Système nerveux

330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection sous-rétinienne de nanoparticules puis subit des examens d'imagerie et un électrorétinogramme sous anesthésie, un test comportemental optocinétique sur animal vigile et une craniotomie terminale, avant d'être tué pour prélever les yeux. Le porteur indique que l'injection peut provoquer inflammation, décollement ou déchirure de la rétine et opacité de la cornée. Il présente les nanoparticules comme une piste de restauration visuelle pour les rétinites pigmentaires, les bénéfices pour les personnes restant à valider.

Objectifs

La rétinite pigmentaire désigne un ensemble de pathologies progressives et héréditaires de la rétine qui mène à une cécité incurable et qui atteint plus d'un million de personnes à travers le monde. Elle résulte de la mutation dans un gène spécifique des photorécepteurs à bâtonnets, la rhodopsine, qui provoque la perte de ces neurones. Cette disparition provoque par la suite la dégénérescence progressive et secondaire des photorécepteurs à cônes. Récemment, il a été montré chez un modèle de rat aveugle qu'il est possible de réactiver la rétine dégénérée par des implants constitués de nanoparticules. Les nanoparticules peuvent être délivrées dans l’œil par des injections et s’ancrer aux membranes des neurones cibles de la rétine pour convertir les stimuli lumineux en une stimulation électrique. Ainsi les photorécepteurs endommagés sont rendus à nouveau sensibles à la lumière grâce à ces nanoparticules. Cependant, il reste à comprendre quel champ de vision et quelle acuité visuelle sont réellement retrouvés. Cette étape est essentielle pour évaluer le bénéfice qui pourrait être apporté par ce type de thérapie chez des patients. Il est aussi important d’étudier la distribution et l’évolution de ces nanoparticules dans l’œil après injection et de s’assurer de leur biocompatibilité par l’absence de réactions inflammatoires. L'objectif de ce projet est d'évaluer ces paramètres (biocompatibilité, distribution, acuité visuelle) chez un modèle murin de rétinite pigmentaire. La validation fonctionnelle sera réalisée par des tests comportementaux (test optomoteurs), l’enregistrement de l’activité électrique de l’œil in vivo (electrorétinogramme) et par l'enregistrement de l’activité cérébrale des animaux en expérimentation terminale, soit par une technique d'imagerie fonctionnelle ultrasonore non invasive, soit par une méthode électrophysiologique (potentiels visuels évoqués) au niveau du cortex visuel.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous cherchons à réactiver la vision au niveau de la rétine et à étudier si la thérapie choisie permet une transmission de l’information visuelle au cerveau. L’approche retenue pour notre étude est l’injection sous-rétinienne de nanoparticules. Il s’agit de remplacer les photorécepteurs absents par un système de stimulation électrique des neurones rétiniens restants. La finalité de l’étude est de valider un nouveau modèle d’implant basé sur des nanoparticules, plus performant et répondant au critère de biocompatibilité. Ces avancées biomédicales permettront de développer de nouvelles méthodes d'interfaçage des stimuli optiques avec le système nerveux pour le traitement des pathologies dans lesquelles la dégénérescence neuronale a induit une perte de fonction spécifique et irréversible. Le modèle murin présente un fort intérêt pour cette étude car l’architecture oculaire est très proche de celle de l’œil humain et le modèle de dégénérescence est similaire à celui rencontré dans les rétinites pigmentaires

Procédures

Procédures chirugicales (2): - Injection sous-rétinienne (1 fois par animal), sous anesthésie générale (gazeuse), 10 min; - Craniotomie + Enregistrement des potentiels évoqués visuels et Imagerie ultrasonore , (1 fois par animal, expérimentation terminale) sous anesthésie générale (fixe), 60 min; / Examens sous anesthésie générale:- Examen d’imagerie (2 à 6 fois par animal) sous anesthésie générale (gazeuse), 10 min; - ERG (1 fois par animal) sous anesthésie générale (fixe), 30 min;/ Test comportemental optocinétique (2 à 4 fois par animal) sur animal vigile, 15 min.

Impact sur les animaux

Les possibilités de nuisance sont essentiellement liées à : -Une mauvaise réaction à l’anesthésie (gazeuse ou fixe). -à l’injection : une éventuelle inflammation due aux nanoparticules (d’où l’étude) des problèmes de dégradation de l’œil : décollement de rétine, rétine déchirée, d’atteinte oculaire (inflammation, d’opacité cornéenne, paupières mi-closes, yeux gonflés etc.).

Devenir

L’euthanasie est requise pour permettre le prélèvement des yeux des souris, qui seront ensuite étudiés par des analyses histologiques. Tous les animaux des procédures seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Remplacement

Dans ce projet, l’évaluation des réactions inflammatoires (biocompatibilité des nanoparticules) et la restauration de la vision au niveau de la rétine ainsi que la transmission de l’information visuelle au cerveau ne peuvent pas être réalisées par des expérimentations ex vivo. L’acuité visuelle ne peut être évaluée que par des tests comportementaux chez l’animal in vivo. Les mécanismes physiologiques (dépolarisations corticales) et variations de flux sanguin au niveau du cortex visuel, ne peuvent être observés que sur un cerveau en fonctionnement. L’utilisation de l’animal est donc indispensable.

Réduction

Basé sur l’expertise du laboratoire et sur des projets proches, le nombre d’animaux (330) a été estimé pour obtenir un nombre minimum de résultats significatifs tenant compte des éventuelles pertes dues à une mauvaise injection, une mauvaise réaction à l’anesthésie, ou par atteinte des points limites durant les procédures expérimentales. La rédaction d’un protocole précis ainsi que la bonne maîtrise des outils de chirurgie et d’imagerie par les expérimentateurs correspondants permet de minimiser les pertes inutiles. Une analyse de puissance statistique a été faite et le nombre d’animaux utilisé par protocole expérimental a été estimé en vue d’atteindre un compromis entre une puissance élevée et un nombre d’animaux raisonnable. Des tests statistiques seront effectués (test t de Student, analyse de variance...) et permettront de minimiser le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum. Les animaux sont hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (cotons + tunnel en carton + bâton en bois) alimentation et abreuvement à volonté. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. L’atmosphère est contrôlée pour les conditions d’hébergement (température et hygrométrie stable). Les animaux bénéficieront si nécessaire d’une anesthésie gazeuse par inhalation ou d’une anesthésie fixe par injection intrapéritonéale. Des analgésiques seront administrés, pour que l’animal sous anesthésie ou en post-opératoire, ne ressente aucune douleur pendant les procédures expérimentales. Une observation régulière des animaux sera effectuées et suite aux procédures chirurgicales, une signalétique spécifique permettra une surveillance quotidienne adaptée des animaux. La structure de bien-être animal (SBEA) a mis en place des étiquettes indiquant "Suivi post-opératoire" qui sont à apposer sur le porte-étiquette de la cage juste après une intervention chirurgicale. Cela permet à la zootechnie lors de leur tour bien-être animal deux fois par jour d'avoir l'indication rapide que les animaux ont été opéré et ainsi ouvrir la cage et procéder à la vérification. L'expérimentateur qui vient faire son suivi post-opératoire est en charge de retirer cette dernière quand l'animal a complètement récupérer de l’opération. Tous signes d’inconfort ou de détresse sera pris en compte tels que l'apparence et la position anormale : poil ébouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, couché sur le côté; comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit, changement des périodes de sommeil, réduction de la mobilité. Les points limites sont: État de choc, léthargie, inconscience, immobilité. Difficultés respiratoires. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées et de notre expérience sur ce modèle.

Choix des espèces

Le modèle murin présente une architecture de l’œil très proche de celui humain, une organisation de la rétine similaire. De plus l’existence d’un modèle génétique de rétinite pigmentaire proche du phénotype humain, avec une dégénérescence rapide (aveugle à 60 jours convient parfaitement à notre étude. Au contraire, le modèle de rat aveugle que nous utilisons pour d’autres études dégénère moins vite (environ 9 mois) entraînant des conditions d’hébergement plus compliquées. Les souris seront âgées de 6 semaines à leur entrée dans l’animalerie et respecteront 5 jours d’acclimatation minimum. La première procédure expérimentale sera l’injection à l’âge de 8 semaines. C’est à cet âge que la rétinite pigmentaire des animaux sera suffisamment avancée (animal considéré aveugle) pour nos études sur les nanoparticules.

5 236 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent neuf tests comportementaux moteurs (activité locomotrice, coordination, force d'agrippement, anxiété), jusqu'à quatre injections et une chirurgie cérébrale sous anesthésie, certaines lignées mutantes voyant environ 30 % des souriceaux mourir avant l'âge adulte. Le porteur étudie des formes génétiques de dystonie qu'il qualifie lui-même de rares, tout en mobilisant plus de cinq mille souris. Il reconnaît l'existence de modèles cellulaires et informatiques mais affirme qu'ils ne peuvent "pas encore se passer" de l'expérimentation animale, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au long terme.

Objectifs

La dystonie est un trouble moteur caractérisé par des contractions musculaires pathologiques, provoquant des postures et/ou des mouvements anormaux, qui sont très handicapants et douloureux dans les formes graves. Les possibilités de traitements médicaux restent limitées, parce que les mécanismes physiopathologiques de cette maladie sont encore mal connus. Des altérations des voies de signalisation impliquant l’adénosine monophosphate (AMP) cyclique dans les neurones du striatum sont associées à différentes formes génétiques de dystonies. Le but de notre travail est d’utiliser des modèles de souris porteuses de mutations dans les mêmes gènes que ceux impliqués dans certaines formes de dystonies. L’objectif scientifique est de mieux comprendre les mécanismes physiologiques de ces maladies. Le projet consiste à caractériser les déficits moteurs et comportementaux ainsi que les altérations du fonctionnement neuronal chez les souris mutantes. De plus, nous étudierons les effets de certaines molécules pharmacologiques chez les souris mutantes, notamment dans l’espoir de trouver des médicaments capables de réduire des déficits moteurs à l’origine de la dystonie. Bien que les formes de maladies étudiées soient rares, notre étude pourrait suggérer des pistes pour améliorer les traitements des dystonies en général et d’autres troubles des mouvements.

Bénéfices attendus

Le projet fera progresser les connaissances dans les domaines de la physiopathologie des dystonies. Nous chercherons à trouver des traitements pharmacologiques susceptibles de réduire les troubles moteurs détectés dans les souris mutantes. En cas d’effets bénéfiques, les molécules actives constitueraient de nouvelles pistes thérapeutiques pour soigner les dystonies avec des retombées à long terme en médecine humaine.

Procédures

- 9 tests du comportement moteur : activité locomotrice (sessions de 5 min à 32 h, au maximum 11 sessions espacées d’au moins 24 h pour un animal), coordination motrice et son apprentissage (sessions de 5 min en général, au maximum 7 sessions espacées de 5 min par jour, pendant 7 jours), force d’agrippement (maximum 6 tests de quelques secondes, espacés de 30 min), et anxiété (session journalière de 30 min à 5 min selon les tests, durant au maximum 7 jours) - Au maximum 4 injections intra-péritonéales (30 s) ou orales (30 s) d’agents pharmacologiques et même nombre d’injections des solvants utilisés pour dissoudre les agents - 1 chirurgie cérébrale sur animal sous anesthésie et analgésie pendant 30 min - Elevage de souris mutantes avec un phénotype dommageable (maximum pendant 6 mois) - En fin de procédure, euthanasie de tous les animaux par différentes méthodes en fonction du type de prélèvements et d’analyses nécessaires.

Impact sur les animaux

L’étude du comportement moteur des souris correspond à des tests assez simples (procédures d’une durée variant entre 32 h et 10 s) qui n’induisent aucune douleur, seulement un stress léger lié à la découverte de l’environnement du test. Le projet comprend plusieurs injections d’agents pharmacologiques, espacées dans le temps, sur le même animal. Les agents pharmacologiques utilisés provoquent des changements comportementaux marqués pendant un temps limité (1 à 2 h), mais ne stimulent pas directement la douleur. Certaines nuisances sont attendues en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. Dans une lignée de souris mutantes nécessaire au projet, une létalité anormale a été observée dans environ 30% des souriceaux présentant un type de mutations particulières, entre 10 et 30 jours après la naissance. Ils présentaient un arrêt de la croissance alors que les autres souriceaux avec les mêmes mutations atteignaient l’âge adulte après un développement apparemment normal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour réaliser des analyses biochimiques, histologiques et physiologiques

Remplacement

Nous étudions des fonctions spécifiques du système nerveux dont l’exploration requiert un cerveau avec le moins d'altérations possibles et donc l’expérimentation sur l’animal. Notre projet propose de disséquer les conséquences des mutations d’ADCY5 et de GNAL sur le contrôle moteur et l’apparition de mouvements anormaux, mettant en jeu différents réseaux neuronaux. Le projet utilisera des approches intégrées sur animal entier, nécessitant des souris transgéniques et des études comportementales sur l’animal vivant. Certains mécanismes cellulaires peuvent cependant être étudiés sur des cellules en culture. Des modèles mathématiques et computationnels ont été développés pour comprendre les mécanismes neuronaux que nous étudions. Cependant, nos connaissances sur les processus neurobiologiques sont limitées et les modèles in silico ne peuvent pas encore se passer de validations avec de l’expérimentation animale. Cependant, nous nous efforçons, autant que possible, d’évaluer nos approches et d’adapter nos expériences en fonction du développement des modèles computationnels ou en culture cellulaire.

Réduction

Nous chercherons à réduire le plus possible la variabilité expérimentale par des protocoles expérimentaux rigoureux et par l’utilisation de groupes d’animaux le plus stables possibles en termes génétiques et d’hébergement. Le fond génétique des souris correspondra à des lignées consanguines, et donc par définition présentant une variabilité génétique minime. De plus les groupes de souris avec les différents génotypes seront issus des mêmes portées. Au cas où les différences de genre s’avéraient ne pas présenter d’interactions significatives avec les effets des différentes mutations, nous utiliserions dans la suite de l’étude des groupes mixtes, permettant de limiter le nombre de souris d’un sexe non utilisables pour les expériences. Le nombre total d’animaux impliqués dans le projet est de 5236 souris au maximum dont 5058 dans les procédures expérimentales proprement dites et 178 souris avec un phénotype dommageable qui mourront avant leur utilisation dans les expériences. En effet, dans une lignée, au maximum 712 souris avec un génotype potentiellement dommageable seront produites, 534 incluses dans les procédures expérimentales et 178 non utilisables. D’une façon générale, les résultats seront analysés et interprétés grâce à des méthodes statistiques rigoureuses et éprouvées. La taille des groupes d’animaux inclus dans les expériences est estimée en se basant des travaux précédents. 10 animaux par groupe seront en général suffisants pour dégager des effets significatifs du point de vue statistique dans les tests comportementaux envisagés.

Raffinement

Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus au maximum et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole.

Choix des espèces

Dans le projet, la souris sera utilisée afin de tirer profit des techniques de transgénèse très efficaces dans cette espèce. La souris est le modèle le plus utilisé pour les maladies humaines du mouvement. Pour ces études, il existe de nombreux tests comportementaux qui sont développés chez la souris. La souris a des mouvements coordonnés des pattes pour des comportements moteurs élaborés et elle est déjà utilisée dans des modèles de mouvements anormaux hyperkinétiques, particulièrement pertinents dans l’étude des pathologies étudiées ici. Le striatum murin, comporte également une organisation anatomo-fonctionnelle proche de celles des primates non humains et des humains. Cela en fait ainsi un modèle particulièrement utile à l’étude d’une maladie striatale, telle que les mouvements anormaux liés aux mutations des gènes que nous étudierons. Expériences chez des animaux adultes femelles et mâles. Les animaux utilisés seront adultes avec un âge supérieur à 8 semaines. Le projet s’intéresse à la pathogenèse et la thérapeutique des mouvements anormaux qui sont observés à l’âge adulte même si les symptômes apparaissent très souvent dès le plus jeune âge. C’est pourquoi, nous n’étudierons que des animaux adultes dans le cadre de ce projet. De plus, les femmes et les hommes peuvent être affectés par les maladies étudiées et c’est la raison pour laquelle des souris femelles et mâles seront incluses dans l’étude.

645 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant vingt-huit jours des injections quotidiennes de corticostérone, l'hormone du stress, pour induire un état anxio-dépressif, puis passent une batterie de tests comportementaux (open field, labyrinthe en croix surélevé, splash test, novelty suppressed feeding, interaction sociale), avant d'être tuées pour analyser leur cerveau. Le porteur qualifie l'induction du phénotype dépressif de "nuisance légère" et affirme les nuisances "très faibles". Les bénéfices se limitent à des informations sur de nouvelles molécules contre les déficits sociaux, le porteur jugeant l'expérimentation animale "indispensable" faute de modèle in vitro.

Objectifs

L’objectif de ce protocole est de caractériser les effets de différents antidépresseurs sur different types de comportements, chez un modèle de dépression développé chez la souris. A coté des tests comportementaux utilisés pour la quantification de l'anxieté et du comportement de type depressif, le comportement de type social, qui est une caractéristique clé des rongeurs, sera evalué à l'aide de cages d'interaction sociale. Cette caractérisation phénotypique complète nécessite l’utilisation de plusieurs tests comportementaux mesurant l’état anxieux/dépressifs des animaux et l’état social, chez des souris modèles d'anxiété-dépression induit par un traitement chronique de corticostérone (hormone du stress chez les rongeurs).

Bénéfices attendus

Cette étude examinera les effets comportementaux à la fois de type anxiolytic-antidepressif, et de type social de differentes molécules chez des souris rendus anxio-dépressifs par un traitement chronique de corticostérone. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles informations surtout sur l'utilisation de certaines nouvelles molécules pour le traitement des deficits sociaux souvent présents dans les pathologies de type anxieux et dépressif.

Procédures

Administration quotidienne de médicaments par injection intrapéritonéale (réalisée en 10 secondes) pendant 28 jours. Tests comportementaux : toutes les souris seront soumises à une batterie de test comportementaux 4 tests en 5 jours : -le test de l'open field (mesure de l'activité motrice) qui dure 30 minutes, - labyrinthe en croix surélevé qui dure 5 minutes, - le splash test (observation du toilettage) qui dure 5 minutes - novelty supressed feeding qui dure 5 minutes, -test d'interaction sociale : les souris sont placées dans une cage où le comportement de chaque souris vis à vis de ses congénères est automatiquement évalué : cette évaluation a lieu 3 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Outre l'induction de phénotype dépressif qui est considéré comme une nuisance légère, les nuisances pour ces animaux sont très faibles : les tests comportentaux n'impliquent pas de douleur . Les administrations de médicaments seront réalisées par du personnel qualifié à ces techniques.

Devenir

Suite à la dernière batterie de tests comportementaux, les souris seront euthanasiés pour analyse post mortem des cerveaux

Remplacement

Dans l’état actuel des connaissances modéliser in vitro ou in silico des troubles de l’humeur n’est pas possible. Le recours à l’expérimentation animale est donc indispensable pour étudier ces pathologies et les alterations comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique. L'élément le plus important pour la réduction est l'utilisations des mêmes animaux tout au long de l'expérience chaque animal est même son propre témoin (évaluation du comportement au cours des différentes phases du protocole).

Raffinement

Au cours des semaines de traitements une surveillance quotidienne sera entreprise pour veiller au bien être des animaux. Des points limites ont été définis et seront strictements appliqués.

Choix des espèces

L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet. En effet, cette espèce a été choisie puisqu'elle permet de modéliser la pathologie dépressive ainsi que d'évaluer les différents effets des médicaments testés. Les animaux seront des adultes âgés de 6-8 semaines au moment de la réception, comme nous sommes intéressés aux effets comportementaux à l'âge adulte.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous-cutanée sous anesthésie puis des injections de morphine à doses croissantes deux fois par jour pendant six jours, pour observer les effets du sevrage sur leurs interactions sociales par un suivi vidéo. Le porteur indique que le sevrage aux opiacés provoque une douleur modérée et une perte de poids. Les souris sont ensuite tuées sans aucune analyse post-mortem, faute de pouvoir les réutiliser après un traitement pharmacologique, une mise à mort que le porteur présente comme conforme aux "3R".

Objectifs

Les troubles de consommations aux opiacés sont en forte augmentations ces dernières années et ont des conséquences dévastatrices. Ce projet de recherche vise à comprendre le développement des troubles de l’humeur (en particulier dépression et les déficits d’interaction sociale) qui se développent lors de la mise en place d’une dépendance aux opiacés. Les opiacés agissent sur un système spécifique dans le cerveau. En conditions normales, ce système régule la douleur, les processus de récompense, les réponses émotionnelles et les réponses au stress. L’exposition aux opiacés altère le fonctionnement de ce système, ce qui conduit aux troubles du comportement et de l'humeur. L’objectif de ce projet consiste à comprendre le développement de ces pathologies, en particulier les déficits sociaux en utilisant de nouveaux tests comportementaux murins permettant de suivre les interactions entre animaux en temps réel.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre l’effet des troubles de consommations aux opiacés dans les interactions sociales entre les animaux. L’appareillage utilisé effectue en effet un suivi permanent de l’activité des animaux, qu’ils soient proches de congénères ou isolés. Ce type d’analyse complexe nous permettra de poursuivre notre recherche sur les adaptations à la suite de l’abstinence aux opiacés.

Procédures

-Implantation sous-cutanée d'une puce sur l’ensemble des souris soit 90 souris. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique durant une durée de 30 minutes maximum. -Injections à doses croissantes de la morphine ou solution saline, durée moins d’une minute par injection, 2x par jour, espacées de 12 heures, pendant 6 jours sur deux groupes de souris mâles composés de 15 traités à la morphine et 15 traités à une solution saline et deux groupes de souris femelles composés de 15 traitées à la morphine et 15 traitées à une solution saline

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une implantation d'une puce permettant l'identification par radiofréquence en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse. Ensuite, ils resteront en groupe sociaux dans leurs cages d'hébergement. Après deux semaines de repos, les souris des groupes traités à la morphine ou solution saline vont subir des injections à doses croissantes de la morphine ou solution saline, par la voie intrapéritonéale 2x par jour, pendant 6 jours. Lors des périodes d'analyse, les souris seront simplement transférées dans une arène de 50 cm de côté qu'ils pourront explorer. Les expériences réalisées précédemment avec la morphine montrent une faible perte de poids totalement réversible et d'une courte durée. Il y aura une douleur induite par le sevrage opiacé qui est considérée comme modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet sans analyse post-mortem. En effet, nous ne pouvons pas réutiliser ces animaux dans une autre étude sachant qu'ils ont reçu un traitement pharmacologique. En accord avec le principe des « Trois R », ils ne seront donc pas gardés en vie, car aucune autre utilisation ne peut leur être attribuée.

Remplacement

Les effets de l’exposition aux opiacés sur le comportement et leurs conséquences ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne peuvent pas récapituler la complexité du cerveau. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes mammifères vivants et entiers. La souris est l’organisme le plus adapté car, nous pouvons étudier des comportements liés aux addictions et aux réponses émotionnelles.

Réduction

Pour cette étude, nous emploierons le minimum d'animaux pour pouvoir conclure de manière robuste et statistiquement significative. Les animaux utilisés seront consanguins, ce qui permet de diminuer la variabilité entre individus et donc de réduire le nombre d'animaux tout en mettant en évidence un effet statistiquement significatif. De plus, les mesures d'interactions sociales seront répétées au cours du temps sur les mêmes animaux ce qui permet également de réduire le nombre d'animaux. Ces expériences produisent également de nombreuses données (vidéo 3D) qui seront sauvegardées et qui permettront de faire des analyses poussées sur un nombre d'animaux limité. Nous utiliserons des tests statistiques pour étudier les données et mettre en évidence des différences significatives entre les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

Nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les réponses comportementales à l’administration d’opiacés. De plus, au cours de l’étude, tout signe d'inconfort sera pris en charge en prenant les mesures appropriées en fonction du niveau observé, limitant ainsi la souffrance à l’animal. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. Pour éviter tout stress de l'animal durant l'implantation, une anesthésie gazeuse sera effectuée.

Choix des espèces

La souris est un modèle de prédilection pour la recherche biomédicale. Avec 90% de son génome identique à l’homme, elle est aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies. Etant donnée que les pathologies neuropsychiatriques se manifestant principalement à l’âge adulte chez l’humain, notre étude se fera chez des animaux ayant atteint le stade mature de leur développement, c’est-à-dire au minimum 2 mois pour les modèles souris.

180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 mâles tués à l'issue et 60 femelles réutilisées dans d'autres projets de l'équipe. Les souris subissent une gonadectomie sous anesthésie avec pose d'implants hormonaux, puis des tests de comportement de reproduction, les femelles utilisées pour déclencher le comportement des mâles, ceux-ci étant ensuite tués pour analyser leur cerveau. Le porteur décrit des atteintes possibles allant du dos courbé et de la perte de poids rapide à l'état de choc et à la détresse respiratoire, les souris perdant 20 % de leur poids étant mises à mort. Les bénéfices se limitent à mieux comprendre l'action des hormones sexuelles sur le comportement, et le porteur affirme que l'étude ne peut se faire que sur "l'organisme entier".

Objectifs

La survie des espèces dépend de la capacité des individus à se reproduire. Pour une reproduction réussie, il faut non seulement une production de gamète (oocytes et spermatozoides) mais également l’expression des comportements de reproduction mâle et femelle optimisant ainsi la rencontre des partenaires sexuels et la fécondation. Chez le mâle, le comportement de reproduction est contrôlé par le cerveau sous l’action des hormones sexuelles : androgènes (testostérone) et des oestrogènes (oestradiol). Différentes études sur des modèles de souris ne possédant pas les récépteurs de ces hormones sexuelles dans le cerveau ont permis de montrer le rôle de la testostérone et de l’oestradiol dans la régulation du comportement sexuel mâle. Néanmoins, la manière dont les hormones agissent spécifiquement sur le cerveau restent encore à identifier. Dans cette étude, nous souhaitons donc identifier les modes d’actions et les cibles cellulaires dans le cerveau des androgènes et des oestrogènes Plus particulièrement, nous étudirons les effets de la délétion génétique des récepteurs des hormones sexuelles au sein du cerveau sur les structures cérébrales régulant le comportement sexuel mâle.

Bénéfices attendus

Au cours de la vie, notre corps et nos fonctions biologiques sont soumis à des variations hormonales pouvant avoir un impact sur notre système reproducteur et sur notre cerveau. Cette étude participera à faire progresser la compréhension des effets des variations des hormones sexuelles testosterone et oestradiol sur la fonction de reproduction mâle spécifiquement. Les modèles animaux transgéniques utilisés nous permettront de comparer les effets d'une absence de signalisation des hormones sexuelles, oetsradiol et testosterone, sur le comportement de reproduction chez le mâle.

Procédures

Les souris utilisées au sein de ce projet subiront une chirurgie gonadectomie et pose d’implants sous-cutanée (180 animaux) sous anesthésie générale avec réveil et analgésique d’une durée maximale de 30 minutes. Ensuite, l’ensemble des souris de cette demande d’autorisation de projet entreront dans un protocole de tests de comportement de reproduction. Pour les femelles stimuli (60 animaux), des injections sous-cutanées seront pratiquées quelques heures avant les tests de comportement de reproduction.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, nous pratiquerons sur les animaux des chirurgies sous anesthésie générale à l’isoflurane pendant lesquelles les gonades seront retirés et un implant contenant des hormones sexuelles estradiol/testostérone sera posé en sous-cutané. Les éventuels symptômes à court et à long terme liés à cette procédure chirurgicale sont : Apparence et position anormale (poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie); Comportements anormaux (aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation)); Une perte de poids rapide; Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité; Difficulté respiratoire. Certains animaux subiront également des injections sous-cutanées pouvant entrainer un stress lié à la contention et aux injections.

Devenir

L’ensemble des mâles adultes (120 animaux) de cette demande d’autorisation de projet seront euthanasié à la fin des différentes procédures afin de réaliser des prélèvement et analyses post-mortem nécessaires à l’étude des cibles moléculaires des signalisations androgénique et oestrogénique impliquées dans la plasticité cérébrale controlant l’expression du comportement de reproduction chez le mâle adulte. L’ensemble des femelles adultes (60 animaux) utilisés pour tester les comportements de reproduction mâle seront réutilisés dans d’autres projets au sein de l’équipe.

Remplacement

L’étude de la fonction et du comportement de reproduction ne peut se faire que sur l’organisme entier. Dans cette étude, nous souhaitons identifier les cibles cérébrales des androgènes nécessaires à la régulation de la fonction de reproduction et l’expression du comportement sexuel mâle. Cela nécessite donc l’utilisation de modèles animaux afin de pouvoir étudier les structures et populations cellulaires contrôlant la reproduction. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques récentes pour l’étude de la fonction des gènes dans le cerveau. Des animaux vivants sont donc nécessaires pour ce projet afin de réaliser des analyses comportementales et neuroendocrines sur des souris transgéniques dont les récepteurs aux différentes hormones stéroidiennes sont délétés dans le système nerveux. Ainsi des méthodes alternatives et/ou substitutives ne peuvent remplacer l’animal entier pour ce projet.

Réduction

Dans cette demande d’autorisation de projet, nous utiliserons un total de 180 animaux sur 2 procédures qui nous permettrons d’étudier les cibles moléculaires des récepteurs aux hormones sexuelles, androgènes et oestrogènes, impliquées dans le contrôle central du comportement de reproduction mâle. Pour chaque procédure, nous avons eu à cœur de calculer au plus juste le nombre d’animaux dans chaque groupe afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la puissance statistique de l’étude. Pour les études comportementales, 8 à 12 animaux par groupe sont nécessaires pour des résultats fiables et consistants. De plus, nous utiliserons les mêmes cohortes d’animaux pour les analyses comportementales et moléculaires. Nous péléverons également d’autres organes et les garderont pour de futures études ou afin de les proposer aux collaborateurs de l’équipe.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie spécialisée sous la supervision des soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010-63-EU en termes d’espaces et d’environnement. Les souris seront soumises à un cycle de lumière-obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l’enrichissement, un nid végétal sera placé dans la cage. Afin de minimiser les effets indésirables de la chirurgie sous anesthésie avec réveil, les animaux seront injectés en sous-cutanée avec un analgésique en pré-opératoire 30 minutes avant la chirurgie et avec un analgésique anti-inflammatoire en post-opératoire toutes les 24h pendant 3 jours suivants l’opération. Par la suite, un suivi journalier sera réalisé afin d’observer les signes potentiels d’un mal-être animal. Les critères absolus suivants seront observés : Apparence et position anormale : poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie ; Comportements anormaux : aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation) ; Une perte de poids rapide et supérieur à 20 pourcent du poids corporel de l’animal mesuré avant la chirurgie. Les animaux seront pesés tous les jours pendant 5 jours après le protocole de chirurgie stéréotaxique puis 1 fois par semaine ; Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité ; Difficulté respiratoire Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s’assurer que toute souris présentant une perte de poids excessive (-20 pourcent du poids corporel au début de l’étude) ou une détresse seront euthanasiées.

Choix des espèces

La souris est l’un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et comportementales grâce à la disponibilité d’outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques, vecteurs viraux, …) et de données dans la littérature permettant de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires et ainsi d’implémenter les connaissances sur cette thématique. Les animaux seront utilisés à l’age adulte (à partir de 8 semaines). En effet, le but de ce projet est d’étudier les effets de l’invalidation des différents récepteurs des hormones stéroidiennes sur la neuroplasticité des structures cérébrales associés à la régulation des comportements de reproduction chez la souris mâle adulte.