Scanner CT sous anesthésie générale : 1 seule fois par animal ; injection d’anesthésique et de son antidote (voie intramusculaire), durée d’anesthésie : environ 10min. *Adaptation du dispositif de neurostimulation : jusqu’à 10 fois par animal ; injection d’anesthésique et de son antidote (voie intramusculaire), durée d’anesthésie : environ 30min. *Imagerie TEP-CT sous anesthésie générale : cette imagerie sera réalisée 2 à 3 fois ; injection d’anesthésique (intramusculaire); injection du produit radioactif (intraveineuse, par cathéter veine saphène ; durée d’anesthésie : environ 1h30 à 2h00. *Neurostimulation ultrasonore sous anesthésie générale chimique : 2 à 10 séances de stimulation ; application sur la tête du dispositif de neurostimulation ; injection d’anesthésique et de son antidote ; durée de contention dans une chaise de contention : environ 30min par stimulation.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sont les suivants : - Augmentation du stress lors des phases d’induction d’anesthésie (contention dans la cage). - Douleurs/gênes au niveau du site d’injection de l’anesthésie. - Douleurs/gênes oropharyngées liées aux intubations. - Augmentation du stress lors du transport entre les deux sites de manipulation. - Gênes suite à l’installation dans la chaise de contention. - Gênes au niveau du site d’apposition de la sonde ultrasonore.
Devenir
Les animaux sont gardés en vie pour intégrer les procédures décritres dans une autre DAP en relation avec celle-ci.
Remplacement
Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé des séquences ultrasonores et un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore chez les rongeurs. Dans la continuité de ce projet et en raison des limitations physiologiques des rongeurs et des contraintes physiologiques liés au crâne et au cerveau humain, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore chez le singe dans la perspective d’un essai clinique chez l’Homme.
Réduction
Les méthodes d’imageries utilisées pour ce projet permettent d’utiliser un animal comme étant son propre contrôle. Nous n’avons donc aucun recours à un groupe d’animaux contrôle supplémentaire. Nous souhaitons tester les effets de la neurostimulation ultrasonore aigüe (n=8 individus) et la neurostimulation ultrasonore chronique (n=8 individus). Les procédures expérimentales ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Ainsi l’activité cérébrale d’un animal après neurostimulation sera comparée avec sa propre activité cérébrale avant neurostimulation, chaque animal sera donc son propre contrôle. Ces activités cérébrales seront statistiquement comparées. En considérant une modification de 10% de l’activité cérébrale par rapport à l’activité contrôle, un effectif de 8 animaux par groupe sera utilisé.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe pour garder des liens sociaux et en présence d’objets d’enrichissement (manipulation d’objet, vidéo, musique). Ils auront un accès ad libitum à l’eau et seront nourris 2 fois par jour dont au moins une fois avec une ration de fruit. Les animaux seront observés tous les jours. Les procédures expérimentales seront réalisées dans une salle correctement chauffée. Pour les procédures sous anesthésie, les animaux seront manipulés sur un tapis chauffant, un monitoring cardio-pulmonaire sera effectué pendant toute la durée de la manipulation. Les animaux seront placés sous surveillance à leur réveil. Pour le transport entre les sites de manipulations, les animaux seront placés en cage d’isolement. Autant que possible les animaux seront transportés par groupe de deux minimums. Des temps d’habituation entre les transports et la manipulation sont prévus pour faire baisser le stress des animaux.
Choix des espèces
Le choix de cette espèce se justifie (1) par l’analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le singe et l’humain et (2) par sa proximité phylogénétique avec l’espèce humaine. Des macaques pubères seront utilisés pour cette étude. Les pathologies pouvant être soignées par la méthode de neurostimulation ultrasonore sont pour la plupart des pathologies de l’adulte. De ce fait, il s’avère nécessaire de travailler sur des animaux post-pubère ayant un âge supérieur à 3 ans et un poids inférieur à 5 kg.
Hétérogénéité fonctionnelle des cellules en grain du cervelet
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux nouveau-nés subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie, dont une électroporation pouvant provoquer un arrêt cardio-respiratoire et la mort, avec un risque de cannibalisme par la mère et un stress lié à la séparation maternelle, avant d'être tués pour des analyses du cervelet. Le projet étudie le rôle des cellules en grain du cervelet dans le traitement des informations sensorielles et motrices. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit ces phénomènes du développement.
Objectifs
Le cervelet est une structure cérébrale qui permet à tout individu de s’adapter à son environnement en contrôlant et corrigeant la posture et les mouvements en fonction des informations qu’il reçoit du monde extérieur et du reste du corps. Une mauvaise transmission de ces informations pourrait être à l’origine de maladies neurologiques et psychiatriques, telles que des ataxies, des dystonies, des formes d'autisme ou de schizophrénie . L’objectif de ce projet est d’identifier comment les différents groupes de cellules en grain du cervelet qui forment la couche de cellules par laquelle les informations arrivent au cortex cérébelleux, influencent le fonctionnement et l'encodage des informations.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre les bases cellulaires des dysfonctionnements synaptiques dans le cortex cérébelleux chez la souris, en particulier au niveau de la couche d'entrée au cervelet, la couche des cellules en grain. Ces dysfonctionnements pourraient être à l’origine de troubles comportementaux associés à des troubles neurologiques et psychiatriques chez l'homme.
Procédures
Tous les animaux subiront au moins une procédure d'identification et de génotypage sur animal vigile (durée 5 minutes). Un premier groupe d’animaux nouveau-nés subira une seule intervention chirurgicale d'une durée de 20 minutes maximum sous anesthésie et analgésie profonde. Un deuxième groupe d’animaux nouveau-nés subira une intervention chirurgicale d'une durée de 20 minutes maximum sous anesthésie et analgésie profonde .
Impact sur les animaux
Une des chirurgie peut induire un arrêt cardio-respiratoire conduisant à la mort de la souris nouveau-née dans les minutes qui suivent l'électroporation. La séparation maternelle de plusieurs heures peut induire un stress pour la mère et les souris nouveau-nées. La chirurgie sur les souris nouveau-nées peut induire du cannibalisme par la mère. Des injections peuvent induire des sensations désagréables de piqure et des douleurs abdominales modérées. Des pertes de poids, des douleurs et réactions inflammatoires peuvent être induites par la chirurgie.
Devenir
Dans les deux procédures les animaux sont mis à mort afin de réaliser des analyses électrophysiologiques, tissulaires et histologiques.
Remplacement
Pour ce projet, nous souhaitons étudier dans le cerveau de souris adultes des phénomènes biologiques complexes qui se mettent en place dans le cerveau des souris nouveau-nées. Ces phénomènes sont contrôlés à tout moment par différentes parties du cerveau. Il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico qui puissent reproduire la complexité des phénomènes biologiques qui se mettent en place dans le cerveau pendant la croissance de la souris ce qui signifie que le modèle animal ne peut pas être remplacé.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement valides. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et produire des résultats spécifiques de genre. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis. l’utilisation conjointe de plusieurs outils expérimentaux permettra de diviser par deux le nombre d’animaux nécessaires pour le projet.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées en groupes sociaux. Elles font l’objet d’observations régulières tout au long de l'expérience et l'enrichissement (matériel de nidification et bâton à ronger) est systématiquement appliqué à toutes les cages. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Pour limiter le stress et le cannibalisme plusieurs types de raffinements seront utilisés: (1) les animaux seront rendus à la mère après un délai permettant d'attenuer les odeurs étrangères. (2) Nous ajouterons de la frisure et/ou des carrés de coton en quantité suffisante pour l'élaboration du nid, un tunnel et des barres de bois à ronger. Aucun changement de litière ne sera réalisé dans les 24 h qui précèdent et les 72h qui suivent la chirugie. En cas de perte de poids, nous mettrons à disposition de l'eau gélifié et de la nourriture dans la cage. Enfin, des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille de score pour une prise en charge adaptée des animaux.
Choix des espèces
Le choix de la souris est justifié par le fait que de nombreux modèles génétiques développés chez la souris ont permis de comprendre les mécanismes physiologiques et moléculaires responsables de pathologies neurologiques humaines. Les voies anatomiques et le traitement réalisé par le cervelet sont similaires chez la souris et chez l'homme. Nous utiliserons des souris transgénique afin de cibler les groupes de cellules que nous allons étudier. Ces groupes de cellules seront manipulées génétiquement très tôt au cours du développement des souriceaux ce qui nous permettra d'étudier leur rôle dans l'encodage des informations pendant le développement du cervelet. Les procédures expérimentales seront donc réalisées chez des souris nouveau-nées (3 à 12 jours après la naissance).
Etude du rôle d’un récepteur dans un modèle d’ischémie cérébrale néonatale chez le souriceau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux subissent une ischémie cérébrale provoquée sous anesthésie, puis une série de tests comportementaux évaluant la préhension, la coordination motrice, les réflexes et la mémoire spatiale, du stade juvénile jusqu'à cinq mois, avant d'être tués pour prélever le cerveau. Le projet étudie le rôle d'une protéine dans les lésions cérébrales d'un accident vasculaire du nouveau-né, plus fréquent chez les garçons. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, aucun modèle in vitro ne reproduisant ces mécanismes.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral est fréquent chez l’adulte et l’enfant. Les lésions de la substance blanche et les déficits moteurs et d'apprentissage sont caractéristiques des troubles neurodéveloppementaux tardifs consécutifs à un accident vasculaire cérébral néonatal. Aujourd’hui encore, l’équipe médicale ne dispose d’aucun traitement pour réduire ces déficits. Le sexe est un facteur influençant le devenir à long terme des enfants, ce qui suggère la nécessité d'une thérapie adaptée au sexe de l’enfant. En particulier, l’accident vasculaire cérébral néonatal survient plus fréquemment et est plus sévère chez les garçons. Les raisons de cette différence liée au sexe sont encore inconnues, mais pourraient être liée à la neuro-inflammation. De plus, l’inflammation consécutive à l’accident vasculaire cérébral néonatal associée à la grande vulnérabilité des cellules cérébrales en développement à ce stress inflammatoire participent à l’apparition des lésions cérébrales. En fonction du sexe, les microglies, chef d’orchestre de la neuro-inflammation, sont différentes en nombre, localisation et fonction dans le cerveau en développement. Ainsi, la réponse neuro-inflammatoire post-ischémique pourrait expliquer les différences de devenir entre les 2 sexes. Suite à son activation, la microglie peut exercer des effets délétères, mais elle peut aussi exercer des effets bénéfiques, et ceci, selon son environnement. De plus, la protéine étudiée, qui est notamment exprimée par la microglie, pourrait être impliquée dans sa fonction bénéfique ou délétère. Cependant, à ce jour, il n’existe aucune donnée sur l’implication de cette protéine à la suite d’un accident vasculaire cérébral néonatal. L'objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de la protéine d’intérêt dans dans la neuro-inflammation microgliale et les lésions de la substance blanche dans un modèle d’ischémie cérébrale néonatale chez le souriceau.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires à l’origine du dimorphisme sexuel observé sur l’inflammation, les lésions cérébrales et les déficits moteurs et cognitifs induits par une ischémie cérébrale néonatale. Il pourrait ainsi permettre le développement de nouveaux médicaments, afin de limiter les conséquences d’un AVC chez les bébés.
Procédures
• Ischémie cérébrale néonatale sous anesthésie générale: 15-20 min • Analgésie par voie sous-cutanée sur animal vigile 30 min avant l’ischémie: moins d’1 min • 4 prélèvements de sang chez la souris adulte vigile sur une période de 3 mois : 1 prélèvement
Impact sur les animaux
• Hémorragie pendant la chirurgie = échec de la procédure • Rejet des souriceaux par la mère après la chirurgie • Stress lié à la séparation maternelle pendant les tests comportementaux chez le souriceau • Stress lié à la contention chez la souris adulte pour réaliser les prélèvements de sang
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux seront prélevés pour réaliser différentes analyses.
Remplacement
Les mécanismes impliqués dans les lésions cérébrales à la suite d’une ischémie cérébrale mettent en jeu plusieurs types cellulaires dans différentes structures cérébrales qu’il est impossible de reproduire in vitro. Il est donc indispensable d’avoir recours à l’animal, afin de reproduire la pathologie humaine. De plus, les déficits comportementaux et les lésions cérébrales ne peuvent être évalués qu’in vivo
Réduction
Le taux d'échec des gestes pour réaliser l’ischémie cérébrale (hémorragie) et de mortalité liée au rejet par la mère, ainsi que la bonne connaissance du modèle permettront de réduire le nombre d'animaux au minimum. Notre équipe a une longue expérience d’utilisation des modèles d’ischémie cérébrale, nous permettant de bien estimer le nombre d’animaux par groupe nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valides.
Raffinement
Les cages seront enrichies en cotons compactés, afin notamment que les mères puissent réaliser des nids de meilleure qualité pour leurs petits. La durée de séparation maternelle, occasionnée par l’anesthésie et la chirurgie des souriceaux, n’excèdera pas 15-20 minutes. Afin de s'assurer du bien-être animal, l'intervention chirurgicale permettant de réaliser l’ischémie cérébrale sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera donné en pré-opératoire, afin de limiter la souffrance des animaux. La mise en place de points limites et l'observation du comportement des animaux permettront d'identifier toute souffrance et douleur, et d'entraîner une mise à mort anticipée, si nécessaire.
Choix des espèces
Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour pour mimer les lésions post-ischémiques du stade néonatal et offre un large répertoire d’évaluation comportementale. De plus, cette espèce nous permet d’évaluer le rôle de notre protéine d’intérêt grâce à l’utilisation de souris transgéniques. L’ischémie cérébrale néonatale est à l’origine d’une inflammation microgliale présente durant les jours qui suivent l’ischémie cérébrale. Elle sera réalisée sur des souriceaux (9 jours post-natal), car ils possèdent un stade du développement cérébral qui correspond à celui d’un bébé né à terme chez l’Homme. L’ischémie cérébrale néonatale induisant des déficits moteurs et cognitifs au stade adulte, les tests comportementaux seront donc réalisés chez des souriceaux (1 à 21 jours après l’ischémie cérébrale) et des souris adultes (3 à 5 mois après l’ischémie cérébrale).