Système nerveux

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par exsanguination sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent du tamoxifène, subissent des tests sensoriels et moteurs sur animal vigile, une mesure de la conduction nerveuse par électromyographie sous anesthésie et une hyperglycémie provoquée après six heures de jeûne. L'objectif est de comprendre le rôle de l'enzyme PCSK9 dans les nerfs périphériques et d'évaluer un risque possible des traitements anti-cholestérol qui la bloquent. Le porteur qualifie d'"indispensable" le recours aux animaux vivants et d'"inestimable" le système génétique employé, la neuropathie étant selon lui impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

Le projet a pour objectif principal de comprendre le rôle de PCSK9 dans le système nerveux périphérique. PCSK9 est une enzyme fortement exprimée dans le foie où elle joue un rôle clé dans le métabolisme lipidique. PCSK9 est un inhibiteur naturel du récepteur au LDL-cholestérol, LDLR. Des cibles thérapeutiques pour PCSK9 ont été développées récemment et sont actuellement utilisées en clinique pour traiter des patients atteints de dyslipidémie, dont des patients diabétiques. L'utilisation d'inhibiteurs de PCSK9 chez l'homme permet de bloquer sa fonction et de diminuer les taux de LDL-cholestérol plasmatique suite à l'augmentation du nombre de récepteurs au LDL-cholestérol au niveau du foie. Nos précédents travaux ont pu mettre en évidence que PCSK9 est également exprimé dans le système nerveux périphérique au niveau des nerfs où son role reste pour l'instant totalement inconnu. Suite à cette observation, il est essentiel de déterminer la fonction de PCSK9 dans cette structure afin d'évaluer le risque potentiel de l'utilisation des thérapies bloquant son activité sur les fonctions sensorielles et motrices des patients traités. Afin d’étudier la fonction de PCSK9 dans les nerfs périphériques, nous utiliserons plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées permettant d'éliminer spécifiquement son expression dans différents tissus. Nous évaluerons les fonctions sensorielles et motrices des animaux en réalisant des tests comportementaux. Nous évaluerons également le bon fonctionnement des nerfs sensoriels en faisant des mesures de la vitesse de conduction par la technique de l'électromyographie.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera de nouvelles données sur la fonction de PCSK9 dans les nerfs périphériques. PCSK9 est un inhibiteur naturel du récepteur au LDL-cholestérol, LDLR. Des cibles thérapeutiques pour PCSK9 ont été développées récemment et sont actuellement utilisées en clinique pour traiter les patients atteints de dyslipidémie, dont des patients diabétiques de type 2. L'utilisation d'inhibiteurs de PCSK9 chez l'homme permet de bloquer sa fonction et de diminuer les taux de LDL-cholestérol plasmatique suite à l'augmentation du nombre de récepteurs au LDL-cholestérol au niveau du foie. Suite à la mise en évidence de l'expression de PCSK9 dans les nerfs périphériques, il est essentiel de déterminer sa fonction dans cette structure afin d'évaluer le risque potentiel de l'utilisation des inhibiteurs de PCSK9 sur les fonctions sensorielles et motrices chez les patients traités. Ce projet permettra de déterminer le rôle de PCSK9 dans les nerfs périphériques et de déterminer si son inhibition en clinique peut avoir un impact sur le développement de neuropathie chez les patients traités.

Procédures

Le prélèvement de tissus pour le génotypage des souris et la mise en place d’une bague d’oreille numérotée sera réalisé sous anesthésie générale sur l’ensemble des animaux et la technique sera d’une durée de 5min par animal. Les tests comportementaux seront réalisés sur animaux vigiles sur l’ensemble des animaux et le geste technique sera d’une durée de 20min par animal. La vitesse de conduction nerveuse sera effectuée sous anestéshie générale et sur l’ensemble des animaux pour une durée de 20 min par animal. L’hyperglycémie provoquée se fera sur animaux vigiles et sur l’ensemble des animaux pour une durée de 120 min par animal avec des prélèvements à différents temps. L’exsanguination sera effectuée sur l’ensemble des animaux du projet qui seront mis sous anesthésie générale et la procédure durera 5min par animal.

Impact sur les animaux

Concernant les nuisances ou effets indésirables possibles sur les animaux, nous avons identifié certaines manipulations qui pourraient entrainer des nuisances ou des effets indésirables sur les animaux. L’injection de tamoxifène sur animal non anesthésié peut entrainer un certain niveau de stress. Afin de limiter le stress, les animaux seront manipulés par des expérimentateurs formés à la préhension et à la contention des animaux de laboratoire. Le tamoxifène est un anti-estrogène administré dans le cancer du sein de la femme. Même si quelques effets secondaires peuvent être observés tels qu'une mortaité embryonnaire, une infertilité temporaire ou un blocage intestinal, en recherche, elle est couramment utilisée chez la souris pour activer la recombinase Cre dans des lignées de souris génétiquement modifiées. Au vu des doses utilisées et de la période d’injection (5 jours), nous ne nous attendons pas à des effets indésirables sévères. Concernant les tests sensoriels et moteurs, l’isolement des animaux pour effectuer les tests peut entrainer un certain niveau de stress. Afin de limiter ces effets, les animaux seront habitués à la salle de test, à son environnement et au matériel pendant 3 jours consécutifs (30 minutes par jours). Pour l'hyperglycémie provoquée, la mise à jeun de l’animal pendant 6 heures peut entrainer des effets indésirables. Afin de limiter le stress, la mise à jeun se fera pendant la journée afin que les expérimentateurs puissent surveiller le comportement des animaux pendant cette période.

Devenir

L'ensemble des animaux est maintenu en vie au cours des procédures 1 à 7. A la fin de la procédure, l'ensemble des animaux subiront une exsanguination suite à une ponction cardiaque après anhestésie à l’isoflurane.

Remplacement

Les objectifs de cette étude sont de déterminer le rôle de PCSK9 de manière spécifique dans le système nerveux périphérique. Elle nécessite donc l’utilisation de lignées de souris transgéniques dans le but de supprimer l’expression de la protéine PCSK9 dans différents types cellulaires composant le nerf. Par ailleurs, le recours à l’expérimentation sur des animaux vivant est indispensable car la neuropathie est impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés (ex : culture cellulaire), de même que les tests de phénotypage sensoriel et moteur. De plus, le système Cre-loxP est un système inestimable pour le contrôle de la délétion de différents gènes au niveau du système nerveux chez la souris et est très fréquemment utilisé chez les modèles de souris transgéniques. Les études seront systématiquement optimisées d’après la littérature et/ou les observations réalisées au laboratoire.

Réduction

L’utilisation des animaux sera réduite au maximum et les expériences seront planifiées et réalisées les unes après les autres afin d’éviter des pertes inutiles. L’application de cette politique de réduction mise en place permettra d’optimiser au mieux chaque expérimentation afin de retirer un maximum d’information d’un minimum d’animaux. Le nombre d'animaux minimum a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Les protocoles ont été établis afin de réduire la douleur et la détresse de l’animal. Les animaux seront sous la surveillance de personnes habilitées et la diffusion par ces personnes de leur savoir-faire permettra de réaliser nos expérimentations dans le respect du bien-être animal et des conditions optimales du suivi des règles d’hygiène et de sécurité. Pour les tests sensoriels et moteurs, les souris bénéficieront d'une acclimatation à la salle de test (30 minutes/jour pendant 3 jours) afin d’éviter le stress de l’animal. Les tests seront effectués sur plusieurs jours dans le but de limiter le nombre de stimulations (mécaniques, nociceptives et motrices). Si lors d'une procédure des signes de douleur ou de détresse sont observés alors l'animal se verra administré une dose d'analgésique (buprénorphine) à 0,01 mg/kg en sous-cutané. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne des zootechniciens et expérimentateurs afin de s’assurer de leur bien-être et de détecter tout signe éventuel de douleur (prostration, isolement, passivité, pelage, respiration, vocalisations)

Choix des espèces

La souris représente une espèce validée dans l’étude des neuropathies. Elle permet l’évaluation des déficits sensoriels et moteurs par la possibilité d’effectuer des tests sensoriels et moteurs non invasifs établis de longue date chez ce modèle animal et récapitulant les tests sensoriels réalisés chez l’homme. Nous utilisons des souris car elles sont déjà à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris transgéniques permettant l’étude de protéines d’intérêt impliquées dans les neuropathies. Nous utiliserons des souris âgées de 10 semaines. Nous avons choisi ce stade de développement car le système somatosensoriel est mature et fonctionnel à partir de 8-10 semaines.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection dans le cerveau profond, sous anesthésie, pour éteindre l'activité de populations de cellules de l'horloge biologique, puis un hébergement isolé de trois semaines avec roue d'activité, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour vérifier le site d'injection. L'objet du projet est de comprendre l'horloge circadienne, en lien avec les troubles liés au travail de nuit. Le porteur reconnaît que le déphasage provoqué peut entraîner fatigue et troubles du sommeil, et renvoie à d'éventuels traitements futurs.

Objectifs

En France, environ 15% de la population active est concernée par le travail de nuit. Ce mode d'organisation du travail augmente les risques de troubles du sommeil et du métabolisme, de cancer ou de problèmes cardiovasculaires et psychiques. Pour répondre à cet enjeu de santé publique, il convient de mieux connaitre l'horloge interne qui régule nos rythmes biologiques en adéquation avec le cycle jour-nuit de 24 heures. Cette horloge circadienne (= "autour du jour") est localisée dans une petite structure du cerveau profond, appelée les noyaux suprachiasmatiques (NSC). Les NSC contiennent environ 10000 cellules nerveuses, douées d'une rythmicité circadienne autonome reposant sur un petit ensemble de gènes, appelés gènes de l'horloge. Alors que les interactions entre ces gènes de l'horloge sont maintenant bien connues et définissent les rouages moléculaires de l'horloge, le rôle des différentes cellules des NSC reste mal connu. Pour répondre à cette question, notre approche expérimentale vise à éteindre l'activité électrique ou à inactiver le mécanisme de l'horloge moléculaire dans des populations cellulaires spécifiques des NSC chez des souris génétiquement modifiées. Notre objectif sera de cibler une dizaine de populations cellulaires différentes et d'identifier lesquelles participent au rythme de locomotion circadienne, mesurée à l'aide d'une roue d'activité dans la cage des animaux.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra d'identifier les cellules régulant les rythmes circadiens, et selon quelle modalité (phase, amplitude, période?). Cette dissection cellulaire de l'horloge circadienne des Mammifères est une étape essentielle pour comprendre le fonctionnement physiologique de l'horloge et son dérèglement pathologique dans le cadre de notre société moderne, active 7 jours sur 7, 24 heures sur 24. A terme, les cellules ainsi identifiées pourraient constituer la cible de traitements adaptés pour accompagner les travailleurs de nuit et les voyageurs souffrant de jetlag. Un autre bénéfice attendu consiste dans l'obtention de nouvelles données sur le rôle du canal NALCN que nous ciblerons pour éteindre l'activité électrique des cellules des NSC. Ce canal ionique est associé à des maladies génétiques rares. Les enfants touchés par ces maladies développent très souvent des troubles du rythme veille-sommeil. Comprendre le rôle précis de NALCN dans l'horloge circadienne serait une avancée majeure pour alléger les conditions de vie de ces jeunes patients et de leur famille, déjà confrontés à des situations très sévères.

Procédures

1. Injection intra-cérébrale sous anesthésie générale : 30-60 minutes. 2. Hébergement en cage individuelle (avec contact visuel avec des congénères) pour mesure du rythme de locomotion volontaire dans une roue d'activité : 3 semaines.

Impact sur les animaux

L'effet attendu des manipulations réalisées est une perturbation de l'horloge circadienne : diminution ou perte totale de la rythmicité circadienne, ou déphasage entre le rythme interne et le cycle jour-nuit extérieur. La perte de rythme n'est a priori pas dommageable sur la durée du protocole. Le déphasage peut provoquer une fatigue liée à des troubles du sommeil. Sur le long terme, le développement d'un syndrome métabolique (diabète, obésité) ou au contraire un amaigrissement est possible, ainsi qu'un risque accru de cancer est possible. Cependant, ces effets extrêmes ne sont pas envisageables en quelques semaines. La nuisance potentiellement causée par la procédure chirurgicale d'injection stéréotaxique sera traitée par anesthésie/analgésie et surveillance des animaux

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour réaliser une vérification histologique du site d'injection.

Remplacement

Le fonctionnement moléculaire de l'horloge a déjà été largement étudié in vitro. Mais comprendre l'impact de ce mécanisme dans des cellules spécifiques au sein d'un organisme nécessite le recours aux modèles animaux. Ici, nous regarderons comment une manipulation cellulaire dans le cerveau profond modifie le rythme repos-activité chez la souris. Les résultats expérimentaux que nous obtiendrons révéleront la complexité fonctionnelle de l'horloge circadienne. Ces données pourront servir de base pour une modélisation réaliste de ce système.

Réduction

Pour chaque groupe expérimental, la quantité totale d'activé sera mesurée en condition d'éclairage jour-nuit, puis d'obscurité constante. Les paramètres du rythme d'activité locomotrice, directement liés à l'horloge, seront évalués sous ces conditions d'obscurité constante (= conditions de libre cours) : 1. Analyse qualitative : le rythme circadien d'activité est-il préservé ou aboli? 2. Analyse quantitative : si une rythmicité est préservée, la période du rythme en conditions de libre cours sera le paramètre limitant. Nous avons réalisé une étude statistique pour estimer la taille nécessaire de nos groupes expérimentaux.

Raffinement

L'injection stéréotaxique de petits volumes (1 µl) dans les NSC est largement documentée, et maitrisée dans notre équipe. Cette opération est conduite sous anesthésie générale de l'animal, et est suivie d'une observation accrue pendant la phase de réveil, avec utilisation d'analgésiques et per- et post-opératoire. La mesure de l'activité locomotrice implique l'hébergement en cage individuelle, équipée d'une roue d'activité. Pour limiter l'isolement social, les animaux garderons un contact visuel avec leurs congénères. D'autre part, l'accès à la roue constitue un enrichissement des conditions d'hébergement très apprécié. Les animaux seront observés visuellement de façon quotidienne. En plus des signes de souffrance couramment recherchés (prostration, poil hérissé, amaigrissement), nous utiliserons la mesure d'activité locomotrice comme point limite spécifique à la procédure mise en œuvre : toute souris parcourant une distance inférieure de 50% à celle parcourue par des souris contrôles sera pesée et observée plus en détail. En fonction des signes cliniques observés, la souris aura accès à une nourriture hydratée et/ou un analgésique adapté. Nous ne nous attendons pas à un degré de souffrance justifiant la mise à mort des animaux, mais si une souris devait atteindre un poids inférieur de 15% au poids avant l'opération, alors elle sera euthanasiée par dislocation cervicale.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère de choix, donnant accès à un grand nombre de lignées génétiquement modifiées. Ici les lignées Bmal1-flox et Nalcn-flox sont uniques et particulièrement adaptée pour répondre à la question posée. D'autre part, la mesure de l'activité locomotrice volontaire dans des cages à roue est un outil très largement utilisé en chronobiologie pour évaluer le fonctionnement de l'horloge circadienne des rongeurs. Souris jeunes adultes (7-8 semaines), lorsque la croissance est terminée pour des coordonnées stéréotaxiques fiables.

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire le syndrome de Dravet, elles présentent des crises d'épilepsie spontanées entraînant une mort subite chez 35 % d'entre elles, subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes corticales et des tests comportementaux dont 44 immersions forcées dans l'eau sur vingt jours. Elles sont tuées en fin de procédure, aucune ne pouvant être réutilisée après un mois de traitement. Le porteur affirme, en citant le NC3Rs, que les crises ne seraient pas ressenties comme douloureuses, et juge le modèle murin "indispensable".

Objectifs

Le syndrome de Dravet est une épilepsie d'origine génétique qui apparaît avant l'âge de 1 an. Les crises épileptiques sont le plus souvent associées à des difficultés d'apprentissage et de coordination motrice ainsi qu'à des troubles de type autistique ou encore anxieux. Ce syndrome est dû, dans 80% des cas, à une mutation qui affecte le fonctionnement d'un canal sodique localisé majoritairement dans la membrane de neurones inhibiteurs et qui joue un rôle primordial dans la régulation de leur excitabilité. Plusieurs équipes, incluant la nôtre, ont montré que les mutations de ces canaux d'intérêt entraînaient une baisse de l'excitabilité des neurones inhibiteurs à l'origine des crises d'épilepsie. Notre projet de recherche a pour objectif d'évaluer l'efficacité d'un nouveau traitement chronique précoce sur le développement des différents symptômes dans un modèle murin du syndrome de Dravet. En effet, un grand nombre de patients atteints du syndrome de Dravet n'ont pas d'amélioration de la fréquence et de la sévérité de leurs crises épileptiques avec les traitements pharmacologiques actuels. De plus, les effets de ces traitements sur les troubles associés ont très rarement été évalués. Nous disposons d'un modèle de souris déficientes pour les canaux d'intérêt dont le phénotype récapitule les symptômes observés chez les patients atteints du syndrome de Dravet. Le traitement chronique est un peptide de synthèse résistant à la dégradation et qui se fixe sur les récepteurs d'un neuropeptide abondant dans un type de neurones inhibiteurs et qui est capable d'augmenter l'excitabilité des autres neurones inhibiteurs. Notre stratégie est de potentialiser l'effet des neurones inhibiteurs contenant le neuropeptide en administrant ce traitement et ainsi s'opposer à la baisse de l'excitabilité des autres neurones inhibiteurs, mécanisme central dans le syndrome de Dravet.

Bénéfices attendus

C'est une nouvelle piste thérapeutique qui pourrait permettre d'améliorer la pharmacorésistance observée chez les patients atteints du syndrome de Dravet. En effet, il existe un grand nombre de patients atteints du syndrome de Dravet dont la fréquence et la sévérité des crises épileptiques ne diminuent pas avec les traitements pharmacologiques actuels, y compris les traitements en cours d'essais cliniques. De plus, les effets de ces traitements sur les troubles associés (anxiété, autisme, troubles moteurs...) ont très rarement été évalués alors qu'ils constituent une part importante des symptômes.

Procédures

Deux groupes de 14 souris mutantes subiront une chirurgie sous anesthésie générale afin d'implanter à la surface du cortex des électrodes permettant l'enregistrement de l'activité électrique et donc de détecter les crises épileptiques. Cette chirugie dure moins d'1h. La majorité des tests comportementaux qui seront utilisés sont basés sur la tendance naturelle des rongeurs à explorer un nouvel environnement et se feront en une seule session (5 à 30 min). Trois tests d'apprentissage (moteur, environnement spatial ou conditionnement) seront réalisés en 1 à 3 sessions sur 2 ou 5 jours. L'un des test d'apprentissage spatial se déroulera sur 20 jours (dont 5 jours sans manipulation) et impliquera d'immerger les animaux dans une eau à 23°c (pour 1 min maximum par essai. (4 essais quotidiens x5)+2 immersions, protocole répété une fois = 44 immersions sur 20 jours). Le test comportemental réalisé en dernier (mesure continue de l'activité spontanée de l'animal sur la durée du cycle circadien) requiert que les souris soient placées en cage individuelle pendant 3 jours.

Impact sur les animaux

La lignée de souris génétiquement modifiée que nous utiliserons présente des crises d'épilepsie tonico-cloniques spontanées à partir d'environ 3 semaines après la naissance. Les souris sont particulièrement vulnérables à ces crises au cours de cette période du développement jusqu'à environ 40 jours après la naissance, ce qui, dans 35% des animaux, conduit à une mort subite (SUDEP) sans souffrance. Cette mortalité est également constatée chez les enfants atteints du syndrome de Dravet. Les crises d'épilepsie dans le syndrome de Dravet sont des crises généralisées (ç-à-d impliquant l’ensemble du cerveau), et, sont, par définition, associées à une perte de conscience. Cette perte de conscience explique pourquoi les crises tonico-cloniques ne sont pas ressenties comme douloureuses chez les patients et c’est très vraisemblablement le cas dans les modèles animaux, comme cela est expliqué dans un article sur les modèles d’épilepsie du National Centre for Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs). Les crises tonico-cloniques sont de courte durée (entre 20 et 30 s) et les animaux récupèrent rapidement (2 à 5 min). En d’autres termes, les souris sortent progressivement de leur état d’inconscience et se mettent à bouger petit à petit sans qu’il y ait de signes évidents de souffrance (pas de posture, cri ou expression faciale de douleur). La fréquence des crises spontanées dans ce modèle murin est d'1crise tous les 2 jours.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés pour ce projet seront euthanasiés en fin de procédure. En effet, nous ne pouvons pas réutiliser des animaux ayant reçu un traitement chronique pendant 1 mois ou plus. De plus, pour les études comportementales, les animaux (contrôles ou traités) doivent être naifs pour chacun des tests utilisés.

Remplacement

Afin de répondre au principe de remplacement, nous réaliserons, parallèlement aux expérimentations in vivo, des études in vitro sur cultures cellulaires permettant de caractériser l'interaction entre nos canaux d'intérêt et le système neuropeptidergique ciblé par le traitement. L’utilisation d'un modèle animal in vivo reproduisant le phénotype clinique décrit chez les patients atteints du syndrome de Dravet est cependant indispensable à l'objectif de notre projet, à savoir évaluer l'efficacité d'un nouveau traitement pharmacologique sur l'ensemble des symptômes (épileptiques et non épileptiques) observés dans ce syndrome.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaires dans chacune des 2 procédures tout en s'assurant d'avoir le nombre suffisant pour interpréter nos expériences sur le plan statistique (analyse a priori via le logiciel Gpower). Dans toutes les procédures, nous comparerons les résultats obtenus chez les souris mutantes à ceux obtenus chez les souris contrôles issues des mêmes portées. Dans une des procédures, nous utiliserons aussi bien les femelles que les mâles d'une même portée car il n'a pas été constaté de différences entre les sexes concernant les troubles épileptiques chez ces souris. Dans l'autre procédure, seuls des mâles seront utilisés pour les tests comportementaux et les femelles produites seront utilisées pour les expériences in vitro.

Raffinement

Toutes les mesures de raffinement appropriées seront prises pour éviter toute souffrance ou inconfort à l’animal. Ainsi, toutes les souris seront élevées dans un environnement enrichi (social et physique) et une manipulation régulière des animaux sera réalisée afin de réduire leur stress. Concernant les animaux soumis à la procédure chirurgicale, ils seront réchauffés grâce à un tapis chauffant avant, pendant et après l’intervention afin d’éviter la perte de température corporelle due à l’anesthésie. Un anti-inflammatoire sera administré dans l'eau de boisson pendant la période post-opératoire et un suivi journalier permettra d’évaluer leur état de santé et ainsi d’intervenir rapidement par rapport aux points limites définis (voir champ 4, procédure 1). Enfin, compte tenu du fait que les souris mutantes présentent des crises tonico-cloniques spontanées, une attention particulière sera portée aux critères de poids, de stress et d’hyper-réactivité comme recommandé par le NC3Rs pour les modèles d’épilepsie avec crises spontanées.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris déficientes en nos canaux d'intérêt avec un fond génétique 100% C57Bl/6J. Cette lignée sera issue du croisement de 2 lignées parentales ne présentant pas les symptômes caractéristiques du syndrome de Dravet. La souris C57Bl/6 est une espèce très largement utilisée pour les études in vivo. Nos études s'appuieront donc sur des protocoles déjà décrits dans la littérature. L'évaluation du potentiel thérapeutique du peptide de synthèse sur les troubles épileptiques et non épileptiques débutera avant l'apparition des crises d'épilepsie chez les souris mutantes. Le traitement chronique débutera par conséquent à 17jours après la naissance (P17) et se terminera à l'âge adulte (vers P60-70) à la fin des procédures.

11520 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à deux chirurgies cérébrales pour induire une maladie à alpha-synucléine puis recevoir une thérapie génique, avec un suivi comportemental locomoteur, avant la mise à mort et l'étude histologique du cerveau. Le porteur indique que ces modèles neurodégénératifs n'entraînent "pas de symptôme marqué", les atteintes étant surtout moléculaires. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le développement des synucléinopathies et espère restaurer le "nettoyage" des neurones contre Parkinson.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (MP) ou l’atrophie multisystématisée (AMS) sont caractérisées par l’agrégation d'une protéine mutée dans différents types cellulaires. Ces agrégats, toxiques pour les cellules, provoquent après accumulation des symptômes moteurs tels qu’une rigidité musculaire, une difficulté/incapacité à initier le mouvement , mais aussi des symptômes non-moteurs comme un état dépressif ou des troubles digestifs. Actuellement, ces maladies neurodégénératives ne possèdent pas de traitement curatif, mais seulement des traitements symptomatiques ayant un effet limité, accompagné d’effets indésirables. Le but de ce projet est de développer un outil thérapeutique visant à restaurer la voie de nettoyage des neurones en permettant ainsi de dégrader les agrégats protéiques.

Bénéfices attendus

La maladie de Parkinson touche plus de 100.000 personnes en France, dont 80% sont âgées de plus de 65 ans. Au cours des années à venir nous allons observer une augmentation importante du nombre de cas en raison du vieillissement de la population et de l'amélioration de l'espérance de vie. De ce fait la découverte d’un traitement curatif (et non symptomatique) est un des grands axes de la recherche. Ce projet novateur ayant pour but de développer un traitement curatif a certains types de maladies neurodégénératives, grâce à des outils permettant de rétablir le fonctionnement des voies de dégradation de protéines agrégées de façon anormales par les neurones. Nous espérons, grâce à notre traitement rétablir l’activité de dégradation et de "nettoyage" dans les neurones et donc éviter la neurodégénérescence chez des modèles animaux de maladies neurodégénératives.

Procédures

Les animaux subissent deux intervention chirurgicales au maximum, avec une durée de 30 minutes, qui correspondent à la création des modèles et le traitement. Une étude de comportement simple locomoteur, non invasif et non contraignant sera réalisée pendant ce projet, afin d'avoir un suivi de l'évolution du modèle et de l'impact du traitement.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent au maximum deux chirurgies d'une durée de 30 minutes maximum chacune, correspondant à l'induction du modèle et au traitement. Les nuisances peuvent être liées à la chirurgie : récupération post-anesthésie, hypothermie, déshydratation, infection de la plaie, mais sont bien encadrés par une analgésie et une anesthésie controlées et par un suivi des animaux postopératoire sur 3 jours minimum. De plus ces modèles neurodégénératifs n'entrainent pas de symptome marqué, en effet les désordres sont plutôt visibles à l'échelle moléculaire.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser une étude histologique détaillée du cerveau et ainsi de déterminer l'éfficacité du traitement.

Remplacement

Dans le respect du R de remplacer, dans l’état actuel des connaissances, nous ne pouvons pas nous passer d’animaux vivants, car il n’est pas possible de mimer le développement spatiotemporel des synucléinopathies dans des modèles in vitro. L’impact bénéfique potentiel sur l’accumulation d’α-synucléine et donc sur le fonctionnement cérébral et la survie neuronale ne peuvent être évalués que chez l’animal.

Réduction

Des études pilotes ont été effectuées au préalable pour confirmer l’activation des lysosomes après injection de plasmide TFEB, et pour confirmer l’absence de toxicité chez l'animal. Tests statistiques : toutes nos études sont réalisées avec un nombre d’animaux minimum mais suffisant pour pouvoir obtenir des résultats qui sont statistiquement représentatifs, et ainsi limiter la répétition des d’études.

Raffinement

Acclimatation : une période de deux semaines permet une bonne acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers ou les expérimentateurs afin de détecter tout inconfort ou souffrance en observant l’aspect physique, l’état du poil, la vigueur, la nutrition, l’hydratation et le comportement social des animaux. Chirurgie : une attention particulière est apportée pour un maintien de l'asepsie pendant la période opératoire. Les animaux sont anesthésiés (Isoflurane, induction 4% 1,5l d’air/min et maintien à 1% 0,4l d’air/min) pendant la chirurgie, ils animaux reçoivent un couverture analgésique une demi-heure avant l’intervention et après l’intervention ainsi que le lendemain . Un suivi post-opératoire est dans tous les cas réalisé grâce à une fiche de scorage qui évalue la perte de poids, la mobilité, les interactions avec les congénères, aspect du poil (0 mauvais, 1 moyen, 2 bon). Les points limites adaptés sont pour les deux espèces : une mobilité réduite voir difficile suite à la chirurgie, une attitude de repli, une allure du poil terne et mal nettoyé, difficulté à récupérer le poids initial, dans les jours suivant la chirurgie. Les animaux sont pesés de manière hebdomadaire pendant toute la durée de l’étude. Si malgré les soins concernant la chirurgie (plaie), les scores restent mauvais durant deux jours consécutifs, si une lésion cutanée s’étend et s’infecte, une décision d’euthanasie est prise par l'expérimentateur en accord avec le personnel zootechnique. Si un constat de stéréotypie est fait, des éléments d’enrichissement comme des roues sont proposés à l’animal. Si cela n’améliore pas son état au bout de 48h, il sera mis à mort selon la règlementation en fonction de l'espèce. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal.

Choix des espèces

La souris permet de travailler les modèles de type pathologies humaines, une fois ces modèles bien établis , ils sont transposables au rat, espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire. Cela rend les enseignements tirés de l'étude des tissus du rat largement transférables à l'homme. De plus, cette espèce permet d’utiliser des animaux modifiés génétiquement. Pour toutes les cohortes, les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 6 semaines pour les rats et 8 semines pour les souris)

1840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cocaïne pendant cinq jours et l'implantation chirurgicale d'une pompe osmotique, puis subissent des mesures d'activité locomotrice et des tests d'anxiété, de dépression et d'anhédonie après sevrage, avant d'être tuées pour prélever le sang et le cerveau. Le porteur induit ainsi une dépendance à la cocaïne pour tester des agents pharmacologiques censés bloquer la sensibilisation comportementale. Il indique privilégier des traitements déjà sur le marché pour un "transfert rapide à la clinique".

Objectifs

A la suite d’une injection répétée de drogue comme la cocaïne, on observe une sensibilisation comportementale qui se traduit chez la souris par une augmentation progressive de l’activité locomotrice après chaque exposition à la drogue. Cette sensibilisation comportementale persiste après plusieurs semaines de sevrage et impliquent des changements neurobiologiques qui ont lieu dans des structures cérébrales responsables de l’addiction. C’est la raison pour laquelle ce modèle est fréquemment utilisé dans l’étude des addictions chez l’animal et aussi parce qu’il est simple à mettre en place. Alors qu’il n’existe aucun traitement spécifique de l’addiction à la cocaïne, le projet propose d’étudier la capacité de plusieurs agents pharmacologiques à bloquer la sensibilisation comportementale induite par la cocaïne. Les molécules les plus efficaces seront ensuite utilisées pour mesurer leur effet à réduire d’autres conséquences d’une exposition répétées à la cocaïne comme l’anxiété, l’anhédonie (incapacité à éprouver du plaisir) et l’état dépressif.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de pouvoir proposer un traitement qui soit à la fois capable de réduire voire de bloquer la sensibilisation comportementale induite par la cocaïne mais aussi de réduire les effets secondaires induits par le sevrage à cette drogue. Le choix de traitements existants sur le marché permettra un transfert rapide à la clinique. En effet, ce projet fait partie d’un projet plus large consistant à tester de nouvelles pistes thérapeutiques chez les patient(e)s dépendant à la cocaïne.

Procédures

Tous les animaux verront leur activité locomotrice mesurée (pendant 1h30 dans un actimètre) avant (pednant 3 jours) puis pendant le traitement à la cocaïne. Tous subiront des injections de cocaïne pendant 5 jours et une implantation d'une pompe osmotique sous anesthésie générale (intervention de 10 min maximum). Une mesure de l’activité locomotrice suite à une injection de cocaïne sera réalisée deux fois (après 13 et 27 jours de sevrage à la cocaïne) chez une partie des animaux. Chez une autre partie des animaux des tests comportementaux (anxiété, dépression, anhédonie) seront réalisés une fois (après 13 et 27 jours de sevrage à la cocaïne). Ces tests durent 5 à 6 min hormis pour l’anhédonie, les animaux devront être placés dans l’actimètre pendant 6 heures.

Impact sur les animaux

Les procédures qui seront réalisées le sont déjà dans des projets antérieurs. Le traitement à la cocaïne entraine une dépendance chez les animaux, qui peut se manifester lors de l’arrêt du traitement par des modifications émotionnelles qui sont les paramètres que nous suivrons dans l’étude pour mettre en évidence l’intérêt des traitements de substitution. Néanmoins ces modifications comportementales restent modérées. Les nuisances attendues sont essentiellement liées à la procédure chirurgicale. L’administration d’antalgiques est prévue en pré et post opératoire. L’injection intrapéritonéale provoque une douleur légère et de courte durée.

Devenir

A l'issue des 3 procédures, les animaux sont mis à mort pour prélèvement de sang et du cerveau.

Remplacement

Ce projet ayant pour but d’étudier des phénomènes psychiatriques et des processus pathologiques, les méthodes alternatives actuelles (e.g., modélisation, études in vitro) sont insuffisantes. Ce projet a également pour but d’étudier des modifications cérébrales complexes et des modifications comportementales qui s’inscrivent dans le cadre d’une étude intégrée, et nécessite donc d’être réalisé sur des animaux.

Réduction

Pour réduire au minimum le nombre de souris utilisées, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace grâce aux données obtenues lors de projets précédents en prenant l’hypothèse d’. Chaque groupe de traitement sera constitué de 20 souris pour révéler les différences comportementales.

Raffinement

L’angoisse des animaux sera minimisée par au moins une semaine d’habituation aux conditions d’hébergement avant le début des expériences. Les animaux seront hébergés dans des conditions normales (4 souris / cage) avec enrichissement du milieu (nids végétaux). Tous les groupes auront un accès libre à l’eau et à la nourriture. L’implantation des pompes osmotiques sous anesthésie gazeuse sera réalisée par une personne compétente ayant suivie la formation réglementaire de chirurgie. Les animaux auront accès à un anti-inflammatoire dans l'eau de boisson 24h avant la chirurgie. En fin de chirurgie, qui dure au maximum 10 min, la phase d’éveil se fait en cage individuelle disposée sur une couverture chauffante pour éviter toute hypothermie. Les souris sont très régulièrement surveillées jusqu’à leur réveil complet. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés juqu’à la date prévue de mise à mort. Ces observations permettent de graduer les points limites pour l'apparence et la perte de poids. En fonction du degré de gravité, les animaux seront isolés et surveillés plus attentivement ou mis à mort en cas de gravité plus importante.

Choix des espèces

L’investigation d’une pathologie telle que l’addiction nécessite d’étudier une espèce animale phylogénétiquement voisine de l’être humain pour pouvoir reproduire la maladie. La souris est un modèle de référence dans le domaine des addictions. En effet, elle est moins avancée dans le processus d‘évolution des espèces que le primate non-humain mais en tant que mammifère, elle possède une organisation anatomique et structurelle du cerveau comparable à celle de l’être humain. La souris est capable d’apprendre des tâches complexes et peut réaliser des comportements élaborés. Les animaux que nous utiliserons seront de jeunes adultes. Ils arriveront au laboratoire âgées de 8 semaines et ne seront pas testés avant leur 9ème semaine, ce qui correspond à une phase où ils sont sexuellement mâtures, et où ils ont aussi un système nerveux mâture. Il est important de réaliser les expériences chez l’animal adulte pour éviter des biais dus à l’âge et le manque de maturité des systèmes physiologiques.

10432 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie gardée en vie comme modèles d'étude, les autres tués après l'imagerie pour prélever le cerveau. Ils subissent une à deux chirurgies stéréotaxiques, une anesthésie terminale pouvant durer six heures pour l'imagerie et des microdialyses répétées, afin de développer des techniques de microscopie de l'espace extracellulaire cérébral. Le porteur ramène les atteintes à un "stress de l'anesthésie", des infections de sutures et des douleurs chirurgicales, pour l'un des plus gros effectifs du lot. Il indique que la caractérisation de cet espace "nécessite" des modèles animaux mimant la complexité des maladies humaines.

Objectifs

La recherche sur le cerveau a fait d'énormes progrès au cours des dernières décénnies dans presque tous les domaines à l'exception de l'exploration de l'espace extracellulaire (EEC). C'est pourtant un compartiment élémentaire qui permet la communication entre les cellules cérébrales, grâce aux nombreuses molécules qui y transitent. L'espace extracellulaire est un système de compartiments interconnectés et limités par des membranes cellulaires. Il est composé par le fluide interstitiel et un échanfaudage dynamique connu comme la matrice extracellulaire (MEC). Environ 20% du volume cérébral est occupé par l'espace extracellulaire qui sert de microenvironnement pour le cerveau et forme un canal de communication chimique intercellulaire (appelé transmission de volume). Cette trasmission en volume peut être modulée par les propriétés biophysique de l'EEC, en particulier les paramètres de diffusion. Il a été montré que la structure et la diffusion de l'eec sont hétérogènes et qu'elles dépendent de conditions internes et externes à l'organisme. De plus, l'EEC est un reservoir pour les ions impliqués dans l'activité électrique des neurones et joue un rôle clé dans la transmission de substances neuro-actives entre les cellules. Ainsi, l'EEC n'est pas seulement le siège de toutes sortes d'intercations cellules-cellule, mais peut également jouer un rôle important dans des fonctions neuronales cruciales, telles que la mémorisation ou la formation de circuits neuronaux. Déterminer comment les molécules se déplacent dans l'espace extracellulaire est un défi très important, non résolu, qui freine l'étude des mécanismes cérébraux pathologiques et thérapeutiques. Le manque de connaissances résulte de l'absence de technologies spécifiques, permettant l'étude résolutive in vivo du microenvironnement.

Bénéfices attendus

Nous proposons d’utiliser deux nouvelles approches de microscopie super résolutive développées dans nos laboratoires pour fournir une description détaillée de l’EEC et du réseau structurel de la MEC dans le tissu sain et pathologique : (i) technique de Shadow imaging (SUSHI) qui est une méthode de marquage où un fluorophore est injecté localement dans le cerveau afin de visualiser l’EEC avec une résolution nanométrique, (ii) technique d’imagerie de nano-objets uniques (suivi des nanotubes/nanoparticules de carbone). Ces approches permettront de composer, à une échelle nanométrique, une carte de l’espace extracellulaire et de sa matrice dans les régions d’intérêt. C’est pourquoi, nous proposons à travers cette étude qui regroupe quatre laboratoires phare en neurosciences à Bordeaux, de caractériser l’EEC via des technologies nouvelles et inédites de microscopie de super-résolution

Procédures

Chirurgie stéréotaxique (1h maximum), au maximum deux chirurgies stéréotaxiques pour les modèles pathologiques Anesthésie pendant la chirurgie (1h) et en terminal pour l'imagerie (jusqu'a 6 h), une fois par animal Imagerie (6h) une fois par animal Collecte d'échantillon par microdialyse sur animaux vigiles et non contraints, 4 fois espacées au minimum d'une semaine.

Impact sur les animaux

Ils sont représentés par l’utilisation de la chirurgie : stress de l'anesthésie, infection des points de suture, douleurs chirurgicales, déshydratation, perte de poids.

Devenir

Les animaux issus des procédures représentent la fabrication des modèles d'études seront gardés en vie. Les animaux issus de l'imagerie seront euthanasiés afin de récupérer les cerveaux pour une analyse histologique.

Remplacement

L'étude de l'espace extracellulaire a connu des avancées récentes, grâce au développement de techniques comme la microscopie en super résolution appliquée aux modèles ex vivo. Pour compléter les connaissances sur le sujet il est nécessaire d'obtenir des données sur l'animal sain et pathologique, à travers des modèles animaux réalisés chez le rongeur. Nous souhaitons caractériser l’espace extracellulaire sain et pathologique, nécessitant l’utilisation de modèles animaux pouvant mimer la complexité des maladies chez l’humain.

Réduction

Cette étude concerne un consortium composé de 4 laboratoires français qui à la fin de l’étude récupèreront des échantillons afin d’effectuer des études histologiques, complétant ainsi les études in vivo et ainsi la base de données scientifiques, limitant l’expérimentation animale à cette seule étude.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité.

Choix des espèces

L'utilisation de rongeur dans le développement d'outil de microscopie en super résolution est pertinente dans cette première phase de notre projet. En effet, la taille réduite de l'animal, son cycle de vie court et la disponibilté des modèles pathologiques permettent d'optimiser le développement d'outils pour l'imagerie in vivo de l'environnement extracellulaire. Souris : les animaux seront utilisés à l'âge de 2 mois et jusqu'a 4 mois, pour permettre de travailler avec des animaux sains et pathologiques adultes. Rats : les animaux seront utilisés au stades post nataux de P1 et jusqu'a P60 (2 mois) pour les animaux sains et pathologiques, qui correspond à un stade de jeune adulte, qui est la période où des troubles psychotiques peuvent apparaître