Système nerveux

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à un champ magnétique statique intense vingt heures sur cinq semaines, puis soumises à des tests de coordination et d'équilibre, avant la mise à mort pour analyse du cerveau. Le porteur nomme les indicateurs surveillés, réduction de mobilité, dos voûté, perte de poids, et attend une possible atteinte du système vestibulaire. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité de confirmer sur un organisme entier des effets observés en culture, dans le contexte des IRM à très haut champ.

Objectifs

Grâce à de nombreuses avancées scientifiques et technologiques, l'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est devenue une modalité d’imagerie de diagnostic incontournable et utilisée en routine clinique. Bien que son utilisation ait montré clairement un intérêt dans diverses pathologies, cette technique induit notamment une exposition des patients à des champs magnétiques statiques intenses (quelques dizaines de milliers de fois l'amplitude du champ terrestre). Lors d’examens IRM, des effets aigus et réversibles ont été rapportés par des patients et des travailleurs, tels que des sensations de nausées et de vertiges, un goût métallique dans la bouche ainsi que des images lumineuses dans la rétine (phosphènes). De nombreuses études ont été menées sur des systèmes in vitro, des animaux ou sur l’Homme pour détecter des effets biologiques des champs magnétiques statiques, notamment sur la reproduction et le développement, le système nerveux et la cognition, ainsi que sur la génotoxicité. Cependant, les résultats de ces recherches cliniques et précliniques sont très divergents et/ou peu concluants et ne permettent pas de répondre clairement à ce jour sur la présence ou non d’éventuels risques pour la santé des champs magnétiques statiques. Face à ces interrogations, la Commission Internationale de Protection contre les Radiations non-ionisantes (ICNIRP) a publié des recommandations sur les limites d’exposition aux champs magnétiques statiques des patients et des travailleurs et une directive européenne (2013/35/UE) a été mise en place. Ces institutions insistent sur l’importance de mener de nouvelles études sur l’Homme et les animaux pour apporter des preuves scientifiques sur de potentiels impacts des champs magnétiques statiques sur la santé. Dans ce contexte, notre projet de recherche porte sur les effets sur le système nerveux central et les comportements qui en dépendent, de l’exposition aux champs magnétiques intenses. Il comporte des analyses in vivo chez la souris, pour caractériser les effets d’exposition de la tête sur certaines fonctions cognitives et sur le système vestibulaire situé dans l’oreille interne et qui contribue à la sensation de mouvement et d’orientation dans l’espace, ainsi qu’au maintien de l’équilibre.

Bénéfices attendus

Notre projet vise une première caractérisation des effets sur le système nerveux central de l’exposition chronique à des champs magnétiques intenses, en particulier sur certaines fonctions cognitives et sur le système vestibulaire qui intervient dans la coordination motrice et le maintien de l’équilibre. Les résultats de cette étude viendront compléter ceux déjà présentés dans une étude récente avec des expositions à 10,5 T et 16,4 T, et contribueront, à apporter de nouvelles preuves scientifiques sur les impacts potentiels des champs magnétiques statiques sur la santé. En effet, l’intensité du champ magnétique utilisé pour réaliser des études d’IRM sur le cerveau humain est un paramètre essentiel, car plus le champ magnétique est intense, plus le signal disponible pour acquérir une image est important, ce qui permet d’atteindre des résolutions spatiales et temporelles plus élevées. L’émergence de nouveaux scanners IRM cliniques à très hauts champs magnétiques nécessite de compléter les études sur les effets potentiels sur la santé humaine (aigus et à long terme) de l’exposition unique ou répétée à des champs magnétiques intenses.

Procédures

Les souris seront soumises : - À une exposition chronique à un champ magnétique statique intense (20h d’exposition réparties en 2 sessions de 2h par semaine pendant 5 semaines) - Des tests comportementaux pour quantifier les effets de cette exposition chronique sur la coordination motrice, l’équilibre et la locomotion volontaire (de 30mn à 1h selon le test allant de 4 à 7 sessions) Les tests comportementaux seront réalisés avant l’exposition (pour caractériser le comportement de base), à différents temps pendant les expositions (pour caractériser les effets de l’exposition chronique), puis 2 semaines après la dernière exposition (pour caractériser des effets persistants).

Impact sur les animaux

Les tests de comportement utilisés pourraient induire un stress chez l’animal. Une phase d’entraînement sera réalisée avant le début des expériences afin que les animaux s’habituent aux expérimentateurs et aux dispositifs de tests comportementaux. La présence d’effets indésirables chez les animaux liés à l’exposition chronique à un champ magnétique, et notamment la potentielle perturbation du système vestibulaire (perturbation de la coordination motrice et de l’équilibre), sera déterminée d’après une série d’indicateurs comportementaux : réduction de la mobilité, dos voûté, pilo-érection, tressautements du corps, perte de poids importante (plus de 20%).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux prélevés afin de réaliser des analyses histologiques, qui permettront d’étudier au niveau cellulaire les potentielles modifications du système nerveux central induites par l’exposition chronique à des champs magnétiques intenses.

Remplacement

Quelques études in vitro menées sur des cultures de cellules souches neurales ou de neurones immatures ont mis en évidence des effets biologiques induits par l’exposition chronique à des champs magnétiques statiques. Néanmoins, il est indispensable de confirmer ces effets sur des organismes vivants car l’auto-renouvèlement, la migration et la différenciation des cellules souches neurales sont des processus finement régulés par leur microenvironnement. Notre projet nécessite d’avoir recours à des animaux à des fins scientifiques car l’objectif de cette étude est de déterminer clairement l’existence ou non d’effets du champ magnétique statique sur le système nerveux central dans son ensemble, mais surtout sur certaines fonctions cognitives et le système vestibulaire, en utilisant des tests comportementaux dédiés.

Réduction

En se basant sur les résultats présentés dans une étude récente qui a montré certains changements comportementaux chez des souris exposées de façon chronique à haut champ magnétique, il apparaît qu’un nombre de 24 animaux par groupe est nécessaire pour mettre en évidence des effets significatifs lors de l’analyse statistique des résultats des tests comportementaux choisis. Cependant, l’ensemble du projet sera réalisé de manière séquentielle : les expériences seront réalisées avec des lots de 8 animaux et ainsi, si des effets significatifs sont observés sur la santé et le bien-être des animaux dès le premier lot ou après l’utilisation du deuxième lot, les expériences seront arrêtées.

Raffinement

Les animaux, une fois obtenus auprès d’élevages agréés, seront hébergés en groupe dans des cages munies de modules d’enrichissement (accessoires de jeu, fabrication de nids), avec un accès illimité à l’eau et la nourriture. Leur état de santé sera étroitement suivi tout au long de l’étude, afin d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance et d’appliquer les critères d’arrêt en cas d’événement inattendu qui compromettrait le bien-être d’un animal. Les tests de comportement qui suivront les expositions au champ magnétique ne sont pas stressants et sont basés sur la curiosité naturelle des rongeurs pour la nouveauté. Une phase d’entraînement sera réalisée avant le début des expériences afin que les animaux s’habituent aux expérimentateurs et aux dispositifs de tests comportementaux

Choix des espèces

La souris est une espèce couramment utilisée dans le domaine des neurosciences car l’organisation anatomique et fonctionnelle des structures cérébrales est relativement proche de celles de l’Homme. De plus, l’espèce souris a été choisie pour cette étude car les tests comportementaux qui seront réalisés ont déjà été réalisés chez cette souche de souris dans de très nombreuses études comportementales, ce qui nous permettra de nous référer à des données connues de la littérature. Des souris de 8-9 semaines environ, mâles et femelles, seront utilisées car ce stade de développement correspond à l’âge adulte pour cette espèce. Pour les expériences de cette étude, le choix d’animaux adultes jeunes se justifie par la nécessite de limiter le risque d’apparition de pathologies liées à l’âge pouvant biaiser certains résultats comportementaux, et par la nécessité de pouvoir comparer les résultats obtenus avec ceux de la littérature.

30 porcelets mini-porcs Yucatan vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Séparés de leur mère à deux jours puis isolés en cage individuelle pendant dix-neuf jours, ils reçoivent par un distributeur automatique un lait infantile enrichi ou non en métabolites du lait maternel, pour améliorer les préparations pour nourrissons. Le porteur reconnaît que la séparation maternelle et l'isolement peuvent être une source de stress, tout en affirmant que les porcelets ne montrent aucun stress au-delà des douze premières heures. Il justifie le recours au porcelet par sa proximité physiologique avec le nouveau-né humain, et prévoit la mise à mort de tous les animaux pour prélever tissus digestifs et cérébraux.

Objectifs

Ce projet a pour enjeu l’amélioration des propriétés fonctionnelles des préparations pour nourrissons (PPN) afin de mimer les effets bénéfiques du lait maternel (LM) et de garantir un développement adéquat du nouveau-né. En effet, il reste à ce jour des différences entre le LM et les PPN, notamment concernant les composés bioactifs retrouvés dans le LM peu ou pas présents dans les PPN. Ainsi, ce projet s’intéresse aux métabolites du LM, afin d'évaluer leurs effets sur le développement du nourrisson, particulièrement au niveau des régions digestives et cérébrales. Plus spécifiquement, nous nous intéressons à des métabolites capables d’être produits par des bactéries et dont l’origine au sein du LM peut être bactérienne, issus de la circulation plasmatique maternelle ou produits in situ au sein du LM par la flore résidente. En effet, l’un des objectifs de ce projet est de pouvoir incorporer ces métabolites dans les PPN par procédés fermentaires. Ainsi, 4 groupes de métabolites ont été sélectionnés : acides gras à chaîne courte, polyamines, dérivés du tryptophane et acides organiques. Ces métabolites ont été préalablement testés in vitro sur des modèles cellulaires d'épithélium intestinal et cérébral afin de sélectionner ceux présentant des intérêts fonctionnels et développementaux. Les métabolites sélectionnés seront ainsi étudiés in vivo dans le modèle mini-porcs Yucatan en les incorporant dans des PPN fournies de façon continue des 2 aux 21 jours des porcelets. Nous disposerons de trois groupes de porcelets, un groupe témoin qui recevra une PPN sans métabolites et deux groupes expérimentaux qui recevront des PPN supplémentées en métabolites, à des concentrations proches du LM, par deux procédés distincts ; une supplémentation par des métabolites achetés dans le commerce et une supplémentation en métabolites apportés par fermentation d'une matrice laitière via des souches de bactéries lactiques et propioniques. Ainsi, nous pourrons évaluer l'impact des métabolites sur le développement physiologique intestinal et cérébral du mini-porc et valider que la fermentation d'une fraction laitière est un procédé fiable pour les apporter.

Bénéfices attendus

L’enjeu de ce projet est d’améliorer la fonctionnalité des PPN en s’intéressant aux métabolites du LM pour mimer au mieux les effets bénéfiques de ce dernier sur la santé et le développement du nourrisson. La sélection des métabolites présentant des intérêts fonctionnels et développementaux est en cours de finalisation et se basera sur les résultats obtenus à partir de modèles in vitro d'épithélium intestinal et de neurones cérébraux. Les métabolites d'intérêts appartiennent aux 4 groupes suivant : acides gras à chaîne courte, polyamines, dérivés du tryptophane et acides organiques. Les métabolites sélectionnés seront incorporés aux PPN à des concentrations proches de celles du LM. L’expérimentation sur porcelet, présentant des caractéristiques physiologiques proches du nouveau-né humain, permettra d’évaluer l'impact de l'apport de ces métabolites par voie orale au cours de la période post-natale précoce au sein d'un système plus complexe et intégré que les modèles cellulaires in vitro et permettant également de prendre en compte la présence du microbiote intestinal et les effets que les métabolites peuvent avoir sur ce dernier. Ce projet contribuera à enrichir les connaissances concernant les métabolites retrouvés au sein du LM en vue d’améliorer la composition des PPN et de se rapprocher des propriétés fonctionnelles du LM. Il permettra également de valider que l'incorporation des métabolites par fermentation bactérienne d’une matrice laitière est un procédé pertinent.

Procédures

Les porcelets seront isolés en cage individuelle durant toute la durée du protocole expérimental, de l'âge de 2 jours à l'âge de 21 jours. Chaque cage individuelle est équipée d'un distributeur automatique de lait par lequel chaque porcelet recevra l'un des trois traitements alimentaires du projet de façon contrôlée et adaptée. Les traitements alimentaires fournis sont les suivant : une PPN témoin sans métabolites et deux PPN enrichies en métabolites, l'une par ajout d'une fraction fermentée de matrice laitière et l'autre par ajout direct des métabolites via des produits achetés dans le commerce. Aucun prélèvement biologique, ni intervention chirugicale ne sera réalisé sur les animaux vivants durant la période d’expérimentation. Les paramètres mesurés concerneront la consommation alimentaire et la croissance des porcelets. Tous les animaux concernés par la procédure (n = 30) seront euthanasiés à la fin de l’expérience pour réaliser des prélèvements post-mortem de tissus et contenus digestifs et de zones cérébrales.

Impact sur les animaux

Les métabolites testés sont naturellement présents dans le LM, les concentrations testées sont proches des concentrations retrouvées dans celui-ci et ne présentent pas de danger pour les porcelets. De plus, ces métabolites ont été testés in vitro à différentes concentrations pour identifier leurs propriétés bénéfiques sur l'épithélium intestinal et le système nerveux central. Enfin, la plupart de ces métabolites ont été étudiés sur différents modèles cellulaires et animaux sans effets toxiques notables dans le cadre de problématiques de recherches différentes. Cependant, l'utilisation de PPN "porcinisées" peut entrainer un effet indésirable sur l’appétit des animaux et possiblement provoquer une perte de poids. Néanmoins, la PPN qui sera distribuée aux animaux dans ce projet est identique à la PPN porcinisée utilisée dans un précédent projet qui s'est déroulé de septembre à novembre 2022 et qui n’a engendré aucun problème d’alimentation, ni de trouble digestif chez les porcelets. La séparation brutale de la mère et l’isolement relatif en cage individuelle pendant une période de 19 jours pourraient constituer une source de stress pour les porcelets. Cependant, les porcelets ne subissent pas de stress répétés (une séparation unique et définitive de la mère), ils seront hébergés dans une salle contenant 5 cages permettant des contacts olfactifs et sonores avec leurs congénères et leur environnement sera enrichi avec des jouets, sources d’interaction avec le milieu environnant.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par la procédure décrite (n = 30) et ils seront tous euthanasiés à la fin de l’expérience. L'euthanasie des animaux est nécessaire pour récupérer les tissus et contenus intestinaux ainsi que les tissus cérébraux qui seront analysés par des approches de biologie moléculaire, d'histologie et ex vivo, afin de répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Le projet s’intéressant à l’impact de l’alimentation sur les fonctions physiologiques et développementales du nourrisson, l’utilisation d’un modèle animal vivant reste indispensable pour une évaluation globale et intégrée de l’effet des métabolites étudiés et de prendre en compte le rôle du microbiote intestinal, qui sont impossible à reproduire dans leurs complexité dans des modèles in vitro. Le porcelet a été choisi pour sa proximité physiologique avec le nourrisson.

Réduction

L’étape in vitro permet de réduire le nombre de métabolites d’intérêt à fournir aux porcelets, métabolites retrouvés au sein du LM et ne présentant pas d’effets négatifs dans les tests effectués (pas de cytotoxicité, pas de perte d’intégrité de l’épithélium, pas d’activité pro-inflammatoire aigüe). Ils seront additionnés à une PPN reconstituée et distribuée sous forme d’alimentation liquide aux porcelets. L’impact des PPN enrichies en métabolites par apport direct ou par fermentation d'une fraction de PPN ou d'une autre matrice laitière à des concentrations proches de celles du LM sera ainsi étudié. Une PPN ne contenant pas de métabolites sera considérée comme la PPN de référence. Un effectif de 10 porcelets par types de PPN soit 30 porcelets au total a été calculé par un test de puissance sur des paramètres étudiés dans d'autres contextes sur ce même modèle, en lien avec des réponses physiologiques. Les données seront analysées statistiquement par des tests ad hoc (analyse de variance multifactorielle) prenant en compte les facteurs traitement alimentaire, sexe, portée et répétition.

Raffinement

Les métabolites testés sont naturellement présents dans le LM, les concentrations testées sont proches des concentrations retrouvées dans celui-ci et ne présentent pas de danger pour les porcelets. Cependant, l'utilisation de PPN "porcinisée" peut entrainer un effet indésirable sur l’appétit des animaux et possiblement provoquer une perte de poids. Néanmoins, la PPN qui sera distribuée aux animaux dans ce projet est identique à la PPN porcinisée utilisée dans un précédent projet qui s'est déroulé de septembre à novembre 2022 et qui n’a engendré aucun problème d’alimentation, ni de trouble digestif chez le porcelet Yucatan. Néanmoins, le poids des animaux sera surveillé pour s'assurer qu'ils n'accusent aucune perte de poids. Les porcelets seront inclus dans le protocole à 2 jours d’âge. La séparation brutale de la mère et l’isolement relatif en cage individuelle pendant une période de 19 jours pourraient constituer une source de stress pour les porcelets. Cependant, les porcelets ne subissent pas de stress répétés (une séparation unique et définitive de la mère), ils seront hébergés dans une salle contenant 5 cages permettant des contacts olfactifs et sonores avec leurs congénères, leur environnement sera enrichi avec des jouets, sources d’interaction avec le milieu environnant, et leur alimentation répond à leurs besoins nutritionnels. L’ensemble de ces éléments, associé à des interactions régulières avec les animaliers, induit un comportement des porcelets qui ne traduit aucun état de stress au-delà des 12 premières heures post-séparation maternelle. De plus, au cours des 12 premières heures qui suivent leur séparation de la mère, les animaliers sont en permanence présents dans les salles.

Choix des espèces

Le mini-porc Yucatan est un modèle animal proche de l’Homme, plus que ne peuvent l'être les rongeurs sur de nombreux aspects tels que la taille, l'anatomie du cerveau avec la présence de circonvolutions cérébrales notamment, l’anatomie de tube digestif, la physiologie digestive, le système immunitaire et le microbiote. S’intéressant à l’alimentation infantile, il est à noter que la dynamique de croissance et de développement des organes digestifs et du cerveau chez le porc nouveau-né est très proche de celle décrite chez le nouveau-né humain. De plus, il s’agit d’un animal omnivore monogastrique, ce qui en fait un modèle très utilisé pour les recherches en nutrition humaine. Enfin, sa taille et sa maturité à la naissance sont compatibles avec un allaitement avec des PPN dès les premiers jours de vie. S’intéressant à l’alimentation infantile, les porcelets inclus dans le protocole seront des nouveau-nés de 2 jours d’âge. Ils seront suivis pendant les trois premières semaines de vie avec une alimentation lactée.

864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie intracérébrale sous anesthésie pour injecter une toxine détruisant les neurones à dopamine et reproduire la maladie de Parkinson, plusieurs séries de tests moteurs dont le détail n'est pas précisé, une mesure de conduction nerveuse sous quatre heures d'anesthésie, puis la mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur reconnaît un ralentissement de la locomotion et des difficultés de motricité fine liés à la dégénérescence induite. Il admet que des cultures cellulaires suffisent pour certaines questions mais affirme que seule l'étude de l'"animal entier" permet d'évaluer l'effet de la L-DOPA sur la motricité.

Objectifs

La maladie de Parkinson se caractérise par une destruction progressive des neurones produisant de la dopamine (neurotransmetteur essentiel) dans la substance noire du cerveau, intervenant dans le contrôle de la motricité et des mouvements volontaires. L’absence de dopamine va provoquer l’apparition de symptômes moteurs comme les tremblements de repos, la rigidité musculaire et le ralentissement des mouvements. Pour l’heure, le seul traitement efficace est la prise quotidienne du précurseur de la dopamine, la L-DOPA. En effet, les neurones de la substance noire produisent la dopamine à partir de la L-DOPA ; le conversion de la L-DOPA en dopamine nécessite l'activation d'un enzyme appelé AADC. Dans ce projet des souris génétiquement modifiées qui ont ou non l'enzyme AADC actif seront soumises ou non à l'administration intracérébrale d'une toxine qui provoque la dégénérescence des neurones de la substance noire. La motricité des souris sera évaluée ; la conduction nerveuse et différents paramètres cellulaires et moléculaires seront aussi étudiés au niveau du cerveau. A travers ces expériences, l'objectif du projet est donc d'identifier quels sont les effets propres de la L-DOPA (situation où l'AADC n'est pas actif) chez les animaux normaux et dans la situation pathologique mimant la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d'étudier les propriétés de neurotransmission de la L-DOPA. Ainsi, les résultats permettront d'étayer les connaissances fondamentales sur l'importance de la L-DOPA seule dans le fonctionnement de structures cérébrales interconnectées spécifiques impliquées dans la planification et l’exécution des mouvements. Le projet apportera des connaissances également sur la contribution de la L-DOPA en condition pathologique dans un modèle animal de maladie de Parkinson. A long terme, les résultats de cette étude devraient contribuer à redéfinir et améliorer les traitements symptomatiques de la maladie de Parkinson

Procédures

En fonction des animaux, l'étude dure 10, 16 ou 22 semaines. Le nombre d'intervention listé est donné pour la durée de l'étude. 1) En fonction de la durée de l'étude, les animaux vigiles subiront 2, 3 ou 4 séries de 5 tests comportementaux permettant d'évaluer la motricité. Une série de 5 tests comportementaux se réalise sur 2 semaines ; chaque test comportemental est séparé du suivant par 2 jours. Chaque test comportemental dure au maximum 1h. 2) En fonction de la durée de l'étude, les animaux vigiles seront pesés 11, 17 ou 23 fois ; chaque pesée dure au maximum 1 minute. La pesée permet de suivre l'état de l'animal et prévoir la quantité d'antalgique et d'anesthésique à injecter. 3) En fonction des paramètres étudiés, les animaux vigiles subiront 1 ou 2 injections d'antalgiques et/ou d'anesthésiques. Chaque pesée dure au maximum 1 minute. 4) Les animaux seront tous anesthésiés deux fois. Les animaux anesthésiés subiront 1 chirurgie intracérébrale (anesthésie gazeuse) d'une durée d'1h30 nécessaire à l'inactivation de la L-DOPA et à l'induction de la dégénérescence des neurones de la substance noire. Certains animaux subiront une seconde anesthésie gazeuse d'une durée de 4h pendant laquelle la conduction nerveuse intracérébrale est mesurée. Tous les animaux seront anesthésiés avec une dose létale d'anesthésie fixe double dose et d'antagique à la fin du projet.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut induire une légère perte de poids transitoire et un stress notamment au réveil. L'induction de la dégénérescence neuronale permettant de modéliser la maladie de Parkinson va induire un léger ralentissement de la courbe de croissance des animaux ainsi qu'un ralentissement global de l'activité locomotrice et des difficultés dans la motricité fine.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort en fin de procédure, afin de prélever les cerveaux pour les étudier.

Remplacement

Certaines recherches sur la maladie de Parkinson peuvent être effectuées à l'aide de modélisation basée sur des cultures cellulaires (in vitro) dans le cadre d'études sur les causes de la mort neuronale observée dans la maladie de Parkinson. En revanche, cette approche n'est pas adaptée lorsque l'on s'intéresse aux modifications comportementales qui nécessitent l'intégrité des réseaux neuronaux. Seules des études sur animal entier permettent d'étudier l'effet de la L-DOPA sur la motricité

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été calculé avec un test statistique approprié afin d'obtenir des résultats fiables malgré la variabilité interindividuelle. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques.

Raffinement

Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (actes réalisés par du personnel expérimenté, médicamentation définie avec le vétérinaire référent et les tests comportementaux basés sur le comportement spontané des animaux, ne nécessitant pas d’intervention directe de l’expérimentateur). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide) avec un contrôle des paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire, fréquence cardiaque), additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivi au lendemain de la chirurgie voire 48h post-opératoire si l'état de l'animal le nécessite. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et à agir rapidement pour interrompre la souffrance. Les animaux sont hébergés quatre par cage, avec eau et nourriture ad libitum. L’hébergement en animalerie est réalisé en portoir ventilé, dans des pièces à température et hygrométrie régulées et contrôlées selon les normes en vigueur. Un enrichissement adapté à l'espèce est disposé dans les cages d'hébergement. Les animaux sont manipulés a minima de façon hebdomadaire. Une phase d'habituation aux expérimentateurs est prévue en amont de l'étude. Le binôme d'expérimentateurs reste le même tout au long de l'étude.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation de souris pour plusieurs raisons : la similitude des réseaux neuronaux entre ce modèle et l'humain ainsi que des altérations motrices similaires mais aussi, le modèle est largement décrit dans la littérature, les tests de motricité sont maitrisés chez la souris, et la modification génétique d'intérêt pour cette étude est réalisée sur des souris. Les animaux utilisés seront des animaux mâles et femelles adultes (8 semaines au début des tests comportementaux réalisés avant la chirurgie) de façon à se rapprocher du stade de développement de la maladie de Parkinson.

780 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rates gestantes sont nourries d'un régime très pauvre en protéines, soumises à des frottis vaginaux quotidiens et à une injection intraveineuse, puis tuées par ponction cardiaque avant le terme pour prélever les fœtus et étudier le développement de leur hypothalamus. Le porteur présente son travail comme éclairant les risques de régimes "végétariens ou végétaliens" mal suivis pendant la grossesse, et reconnaît sacrifier les mères en gestation pour éviter le cannibalisme à la naissance. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne reproduit la gestation et le développement cérébral et juge le recours aux animaux "indispensable".

Objectifs

L'objectif du projet est d'étudier l'impact d'une restriction protéique sévère sur le développement fœtal de l’hypothalamus, une structure cérébrale qui joue un rôle clé dans la régulation de l’équilibre nécessaire entre apports et dépense énergétiques, indispensable au maintien d’un poids stable pendant toute la vie d’un être humain. Ce projet se situe dans le contexte de l’étude des origines précoces des maladies de l’adulte, ou DOHAD (Developmental Origins of Health and Adult Diseases) qui est au cœur des préoccupations de notre laboratoire. L’alimentation pendant la grossesse, en agissant sur les étapes précoces du développement fœtal, pourrait influencer de façon durable le fonctionnement cérébral et métabolique de l’organisme. La carence en protéines est une réalité pour de nombreux pays en voie de développement. Dans les pays industrialisés, sous l’influence des recommandations préconisées à juste titre dans les programmes alimentaires, la consommation de viande est en baisse. Cependant la végétalisation importante ou totale de l’alimentation comme lors des régimes végétariens/végétaliens ne permet pas toujours de couvrir les besoins en acides aminés essentiels qui augmentent pendant la grossesse (passant de 50 à 65 g/j). Les protéines végétales sont pauvres en lysine, thréonine et acides aminés soufrés et sont moins bien assimilées par l’organisme. Il est donc important d’évaluer les conséquences d’une carence en protéines pendant la grossesse et de comprendre comment la malnutrition pendant la vie fœtale contribue à la santé et à la maladie plus tard dans la vie. Les recommandations actuelles pour les femmes enceintes concernent essentiellement l’acide folique, le fer et éventuellement d’autres micronutriments, mais très peu voire pas du tout les macronutriments et en particulier les protéines. En utilisant le rat comme modèle, nous visons à déterminer quels processus cellulaires et moléculaires sont affectés par un régime pauvre en protéines, et si les conséquences sont irréversibles ou pas. L'objectif au niveau clinique est de fournir des données fondamentales sur les risques pour le développement du fœtus associés à certains régimes populaires lorsqu'ils sont poursuivis tout au long de la grossesse sans un suivi soutien nutritionnel professionnel. Nous voulons acquérir des données pertinentes sur les stades qui sont importants pour le développement normal du cerveau et sur les conséquences possibles pour le développement de l'enfant.

Bénéfices attendus

Nous connaissons déjà les effets d'un régime maternel restreint en protéines à 8% sur le développement de l’hypothalamus ; ils sont multiples mais légers. En utilisant un régime plus restreint à 4%, le but est d’induire des effets plus marqués au niveau cellulaire et moléculaire afin de mieux distinguer et comprendre les effets précis sur les étapes clés du développement, y compris la maturation des différents types de neurones hypothalamiques : Quel type de cellule est le plus vulnérable ? Comment sont-elles connectées les unes aux autres (i.e. le connectome). En outre, nous identifierons la fenêtre temporelle spécifique pendant laquelle la restriction protéique est néfaste pour le développement de l'hypothalamus. Grâce à une analyse au niveau de la cellule unique, une liste complète de gènes impliqués dans la malformation des réseaux neuronaux sera générée et nous aidera à identifier les cibles clés responsables des effets indésirables. Cet ensemble de résultats nous permettra de comprendre exactement comment et quand les noyaux hypothalamiques se forment, et comment cela entraîne des effets persistants avec un régime faible en protéines. À long terme, l'impact est multiple. Notre recherche fournira des données sur les risques pour le développement du fœtus associés à certains régimes populaires pauvres en protéines (c'est-à-dire végétariens ou végétaliens) lorsqu'ils sont poursuivis tout au long de la grossesse sans soutien nutritionnel rigoureux de la part d'un diététicien, et sur les conséquences possibles pour la santé et les maladies ultérieures. Nos résultats serviront à contribuer à l'établissement d'un cadre diététique qui puisse aider les gynécologues, les diététiciens et les femmes pendant la grossesse. Cela contribuera également à réduire les coûts économiques liés aux naissances prématurées, aux retards de développement et aux soins postnatals prolongés en raison de la restriction de croissance intra-utérine.

Procédures

Les femelles seront soumises à des prélèvements de cellules vaginales exfoliées tous les jours pendant 4 à 7 jours afin de déterminer la période de fécondité et le lendemain de l'accouplement. Ces prélèvements sont indolores, ne durent que quelques secondes et sont pratiqués sur les animaux vigiles. Certaines seront soumises à une injection intraveineuse dans la veine de la queue (5 à 10 secondes environ) au 14ème jour de gestation. Cette injection sera réalisée sous anesthésie générale. Avant la mise à mort, les femelles gestantes anesthésiées seront soumises à un prélèvement intracardiaque de sang (environ 10 secondes).

Impact sur les animaux

Nous avons fait le choix de nourrir les femelles avec un régime modérément carencé en protéines (8%) pendant la période préconceptuelle afin d’éviter une altération de la fécondité. Le régime carencé à 4% de protéines, administré pendant la gestation, ne devrait pas provoquer d’inconfort ou de souffrance. Nous avons déjà dans le laboratoire l’expérience de ce type de régime pendant la gestation. Ce régime apporte la même quantité d’énergie que le régime contrôle afin d’éviter des apports énergétiques insuffisants aux femelles gestantes, la carence en protéine étant compensés par une augmentation de la teneur en hydrates de carbone (essentiellement amidon, un peu de sucre). Nous avons montré précédemment que la quantité d’énergie ingérée par les femelles gestantes recevant un régime à 4% de protéines était similaire à celles recevant un régime contrôle. La carence en protéines a pour effet de réduire la croissance fœtale, les poids des fœtus et des placentas étaient réduits de 26% et 35% respectivement, mais étonnament, la taille des portées était légèrement supérieure. Par ailleurs, aucun effet négatif majeur, de type mort pendant la gestation, fausse couche ou malformation fœtale n’a été observé. Le fait de sacrifier les femelles pendant la gestation permet d’éviter des effets possibles comme le cannibalisme au moment de la naissance qui peut survenir en cas de dénutrition maternelle. Par ailleurs, les sacrifices pratiqués au plus tard à G17 surviennent en amont de la phase majeure de croissance fœtale qui a lieu les 3/4 derniers jours de la gestation.

Devenir

Aucun animal ne sera maintenu en vie à la fin du projet, les femelles seront commandées au fur et à mesure et le nombre prévu sera éventuellement réduit si tous les prélèvement requis ont pu être obtenus avant. S’il n’est pas possible d’obtenir une gestation dans le délai voulu pour certaines femelles, elles seront sacrifiées ou proposées pour d’autres protocoles. Cependant, cette éventualité est très limitée du fait des régimes expérimentaux avec lesquels les femelles auront été nourries.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est indispensable pour créer les conditions physiologiques caractéristiques de situation physiologiques complexes telles que la gestation et le développement cérébral. A ce jour, aucun modèle ex-vivo ou in-vitro ne permet de reproduire l’ensemble des interactions métaboliques, cellulaires et moléculaires. Cependant, ce modèle animal servira aussi à l’obtention de modèles cellulaires (cellules souches neurales prélevées sur les fœtus) qui permettront de tester des caractéristiques de certains types cellulaires et de développer à terme des modèles cellulaires qui permettraient par exemple de tester l’influence de certaines molécules ou nutriments sur le métabolisme cellulaire in vitro.

Réduction

Un calcul statistique d'effectifs nous permet d'établir qu’un nombre de 20 fœtus (10 mâles + 10 femelles) provenant de 10 mères différentes est nécessaire pour chaque analyse à chacun des 2 stades, ce qui fait un total de 20 femelles par régime. Nous prévoyons 10 femelles de plus par régime (soit 30 femelles) pour pallier aux éventuels problèmes de type gestation non détectée, nombre insuffisant de petits, etc. Ce nombre pourra être réduit dès que le nombre de fœtus prélevés par groupe sera atteint. Pour chaque portée, nous prélèverons un minimum de 12 fœtus (idéalement 6 males et 6 femelles) par portée afin d’avoir un nombre suffisant de fœtus des 2 sexes pour chaque analyse.

Raffinement

L’environnement des femelles avant et pendant la gestation sera enrichi (tunnel, bâton à ronger, frisottis). Les procédures envisagées sont classées « modérées » du fait de la teneur faible en protéines du régime 4% auquel seront soumises la moitié des femelles gestantes. Les animaux seront suivis par un personnel animalier compétent et observés quotidiennement pour détecter d’éventuels signes de souffrance. Leur prise alimentaire et leur prise de poids pendant la gestation seront mesurées 3 fois par semaine afin de détecter une éventuelle sous-alimentation ou perte de poids anormale. Les points limites définis conduiront, s’ils sont observés, à la mise à mort des animaux le cas échéant.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce utilisée dans notre laboratoire et bien d’autres depuis de nombreuses années pour les protocoles expérimentaux visant à étudier l’influence de la nutrition en période périnatale sur le développement fœtal et postnatal. Nous avons déjà obtenu de nombreux résultats sur cette espèce, qui est appropriée, par sa taille, aux études anatomiques, cellulaires et moléculaires que nous pratiquons. Le projet porte sur l’influence de la nutrition maternelle en période préconceptuelle et gestation sur le neurodéveloppement fœtal. Les animaux commandés au fournisseur seront des femelles vierges de 8 semaines et des mâles reproducteurs. Les analyses porteront sur des organes prélevés post mortem sur des rates gestantes, et des fœtus à différents stades de la gestation. Aucune analyse n’est prévue dans ce projet dans la période post-gestation.