Système nerveux

1 800 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent deux chirurgies cérébrales pour l'injection de virus et l'implantation d'une lentille d'imagerie, une consommation forcée d'alcool sur plusieurs semaines et une tâche d'auto-administration, pour étudier les circuits cérébraux de l'addiction. Le porteur indique que les rats ne développant pas de consommation excessive ou échouant à la tâche sont euthanasiés en cours de route, ce qui explique le grand nombre d'animaux engagés. Sur le remplacement, il affirme que ces effets ne peuvent être étudiés sur modèles cellulaires et que seuls des rats modifiés permettent de cibler les neurones visés.

Objectifs

L’alcoolo-dépendance est une maladie chronique et hautement récidivante en dépit des thérapies existantes puisque 70% des patients rechutent après 12 mois de prise en charge (plus de 90% après 4 ans). Le trouble de l’usage d’alcool (TUA) et toutes les conséquences liées à la consommation d'alcool représentent une charge importante pour la santé publique et les économies du monde entier, notamment en France et particulièrement dans notre région. À l'instar des autres dépendances aux drogues, le TUA est défini comme un syndrome pathologique caractérisé par une perte de contrôle et des envies incontrôlables (« craving »), la persistance de la consommation en dépit des conséquences (usage compulsif), un mal-être et des symptômes physiques à l’arrêt de la consommation (sevrage) et des rechutes qui peuvent survenir même après des années d'abstinence. C’est une maladie grave, complexe, fréquente et hautement invalidante qui est dévastatrice non seulement pour l’individu mais aussi pour l’entourage et la société. Pour identifier les cibles thérapeutiques qui amélioreront les options de traitement disponibles pour le TUA, il y a donc un besoin critique de comprendre les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent l'apparition, le maintien et la rechute de cette addiction à d'alcool.

Bénéfices attendus

Sur le plan scientifique, les données du présent projet offrent non seulement une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques à la base de l’addiction à l’alcool, mais aussi ouvrent des possibilités en termes de nouveaux traitements cellulaires et génétiques de cette maladie. Ce projet scientifique est très ambitieux et très original car il va combiner des techniques de pointes avec l’utilisation des modèles animaux validés pour évaluer le développement d’addiction à l’alcool. Vu la pertinence et l’innovation du projet, les retombées seront importantes en termes de mise en place de techniques originales in vivo, chez l’animal vigile, ce qui n’est pas courant et mérite donc d’être souligné. Les résultats permettront aussi d’avoir des données en fonction du sexe, ce qui est important à l’heure actuelle car ce facteur est assez peu étudié dans les recherches du domaine. Le protocole est aussi original, dans le sens ou l’approche longitudinale va nous permettre d’obtenir des données aux différentes étapes des processus impliqués dans l’addiction et nous serons donc en mesure de proposer des interventions dans le champ de la prévention, avec l’idée d’intervenir précocement. Nous serons en mesure d’identifier des mécanismes dans des voies neuronales spécifiques et dans des types de neurones spécifiques et de démontrer que leur modulation permet de jouer sur la consommation d’alcool et sur certains critères de l’addiction. Cela avancera notre compréhension de comment les structures du circuit de récompense, impliquées dans l’évaluation de la récompense et le control cognitifs (système top-down), sont modifiées suite à l’exposition à l’alcool et comment ces régions cérébrales sont impliquées dans les comportements liés à l’addiction à l’alcool.

Procédures

Les animaux vont subir deux chirurgies espacées de 3 semaines dans le but d'injecter un virus dans différentes structures cérébrales en premier lieu, d'implanter une lentille d'imagerie et de placer une base crânienne d'un miniscope en deuxième lieu. La première chirurgie durera environ 30 minutes, tandis que la deuxième prendra environ une heure. Des prélèvements de sang pour évaluer l'alcoolémie seront réalisés à la lors des différentes étapes de la procédure 1 (début et à la fin de la procédure de la consommation volontaire et à la fin de l'apprentissage opérant d'alcool) et 2 (expériences visant à tester la compulsivité et de la rechute). Nous prévoyons de prélever entre 150 et 200 μL de sang veineux à chaque prélèvement, en respectant un intervalle d'au moins 2 semaines entre chaque prélèvement. Les rats seront anesthésiés pendant le prélèvement, ce qui prendra moins de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Ces expériences doivent être réalisées avec des animaux placés individuellement dans des cages, ce qui peut entraîner un stress social chez notre modèle animal. D'expérience, les étapes de consommation volontaire d'alcool ne conduisent à aucune souffrance ou douleur chez nos animaux. Les phases qui vont faire subir aux rats une certaine douleur sont les procédures chirurgicales visant à injecter les vecteurs viraux et à implanter des lentilles intracrâniennes.

Devenir

Pour induire une forte consommation d'alcool chez les rats, une première étape de consommation volontaire intermittente est réalisée pendant environ 8 semaines. Les rats ont accès à deux bouteilles pendant 24 heures : une contenant de l'alcool à 20% v/v et une contenant de l'eau. Certains rats développent une consommation excessive d'alcool après environ 10 à 12 sessions, tandis que d'autres ne le font pas. Ceux qui ne développent pas une consommation excessive d'alcool sont euthanasiés, et des échantillons de tissus tels que le foie ou le cerveau peuvent être prélevés sur ces animaux pour des tests ultérieurs. Les rats qui réussissent la tâche d'auto-administration opérante d'alcool sont sélectionnés pour les chirurgies. Ceux qui ne parviennent pas à acquérir cette compétence sont également euthanasiés eet des échantillons de tissus peuvent être prélevés sur eux. À la fin de l'étude, les animaux tous les animaux seront anesthésiés.

Remplacement

Les conséquences de l’exposition répétée à l’alcool sur le circuit de la récompense ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent pas la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux neuronaux complexes. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers. De plus nous utiliserons des rats génétiquement modifiés permettant de cibler spécifiquement les différentes population neuronale dans nos régions d’intérêt dans le cadre de ce projet, ces modèles n’existent que chez Le rongeur.

Réduction

Pour les tests comportementaux, nous identifions le minimum d’animaux nécessaires pour un résultat statistiquement significatif, qui est déterminé en utilisant une « power analysis » basée sur nos résultats précédents, et un n = 30/groupe est généralement suffisant. Il est donc nécessaire de commencer avec un grand nombre d'animaux dans nos groupes. Si nous avons initialement 30 rats par groupe, nous perdrons ensuite environ 15 à 20 % des rats après la première étape d'acquisition de consommation volontaire excessive d'alcool, puis encore 15 à 20 % à la seconde étape d'acquisition de tâche opérante. Cela nous amènera à avoir une vingtaine de rats par groupe avant les tests de compulsivité. Théoriquement, nous aurons au maximum 5 à 6 rats qui développeront un comportement compulsif. Cela représente le nombre minimum nécessaire pour effectuer des tests statistiques. A noter donc qu’il est des fois nécessaires de répéter chaque expérience sur deux cohortes indépendantes, si le nombre de rats compulsif est inférieur à 5. Ces études se feront de manière longitudinale, afin de tester plusieurs paramètres (la consommation du type «binge »; perte de contrôle ; motivation ; consommation compulsive ; abstinence et rechute) chez le même animal afin de réduire au maximum le nombre de rats utilisés. Par ailleurs, les animaux sont surveillés quotidiennement.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les rats sont hébergées en groupe sociaux de 2 animaux par cage (Sauf besoin expérimental), et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie (anesthésique profond et un anesthésique local autour du site de chirurgie) et les animaux recevront un traitement antidouleur. La température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté jusqu’au complet réveil de l’animal. Les animaux seront ensuite suivis et la souffrance sera évaluée. En plus des points limites spécifiques à chaque procédure, nous utiliserons une grille d’évaluation jusqu’à la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus couramment utilisé dans les études d’auto-administration opérante d’alcool de part ses capacités d’apprentissage de la tâche opérante mais également pour son attrait naturel pour l’alcool. Les rats adultes seront agés de 8 semaines à leur arrivée au laboratoire pour une utilisation allant de quelques semaines à plusieurs mois.

186 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte de la capsaïcine pour provoquer une hypersensibilité douloureuse, puis on leur administre des composés par voie intrathécale et sous-cutanée sous anesthésie, avec des tests répétés de mesure de la douleur, pour améliorer un candidat médicament antidouleur. Le porteur indique qu'il lui est impossible de soulager la douleur de ces animaux pendant l'expérience, puisque c'est précisément l'objet de l'étude. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et que l'intégration de la douleur impose des études sur l'animal vivant.

Objectifs

Parmi une série de composés chimiques synthétisés par le laboratoire, nous avons identifié une molécule ayant un effet anti-allodynique à la fois très puissant et prolongé sur des modèles murins d’allodynie mécanique inflammatoire comme neuropathique. Nous voulons améliorer cet effet anti-allodynique via l’optimisation de la formule chimique du composé, pour ensuite comparer l’effet thérapeutique des nouveaux composés à notre référence. Ce projet vise a répondre à deux questions : 1. Détermination de l'effet dose du composé de référence sur l'hypersensibilité mécanique d'origine inflammatoire induite par la capsaïcine. 2. Les nouveaux composés ont-ils un effet sur l'hypersensibilité mécanique d'origine inflammatoire induite par la capsaïcine ?

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de déterminer si l'amélioration du composé améliore son effet anti-allodynique, afin d'en faire un candidat médicament pour traiter l'allodynie.

Procédures

Toutes les injections intrathécales (1 par animal d'environ 3min) et sous-cutanées (1 par animal d'environ 2min) seront pratiquées sous anesthésie générale. Les tests de mesure de la douleur en comportement sont réalisés 7 fois en 1h30.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse. Cependant, puisque nous travaillons sur la douleur, il nous est impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l’expérience. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels. Une grille de score est mise en place afin d'évaluer le bien être des animaux au quotidien suite aux injections intratéchales et sous cutanées. Les résultats préliminaires obtenus au laboratoire ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être utiliser dans d'autres procédures.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de produit inflammatoire.

Réduction

Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif. Les données sont traitées selon les données de la littérature. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique. Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques. La significativité sera définie pour une valeur de p≤0,05.

Raffinement

Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, systémiques, locales ou sous-cutanées, les rats sont préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. De plus, en cas d’injection d’un produit inflammatoire , le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone d’injection, est poursuivi dans les jours suivants. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Les points limites des animaux sont identifées par une liste définie.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années. C’est par ailleurs un bon modèle pour les études comportementales. Les animaux utilisés seront des rats adultes, par comparaison avec les autres données de la littérature.

1 370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation du gène tau, elles subissent des tests de mémoire, une privation d'eau limitant l'accès à dix minutes par jour et une diète déplétant les cellules immunitaires du cerveau, pour étudier le rôle d'ApoE4 dans la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique qu'environ 15 % des souris développent une paralysie progressive des membres postérieurs et que des crises d'épilepsie, une hydrocéphalie ou une malocclusion peuvent survenir, avec mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids. Sur le remplacement, il affirme que la dégénérescence synaptique est très difficile à obtenir in vitro et juge le modèle murin "indispensable".

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle il n’existe aucun remède à ce jour. Dans la MA, les synapses (zone de contact entre deux neurones où a lieu la transmission du message nerveux) dégénèrent progressivement, menant aux troubles de mémoire bien connus dans la MA. L'apolipoprotéine E (ApoE) est une protéine essentielle aux fonctions synaptiques. L'isoforme E4 d’ApoE (ApoE4) augmente fortement le risque de développer la MA. Bien que nos études précédentes aient pu montrer qu’ApoE4 exacerbe la perte synaptique, on ne se sait pas exactement comment. Déterminer comment ApoE4 contrôle la dégénérescence des synapses dans la MA est essentiel pour comprendre la maladie, mais nécessite une caractérisation fine des fonctions ApoE4 au niveau des synapses. Ce projet testera l'hypothèse selon laquelle ApoE4 aggrave la perte synaptique dans la MA tau par 3 modules : 1) Identifier comment ApoE4 modifie la fonction des synapses endommagées par la MA. 2) Identifier comment ApoE4 modifie la structure des synapses endommagées par la MA. 3) Identifier si ApoE4 utilise les microglies (cellules immunitaires du cerveau) pour exacerber la perte synaptique. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre les interactions entre l'ApoE4 et la perte des synapses dans la MA. Nous utiliserons un modèle de souris qui reproduit la perte synaptique comme observée chez les patients MA.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la dégénérescence synaptique dans la MA et le rôle d’ApoE4 et des microglies dans ce processus pathologique. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités d’ApoE4 et des et microglies qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.

Procédures

- Une biopsie rapide de l'oreille (permettant l'identification et le génotypage des animaux) (2 secondes) - Trois tests comportementaux pour évaluer la mémoire (1 semaine à 3 semaines) - Une euthanasie sous anesthésie/analgésie (unique, 1 minute) - Possible développement d'un phénotype dommageable à partir de 7 mois (15% des souris P301S, développement progressif de quelques semaines à 1 mois) - Une diète spéciale permettant la déplétion des microglies (1 mois) - Une privation en eau contrôlée (accès à l'eau 10 minutes par jour )

Impact sur les animaux

Il n’y pas d’effet indésirable attendu sur les animaux lié à l’utilisation des traitements proposés (diètes). En ce qui concerne le comportement, il s'agit de manipulations répétées qui sont indolores et non invasives mais peuvent être stressantes pour les animaux. Les animaux seront privés en eau pour créer un niveau de motivation suffisant pour apprendre et mémoriser les indices olfactifs lors de l'helico Maze. Les souris seront privées en eau de la façon suivante: accès à l'eau 10 minutes par jour 5 jours avant le premier jour d'expérimentation. Puis, lors des jours d'expérimentation (5) les souris auront accès à l'eau pendant 10 minutes chaque jour en plus de l'eau bue pendant l'expérimentation. Les souris porteuses du transgène P301S peuvent développer plusieurs phénotypes dommageables qui seront discutés dans la procédure et pour lesquels des points limites stricts seront établis). Les animaux issus de la procédure 2 seront mis à mort à la fin de la procédure par surdosage anesthésique suivi d'une perfusion intracardiaque. Une heure avant l’injection d’anesthésiques, nous injecterons un analgésique en sous-cutané .

Devenir

Pour la partie du projet permettant la création et le maintien de lignées de souris transgéniques à phénotype dommageable, une partie des souris sera utilsée pour la deuxième procédure, l'autre partie sera mise à mort à la fin de la procédure. Pour la partie du projet avec les analyses comportementales, perfusion et prélèvements des tissus, tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analyser.

Remplacement

Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence synaptique est très difficile à obtenir in vitro. Ces souris P301S représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence synaptique et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Puisque le but principal est de comprendre et combattre la dégénérescence synaptique dans la MA, nous devons utiliser un modèle qui développe une perte synaptique similaire à celle présente chez les patients atteints de la MA. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte synaptique, nous nous tournons donc vers ce modèle murin. De plus, les modèles de test comportementaux n'étant pas possible in vitro, l’utilisation d’un animal qui développe des altérations mnésiques similaires à celles observées dans la MA est donc nécessaire, avec des capacités mnésiques mesurables. Les souris P301S transgéniques permettent de reproduire ces symptômes mnésiques de la MA ainsi que les mécanismes à l’origine de ces troubles.

Réduction

Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Du fait de la variabilité pathologique précédemment rapportée entre mâles et femelles dans le modèle P301S, nous n’utiliserons que les mâles afin de réduire la variabilité au sein des groupes et ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons les mâles car ils développent une perte synaptique plus tôt par rapport aux femelles. Les seules femelles utilisées seront celles nécessaires à la création et au maintien des différentes lignées de souris pour la reproduction. Nous avons conscience que l’utilisation des deux sexes serait un atout scientifique mais le nombre d’animaux nécessaires serait bien trop important d’un point de vue éthique. Nous proposons donc de faire cette étude exploratoire chez les mâles. Dans le futur, lorsque les mécanismes liant ApoE4 à la perte synaptique seront établi chez les mâles, nous ferons une nouvelle demande auprès du comité d’éthique afin de confirmer (ou non) les résultats principaux découverts chez les mâles sur une petite cohorte de femelles.

Raffinement

Les souris seront hébergées sous un cycle lumière-obscurité de 12 heures à 21°C(±1°C) dans des portoirs ventilés (12vol/h), sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglass et dômes en papier, accompagné de Nestlets en coton). Les animaux seront sous la responsabilité de personnels animaliers expérimentés. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Les souris peuvent perdre du poids avec la privation en eau ; Au-delà de 20% de perte de poids pendant l'expérience, la souris sera exclue du test comportemental et aura un accès illimité à l’eau afin de recouvrer un poids normal. Les souris P301S développant des phénotypes dommageables, des points limites stricts seront établis afin de réduire les nuisances causées aux animaux. Environ 15% des souris P301S développeront une paralysie des membres postérieurs à partir de l'âge de 7-8 mois. Les premiers signes sont la rétraction des membres postérieurs quand la souris est soulevée par la queue. Au début, les souris sont entièrement ambulatoires et peuvent accéder normalement à la nourriture et à l'eau. Cela peut évoluer vers une faiblesse des membres postérieurs et éventuellement une paralysie. Les souris sont observées quotidiennement pour leur capacité à atteindre la nourriture et l'eau. Ce processus, lorsqu'il se produit, progresse au cours des semaines à plus d'un mois. Points limites : Perte de plus de 20% du poids : euthanasie. Signes de souffrances continues (prostration, dos courbé, …) : euthanasie. Incapacité à se déplacer pour atteindre l’eau ou la nourriture : euthanasie. Notre objectif est de les amener à 10 mois maximum. Les souris P301S sont sensibles au bruit et à la manipulation. Si une crise épileptique se produit, nous laisserons la souris récupérer et observerons 5 minutes. Si elle est incapable de se remettre d'une crise, elle sera euthanasiée. Habituellement, les souris récupèrent et se comportent normalement. Si la souris développe une hydrocéphalie, elle sera euthanasiée. Si une malocclusion est identifiée, la souris sera évaluée. Si elle fait partie d'une procédure, les dents seront taillées chaque semaine par le personnel vétérinaire et le poids sera surveillé. Sinon, la souris sera euthanasiée.

Choix des espèces

Les souris P301S constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que comme modèle pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles. De plus, la dégénérescence synaptique responsable des troubles cognitifs dans la MA est très difficilement modélisable in vitro et nécessite des modèles transgéniques exprimant des protéines humaines mutées. Pour étudier l’impact d’ApoE4 sur la dégénérescence synaptique, nous utiliserons des souris sauvages et les souris génétiquement modifiées P301S exprimant la protéine tau humaine mutée menant au développement de la perte synaptique et des troubles cognitifs. Ces souris seront croisées avec des souris transgéniques exprimant les isoformes humaines ApoE2, ApoE3 ou ApoE4. - Une cohorte sera utilisé à 7 mois (avec tests comportementaux de un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades précoces de la dégénérescence synaptique dans ce modèle - Une cohorte sera utilisé à 10 mois (avec tests comportementaux e un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades tardifs de la dégénérescence synaptique dans ce modèle

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections par jour, par voie intrapéritonéale, sous-cutanée ou par gavage, d'un traitement chronique au THC destiné à provoquer une dépendance puis un sevrage, et 504 d'entre elles passent des tests comportementaux dont le porteur ne précise pas le détail. Il indique que la mise à mort est réalisée rapidement sans anesthésie préalable, pour ne pas fausser les mesures. Sur le remplacement, il décrit des analyses in silico et in vitro déjà menées, mais affirme que l'étude de systèmes intégrés ne peut se faire que chez l'animal.

Objectifs

Le cannabis est la drogue d’abus la plus utilisée dans le monde et compte environ 200 millions d’utilisateurs pour 15 millions de personnes dépendantes. Le cannabis contient naturellement des composés, appelés cannabinoïdes, parmis lesquels le ∆9-tétrahydrocannabinol (ou THC) est le plus abondant. Le THC est principalement responsable des effets toxiques et addictifs du cannabis de part ses propriétés psychoactives, et agit dans le cerveau en se fixant sur les récepteurs aux cannabinoïdes de type 1 (récepteurs CB1). Les récepteurs CB1 sont très abondants dans le système nerveux central et jouent un rôle majeur dans la régulation de l’activité neuronale. L’abus de cannabis, impliquant une action du THC sur les récepteurs CB1, peut donc être à l’origine de troubles neurologiques et psychiatriques importants. Ainsi, une meilleure connaissance du fonctionnement et de la régulation des récepteurs CB1 est primordiale pour comprendre les effets du cannabis et pouvoir les réduire. Dans ce cadre, le projet consistera à évaluer, chez des souris, la réponse comportementale à l’administration chronique de THC, mimant un état de dépendance, et à l’arrêt de ce traitement, induisant un état de sevrage. Nous chercherons à identifier des molécules pouvant diminuer les conséquences liées à la dépendance et au sevrage au THC. Cette étude contribuera ainsi à mieux comprendre les mécanismes de régulation des récepteurs CB1 dans le but de développer un traitement contre les troubles liés à l’abus de cannabis.

Bénéfices attendus

Les récepteurs aux cannabinoïdes CB1 comptent parmi les récepteurs métabotropiques les plus abondants dans le système nerveux, et participent à la régulation de nombreuses fonctions cérébrales. La dé-régulation de l’activité de ces récepteurs est ainsi associée à l’apparition de troubles neurologiques majeurs tels que l’addiction, les psychoses, l’anxiété ou encore les troubles cognitifs. L’idendification de mécanismes de régulation endogènes aux récepteurs CB1 offre donc de nouvelles pistes de recherche dans le but de développer des stratégies thérapeutiques innovantes permettant une amélioration de la qualité de vie des patients concernés. Ce projet consistera ici à produire une meilleure connaissance des mécanismes fondamentaux sous-tendant la régulation des récepteurs CB1.

Procédures

L’ensemble des gestes techniques décrits ci-après sera réalisé par une personne compétente formée à l’expérimentation animale et aux gestes techniques, qui sera sous la responsabilité du porteur de projet et sera en contact régulier avec le personnel zootechnique de l’animalerie d’expérimentation et les responsables du bien-être animal. 1) Administrations per os par gavage: Ces administrations seront réalisées sur un total de 216 animaux vigiles dans la limite des volumes d’injections préconisés pour la taille et l’espèce des animaux. L’ensemble des animaux recevra deux injections par jour espacées de 8h minimum pendant 6 jours maximum. 2) Injections sous-cutanées: ces injections seront réalisées sur un total de 144 animaux vigiles dans la limite des volumes d’injections préconisés pour la taille et l’espèce des animaux. L’ensemble des animaux recevra deux injections par jour espacées de 8h minimum pendant 6 jours maximum. 3) Injections intra-péritonéales: ces injections seront réalisées sur un total de 792 animaux vigiles dans la limite des volumes d’injections préconisés pour la taille et l’espèce des animaux. L’ensemble des animaux recevra deux injections par jour espacées de 8h minimum pendant 6,5 jours. 4) Tests comportementaux : L’ensemble des tests comportementaux prévus dans cette étude concernera 504 animaux. Les tests, classiquement utilisés chez la souris, seront réalisés sur des animaux vigiles. 5) Mise à mort : Un total de 792 animaux fera l’objet d’une mise à mort rapide. Celle-ci sera réalisée chez les animaux sans anesthésie au préalable dans la limite des contraintes techniques imposées par les analyses faites ex vivo.

Impact sur les animaux

L’administration de substances par voie intra-péritonéale, sous cutanée et/ou orale par gavage, ainsi que la contention nécessaire à la réalisation des administrations entrainent des douleurs et du stress. Des nuisances pourraient survenir à la mise en cage individuelle des animaux en raison du stress lié à l’isolement. De plus, les administrations de THC et l’exposition à des tests évaluant le comportement de type anxiété peuvent engendrer des effets indésirables et du stress.

Devenir

Procédures I et II : Les animaux seront mis à mort pour le prélèvement du sang et du cerveau pour des analyses ex vivo ultérieures. Ces procédures se feront sans utiliser d’anesthésie, celle-ci pouvant modifier les paramètres mesurés (quantification des endocannabinoïdes et neurostéroïdes) et induire ainsi des biais expérimentaux.

Remplacement

Dans le cadre de la stratégie de remplacement, des approches substitutives à l’expérimentation animale ont été réalisées en amont de ce projet. Des analyses in silico nous ont permis d’identifier le site de fixation allostérique de la pregnenolone sur le récepteur CB1. De plus, des études in vitro ont permis de montrer l’effet régulateur de la pregnenolone et de ses analogues sur le récepteur CB1. Ce projet s’applique maintenant à l’étude de systèmes intégrés qui ne peuvent être réalisés que chez l’animal.

Réduction

Dans le cadre de la stratégie de réduction, notre expérience au sein du laboratoire nous a permis de déterminer qu’un nombre de 8 souris par groupe expérimental est nécéssaire pour les prélèvements et analyses ex vivo, afin d’obtenir des données représentatives de l’échantillon de population. Ce nombre sera porté à 12 souris par groupe pour les analyses comportementales, afin de pallier à la variabilité inter-individuelle et pouvoir réaliser des analyses statistiques cohérentes. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles afin de déterminer d’éventuelles différences liées au sexe. Le cas contraire, les données des mâles et femelles seront regroupées de sorte à augmenter le nombre d’individu par groupe pour étudier les effets traitement. Enfin, les études réalisées au cours du projet précédent et une connaissance accrue de la bilbiographie sur la pregnénolone et le récepteur CB1 nous ont permis de déterminer les doses effectives pour les traitements pharmacologiques. Ceci nous permet de proposer des groupes expérimentaux pertinants avec des conditions témoins appropriées.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne, et ce dès leur réception. La manipulation des animaux et les soins éventuels seront prodigués par des personnes habilitées à l’expérimentation animale et compétentes, en accord avec la grille de score des points limites. De plus, une personne habilitée sera en charge de vérifier le pourcentage d’humidité dans l’air et la température, ainsi que le niveau sonore (si un bruit anormal survient) dans les pièces d’hébergement et d’expérimentation afin de détecter d’éventuelles nuisances et alerter les personnes compétentes pour pallier à celles-ci. A leur réception, les souris seront maintenues en cages d’hébergement collectives en présence d’enrichissement (carrés de cellulose, sizzle, tunnels en carton), et ce jusqu’à une semaine avant le début des expériences. Les animaux seront alors placés dans des cages individuelles transparentes et rapprochées les unes des autres afin de maintenir des contacts olfactifs et visuels entre les animaux et en présence du même enrichissement. La mise en cage individuelle est ici nécéssaire afin de minimiser l’impact potentiel de la hierarchie sociale sur le phénotype des et afin de reproduire les conditions d’hébergement dans le projet précédent. De plus, les animaux seront manipulés par un expérimentateur habilité à l’aide des tunnels en carton, afin de réduire le stress lié à cette manipulation. Les expériences seront réalisées dans une pièce dédiée dans l’animalerie, et les animaux seront transférés au minimum 30 minutes avant le début des tests dans la pièce d’expérimentation afin de les familiariser à ce nouvel environnement. Le cas échéant, un enrichissement supplémentaire pourra être apporté dans les cages d’hébergement afin d’optimiser le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal courant pour les études pharmacologiques et l'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permettra une éventuelle transposition des résultats obtenus dans le projet de recherche à l'homme (dans les études de recherche et de développement). De plus, les effets comportementaux des cannabinoïdes ont été bien décrits et validés chez la souris. Les expériences seront réalisées sur des animaux jeunes et adultes (âgés de 2 à 5 mois). Ce projet se fera dans la continuité des projets précédents menés sur des animaux du même âge, ce qui nous permettra de compiler les données obtenues entre les différents projets et ainsi faire progresser nos connaissances sur les mécanismes de régulation endogène du récepteur CB1.

1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans le cerveau une injection de neurotoxine détruisant les neurones dopaminergiques pour reproduire des symptômes de la maladie de Parkinson, puis subit jusqu'à sept tests moteurs et cognitifs, de rotation, d'agilité, de mémoire ou de force de préhension. Le porteur indique que la neurotoxine provoque une réduction de mobilité et une forte perte de poids, et qu'environ 33 % des souris ne survivent pas aux trois jours suivant la chirurgie. Il affirme que ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles reposent sur un modèle murin de la maladie.

Objectifs

La maladie de Parkinson est caractérisée par une dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques de la substantia nigra (SN) et une dérégulation de l'activité des interneurones dans le cortex moteur primaire. Ce projet vise à évaluer l'impact de cette dégénérescence sur l'expression des gènes, les marques épigénétiques, et le statut de maturation des interneurones du cortex moteur. Nous utiliserons un modèle de souris pour la maladie de Parkinson qui consiste en une ablation unilatérale des neurones dopaminergiques de la SN. Bien que ce modèle ne récapitule pas toutes les caractéristiques de la maladie de Parkinson, la perte importante de ces neurones entraîne plusieurs symptômes de la maladie de Parkinson, notamment des déficits moteurs, qui sont quantifiables. Les objectifs majeurs du projet sont d’analyser les changements moléculaires et physiologiques dans les interneurones du cortex moteur primaire suite aux lésions, de comparer les changements dû au sexe, et d'identifier des cibles thérapeutiques modifiables dans ces interneurones afin de restaurer une activité normale des neurones moteurs. Ce projet impliquera 1680 animaux et ne peux pas être remplacé par d’autres modèles. Plusieurs analyses seront effectuées sur chaque animale afin de réduire leur nombre, et des mesures spécifiques assureront le minimum de nuisances sur le bien-être des animaux. Ce projet permettra de mieux comprendre la maladie de Parkinson et d’ouvrir de nouvelles perspectives pour son traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet analysera les changements moléculaires et physiologiques dans les interneurones du cortex moteur primaire de la souris adulte en réponse aux lésions de la substantia nigra comme modèle de la maladie de Parkinson. Ce projet permettra d'identifier des cibles thérapeutiques modifiables dans ces interneurones pour restaurer une activité normale de neurones moteurs, et d’identifier les diffénces dû au sexe. Ce projet permettra de mieux comprendre la maladie de Parkinson et d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement de cette maladie.

Procédures

Une injection stéréotaxique intracérébrale sera effectuée sur des animaux anesthésiés ; cette procédure chirurgicale dure environ 1 heure et sera effectuée une seule fois. Certains animaux seront implantés avec une canule intracérébrale ; cette procédure chirurgicale stéréotaxique sera effectuée sur des animaux anesthésiés, dure environ 1 heure, et sera effectuée une seule fois. Les animaux seront soumis au test de tendance à la rotation qui durent 10 minutes et sera répété 4 fois. Les animaux seront soumis 2 fois à un test de capacité motrice qui durent 3 minutes par jour sur 5 jour. Certains animaux seront soumis à un seul test qui évalue le niveau d'anxiété et dure 30 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test d'agilité qui dure 2 minutes par jour sur 5 jour. Certains animaux seront soumis à un seul test de mémoire spatiale qui dure 30 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test de capacité sensorimotrice qui dure 5 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test de force de saisie qui dure 3 fois 1 minute. Certains animaux seront soumis à un seul test de force neuromusculaire qui dure 3 fois 1 minute..

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale. L’injection de la 6-OHDA (neurotoxine catécholaminergique) peut avoir des effets neurotoxiques qui durent plusieurs jours, entraînant une réduction de mobilité et une perte de poids importante ; le rétablissement complet est attendu au bout de 2 à 3 semaines. Environs 33% des souris ne survivent pas les 3 premiers jours suivant la chirurgie. Les tests de comportement et leur multiplicité peuvent provoquer du stress et de la fatigue chez les animaux. Ils seront soumis à un maximum de 7 tests différents sur une période de 5 jours afin d'évaluer divers aspects de leur comportement locomoteur.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur cerveau sera collecté afin de permettre des analyses histochimiques et biochimiques.

Remplacement

Nos recherches sur les effets de la dégénérescence des neurones dopaminergiques nécessitent des souris pour comprendre comment cela impact les circuits cérébraux implicants notament les interneurones du cortex moteur. Nous utilisons la souris comme modèle pour s'appuyer sur les résultats de recherches antérieures. Ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles dépendent d’un modèle murin de la maladie de Parkinson.

Réduction

Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies de plusieurs analyses comportementales nous ont permis de définir le nombre d’animaux par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Nous effectuerons plusieurs analyses (comportement, histologie, biochimie) sur chaque souris, ce qui nous permettra de réduire davantage le nombre d'animaux.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée à un traitement analgésique. Après la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage chauffée avec une lampe chauffante jusqu'à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leur groupe d'origine pour éviter le stress de l'isolement. Pour évaluer les points limites, les souris seront inspectées quotidiennement afin de détecter les signes d'infection et de douleur (changement de posture, de pelage, d'expression faciales), et des mesures de poids seront prises au moins deux fois par semaine. En cas d'infection ou de signes de douleur, les animaux recevront un traitement approprié. En cas de perte de poids, les animaux seront placés dans des cages chauffées et recevront un régime alimentaire enrichi. Les animaux seront euthanasiés si aucune amélioration n'est constatée après 2 jours de traitement ou si la perte de poids dépasse 20% du poids de départ.

Choix des espèces

La génétique de la souris est très bien connue et proche de celle de l'homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude de la maladie de Parkinson. C'est un animal avec lequel nous avons l'habitude de travailler et pour lequel nous avons une bonne expertise pour réduire les conditions de stress, d'inconfort et de douleur. Il nous permet également de créer des modèles pour l'étude des pathologies humaines. Ce projet implique un modèl de la maladie de Parkinson qui nécessite des souris adultes. Les lesions de la subsantia nigra seront effectuées sur des souris agées de 60 jours, lorsques elles sont considérées comme jeunes adultes. Les injections stéréotaxiques sont effectuées 3 semaines après une lesion afin de respecter une période de récuperation. Le comportement sera évalué pendant 2 sessions : 1) vers 2 semaines après lesion et 2) vers 3 semaines après injections stéréotaxiques (entre 100 et 120 jours).

61 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trente-huit reçoivent une greffe de tumeur mammaire, puis des injections de paclitaxel qui provoque une hypersensibilité au toucher et au froid, mesurée par des tests répétés pendant trois semaines, et toutes subissent une chirurgie cutanée avant la mise à mort. Le porteur affirme qu'en dehors des tests les souris ne montrent aucun signe de souffrance ni de perte de poids, tout en reconnaissant que la croissance de la tumeur peut endommager les tissus et provoquer des douleurs. Le projet vise à ajouter une tumeur aux modèles existants de neuropathie chimio-induite, un outil destiné à de futurs tests de molécules.

Objectifs

Les neuropathies périphériques associées de douleurs neuropathiques induites par les agents anticancéreux neurotoxiques représentent une des causes principales de l’altération de la qualité de vie des patients survivant à un cancer. Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie (NPIC) sont très fréquentes, plus de 60 % des patients sous chimiothérapie anticancéreuse, et impactent fortement la bonne mise en œuvre des protocoles de chimiothérapie, pouvant conduire à une diminution des chances de survie des patients. A ce jour, il n’existe aucun traitement preventif contre les NPIC. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pharmacologiques spécifiques des NPIC représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge des patients traités par chimiothérapie anticancéreuse. Un modèle de neuropathie sensitive induite par le paclitaxel, un agent anticancéreux communément utilisé dans la prise en charge du cancer du sein triple négatif, a déjà été développé et caractérisé, et a permis de mettre en évidence les propriétés neuroprotectrices de plusieurs molécules. In vitro, l’effet de l’interaction bénéfiques des molécules neuroprotectrices sur l’activité cytotoxique des chimiothérapies, ainsi que leur potentiel anticancéreux propre a été mis en évidence sur des lignées cancéreuses humaines. Fort de ces résultats, nous souhaiterions poursuivre dans un modèle animal plus intégratif impliquant les phénomènes de douleur et d’inflammation. Aucun modèle animal de neuropathie sensitive induite par le paclitaxel et associée à un cancer n’a encore été développé. Un tel modèle permettrait de mieux comprendre le lien entre le cancer et le développement des neuropathies associées à la chimiothérapie neurotoxique et d’évaluer l’effet de molécules candidates neuroprotectrices sur les douleurs induites par la chimiothérapie, ainsi que sur l’activité antitumorale de la chimiothérapie. L’objectif est de mettre en place et caractériser un modèle syngénique de cancer de sein sensible au paclitaxel, et dévellopant une neuropathie induite par le paclitaxel. Le modèle syngénique (greffe de même fond génétique que l'hôte), contrairement au modèle de cancer humain xénogreffé, permet de conserver une immunocompétence. L’intérêt est de pouvoir mettre en évidence l’implication du système immunitaire et de l’inflammation dans le développement des neuropathies chimio-induites en présence d’un cancer.

Bénéfices attendus

L’intérêt principal de ce modèle de neuropathie chimio-induite est la présence de la tumeur. Ce modèle fournira un outil pour la mise en place de nouvelles thérapeutiques neuroprotectrices dans un contexte de chimiothérapie néoadjuvante neurotoxique associé à une chirurgie. Les modèles murins actuels de neuropathie chimio-induite sont exempts de tumeur. Le modèle proposé permettra d’évaluer l’impact de la présence d'une tumeur sur l'évolution de la neuropathie chimio-induite. Ce modèle permettra également, dans des porjets futurs, de valider si nos molécules neuroprotectrices, interagissent avec l’activité anti-tumorale du paclitaxel dans un modèle intégré.

Procédures

Trente huit souris recevront une injection sous-cutanée au niveau du flanc droit de cellules cancéreuses murines. Ving-trois souris recevront une injection sous-cutanée au niveau du flanc droit de 200 µL de sérum physiologique. Cette étape sera réalisée sous anesthésie légère à l'isoflurane pour l'ensemble des animaux. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisée à l'aide de la mesure au pied à coulisse de la tumeur 3 fois par semaine, sous anesthésie légère à l'isoflurane, seuls les animaux ayant reçu des cellules cancéreuses subiront cette intervention. Ving-neuf animaux recevront 4 injections intrapéritonéales de chimiothérapie (1 injection tous les deux jours pendant 7 jours), et les animaux contrôles recevront 4 injections intrapéritonéales de sérum physiologique selon le même shéma. L'ensemble des animaux (soit 61) subiront une chirurgie cutanée, avec résection de la tumeur sous-cutanée pour les animaux ayant une tumeur et ouverture des plans cutanés pour les animaux sans tumeur. Durant la procédure chirurgicale, les animaux seront anesthésiés à l'isoflurane et recevront une injection sous cutanée de lidocaïne en pré-médication et une injection sous cutanée de buprénorphine en post-médication. L'ensemble des animaux sera soumis à deux test comportementaux; l'un évaluant la sensibilité tactile et l'autre la sensibilité thermique, tous les 3 jours pendant 21 jours environ.

Impact sur les animaux

La neuropathie périphérique induite par le paclitaxel, un agent anticancéreux, se manifeste chez l'Homme par des troubles de la sensibilité, des douleurs neuropathiques ou des faiblesses. Notre équipe a développé et caractérisé chez la souris un modèle de neuropathie induite par le paclitaxel dans lequel nous observons l'apparition d'une hypersensibilité tactile et d’une hypersensibilité au froid en réponse à un stimulus. Les animaux ne présentent aucun trouble moteur (la coordination motrice et la force musculaire ont été évaluées). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu du paclitaxel ont un comportement similaire aux animaux contrôles et ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids. La croissance de la tumeur peut générer des nuisances telles que des dommages aux tissus environnants, induissant des douleurs et de l’inconfort, le développement potentiel de métastases. Les souris peuvent souffrir de faiblesse et de déficience physique en raison de la croissance tumorale et de la propagation de la maladie. Les points limites permettront de limiter au maximum ces nuisances.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations morphologiques associées au paclitaxel et au développement de la tumeur seront mises en évidence par l’analyse histologique et immunohistologique. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêt seront prélevés sur chaque animal.

Remplacement

Il n'y a actuellement aucune méthode de remplacement pour l'expérimentation animale qui reproduit tous les mécanismes impliqués dans la génération de douleur causée par les cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi un modèle qui suit le protocole d'injection des agents anticancéreux le plus proche de celui utilisé chez l'Homme. Une étude in vitro est en cours pour évaluer l'effet des molécules neuroprotectrices sur les neurones sensoriels humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites. Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, etc.) impliqués au niveau des neurones sensoriels humains, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation liés aux neuropathies induites par le paclitaxel (utilisé en chimiothérapie) ainsi que la complexité des phénomènes qui aboutissent à la sensation douloureuse. De même, l’effet de nos molécules neuroprotectrices sur l’activité cytotoxique du paclitaxel a été évalué in vitro sur des lignées cancéreuses humaines.

Réduction

Le nombre de 10 animaux par groupe pour l’étude principale a été déterminé avec un test statistique spécifique qui estime un nombre total de 32 animaux (avec 9 mesures de la sensibilité), soit 8 par groupes (en estimant une prise de tumeur de 100 %). L'analyse statistique sera réalisée à l'aide d'un logiciel dédié. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, les tests de comportements puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements de tissus seront effectués sur chaque animal mort. Les résultats générés par les animaux de l'étude pilote (n = 3) pourront être utilisés pour l'analyse statistique de l'étude principale et ainsi permettre d’augmenter le nombre d'animaux de l'étude principale.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seuls des test d'évitements seront utilisés pour l'évaluation de la sensibilité, et une valeur limite est établie pour chaque test à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés à la molécule de chimiothérapie doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux contrôles pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses aux tests comportementaux seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal. Les animaux seront anesthésiés légèrement pendant l’injection sous-cutanée des cellules cancéreuses et à chaque contrôle de la croissance tumorale au pied à coulisse. Pendant la chirurgie, les animaux seront profondément endormis par anesthésie gazeuse. Une anesthésie local sera réalisée au niveau du site de la tumeur avant résection. Un onguent ophtalmique sera appliqué durant l’anesthésie afin d’éviter un dessèchement oculaire. Une injection sous-cutanée d'analgésique sera réalisée avant le réveil, afin de diminuer les douleurs post-opératoires et faciliter la récupération. La température corporelle sera maintenue tout au long de la chirurgie à l’aide d’un tapis chauffant, puis à l’aide d’une lampe chauffante durant la phase de réveil.

Choix des espèces

Ces modèles murins de neuropathie induites ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Le choix de la lignée de cellule cancéreuse murine et de la souche de souris a été déterminé pour limiter les risques de réaction immunitaire et de rejet. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit de la vincristine, un anticancéreux qui provoque une hypersensibilité douloureuse au toucher, mesurée par l'application de filaments sous la patte à plusieurs reprises, avant que les animaux soient tués pour l'analyse des nerfs. Le porteur affirme que les souris ne présentent en dehors des tests aucun signe de souffrance ni de perte de poids, et teste un composé censé prévenir cette neuropathie. Les bénéfices avancés, un futur essai clinique chez des patients sous chimiothérapie, sont renvoyés au conditionnel et au long terme.

Objectifs

Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie sont le second effet indésirable le plus fréquent après l’hépatotoxicité. Dans le domaine de l’onco-hématologie, la vincristine, un agent anticancéreux commumément utilisée pour la prise en charge des lymphomes, constitue une des chimiothérapies les plus neurotoxiques et est responsable de la neuropathie induite par la vincristine, caractérisée notamment par l'apparition d'une hypersensibilité tactile douloureuse. Cette complication impacte autant la qualité de vie des patients que la bonne mise en œuvre des protocoles de chimiothérapie. Pour autant, il n’existe à ce jour aucune stratégie pharmacologique préventive reconnue. Avec une incidence croissante de 25 millions de cancers par an à travers le monde, on comprend que le développement de telles stratégies neuroprotectrices constitue un enjeu de santé publique. Le système rénine-angiotensine, bien connu dans la régulation de la pression artérielle, est également exprimé au niveau du système nerveux périphérique. Il a déjà été démontré que la modulation pharmacologique des récepteurs à l’angiotensine II, permettait d’exercer un effet neuroprotecteur dans plusieurs modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Le système rénine-angiotensine, bien connu dans la régulation de la pression artérielle, est également exprimé au niveau du système nerveux périphérique. Certains éléments du système rénine angiotensine, peu étudiés, pourraient jouer un rôle important dans les phénomènes de neuroprotection/neurorégénération du nerf périphérique. L’activation d'un récepteur du systéme rénine-angiotensine présenterait des propriétés analgésique et neurorégénérative au niveau du système nerveux périphérique. Nous supposons que l'activation de ce récepteur par un traitement préventif pourrait également avoir des effets neuroprotecteurs en l’administrant avant la chimiothérapie. A court terme, nous nous attendons à ce que ce traitement préventif améliore la sensibilité tactile chez des animaux ayant reçu de la vincristine et présentant une hypersentibilité tactile, et restaure/prévienne également les altérations morphologiques des tissus du système nerveux sensitif induites par la chimiothérapie. A plus long terme, nous espérons réaliser la même étude sur nos modèles de neuropathie induite par le paclitaxel et l’oxaliplatine, deux autres agents anticancéreux neurotoxiques, avec un effet bénéfique attendu du traitement préventif sur les troubles sensitifs et les atteintes nerveuses induites par les chimiothérapies. La mise en évidence d’un effet neuroprotecteur du traitement préventif dans nos modèles animaux permettrait de faciliter la translation chez l’Homme, avec la mise en place rapide d’un essai clinique évaluant son effet sur le développement des neuropathies induites par la chimiothérapie.

Procédures

Chaque animal (soit 100 animaux) recevra une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 7 jours. Sur les 100, 35 animaux subiront une injection i.p. le matin du traitement préventif puis une injection i.p de vincristine l'après-midi. Sur ces 35 animaux, 10 recevront en plus une injection sous-cutanée d'un bloqueur une heure avant l'i.p. du traitement préventif. L'ensemble des animaux sera également soumis au test des filaments qui permet d'évaluer le dégré de sensibilité tactile, une fois avant le début des traitements puis à J1, J3 et J7. L'injection intrapéritonéale a été privilégiée par rapport à l'injection intra-veineuse. Les injections seront répétées tous les jours pendant 7 jours, ainsi la répétition des injections sera plus aisée en intrapéritonéal qu'en intraveineux. La pose d'un cathéter a été exclu afin de garantir une liberté de mouvement totale à l'animal nécessaire pour le test comportemental. L'injection du bloqueur, qui n'est pas un produit irritant, se fera en sous-cutanée, afin de ne pas dépasser le nombre de deux injections i.p. par jour.

Impact sur les animaux

Nous avons déjà dévellopé et caractérisé le modèle de neuropathie induite par la vincristine. Dans ce modèle, nous observons l’apparition d’une allodynie mécanique suite à l’administration de vincristine. Cette allodynie se traduit par une hypersensibilité en réponse à un stimulus focalisé qui est l’application d’un filament sur la voute plantaire. Les animaux ne présentent aucun trouble moteur (la coordination motrice et la force musculaire ont été évaluée). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu de la vincristine présentent un comportement tout à fait similaire aux animaux témoins. Ils ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids. Ainsi, nous nous attendons à ce que les animaux recevant de la vincristine et le traitement préventif présentent une amélioration de leur symptômes, à savoir un retour à la normale de la sensibilité tactile.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations morphologiques associées à la vincristine et aux traitements seront mises en évidence par l’analyse histologique et immunohistologique des tissus du système nerveux sensitif. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêts seront prélèvés sur chaque animal.

Remplacement

Il n'existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l'expérimentation animale disponible qui reproduit l'ensemble des mécanismes mis en jeu à la génération d'une douleur induite par des cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi un modèle dont la séquence d'injection des agents anti-cancéreux est la plus conforme aux protocoles de chimiothérapies neurotoxiques utilisés chez l'Homme. En parallèle de cette étude chez la souris, une étude in vitro évaluant l'effet de la vincristine et de sa combinaison avec le traitement préventif sur des neurones sensitifs humains dérivés est en cours. Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, ...) mis en jeu au niveau du neurone sensitif humain, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation inhérents aux neuropathies induites par la chimiothérapie, ainsi que toute la complexité des phénomènes aboutissant à la sensation douloureuse.

Réduction

Le nombre de 10 animaux par groupe a été calculé à partir de résultats (moyenne et écart-type) obtenus au cours d'une étude sur le modèle de neuropathie induite par la vincristine. L'analyse statistique sera réalisée à l'aide de deux logiciels. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, le test de comportement puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements seront effectués sur chaque animal mort avant qu'il soit placé dans le congélateur de cadavres.

Raffinement

Une étude pilote permettra d'évaluer l'effet du traitement préventif sur l’état général des animaux et le développement d'une neuropathie sensitive sans troubles moteurs dans nos conditions d"hébergement : l’apparition de signes de souffrance ou de toxicité sera évaluée à l’aide d’une grille de suivi biquotidien et l'apparition de la neuropathie sensitive sera évaluée à l'aide d'un test d'évaluation de la sensibilité tactile. Si le score pour au moins 1 souris est supérieur à 10 alors cette étude pilote sera renouvelée avec des doses deux fois inférieures. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de cette étude pilote, et que le traitement préventif ne présente pas d’effet positif sur la neuropathie, alors la même étude sera réalisée sur deux nouveaux groupes de 5 souris. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de l’étude pilote, et que le traitement préventif présente un effet positif sur la neuropathie alors nous procèderons à l’étude principale, à la dose efficace. Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seul un test d'évitement sera utilisé pour l'évaluation de la sensibilité, et une valeur limite est établie pour chaque test à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés à la vincristine et/ou au traitement préventif doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux contrôle pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses au test comportemental seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal.

Choix des espèces

Des modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique. Ces conditions sont les mieux réunies avec des adultes jeunes (7-8 semaines, poids 25-30g).