Système nerveux

70 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous reçoivent une injection intracérébrale de cellules tumorales par craniotomie, et trente d'entre eux subissent une seconde chirurgie pour implanter un dispositif d'administration et une pompe osmotique. Le porteur teste une voie d'administration locale de médicament contre le glioblastome, et non une molécule, ce qu'il présente comme réalisable seulement in vivo. Il fixe comme point limite une taille de tumeur qu'il décrit comme n'induisant pas encore de souffrance perceptible.

Objectifs

Bien que l'incidence du glioblastome soit faible (~6/100000) la médiane de survie post-diagnostic est de l'ordre de 15 mois malgrè un traitement agréssif associant une chirurgie et une chimio/radiothérapie. Parmi les améliorations thérapeutiques possibles, l'utilisation d'une infusion focale à flux fixe (CED) est une option. Toutefois, ce type d'infusion est limité dans le temps et possible qu'au moment de l'exèrese. L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer l'apport d'un nouveau dispositif médical permettant de délivrer localement un médicament par une infusion multifocale à flux fixe et ceci sans contrainte de temps.

Bénéfices attendus

Le bénéfice à cours terme est de proposer une approche thérapeutique innovante et modulable pour le glioblastome dont la médiane de survie reste très courte.

Procédures

Parmi les 70 animaux inclus dans cette étude, 70 recevront une injection intracerébrale de cellules tumorales. Ils subiront donc une chirurgie sous anesthèsie générale de 15-20 minutes, une incision cutanée, une craniotomie de 0.5mm de diamètre. Parmi les 70, 30 subiront une seconde chirurgie 8 jours après la première. Les gestes seront identiques à ceux réalisés précédement. 30 subiront une seconde chirurgie, 8 jours après la première, sous anesthèsie générale de 60 minutes, une incision cutanée, une craniotomie de 4mm de diamètre au niveau de la plaque pariètale, suivi par la pose du dispositif et un décollement cutané au niveau interscapulaire afin de poser une pompe osmotique. Les 10 derniers ne subiront pas de chirurgie complementaires. Tous les animaux seront suivi par IRM afin d'évaluer l'impact des thérapies mises en oeuvre sur la croissance tumorale.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont relatives aux chirurgies incluses dans le protocole. En effet, une première chirurgie consistera à injecter les cellules tumorales au travers d'un orifice de diamètre inférieur à 1mm dans le crâne du rat après incision cutanée. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale (isoflurane) avec injection sous cutanée pré-opératoire et post opératoire de buprénorphine (0,1mg/kg 0,1mg/mL Buprécare) et injection locale de lidocaine (16,2mg/mL, 100uL). La seconde chirurgie sera réalisée une semaine après la première, également sous anesthésie générale (isoflurane) avec injection sous cutanée pré-opératoire et post-opératoire de buprénorphine et injection locale de lidocaine. Cette chirurgie s’accompagnant d’une craniotomie de 4mm de diamètre et d’une tunnelisation pour la pose de la pompe osmotique, des doses supplémentaires de buprénorphine seront dispensées 6h et 18h post chirurgie. Enfin, après chaque chirurgie, les animaux seront isolés pour 24h afin d’éviter qu’ils ne se rongent mutuellement les sutures.

Devenir

En fin de procédure 1 (inoculation de cellules tumorales) tous les animaux seront conservés car impliqués dans la procédure 2. En fin de procédure 2 (evaluation du nouveau dispositif) tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Il existe de nombreux tests de toxicité de molécules sur des modèles cellulaires. Ces tests ont été réalisés et nous on permis de selectionner 2 molécules avec un potentiel thérapeutiques certains sur la lignée de glioblastome testée. Dans notre cas, nous ne cherchons pas à tester une nouvelle molécule mais une voie d'administration innovante et ceci ne peux être réalisé qu'in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum tout en maintenant une puissance statistique suffisante. en effet, une simulation en utilisant G-power montre que pour nos groupes (non traités, traités PBS avec le nouveau dispositif, traités par la molécule 1 avec le nouveau dispositif, traité en CED par la molécule 1 et traité par du PBS par CED) contenant un nombre d'individus équivalent et égal à 10, un gain de survie moyen de 2 jours pour la thérapie CED et au minimum 3 fois supérieur pour le nouveau dipositif peux être mis en evidence avec un risque alpha de 0.05 et beta 0.95.

Raffinement

Outre les conditions d'hébergement assurées par la structure (cycle jour/nuit, température, papier pour constitution de nid...) les animaux seront maintenus en normothermie pendant toutes les procédures chirurgicales. Ces procédures seront réalisées sous anesthèsie isoflurane et une injection locale au niveau de la zone d'inscision de lidocaine. Une analgésie pre et post operatoire par de la buprenorphine et également associée. De plus, le suivi réguliers par IRM de la croissance tumorale, là aussi en normothermie assurée par une couverture chauffante asservie à la temperature réctale, et le suivi lors de ces examens du rythme respiratoire, la production de données sériées permet de limiter le nombre d'individus nécessaire pour tester notre hypothèse de travail. De plus, le suivi de la masse tumorale permet d'arreter le protocole expérimental avant tous signes cliniques de souffrance de l'animal. En effet, notre expérience de ce type de modèle nous permet de fixer comme point limite une taille de tumeur de 100µL, taille qui n'induit pas de modifications comportementales traduisant une souffrance.

Choix des espèces

Les tumeurs 9L sont des tumeurs initialement produites chez le rat fisher et ne se developpent que chez cette souche immunocompétente. Les animaux utilisés seront des animaux adultes de 7-8 semaines au moment de la première chirurgie. A cet age, il est possible de poser le dispositif sur le crane de l'animal en ne touchant qu'une seule plaque pariètale. De plus, le dispositif faisant environ 3mm de hauteur, il est possible de suturer sans crèer de tension importante. Enfin, avec cette taille de rat, la pompe osmotique (environ 1cm de long et 0.4cm diametre) alimentant le dispositif une tubulure souple en polyurethane peut être placée entre les omoplates sans entraver la mobilité de la tête.

150 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection cérébrale de vecteurs viraux sous anesthésie, reçoivent du tétrahydrocannabinol, passent des tests de comportement moteur et sont isolées une semaine, avant d'être tuées pour vérification histologique. Le porteur étudie le rôle du récepteur CB1, cible des molécules du cannabis, dans le contrôle moteur et les maladies neurodégénératives. Il affirme que les simulations numériques ne sont pas fiables et que le recours à l'animal "demeure nécessaire".

Objectifs

Le « système moteur » est principalement composé par le groupe de noyaux appelé « les ganglions de la base ». Ce système fortement conservé chez les mammifères, y compris l’homme, est un système complexe des connexions entre différents noyaux fortement régulé par plusieurs mécanismes agissant en différentes étapes, et toujours ces mécanismes sont à clarifier complètement. Le système des ganglions de la base est aussi la principale cible des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington. Pour nous, un possible candidat qui pourrait être important dans le control des ganglions de la base est le système endocannabinoide. Dans le cerveau, l’action du principal composé psychoactif du cannabis passe par un ensemble de molécules, appelées collectivement « système endocannabinoïde ». Ce système contrôle de très nombreuses fonctions du corps humain. Il est notamment impliqué dans le contrôle moteur et la coordination. Avec ce projet (que est un complement de un projet deja en cours) nous voulons comprendre le mécanisme physiologique par lequel les cannabinoïdes agissent sur les fonctions motrices, et leurs implications possibles dans les maladies neurodégénératives affectant ces fonctions.

Bénéfices attendus

Le récepteur CB1 est la cible endogène des molécules psycho-actives du cannabis. Au niveau endogène, ce récepteur est activé par des molécules lipidiques (endocannabinoïdes) qui jouent un rôle crucial dans les mécanismes de protection et régénération neuronales. De plus, l’administration de drogues dérivées du cannabis a été suggérée comme un outil thérapeutique pour plusieurs maladies du système nerveux centrale et des ganglions de la base. Ce projet nous aidera à mieux comprendre le mécanisme physiologique par lequel les cannabinoïdes régulent l'activité de ce circuit neuronal en visant donc au development d’outils thérapeutiques pour les troubles moteurs associé aux maladies neurodegeneratives.

Procédures

Nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées. Sur certaines souris, nous allons injecté des vecteur viraux pour reduire la signalisation du recepteur CB1 dans des regions specifiques du cerveau. Cette procédure chirurgicale se fera sous anesthésie générale, avec un traitement analgesique pour prévenir la douleur (durée total de 30 minutes). L'intervention aura une durée de 30 minutes. Dans la période postopératoire (intevention de 3 jours), une injection sous-cutanée de Buprénorphine sera administrée 6 heures apres la premiere injection et répétée une fois par jour pedant 3 jours. Trois semaines apres chirurgie, les souris seront en isolement une semaine avant injection et seront injecteé avec differentes drogues: Tetrahydrocannabinol et leur vehicule (Durée total de 45 minutes). Apres traitments, les souris seront soumis a des tests de comportement moteur (Durée de 5minutes ). Apres le comportement, les souris seront mis a mort selone les modalité decrites.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de risque majeur lié à l’acte chirurgical et la douleur associée est traitée par une anesthésie approprié et des analgésiques. Il n’y a pas de signe perceptible des douleur après l'opération, durant la récuperation et lieés au procedures de injection et comportement. Néanmoins, il y a des points limites bien décrit dans les procédures. Le taux d’apparition des signes d’infection de la plaie suite à la chirurgie est très faible.

Devenir

Les souris issue de la procedure de chirurgie seront en suite traité avec des drogues suivi par des tests comportamentales. En suite les animaux seront mis a mort pour fin experimentation et verification hystologique des injectiones virales.

Remplacement

A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui ont un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale.

Réduction

Les animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux n'excèderont pas 15 animaux, c'est à dire le nombre minimal d'échantillons permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine et aussi décrit dans la literature scientifique sur le sujet. Au regard du faible nombre d'individu par groupes expérimentaux, les analyses statistiques basées sur des tests non paramétriques seront privilégiées par rapport aux tests paramétriques. De cette facon, les nombres prévus permettent de garantir une bonne interprétation des résultats. Néanmoins, si l’expérience nous montre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.

Raffinement

Un protocole de surveillance et un suivi quotidien et rigoureux seront mis en place par l’experimentateur et le personnel zootechnicien. En cas de blessure légère, un protocole de soins et désinfection sera mis en place (antiseptique topique et antiinflammatoire systémique) jusqu’à la guérison. En cas d’atteinte du point limite terminal, l’animal sera mis à mort. Pour les traitments pharmacologiques, les injections IP sont bien maitrisées dans le laboratoire et ils n’induisent pas de mal-être chez l’animal. En plus les produits utilisés (et leur doses) sont bien tolérés chez les animaux. Les souris seront néanmoins bien observées suite aux injections, par un personnel qualifié ainsi que par l’expérimentateur, et ce, afin que des mesures d’analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. Pour certaines experiences de comportement moteur, les souris seront isolées pedant 7 jours avant injection. Toutes les mesures pour reduire l'impact de ce type d'hébergement seront mise en place (congénères à proximité et enrichissement approprié). Les animaux seront hébergés dans des cages collectives avant et après manipulation, sauf pour certaines experience de comportement moteur que prevoi une semaine d'isolement. Les souris seront hébergés avec un milieu enrichi (matériel de nidification en coton et 2 tunnels par cage), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière pour les souris. Les souris seront observées quotidiennement par un personnel qualifié ainsi que par des expérimentateurs, formés selon la règlementation en vigueur et ce, afin que des mesures d’analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. La mise en place des points limites repose sur une évaluation de l'état général et comportemental des animaux comme expliqué dans la procédure. Toutes les procédures chirurgicales, pré- et post-opératoire, prévoit aussi l’utilisation d’analgésique pour la prise en charge de la douleur. Elles seront effectuées par des experimentateurs formés à la chirurgie chez les rongeurs, selon la règlementation en vigueur.

Choix des espèces

A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui ont un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale. La souris représente le modèle idéal pour ces trois raisons : 1) Possibilité d’étudier des mutants pour une protéine donnée (ici le récepteur CB1), 2) Pour une reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Les infrastructures sont équipées pour être destinées à l’étude des rongeurs. L'age des animaux sera de 8-12 semaines car les protocoles que nous avons établis seront développés à l'âge adulte des souris en évitant les problèmes de développement et la variabilité associée. Cela nous permettra également de comparer avec d'autres études sur le terrain.

110 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une restriction alimentaire, un implant cérébral chirurgical et un hébergement en cage individuelle pour enregistrer leur activité cérébrale pendant des tâches de mémoire en labyrinthe et pendant le sommeil. Le porteur présente la restriction alimentaire et l'exercice en labyrinthe comme "bénéfiques" pour la santé des animaux, et indique qu'une démarche de replacement auprès d'une association reste seulement "en cours". Il affirme que l'étude des mécanismes de la mémoire ne peut se faire que sur des animaux au cours de l'apprentissage.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester la théorie standard des mécanismes de la formation et de la consolidation de la mémoire, qui attribue un rôle critique à l'hippocampe et à ses partenaires corticaux et sous-corticaux, notamment pendant le sommeil. Nous entraînerons donc des rats à effectuer des tâches de mémoire impliquant ces systèmes, nous enregistrerons l’activité cérébrale pendant l’accomplissement de ces tâches et pendant le sommeil, et nous tenterons également d'altérer les performances mnésiques en modifiant la dynamique cérébrale au moyen de stimulations ciblées. Des rats seront utilisés pour toutes les étapes de ce projet. Le rat est un modèle standard pour l’étude de la mémoire aussi bien en psychologie animale qu’en neurophysiologie chez l’animal libre de ses mouvements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux de la formation et de la consolidation de la mémoire. Nous nous intéresserons en particulier à l’hippocampe, une structure qui chez l’homme joue un rôle clef dans la mémoire des souvenirs personnels (mémoire épisodique) et des faits généraux (mémoire sémantique), et qui est particulièrement impactée dans les troubles mnésiques liés aux maladies neurologiques, notamment l’épilepsie et la maladie d’Alzheimer. À ce titre, des travaux précédents décrivant une méthode d’amélioration de la consolidation de la mémoire chez le rat ont été récemment répliqués chez l’homme et laissent entrevoir la possibilité de pallier certains déficits mnésiques liés à l’âge ou à la pathologie.

Procédures

Ce projet utilisera 110 rats. Pour étudier les bases neurales de la mémoire, les animaux sont entraînés à effectuer des tâches de mémoire spatiale dans des labyrinthes (max 110 rats, typiquement 1–2 h/jour, 2–4 semaines). L’accomplissement de ces tâches repose sur la motivation des animaux à obtenir des récompenses alimentaires. Une légère restriction alimentaire est donc nécessaire à leur motivation, ainsi que pour éviter leur surpoids (max 110 rats, depuis l’entraînement jusqu’à la fin des enregistrements, typiquement 1–3 mois). Pour permettre une restriction précise, les animaux sont maintenus dans des cages individuelles, à proximité directe de leurs congénères, dans des cages transparentes pour assurer une contiguïté visuelle, auditive et olfactive (max 110 rats, pendant la durée de la restriction). La littérature scientifique montre que la légère restriction alimentaire (>85% du poids normal à l’âge de l’animal) et l’exercice physique dans les labyrinthes sont bénéfiques pour un grand nombre de marqueurs de santé et de vieillissement. Les animaux reçoivent un implant chirurgical (max 110 rats, 1 fois, typiquement 4–12 h) pour pouvoir enregistrer leur activité cérébrale (max 110 rats, typiquement pendant 2 à 3 semaines) pendant l’accomplissement de la tâche (typiquement 1–2h/jour d’enregistrement) ainsi que pendant le sommeil lorsque la mémoire se stabilise à long terme (typiquement 1–6h/jour d’enregistrement). Pour 40 animaux (max), une expression intracérébrale de protéines d'intérêt sera également pratiquée (1 fois, typiquement 1–2h). Une analyse histologique permettra de vérifier les sites d’enregistrement ou d’expression (max 110 rats, 1 fois, typiquement

Impact sur les animaux

Le projet nécessite de maintenir les animaux dans des cages individuelles pendant une durée limitée pour pouvoir assurer une restriction alimentaire (ou hydrique) précise. Pour limiter le stress, les animaux sont maintenus à proximité directe de leurs congénères, dans des cages transparentes (contiguïté visuelle, auditive et olfactive). La légère restriction alimentaire (>85 % du poids normal à l’âge de l’animal) est bénéfique pour un grand nombre de marqueurs de santé et de vieillissement (vieillissement cellulaire, déclin immunitaire, inflammation chronique, communication cellulaire). De plus, les animaux sont entraînés à explorer des labyrinthes (typiquement, 1 à 2h/jour), ce qui contribue également à éviter les inconvénients d’une obésité liée à une consommation alimentaire à volonté combinée à un manque d’exercice physique résultant du maintien en cage. L’exploration de labyrinthes constitue par ailleurs une stimulation bénéfique (exercice physique, curiosité, récompenses alimentaires, etc.) L’implantation des dispositifs d’enregistrement cérébral nécessite une récupération, facilitée par l’utilisation d’anesthésiques gazeux (récupération plus rapide) et de traitements antibiotiques, analgésiques et anti-inflammatoires appropriés.

Devenir

À l'issue de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. La validation des enregistrements nécessite un prélèvement histologique. Une démarche alternative est en cours auprès d’une association pour replacer les animaux qui seraient jugés aptes par un vétérinaire.

Remplacement

Certains mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendant la mémoire (par exemple, le recrutement de nouveaux récepteurs au niveau synaptique) peuvent être défrichés in vitro. Certaines propriétés computationnelles de petits réseaux de neurones peuvent être testées in silico. Mais in fine, l’étude des mécanismes de réseau de formation et de consolidation de la mémoire nécessite de faire des liens corrélationnels et causaux précis entre activité neuronale à grande échelle et comportements d’apprentissage et de mémoire, et ne peut se faire que sur des animaux au cours même de l’apprentissage, du sommeil et du rappel.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons des systèmes d'acquisition haute densité, permettant d'enregistrer >100 neurones simultanément, ce qui maximisera la quantité d'information apportée par chaque animal.

Raffinement

Les soins post-opératoires incluront des traitements antibiotique (ex : marbocyl), analgésique (ex : buprénorphine), ainsi qu'une surveillance quotidienne des animaux. Nos expériences s'effectueront sur des animaux vigiles, libres de leurs mouvements (et non tête fixée) pour se rapprocher au mieux de la physiologie et limiter le stress. Les systèmes d’enregistrement sont miniaturisés au maximum pour s’assurer que les animaux implantés aient un comportement tout à fait normal. Pour limiter le stress dû à l’isolement, nous utiliserons des cages transparentes placées à proximité les unes des autres, de façon que les animaux puissent rester en contact visuel, auditif et olfactif. De la musique sera diffusée dans la pièce pour réduire le stress causé par les éventuels bruits environnants (ex : passage de personnes dans le couloir), qui bien que réduits pourraient devenir plus saillants dans le silence.

Choix des espèces

Le rongeur est l’espèce standard pour toutes les études des bases neurophysiologiques de la mémoire spatiale depuis des travaux fondateurs menés dans les années 70. Ce sont les modèles pour lesquels les outils expérimentaux sont les plus développés (électrophysiologie à grande échelle, vecteurs viraux, optogénétique). En outre, les rats peuvent apprendre des tâches comportementales élaborées et être équipés de dispositifs d’enregistrement visant plusieurs structures cérébrales. Nous utiliserons de jeunes adultes (typiquement 2 à 6 mois), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.

80 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'injection d'un vecteur viral dans le cerveau, puis un isolement en cage individuelle pour toute la durée du projet, des jeûnes prolongés jusqu'à quatorze heures, des tests de tolérance au glucose et de privation de glucose provoquant une hypoglycémie, avant mise à mort par perfusion intracardiaque. Le porteur reconnaît que la récupération chirurgicale, le jeûne et l'isolement sont sources de douleur, de stress et d'inconfort, et cherche à les limiter par des contacts visuels entre cages. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier le rôle des cellules gliales dans le contrôle de la glycémie et du poids.

Objectifs

L’obésité et ses comorbidités représentent un grave problème de santé publique. Le contrôle de la balance énergétique (équilibre entre les dépenses énergétiques et les apports par l’alimentation) est assuré par le cerveau, avec un rôle important dévolu au complexe vagal dorsal (CVD) localisé dans le tronc cérébral caudal. Le CVD dispose de réseaux de neurones sensibles au glucose et à d’autres signaux informant des réserves énergétiques de l’organisme, mais aussi de cellules gliales dont la contribution au contrôle de la balance énergétique commence à être révélée. Cette procédure vise à réduire l’expression de la connexine 43 par interférence ARN et ainsi altérer, au sein du complexe vagal dorsal, les communications par jonctions communicantes entre cellules gliales et les communications paracrines depuis les cellules gliales via les hémi-canaux de connexines, puis à en tester les effets sur la croissance pondérale, la prise alimentaire, la tolérance au glucose et l’adaptation précoce à un régime riche en sucre et graisse (comportement alimentaire, marqueurs métaboliques circulants et morphologie des cellules gliales). Nous utilisons des vecteurs viraux adéno-associés pour inhiber la connexine la plus abondante du système nerveux central spécifiquement dans les cellules gliales du CVD et ainsi altérer leur communication. Nous avons vérifié la spécificité et la fonctionnalité de ces outils dans un précédent projet pilote. Dans le présent projet, nous souhaitons déterminer le rôle fonctionnel joué par cette molécule sur l’homéostasie glucidique et énergétique chez la souris. Les procédures décrites permettront de déterminer si la communication des cellules gliales intervient : 1) dans la tolérance au glucose et les réponses comportementale et neuronales à une privation en glucose ; 2) dans le contrôle de la prise alimentaire et du poids corporel sous un régime alimentaire standard ; 3) dans l’activation gliale et l’adaptation homéostatique lors d’une exposition brève à un régime riche en sucre et en graisses.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules gliales du tronc cérébral caudal régulent la prise alimentaire et la glycémie. Les données recueillies apporteront un éclairage nouveau sur l’importance fonctionnelle de la connexine 43 fortement exprimée par ces cellules gliales : 1) dans la régulation de la prise alimentaire et du poids corporel dans le cadre d’un régime alimentaire standard ; 2) dans les régulations de la glycémie en réponse à une surabondance ou une privation en sucre ; 3) dans les phases précoces de réaction à un régime alimentaire riche en sucre et en graisse, lors desquelles une surconsommation initiale laisse place à une normalisation de l’apport calorique. A plus long terme, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’obésité et de ses comorbidités.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous analgésie morphinique préopératoire et anesthésie générale (durée 45 minutes) pour l’injection intracérébrale d’un vecteur viral contrôle ou ciblant la connexine 43. Les animaux seront ensuite hébergés en cage individuelle pour la durée restante du projet, pour leur sécurité (risque de blessures par les congénères) et pour les mesures individuelles nécessaires pour déterminer l’impact de la réduction de la connexine 43 sur le contrôle de la glycémie et la prise alimentaire. Après récupération chirurgicale, certains animaux subiront un test de tolérance au glucose (4h), au cours duquel une solution de glucose sera administrée par voie orale (moins d’1 min), puis des prélèvements sanguins seront réalisés à la veine caudale sous anesthésie locale pour suivre l’évolution du glucose sanguin (7 prélèvements en 4h, moins d’1 min par prélèvement). D’autres animaux subiront des tests de privation en glucose (par injection IP d’un analogue non métabolisable du glucose ; durée 2h), suivi de mesures de la glycémie (5 prélèvements de sang à la veine caudale en 2h) ou de la prise alimentaire. Les tests de tolérance au glucose et les tests de privation en glucose nécessitent une mise à jeun préalable, respectivement de 14h et de 5h. A la 9ème semaine post-chirurgie, les animaux ayant subi le test de tolérance au glucose seront soumis à un régime alimentaire riche en graisse et en sucre pour une durée de 12h ou 5 jours, ou maintenus sur régime alimentaire standard pendant 5 jours (groupes contrôles). A l’issue de ces régimes, les animaux seront mis à mort sous analgésie morphinique et anesthésie générale. Le cerveau sera prélevé pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux ayant subi les tests de privation en glucose recevront à nouveau une administration IP d’un analogue non métabolisable du glucose (ou de solution saline) et seront mis à mort 3h après cette injection, sous analgésie et anesthésie générale. Le cerveau sera prélevé pour les analyses histologiques post-mortem.

Impact sur les animaux

Les procédures utilisées ont pour objectif de tester la contribution des cellules gliales à la régulation du statut glycémique et de l’homéostasie énergétique. L’accomplissement de cet objectif implique le recours à une chirurgie d’injection intracérébrale. Après cette chirurgie, les animaux sont hébergés individuellement, pour leur sécurité durant la récupération post-opératoire et pour le suivi individuel de la consommation alimentaire et des régulations du statut glycémique dans la suite des procédures. La période de récupération post-opératoire est source d’inconfort et de douleur pour l’animal. Après récupération postopératoire, l’administration orale de glucose ou l’administration intrapéritonéale d’un dérivé non métabolisable du glucose (2DG) causent un inconfort dû à la contention de l’animal et à l’administration elle-même. Ces administrations sont précédées d’une mise à jeun indispensable à la standardisation du statut glycémique, limitée à 14 h pour le test de tolérance au glucose et à 5 h pour la glucoprivation. Cette mise à jeun est une source de stress pour les animaux. L’hypoglycémie provoquée par l’administration 2DG et les contre-régulations physiologiques permettant le retour à la normo glycémie sont une source d’inconfort pour l’animal. Le suivi du statut glycémique requiert des prélèvements répétés d’une goutte de sang à la veine latérale de la queue. L’exposition à un régime riche en sucre et en graisse pendant 12h à 5 jours ne génère aucune douleur ou inconfort mais nécessite des pesées régulières et une manipulation des animaux qui peut être une source d’inconfort. La récupération des cerveaux fixés, indispensable aux études immuno histologiques post-mortem, nécessite une mise à mort par perfusion intracardiaque.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, des analyses histologiques post-mortem sont indispensables : 1) Pour vérifier l’expression du vecteur viral par les cellules gliales dans la région d’intérêt ; 2) et caractériser les réponses cellulaires neuronales et gliales. Ces analyses post-mortem nécessitent donc une mise à mort des animaux.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de l’homéostasie glucidique, la consommation alimentaire et le poids corporel.

Réduction

Au total, 80 souris mâles sont nécessaire à ce projet. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu du nombre des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Un précédent projet pilote nous a permis de vérifier l’efficacité de nos vecteurs viraux à réduire l’expression de la protéine Cx43 de façon ciblée dans la zone cérébrale d’intérêt. Il s’agit ici de déterminer l’impact fonctionnel de cette réduction d’expression. Les mesures terminales à effectuer consistent en une analyse immunohistochimique avec quantification : du nombre et de la morphologie des cellules gliales d’intérêt en réponse à l’exposition brève à un régime riche en graisse et en sucre (procédure 1) et de l’activation cellulaire neuronale et gliale en réponse à une glucoprivation (procédure 2). Le nombre de lots nécessaires à ces analyses dépend du nombre de variables testées dans chaque procédure. Pour la procédure 1 : 2 vecteurs viraux (contrôle et ciblant la connexine 43) x 3 conditions différentes de régime alimentaire (régime riche en graisse et sucre : 12 h ou 5 jours HFS ; régime alimentaire standard : 5 jours), soit 6 lots d’animaux. Pour la procédure 2 : 2 vecteurs viraux (contrôle et ciblant la connexine 43) x 2 traitements pharmacologiques (solution saline ou analogue non métabolisable du glucose), soit 4 lots d’animaux. Pour l’effectif par lot, la quantification du nombre et de la morphologie des cellules gliales nécessite 7-8 animaux par lot, compte-tenu de la variabilité des mesures. Un effectif de 8 animaux par groupe est choisi ici pour prendre en compte la variabilité de ciblage des injections de vecteur viral. Cet effectif par lot est pleinement compatible avec les mesures préalables de tolérance au glucose aux 3 délais post-chirurgie envisagés (4, 6 et 7 semaines), chacun de ces tests mobilisant deux lots d’animaux parmi les 6 de la procédure 1 (2 variables : vecteurs viraux contrôle et ciblant la connexine 43). Pour la procédure 2, les mesures de glycémie et prise alimentaire en réponse à la glucoprivation imposent un effectif de 8 animaux par lot. Ces expériences mobilisent chacune les 4 lots d’animaux de la procédure 2, en raison des 4 variables par expérience : 2 vecteurs viraux (contrôle et ciblant la connexine 43) x 2 traitements pharmacologiques (solution saline ou analogue non métabolisable du glucose).

Raffinement

Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement et tout repérage d’un état anormal fera l’objet d’une quantification par une grille de score adaptée, assortie de points limite et de points d’arrêt préétablis permettant une prise en charge adaptée. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous analgésie et/ou anesthésie générale chimique. La chirurgie d’injection intracérébrale est réalisée sous analgésie morphinique pré-opératoire, anesthésie locale et anesthésie générale chimique et analgésie post-opératoire. En période post-opératoire, un suivi renforcé est mis en place. Durant les deux premiers jours post-opératoires, une analgésie est systématiquement administrée et une alimentation sous forme de gel enrichi est disposée en fond de cage pour limiter la déshydratation et la perte de poids. Les prélèvements sanguins à la veine latérale de la queue pour dosages glycémiques seront réalisés sous anesthésie locale. Les animaux seront habitués à la manipulation et à la contention avant les tests de tolérance au glucose et de glucoprivation. Ces phases d’habituation ont pour objectif de réduire l’angoisse animale et d’éviter des fluctuations importantes de la glycémie et de la prise alimentaire dû à la manipulation des animaux et à la contention. De plus, une habituation au retrait de la mangeoire (pendant 2h en phase diurne les deux jours précédant la mise à jeun de 14 h) et à la nourriture enrichie en sucre et en graisse (pendant 10 minutes en phase diurne les deux jours précédant la bascule sur ce régime) contribuera à diminuer le stress des animaux et évitera la néophobie lors du changement de régime alimentaire. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire depuis la chirurgie d’injection intracérébral jusqu’à la fin des procédures. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes pour rongeurs en polycarbonate sont disposées de façon à permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères et un enrichissement plus varié est mis en place.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque c’est le modèle le plus documenté dans la littérature. Des souris adultes à partir de 8 semaines seront utilisées. Les atlas stéréotaxiques se basent sur cet âge pour estimer les coordonnées stéréotaxiques des structures ciblées.

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux reçoivent des injections répétées de morphine sur cinq jours qui provoquent selon le porteur une tolérance et une hyperalgésie, puis subissent des stimulations mécaniques de la patte au filament de Von Frey déclenchant un retrait douloureux, pour étudier le rôle d'un récepteur dans les effets de la morphine chronique. Le porteur souligne que l'animal peut échapper à la stimulation faute de contention et décrit des points limites incluant vocalisations, automutilation et perte de poids. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace l'étude in vivo car la douleur met en jeu de nombreuses régions nerveuses.

Objectifs

La morphine est un antalgique puissant qui appartient à la classe des opioïdes. Son utilisation, qui permet de soulager des douleurs intenses, peut être limitée en raison de l'apparition d'effets secondaires et de phénomènes de tolérance (accoutumance nécessitant d’augmenter la posologie pour maintenir l’effet antalgique) et d’hyperalgésie (amplification de la douleur suite à un stimulus nociceptif). Ses deux effets secondaires sont liés à l’utilisation de morphine de façon chronique. Il a récemment été mis en évidence l’importance du récepteur Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) au niveau périphérique dans le développement des douleurs neuropathiques. L’objectif général sera d’étudier le rôle de ce récepteur FLT3 au niveau central (plus précisément de la moelle épinière) dans les effets induits par la morphine administrée en aigue et par la morphine administrée en chronique. Les objectifs spécifiques du projet seront : Objectif 1) d’étudier les comportements d’analgésie et d’hyperalgésie des souris Wild type (WT) et des souris KO FLT3 après administration de morphine en aigue ou de morphine en chronique, Objectif 2) d’étudier les effets de ce même traitement (morphine aigue versus morphine chronique) sur les propriétés électrophysiologiques et morphologiques des neurones de la moelle épinière dorsale sur les souris WT et les souris KOFLT3 et Objectif 3) de déterminer si l’activation globale des neurones des couches superficielles de la corne dorsale est différente après morphine aigue ou chronique et si la suppression des récepteurs FLT3 modifie cette activation.

Bénéfices attendus

Ce projet présente un intérêt fondamental via l'étude des mécanismes d'action de la morphine au niveau central, et également un intérêt plus appliqué en permettant éventuellement de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques visant à diminuer les effets secondaires dus à la prise chronique de morphine.

Procédures

Les animaux seront soumis à des piqures intrapéritonéales de morphine (1 à 10 piqures sur 5 jours). Par ailleurs, des stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey pour induire un retrait de la patte sera réalisé. Cette stimulation dure moins d’une seconde.

Impact sur les animaux

Les souris vont soit recevoir une seule injection de morphine (ou de liquide physiologique) en intrapéritonéale qui va induire un effet analgésique ou bien 2 injections/jours pendant 5 jours de morphine (ou de liquide physiologique), qui va provoquer une tolérance ou une hyperalgésie à la morphine qui n’empêche pas les mouvements de l’animal. Par ailleurs, les stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey induisent un retrait de la patte signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention.

Devenir

Tous les animaux des 2 procédures seront mis à mort. Les 2 procédures sont 2 expériences différentes ne permettant pas de réutiliser les animaux.

Remplacement

Il n’y a pas de méthode alternative permettant de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique.

Réduction

Tout d'abord, une réduction sera réalisée dans la partie 1 du projet car les animaux de l'étude « comportement chronique morphine »(objectif 1) seront ré-utilisés pour l'étude des enregistrements électrophysiologiques (objectif 2). De plus, une réduction sera également réalisée dans la partie 2 du projet où nous ne ferons pas de groupe de souris "controle", nous utiliserons le coté contralatéral d'un même animal comme groupe contrôle. Enfin, le nombre de groupes de souris et le nombre de souris par groupe sera réduit au maximum tout en préservant une puissance statistique significative. Le nombre de souris par groupe a été déterminé sur la base des études précédentes et sur un calcul de puissance (http://www. 3rs-reduction.co.uk/html/6__power_and_sample_size.html). Ainsi le calcul de puissance à 80% indique un nombre de 8 souris par groupe pour observer une différence de 50% entre les animaux contrôles et les animaux traités. Afin d'anticiper une perte éventuelle d'animaux liée à la procédure expérimentale (injection...), un nombre maximum de 10 animaux par groupe sera envisagé pour le comportement et les stimulations électriques. La période d’habituation avant le comportement est fondamentale afin d’assurer une reproductibilité des tests et donc de limiter l’hétérogénéité des animaux réduisant le nombre d’animaux utilisés. Enfin, les données récoltées seront analysés par une mesure de variance suivie d’un test de Tukey si normalité vérifiée (sinon test de Mann-Whitney) pour comparer 2 groupes et une ANOVA one-way ou two-way sera réalisée pour comparer plus de 2 groupes expérimentaux.

Raffinement

Les souris bénéficieront d’un enrichissement social: elle seront par groupes de 4 à 6 par cages et environnemental: des rouleaux et des nids seront positionnés dans les cages. Des visites seront réalisées au moins 2 fois par jour et toute observation de signes (points limites) tels que manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur (perte de plus de 15% du poids) ou obésité, et présence de tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue)…mettrait fin à l’expérimentation pour ces animaux par une mise à mort. Pour limiter l’angoisse due aux tests pratiqués, une habituation de minimum une semaine sera réalisée au cours de laquelle les animaux seront placés dans la pièce expérimentale pendant minimum 1h puis ensuite seront exposés aux différents tests sans appliquer le stimulus. Cela permettra aux animaux de s’habituer à l’environnement et à l'expérimentateur limitant ainsi l’impact du stress lié à la procédure expérimentale.

Choix des espèces

Il est nécessaire de réaliser ces études in vitro chez l’animal car aucune méthode alternative actuelle ne permet d’évaluer les effets de la morphine et les effets de délétion de FLT3 dans le développement de la chronicisation douloureuse. Les souris ont été choisies afin de pouvoir travailler en parallèle sur des souris transgéniques adaptées à nos recherches (dépourvues du gène FLT3) pour mieux comprendre les mécanismes d’action de la morphine dans l'induction de la tolérance/hyperalgésie, et sur des souris sauvages. Les souris auront entre 3 et 8 semaines, ce qui correspond aux âges utilisés dans la littérature.