Système nerveux

576 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie cérébrale à la naissance puis, à l'âge adulte, une seconde intervention et une mesure par voltamétrie sous anesthésie, avant de recevoir du THC pour modéliser l'effet du cannabis sur la schizophrénie. Les rates nouveau-nées sont tuées dès le sevrage à 21 jours, les mâles gardés pour la suite puis tués pour contrôle histologique. Le porteur affirme que l'étude de la maladie chez des patients non traités est difficile sur les plans éthique et pratique, ce qui rendrait la modélisation chez le rat "irremplaçable".

Objectifs

La schizophrénie est une maladie neuropsychiatrique complexe qui apparaît à l'adolescence et au début de l'âge adulte, avec un risque plus élevé d'apparition chez les individus de sexe masculin. La schizophrénie est une maladie mentale très invalidante (1ère source de handicap et de suicide des 25-35 ans) touchant environ 1% de la population, évoluant dans +60% des cas vers un état chronique. Son coût global pour la société est considérable. Les causes et les mécanismes biologiques mis en jeu dans la schizophrénie ne sont pas entièrement compris. Actuellement, on considère que la schizophrénie résulterait de connexions défaillantes entre différentes régions cérébrales ayant pour origine une perturbation du développement cérébral, notamment au niveau du cortex antérieur. Ces connexions défaillantes pourraient contribuer au dysfonctionnement des neurones dopaminergiques ; il s’agit d’un groupe de neurones dont l’implication dans l’expression des symptômes schizophréniques est communément acceptée. Récemment, un certain nombre de travaux laissent penser que l’usage du cannabis peut précipiter l’apparition de la schizophrénie ou aggraver les symptômes caractéristiques de cette maladie aussi bien lors d’une consommation chronique, qu’aigüe. Il s’agit non seulement d’un problème de société actuel de première importance, mais aussi d’un problème de santé majeur en raison de la consommation croissante du cannabis dans la population des adolescents et jeunes adultes. L’abord de cette question chez les malades atteints de schizophrénie non-traités par des antipsychotiques, est très difficile à mettre en œuvre, tant sur le plan éthique que pratique, en raison même de la nature de la pathologie, ce qui rend la modélisation chez l’animal tout à fait irremplaçable. Le projet proposé a pour but de mieux comprendre l’impact de l’inactivation néonatale de la partie antérieure du cortex cérébral sur les réponses comportementales et dopaminergiques lors de l’administration du principal composé du cannabis pouvant induire des troubles psychotiques, le delta-9 tétrahydrocannabinol (THC), chez l'animal (rat mâle) jeune adulte.

Bénéfices attendus

Le projet proposé se situe dans le cadre d’une modélisation chez l’animal de la physiopathologie de la schizophrénie. Il pourrait permettre de mieux comprendre certains aspects de la physiopathologie de la schizophrénie. Il pourrait contribuer in fine au développement de nouvelles approches thérapeutiques ; les traitements existants n’étant pas totalement satisfaisants.

Procédures

Les interventions prévues sont les suivantes : 1)Intervention chirurgicale chez l’animal nouveau-né (intervention unique ~15 min); 2) Intervention chirurgicale chez l’animal adulte (intervention unique 1h30 à 2h00); 3) Etude pharmacologique à l’aide de la voltamétrie in vivo (intervention unique~3h).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de la réalisation de ce projet, les animaux sont soumis à deux interventions chirurgicales à l’issue desquelles ils peuvent ressentir de la douleur. Pour ce qui est de la chirurgie réalisée chez l’adulte, les animaux peuvent présenter une légère perte de poids variable selon les animaux. Pour la majorité d’entre eux le retour vers des valeurs normales s’observe au bout de 7jours. Lors de l’étude pharmacologique les animaux peuvent ressentir une légère douleur transitoire au niveau du site d’injection, due à l’aiguille, lors de l’administration de THC. Par contre, le THC lui-même n’est pas décrit comme induisant de douleur, ni de détresse. Les réponses comportementales mesurées sont les réponses spontanées de l’animal. Il n’y a donc aucun effort à fournir par l’animal lors de cette étude.

Devenir

Intervention chirurgicale chez l’animal nouveau-né : Les nouveaux-nés femelles sont mis à mort lors du sevrage au 21ème jour, puis soumis à un contrôle histologique. Lors du sevrage, tous les animaux mâles sont gardés en vie pour être soumis à l’Intervention chirurgicale chez l’animal adulte, puis à l’étude pharmacologique. A l'issue de cette étude, tous les animaux adultes implantés sont mis à mort, puis soumis à un contrôle histologique.

Remplacement

La schizophrénie étant une maladie mentale se traduisant notamment par des troubles comportementaux, il n’y a pas de méthodes alternatives permettant de remplacer les protocoles mis en œuvre chez l’animal vivant, en situation comportementale, et en interaction avec l'environnement. En particulier, l’étude de l’apparition ou l’aggravation de symptômes schizophréniques suite à la consommation de cannabis (notamment de THC) sont très difficiles à étudier chez des malades non-traités, pour des raisons non seulement pratiques, mais surtout éthiques.

Réduction

Dans ce projet, le nombre total d’animaux, maintenu aussi faible que possible, est contraint par le nombre des animaux mâles nécessaires pour réaliser l’étude pharmacologique à l’âge adulte. En effet, pour des raisons de reproductibilité de l’expérience, et d’application du principe de réduction chez les animaux adultes, seuls les animaux mâles sont utilisés. L'utilisation des femelles nécessiterait l'utilisation d'un nombre d'animaux beaucoup plus important que celui proposé. Un nombre de 12 rats mâles par groupe a été déterminé à partir de travaux publiés concernant des études pharmacologiques du même type. Ce nombre apparaît nécessaire pour obtenir des résultats suffisamment robustes d’un point de vue statistique. L’analyse statistique des résultats sera réalisée en prenant en compte la répétition des mesures dans le temps pour un même animal. Cette stratégie de mesures répétées, conduit grandement à réduire le nombre d’animaux mâles utilisés et, en déterminant le décours temporel des réponses, permet de raffiner l’analyse de celles-ci.

Raffinement

Dans le cadre de la réalisation de ce projet, plusieurs éléments de raffinement sont mis en oeuvre. Ainsi, les interventions chirurgicales chez le rat nouveau-né et chez le rat adulte sont réalisées à l’aide d’une anesthésie gazeuse ce qui permet de contrôler au mieux la profondeur de l’anesthésie. Des analgésiques sont aussi utilisés pendant la phase chirurgicale. Pendant la phase post-opératoire, chez le nouveau-né, la bonne cicatrisation de l’incision est suivie quotidiennement en même temps que la pesée des animaux. Chez l’animal adulte, pendant la phase post-opératoire d'au moins 7j, l'eau et la nourriture sont placés dans des récipients adaptés situés directement sur le fond de la cage afin de faciliter la récupération des animaux. Pendant cette phase de récupération post-opératoire les animaux recoivent un traitement analgésique. Les animaux sont aussi habitués à être manipulés. Des points-limites permettant de soustraire les animaux à une éventuelle souffrance ont été établis et feront l’objet d’une attention quotidienne (voire 2 à 3 fois par jour). Un suivi régulier de la littérature sera effectuée tout au long de ce projet pour identifier l’émergence de nouvelles procédures permettant de raffiner celles mises en œuvre dans le projet.

Choix des espèces

Une grande part, pour ne pas dire la majorité des études visant à modéliser chez l'animal la physiopathologie de la schizophrénie ont été réalisées chez le rat, notamment en raison de la grande homologie qui existe entre les réponses comportementales et pharmacologiques observées chez le rat et chez l'homme. L'ensemble des données acquises chez le rat constitue donc un cadre de référence justifiant le choix de cette espèce pour conduire notre projet. Les animaux (rats) nouveau-nés subiront une première intervention chirurgicale au 8ème jour postnatal qui représente un moment crucial du développement cérébral chez le rat, comparable à la fin du second trimestre de gestation chez l’homme, période qui est considérée comme une période de grande vulnérabilité au développement de la schizophrénie. Dans la mesure où la modélisation animale proposée concerne une pathologie (la schizophrénie) ayant une origine neurodéveloppementale, s’exprimant chez le jeune adulte, les animaux mâles ayant subi l'intervention néonatale seront ensuite utilisés à l'âge adulte (11 semaines) pour tester leur réactivité au THC.

1 344 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le stade juvénile ou adolescent, ils subissent une chirurgie d'injection d'un lentivirus dans l'amygdale, puis des tests comportementaux d'anxiété et de comportement social et un apprentissage de la peur par "légers chocs électriques", certains recevant des électrodes implantées, avant d'être tués. Le porteur veut comprendre comment une hyperactivité de l'amygdale à l'adolescence modifie durablement les comportements émotionnels, avec en vue le stress post-traumatique chez l'humain. Il affirme que ces réseaux neuronaux ne peuvent être étudiés ni in silico, ni sur cellule isolée, ni chez les invertébrés.

Objectifs

L’amygdale, une structure cérébrale située en profondeur du lobe temporal, est composée de plusieurs noyaux, chacun jouant un rôle différent dans la fonction amygdalienne et possédant ses propres projections vers des structures cérébrales différentes. Le noyau basolatéral (BLA) est la principale zone d’entrée des informations provenant du système sensoriel et des structures plus intégrées telles que le cortex préfrontal. Les neurones du BLA projettent aussi bien en dehors de l’amygdale que vers la circuiterie intra-amygdalienne. Au cours du développement postnatal, les connexions neuronales entre les structures des circuits de la peur (comme l’amygdale et le cortex préfrontal médian) sont modelées selon leur état de maturation et l’expérience de l’animal. Chez l’humain, l’hyperactivité amygdalienne est souvent corrélée avec des dysfonctionnements sociaux et émotionnels. De plus, l’adolescence correspond à une période du développement particulièrement sensible au stress dont l’impact pourrait être observable chez l’adulte. Vu son rôle primordial dans les comportements émotionnels et le fait que l’amygdale arrive tôt à sa maturité fonctionnelle, il est suggéré qu’un dysfonctionnement de l’amygdale à l’adolescence pourrait être à l’origine d’un développement altéré de sa connectivité avec, entre autres, le cortex préfrontal médian, ce qui pourrait avoir des conséquences sur des comportements émotionnels à long terme (chez l’adulte). Nous chercherons à perturber l’activité de l’amygdale chez le rat aux stades de l’adolescence et la préadolescence (juvénile) grâce aux injections d’un lentivirus qui a pour but d’augmenter l’activité d’une voie de signalisation ubiquitaire, exclusivement dans les neurones principaux de cette structure. Nous étudierons l’impact de cette sur-activation sur les propriétés membranaires des neurones principaux du BLA et des neurones du cortex préfrontal médian, sur la plasticité synaptique de la voie mPFC-BLA, ainsi que sur les comportements de type anxieux et émotionnels chez les jeunes animaux et chez les adultes, ainsi que sur l‘activité du réseau pendant les comportements de peur. Le but de notre recherche à long terme est donc de comprendre les mécanismes impliqués dans des dérèglements émotionnels déclenchés pendant l’adolescence et ayant des conséquences importantes chez l’adulte.

Bénéfices attendus

Nous avons précédemment montré que la modification de l’amygdale (par l’injection d’un virus) lors de l’adolescence réduit l’extinction et augmente la généralisation de la peur chez l’adulte dans un protocole de conditionnement aversif. La quantification d’un marqueur de l’activité neuronale dans les structures du circuit lié à la peur montre que les modifications comportementales sont associées à une augmentation de l’activité neuronale des neurones du cortex préfrontal. Ce projet vise à comprendre comment le virus modifie l’activité électrique des neurones principaux de l’amygdale et comment cette modification peut impacter la connectivité du circuit neuronal sous-tendant le comportement de la peur. Concernant des bénéfices du projet à court terme, il semble fondamental et essentiel de connaitre les effets sur les propriétés électriques et la plasticité des neurones de l’amygdale. Une hyperactivité ou une hyper-réactivité de ces neurones pourrait conduire à des changements durables dans la connectivité des réseaux neuronaux connectés à l’amygdale et contribuer aux modifications comportementales observées chez l’adulte. A long terme, des connaissances apportées par ce projet nous aideront à mieux comprendre comment la modulation de l’amygdale pendant la période critique de l’adolescence pourrait conduire aux effets durables sur la cognition émotionnelle et sociale, qui persistent jusqu’au stade adulte. Nos résultats nous permettront de mieux comprendre les mécanismes sous-tendant la prédisposition à certains syndromes psychiatriques chez l’Homme tel que le stress post-traumatique (PTSD).

Procédures

Tous les animaux subiront une chirurgie pour injection virale chez le jeune (préadolescent ou adolescent) dans l’amygdale, procédure invasive qui nécessite une anesthésie générale (~1h) et un suivi post-opératoire après réveil. Quatre séries expérimentales sont ensuite planifiées : (1) 2-3 semaines plus tard, les animaux sont profondément anesthésiés pour l’extraction et analyse du cerveau frais. (2) A l’âge adulte, les animaux seront à nouveau anesthésiés pour la totalité de l’expérimentation sous anesthésie (~4h) puis mis à mort sans réveil. (3) Les animaux adolescents seront soumis à des tests comportementaux (anxiété, stress, comportement social ; 1 semaine), puis à un apprentissage de peur à l’âge adulte (1 semaine). (4) Une fois adultes, les animaux sont anesthésiés pour l'implantation d'électrodes suivi de réveil pour enregistrement de l’activité neuronale chez l'animal éveillé pendant qu’il est soumis à un apprentissage de peur (4-5 semaines). Ils sont tous euthanasiés sous anesthésie, suivi d’une exsanguination pour certains afin de réaliser une perfusion intracardiaque permettant de fixer le cerveau.

Impact sur les animaux

Tous les animaux subissant une chirurgie pourraient potentiellement montrer des signes de douleur ou d’infection : perte rapide de poids > 15%; forte réactivité à la manipulation ou posture anormale (dos rond, yeux mi-clos, tête basse). Dans ce cas, l’animal sera traité (selon conseils du responsable de l’animalerie ou du vétérinaire) et placé sous surveillance maximale durant 48h. S’il n’y a pas de signes d’amélioration, l’animal sera euthanasié avec accord du responsable de l’animalerie. Selon nos études antérieures, le virus injecté dans l’amygdale n’entraine pas d’effets comportementaux majeurs, à part lorsque les animaux sont soumis à des tests particuliers pour produire un état légèrement anxieux (espace éclairé) ou émotionnel (légers chocs électriques). Ces états ne perdurent pas en dehors des tests. En dehors de ces cas, aucun effet indésirable n’est prévisible.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort , soit pour l'expérimentation, soit pour analyse histologique.

Remplacement

Ce projet de recherche fondamentale s’inscrit dans le champ des Neurosciences Cellulaires et Comportementales. L’évaluation des réseaux neuronaux et comportementale d’une modification cérébrale au cours du développement post-natal jusqu'à l'adulte nécessite l’utilisation d'animaux vivants possédant les structures et les connectivités cérébrales requises. Cela ne peut donc pas être réalisé in silico ou en cellule isolée ou chez les invertébrés.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera le strict minimum permettant un analyse statistique valide des expériences. Les analyses statistiques seront celles classiquement utilisées dans la littérature (voir Joly et al, 2022), incluant, après vérification de l'homogénéité des variances et la normalité des données, des analyses de variance à un ou plusieurs facteurs en fonction des expériences, suivies d'analyses post-hoc appliquant une correction pour la répétition des comparaisons (ex. Bonferroni ou False-Discovery-Rate). Il est à préciser que les femelles et les mâles issus de la colonie de reproduction seront utilisés dans cette étude.

Raffinement

Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes, et utiliserons de l’anesthésie combinée quand approprié à une analgésie pendant les chirurgies et la mise à mort des animaux. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec le SBEA et les conseils vétérinaires. Après chirurgie, une surveillance accrue permettra de détecter tous signes de douleur ou stress induit et de traiter les animaux si besoin avec des antalgiques et antibiotiques selon les conseils du vétérinaire référent. Les animaux seront hébergés par groupes (2 à 4) avec de l’enrichissement autant que possible. Les animaux en situation comportementale seront habitués à l’expérimentateur par manipulation au cours des jours précédents.

Choix des espèces

Le rat est le modèle du choix du laboratoire. En raison de la cohérence avec nos études précédentes, nous poursuivons ce projet sur Rattus norvegicus. La littérature scientifique pertinente à ce projet, en particulier les analyses des comportements sociaux et anxieux, est riche en études réalisées sur le rat. Nous bénéficierons et nous contribuerons donc d’une base de donnés importante. Il est connu que la période de l’adolescence est associée à une susceptibilité au stress et un développement important des structures impliquées, notamment l’amygdale, dans les réponses à la peur. Toutefois de nombreuses structures impliquées dans les comportements émotionnels sont encore immatures à l’adolescence. Nous voulons modifier l’activité de l’amygdale à deux stades du développement, le stade de préadolescence (juvénile) et le stade d’adolescence, qui correspondent à des périodes critiques dans le processus de connectivité de l’amygdale avec d’autres structures du réseau. Les expériences commenceront donc dès l’âge préadolescence jusqu’à l'adulte.

1 632 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'injection d'un vecteur viral portant une forme humaine mutée de l'APP, la pose d'une fenêtre crânienne et une imagerie sous microscope tête fixée à l'état éveillé, avec des tests comportementaux nommés, reconnaissance d'objet et boîte clair-obscur. Le porteur décrit une douleur de trois à cinq jours après la chirurgie et un inconfort lié à la contention de la tête, et met au point ce modèle pour étudier le récepteur nicotinique dans la maladie d'Alzheimer. Il affirme que la souris est "irremplaçable pour l'instant" pour étudier ces circuits neuronaux.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neuro-dégénérative qui affecte principalement les personnes âgées et représente un problème majeur de santé publique, surtout dans les populations vieillissantes. Afin de pouvoir étudier les mécanismes neurobiologiques sous-jacents à cette pathologie, différents modèles ont été développés chez la souris. Cependant, ces modèles présentent de nombreuses limitations, notamment pour l’étude des différentes étapes du développement de la maladie. Le but de ce projet est de mettre au point une nouvelle approche innovante pour étudier le stade précoce de la maladie dans le cerveau des souris, ainsi que pour explorer l’implication de structures cérébrales spécifiques dans son étiologie et enfin étudier le rôle du récepteur nicotinique dans la MA L’une des caractéristiques majeures de la MA consiste en l’accumulation du peptide beta-amyloïde (Aβ) qui est obtenu par clivage séquentiel de la protéine APP (Amyloid Precursor Protein). Pour cette étude, nous avons construit un vecteur viral adéno-associé (AAV) qui exprime la séquence humaine de l’APP contenant des mutations pathogènes identifiées chez les patients ( « Swedish », « London » et « Austrian »). Il s’agit de mutations ponctuelles qui changent un seul acide aminé de l’APP humaine et augmentent la quantité du peptide Aβ produite. Au sein du cerveau des mammifères, les récepteurs nicotiniques sont constitués de 5 sous-unités protéiques α(2-7) et β(2-4) qui s’assemblent selon différentes combinaisons et donnent lieu à des récepteurs fonctionnels aux propriétés pharmacologiques et cinétiques diverses. Au cours de la MA, le nombre des récepteurs nicotiniques se trouve diminué et leur activité altérée. De plus, des données bibliographiques suggèrent une interaction entre certains récepteurs nicotiniques, notamment les sous-types contenant α7 ou β2, et l’Aβ. Tout d'abord, nous allons caractériser l’activité neuronale dans le cortex de la souris en présence et en absence de l'APP, chez les souris wild-type et chez des lignées de souris exprimant la protéine cre recombinase dans des populations spécifiques de neurones pyramidaux, et d'interneurones. Ensuite, pour identifier l’implication des différents sous-types de récepteur dans le développement de la MA, nous allons appliquer la même technologie des vecteurs AAV à des lignées de souris transgéniques .

Bénéfices attendus

L’utilisation de ces nouveaux modèles animaux devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes biologiques qui sous-tendent la maladie d’Alzheimer. D’autre part, ils devraient faciliter l’étude de l’implication des récepteurs nicotiniques, plus particulièrement au cours de la phase précoce du développement de la maladie. Ceci pourrait permettre à plus long terme de développer et tester des médicaments pour lutter de façon précoce contre le développement de la pathologie..

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’injection du vecteur AAV contenant le gène de la protéine d’intérêt (durée estimée : 2 heures). Pour les animaux qui seront imagés sous le microscope à deux photons, l’indicateur calcique sera également injecté et une fenêtre crânienne pour l'imagerie chronique du cortex sera implantée au moment des injections (durée maximale de toute la chirurgie : 3 heures). Des tests comportementaux seront menés pour évaluer la mémoire (test de reconnaissance d’objet) et l’anxiété (boite claire obscure). En ce qui concerne le test de reconnaissance d’objet (RO), la préférence pour un nouvel objet nous permet d’estimer si la mémoire à court-terme est altérée et aussi de vérifier les capacités exploratoires et motrices des animaux ; la souris est placée dans une boîte pendant 30 minutes en présence d’objets. En ce qui concerne le test d’anxiété « clair-obscur » (CO), le dispositif expérimental se compose d'un petit compartiment noir et d'un grand compartiment blanc, connectés par un passage ; la souris est alors mise dans cet appareil pendant 30 minutes en libre exploration.

Impact sur les animaux

Nous estimons que les souris sont susceptibles de ressentir une douleur pendant les 3-5 jours après la chirurgie, pour laquelle nous administrerons des analgésiques. Habituellement, aucune perte de poids significative n'est enregistrée - les souris peuvent perdre jusqu’à 5% de leur poids initial dans les 24 heures suivant la chirurgie, mais ce poids est repris le lendemain. Pendant les premières 24 heures, des périodes de mobilité réduite peuvent aussi être repérées. Dans ces 3-5 jours qui suivent, nous remarquons que quelques animaux peuvent gratter un peu la zone immédiatement autour du ciment dentaire, mais ce comportement disparaît durant la première semaine de récupération. À part cela, nous prévoyons que la barre métallique qui est utilisée pour fixer la tête de la souris à la structure de support du microscope est une source supplémentaire d'inconfort. Néanmoins, après quelques jours (jusqu’à 2 semaines) la souris s’habitue et l’implant ne la gêne plus visiblement. Cette période de récupération après les craniotomies est cruciale et quelques problèmes peuvent être détectés, mais après 2 semaines, les souris ne manifestent plus de signes de stress, douleur ou altération d’activité. L'entraînement des animaux pour l’imagerie in vivo éveillée et leur habituation au microscope biphotonique est aussi susceptible de provoquer des nuisances. Après les premières séances d’entraînement, quelques souris sont plus stressées et leurs comportements sociaux peuvent devenir plus agressifs (pendant l’heure suivante). La préhension de la pièce métallique de la tête et la fixation de l'animal sont les étapes les plus stressantes et les plus inconfortables pour la souris, ce qui exige toujours la mise en place d'un protocole d'habituation minutieux.

Devenir

Toutes les procédures sont basées sur une injection de vecteur AAV localement dans le cortex pré-frontal (PFC). Il est essentiel pour l'analyse des données en imagerie et comportement de pouvoir confirmer la bonne qualité de l'injection, sa localisation précise, le volume du cortex couvert, et la quantité d'amyloide bêta produit. Les souris seront donc mises à mort, perfusées, le PFC coupé et analysé par histochimie.

Remplacement

Dans le cadre de cette étude il n’est pas possible de remplacer la souris par aucun autre modèle. Pour atteindre notre objectif d’identifier l’interaction entre l’amyloïde-beta et les récepteurs nicotiniques et son impact dans l’activité des neurones, il n'est pas possible d'utiliser des modèles mathématiques et bio-informatiques. Ces approches in silico peuvent seulement être utilisées à posteriori pour complémenter et modéliser les résultats in vivo. Il n’est pas non plus possible d'utiliser des lignées cellulaires ou des cultures de tissus, car celles-ci ne présentent pas la connectivité fonctionnelle requise pour ce projet. Concernant les organoïdes cérébraux, bien qu’ils commencent à être explorés pour analyser l’activité neuronale, les populations de neurones et l’organisation ne ressemblent pas à ceux du cerveau des mammifères en conditions physiologiques. Principalement pour étudier des circuits neuronaux axées sur le vieillissement et la neurodégénérescence, les modèles mammifères (comme la souris ou le rat) apportent des avantages significatifs et sont ainsi irremplaçables pour l'instant. De plus, notre étude implique des tests comportementaux s’intéressant à la mémoire, autre aspect critique de cette pathologie, qui ne peut pas être investigué par des études in vitro.

Réduction

L'estimation du nombre d'animaux à utiliser a été basée sur les résultats précédents obtenus avec ce modèle. Nous avons eu recours à des analyses statistiques pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaire pour garantir des résultats significatifs. Le projet inclut 3 procédures d'imagerie chez la souris éveillée. L'estimation des individus à utiliser a été réalisée sur la base du précédent projet et d'autres articles publiés, et adaptée selon les effets attendus dans chaque procédure. En outre, nos articles d'imagerie in vivo dans le cortex et des études comportementales précédentes ont confirmé notre calcul. Afin de garantir l'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, toutes les analyses post-mortem sur la caractérisation des lignées ou l’expression et distribution des protéines spécifiques, seront réalisées sur des animaux injectés et imagés précédemment. Sans compromettre l’obtention de résultats exploitables et fiables, seulement les expériences considérées comme indispensables seront réalisées et toutes répétitions inutiles seront éliminées. Pour utiliser moins d’animaux en expérimentation, nous allons aussi rédiger nos protocoles à l’avance et les optimiser. Chaque manipulation expérimentale sera planifiée dans le but de prévenir des problèmes éventuels, de décider des stratégies et de définir des critères d’interruption (« humane endpoints »).

Raffinement

Pour garantir que les animaux ne soient pas blessés et souffrent le moins possible, différentes mesures seront appliquées. Uniquement des souris adultes (8 semaines) seront soumises à des procédures chirurgicales et autant que possible les frères et sœurs resteront ensemble dans les cages, en groupe de 2 à 6. Les animaux seront injectés avec Buprenorphine 0.1mg/kg 30 min avant et l’analgésique local Lidocaïne (6mg/kg) 10 min avant la craniotomie. Durant les 30 min qui précèdent la chirurgie, les souris resteront sur un tapis chauffant. Pour une anesthésie profonde, on utilisera l’isoflurane. L’induction sera faite dans une chambre ventilée par un mélange d’isoflurane 4% et O2 2L/min. Pendant la procédure, les souris resteront anesthésiées sous un mélange d’isoflurane 1.5-2% et O2 0.6L/min. Leur température corporelle sera surveillée et maintenue à l’aide d’un tapis chauffant équipé d’une sonde rectale et la respiration et l’absence de réflexe de retrait de la patte seront également surveillées. Une solution saline isotonique (0.9%NaCl) sera chauffée et injectée à la fin – le volume dépend du poids de l’animal et de la chirurgie (lors de saignement nous injecterons plus). L’anti-inflammatoire Meloxicam 1mg/kg sera injecté 30 min avant la chirurgie pour prévenir la « soupe inflammatoire », et le jour suivant. Pour les 3 jours, la forme orale de Meloxicam 0.1mg/mL sera diluée dans une boite de complément alimentaire purifié Dietgel (7.5mL/souris/jour) et donnée aux souris. Pendant les 24 heures la souris restera dans sa cage sur un tapis chauffant pour empêcher une diminution brusque de sa température corporelle, garantir une meilleure récupération. Pendant les 5 jours, le poids, mouvement et comportement social des animaux seront surveillés de près, ainsi que la cicatrisation de la suture ou de la fenêtre crânienne. (Si la procédure chirurgicale a été correctement réalisée dans des conditions d'asepsie, aucune infection ne devrait se produire). Si aucun changement n'est remarqué ou si il y a une évidence de douleur ou un comportement anormal, des niveaux de surveillance seront mis en place. Si une souris souffre visiblement et reste en position prostrée, si elle a complètement cessé de manger ou s’il y a une perte considérable de poids (20% de son poids initial) la souris sera mise à mort. Chaque cage sera enrichie avec des petits cylindres de coton/morceaux de papier et un igloo en carton.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle rongeur disponible actuellement, car elle nous permet d’étudier plus profondément les circuits neuronaux. Elle est petite et relativement facile à gérer dans le contexte d’un laboratoire, par rapport à d'autres modèles mammifères plus complexes. Un autre atout de l'utilisation des souris est la vaste liste de boîtes à outils disponibles, ce qui permet d'optimiser les pipelines expérimentaux plus rapidement, réduire l’utilisation de ressources et identifier plus facilement des problèmes possibles (comme la douleur post-chirurgie). En effet, elle est classiquement utilisée pour des études de modification de l’expression des gènes (modèles transgéniques ou expression induite par un vecteur viral). De plus, la plupart des tests comportementaux utiles dans le cadre d’un projet étudiant la MA (comportements liés à une perte de mémoire ou à une dégénérescence des synapses due à l’accumulation de plaques amyloïdes dans le cerveau) ont été développés chez la souris. Les injections intracérébrales seront faites sur des animaux adultes, d’au moins 8 semaines, afin que le développement de leur cerveau soit suffisamment mâture pour la réussite et la reproductibilité des injections. Les analyses fonctionnelles débuteront un mois après les injections, pour garantir que l’expression des vecteurs est assez élevée, et s’étendent jusqu’à 12 mois. Pour l’étude à long terme, les animaux seront également injectés à l'âge de 8 semaines, mais la fenêtre crânienne ne sera implantée qu'un an après l'injection de la protéine APP. Cela évitera que l'indicateur de calcium ne forme des agrégats et que la fluorescence ne s'estompe. Les études de comportement seront menées après vieillissement, à partir de 5 mois d’âge des souris, c’est à dire 2 mois après injection. Les mises à mort pour prélèvement des cerveaux seront effectuées après vieillissement, dans le cas du modèle AAV, qui nécessite un certain temps d’expression, jusqu'à 16 mois, procédure 2.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Âgées jusqu'à 20 mois, elles subissent des tests comportementaux dont le résumé ne précise pas la nature, puis une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélever cerveau et cellules. Le porteur étudie le rôle des oméga-3 et d'un récepteur sur l'humeur et la plasticité synaptique, et renvoie les applications thérapeutiques et nutritionnelles chez l'humain au long terme. Il affirme que le recours à des animaux vivants reste une "nécessité expérimentale majeure" et qu'aucune approche sur cellules, modèle informatique ou chez l'humain ne permet ces mesures.

Objectifs

D’après l’OMS, les troubles de l’humeur (dépression, troubles bipolaires) sont la première cause d’incapacité dans le monde et concernent 350 millions de personnes chaque année. Outre l’impact sur la qualité de vie des patients et de leurs familles, les troubles de l’humeur représentent des coûts de santé considérables. De plus, ~30% des patients demeurent résistants aux traitements pharmacologiques et autres approches thérapeutiques existants à ce jour. Ainsi, une alternative consisterait à développer des stratégies préventives, et notamment nutritionnelles, pour limiter ou retarder l’apparition des troubles de l’humeur. Au laboratoire, le rôle des oméga-3 sur le fonctionnement cérébral et la santé mentale est étudié depuis presque 10 ans. Le laboratoire a notamment démontré qu’une carence en oméga-3 exacerbe les comportements de type anxieux et dépressif chez l’animal, tandis qu’une supplémentation en oméga-3 les diminue. Ces études précliniques sont en accord avec les données chez l’homme, des essais cliniques montrant qu’une supplémentation en oméga-3 améliorerait certains symptômes dépressifs. Ainsi, une supplémentation en oméga-3 peut constituer une alternative intéressante dans la prévention des troubles de l’humeur, mais les mécanismes qui sous-tendent les effets positifs des oméga-3 dans les troubles de l’humeur restent encore très mal connus. Le laboratoire a récemment ouvert une nouvelle hypothèse, en démontrant que les apports en oméga-3 avaient un impact direct sur la plasticité synaptique ainsi que l'arborisation dendritique. La plasticité synaptique regroupe les phénomènes qui confèrent au cerveau sa capacité de s’adapter à l’environnement, par des modifications de la connectivité entre les neurones, au niveau des synapses. Les différentes formes de plasticités synaptiques sont indispensables aux mécanismes d’apprentissage et d’évolution. De plus en plus d’études suggèrent que les troubles de l’humeur sont associés à des dysfonctionnements dans les processus de plasticité synaptique et ces dysfonctionnements pourraient être à l’origine des symptômes neuropsychiatriques des troubles de l’humeur. Les oméga-3 sont des modulateurs importants des fonctions synaptiques, car, faisant partie des éléments structurels des membranes plasmiques, ils modulent la dynamique membranaire ainsi que la fonctionnalité et le trafic des protéines transmembranaires présentes à la synapse.

Bénéfices attendus

L’objectif de notre projet est désormais d’aller plus loin dans la compréhension des mécanismes neurobiologiques par lesquels les oméga-3 contenus dans l’alimentation permettent de protéger les animaux. L’objectif à long terme de ce projet est de transférer les connaissances acquises chez le rongeur à l’homme pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et nutritionnelles. Ces données pré-cliniques nous permettrons de comprendre un peu plus en quoi la nutrition influence les fonctions cognitives et la physiologie de la transmission synaptique. De plus, des applications thérapeutiques peuvent être envisagées, en particulier pour déterminer si une thérapie nutritionnelle peut atténuer les pathologies liées au stress chronique, comme par exemple les troubles de stress post-traumatiques. De façon similaire, des stratégies préventives, liées à une nutrition adaptée et équilibrée en lipides, pourraient être envisagées afin de limiter, réduire ou même d'endiguer l'apparition de troubles dépressifs et/ou anxieux.

Procédures

Les animaux subiront des tests comportementaux qui ne durent que 5 à 10 minutes, peuvent entrainer des nuisances modérées , mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Les piqures d'analgésique et anesthésique avant la perfusion intracardiaque durent quelques secondes et la contention peut stresser les animaux.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entrainer des nuisances modérées, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Les piqures d'analgésique et anesthésique avant la perfusion intracardiaque durent quelques secondes et la contention peut stresser les animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les mécanismes neurobiologiques et rôle des acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la prévention des altérations cognitives et émotionnelles suite à un stress chronique. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié. Les expériences ne peuvent pas être effectuées sur des cultures cellulaires ou dans des modèles computationnels ou encore chez l’homme, car aucune de ces approches ne permet de réaliser toutes ces expériences chez un même sujet. Le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude des troubles de l’humeur reste une nécessité expérimentale majeure.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien. Statistiquement, des études menées précédemment dans notre laboratoire montrent que pour avoir une puissance statistique suffisante, 15 souris C57Bl6/j sont nécessaire par groupe.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille et peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui peut s’avérer nécessaire pour la poursuite à long terme de notre projet. Les expériences de comportement se feront sur des animaux adultes (6mois) et âgés (20 mois).

266 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet enchaîne laparotomie de femelles gestantes, électroporation d'embryons in utero et injections intracérébrales de vecteurs viraux, l'objet étant de mettre au point une méthode d'imagerie du cerveau par bioluminescence. Le porteur précise que tous les animaux recevant une substance neuroexcitatrice développeront une crise d'épilepsie et que les nouveau-nés rejetés par leur mère seront tués. Il affirme qu'il n'existe "aucune alternative non-animale" à l'étude des activités neuronales et que le travail doit se faire sur "l'animal entier".

Objectifs

Les fonctions cérébrales reposent sur l’activité de populations largement interconnectées de neurones très divers, dont la complexité nécessite l’étude in vivo qui préserve l’interconnexion entre neurones et entre structures cérébrales. Ces études in vivo requièrent le plus souvent de ménager un accès à travers le crâne pour insérer des électrodes ou effectuer des mesures optiques dans l’encéphale. Le but de ce projet est d’utiliser la bioluminescence pour développer une imagerie trans-crânienne à invasivité minimale des activités neuronales chez la souris in vivo. En effet, la bioluminescence permet d’obtenir, à l’échelle de populations de neurones ciblés, des informations sur les activités moléculaires et cellulaires grâce à l’utilisation de biosenseurs codés génétiquement. Elle repose sur l’utilisation d’une luciférase (protéine à activité enzymatique) exprimée par transfert de gène, et d’un substrat (luciférine) injecté par voie intrapéritonéale ou intraveineuse, dont la dégradation par la luciférase produit des photons. La bioluminescence présente un fort contraste et fournit des données très quantitatives ; elle est non-toxique et permet des enregistrements de longue durée (heures/jours). Il existe maintenant des biosenseurs dont la luminescence rouge traverse le crâne. Par comparaison avec d’autres biosenseurs luminescents, les biosenseurs choisis pour ce projet fonctionnent à des doses largement subtoxiques de luciférine, et n’émettent quasiment pas de lumière en l’absence d’activité neuronale.

Bénéfices attendus

A terme, ce type d’imagerie permettrait un suivi non-invasif de l’activité cérébrale sur des mois dans des modèles murins de pathologies neurologiques ou psychiatriques humaines. Il serait ainsi possible d’analyser l’évolution pathophysiologique des activités cérébrales et l’implication des différents types de neurones dans cette évolution, afin de mieux comprendre et soigner ces pathologies chez l’humain.

Procédures

1) Laparotomie des femelles gestantes sous analgésie et anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 30-45 min. 2) Electroporation in utero (sous analgésie et anesthésie générale gazeuse) de biosenseurs luminescents non pathogènes dans les cellules pyramidales du cortex cérébral d’embryons de souris, afin de comparer leurs performances pour l’enregistrement optique des activités cérébrales. Cette procédure chirurgicale dure 30-45 min. 3) Injections intracérébrales par stéréotaxie de vecteur viraux luminescents sous analgésie et anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 30-45 min. 4) Injections intracérébrales par stéréotaxie de substance neuroexcitatrice (4-aminopyridine) sous anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 40 min maximum. 5) Enregistrement in vivo par bioluminescence des activités cérébrales sur animal vigile et sur animal anesthésié. Durée d’enregistrement 30 min. 6) perfusion intracardiaque afin de réaliser des études histologiques et de quantifier l'expression des biosenseurs.

Impact sur les animaux

Les procédures de chirurgie peuvent être à l’origine d’une perte de poids transitoire (inférieur à 20% de leur poids initial) et provoquer une douleur pendant 24/48h. Néanmoins elles sont indispensables à notre projet car seules ces chirurgies permettent de cibler spécifiquement des régions corticales. Tous les animaux recevant une injection de substance neuroexcitatrice développeront une crise unique d’épilepsie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de vérifier par immunomarquage l’expression des biosenseurs.

Remplacement

Le cerveau est un organe très complexe qui comprend des milliards de neurones de centaines de types différents, dont chacun établit des milliers de connexions avec d’autres neurones, et qui sont rassemblés en structures largement connectées entre elles et/ou avec d’autres organes. En raison de cette complexité, il n’existe à l’heure actuelle aucune alternative non-animale à l’étude des activités neuronales qui sous-tendent les fonctions cérébrales. C’est pourquoi ce projet, qui propose de développer une méthode d’imagerie trans-crânienne des activités de populations neuronales, avec une invasivité minimale, doit être réalisé in vivo sur l’animal entier.

Réduction

Les expériences de bioluminescence et de transfert de gène réalisées précédemment dans l’unité nous ont permis d'optimiser le nombre d’animaux nécessaire. Nous utiliserons 266 animaux pour ce projet. Ce nombre est très largement inférieur au nombre d’animaux qui serait nécessaire en cas d’utilisation de lignées transgéniques. L’électroporation in utero sera réalisée sur femelle gestante de la lignée C57BL/6, qui porte peu d’embryons (en moyenne 7), assure un meilleur accès pour l’électroporation de chaque embryon, et donc une proportion de nouveau-nés électroporés élevée (en moyenne 3 animaux électroporés par portée) et un rendement d’électroporation par individu assez homogène. Ceci réduit le nombre de nouveau-nés non-électroporés et la variabilité des résultats, et donc le nombre total d’animaux utilisé. Les animaux non-électroporés seront utilisés pour la procédure avec transfert viral. Compte tenu de la variabilité observée dans les rendements d’électroporation in utero et de transfert viral, nous avons estimé à 10 le nombre d’animaux nécessaires pour la plupart des conditions testées afin de révéler des différences significatives. Le nombre d’animaux a été porté à 20 pour deux des conditions testées afin de permettre une analyse plus détaillée des différences quantitatives et qualitatives attendues. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés à l’analyse des petits échantillons. Les expériences d’imagerie permettant une acquisition des résultats en temps réel, le nombre d’animaux sera réduit au maximum grâce à une analyse quotidienne des données. Enfin, les expériences prévues étant échelonnées sur les 8 premières semaines de la vie post-natale, les résultats obtenus à un âge donné permettront d’optimiser les expériences conduites à un autre âge et de limiter le nombre d’âges testés, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés 5 à 7 jours dans une zone d’hébergement A2 avant la procédure. Ils sont hébergés par fratrie ou en groupe de 2 à 4, en portoir ventilé dans un environnement à température (20-24°C) et hygrométrie de 55% contrôlées, avec cycle diurne/nocturne de 12h, et eau et nourriture fournies ad libitum. Les animaux sont dans un environnement enrichi par la présence de matériau végétal pour édifier un nid. L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Ils sont visités chaque jour et manipulés par l’expérimentateur pour réduire le stress le jour de la procédure. Les animaux ne sont séparés que le temps de la procédure et de la récupération post-opératoire. Pendant la chirurgie, l’animal est sous anesthésie générale induite par l’isoflurane et placé sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’animal reçoit une injection d’un analgésique et d’un anesthésique local pour prévenir la douleur pendant et après la chirurgie. Pendant l’opération, les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Après chirurgie, l’animal reçoit en SC une injection de solution saline afin de prévenir la déshydratation. Les animaux sont placés dans une cage de réveil posée sur un tapis chauffant à 37°C jusqu’à leur réveil. Lorsque l’animal a récupéré, il réintègre sa cage d’origine, son comportement est surveillé et la suture est sous observation quotidienne pour évaluer sa bonne cicatrisation. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec le Structure locale de bien-être animal et les conseils vétérinaires. Après chirurgie, une surveillance accrue permettra de détecter tous signes de douleur ou stress et de traiter les animaux si besoin avec des antalgiques selon les conseils du vétérinaire référent. Les nouveau-nés seront observés en continu durant l'heure qui suit le retour à la mère pour vérifier la prise en charge maternelle. En cas de rejet, le nouveau-né sera euthanasié. Les points limites sont définis et les méthodes seront mises en place pour supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux comme l’injection d’antalgiques ou l’euthanasie par injection d’une surdose d’anesthésique.

Choix des espèces

La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système nerveux central avec celui des humains, de l’existence de lignées génétiquement modifiées permettant de cibler l’expression des biosenseurs dans des populations neuronales spécifiques, et de l’existence de nombreux modèles de pathologies neurologiques ou psychiatriques humaines auxquels la méthode d’imagerie non-invasive des activités cérébrales que nous développons pourra être appliquée. Les animaux seront utilisés pour des enregistrements optiques réalisés en semaines postnatales 1 à 8 afin de tester l’effet de l’épaississement de l’os crânien avec l’âge sur l’imagerie de l’activité cérébrale par bioluminescence trans-crânienne. En effet, la croissance du crâne de la souris ralentit fortement après la 7e semaine. Les électroporations s'effectueront sur des embryons au stade embryonnaire E13.5 afin de générer des animaux exprimant les biosenseurs luminescents de la naissance à la semaine 3. Les injections stéréotaxiques de virus recombinant seront réalisées durant les semaines 3 à 7 postnatales afin de générer des animaux exprimant les biosenseurs luminescents durant les semaines 4 à 8 postnatales.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour modéliser l'ataxie de Friedreich, elles reçoivent une anesthésie par injection puis une électromyographie mesurant l'activité du nerf sciatique, l'objet étant d'améliorer la détection d'une onde difficile à enregistrer. Le porteur indique que ces souris développent des déficits moteurs dès cinq semaines et une mortalité par crises d'épilepsie vers vingt semaines, et prévoit de les tuer à quinze semaines. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet ces mesures et qu'il est "indispensable" de les réaliser sur l'animal.

Objectifs

L’ataxie de Friedreich est une maladie neurodégénérative progressive incurable à ce jour. Cette maladie se manifeste par des troubles de l’équilibre et de la coordination des mouvements volontaires (ataxie) liés à une dégénérescence des neurones sensitifs. L’ataxie de Friedreich rare touche environ 1 personne sur 50 000, soit environ 1 300 patients en France. Apparaissant généralement vers l’âge de 9–14 ans, son évolution et ses symptômes varient d’un patient à l’autre. Toutefois, une incapacité à marcher survient généralement 10 à 20 ans après les premiers symptômes. L’électromyographie (EMG) permet d’analyser l’activité électrique des nerfs et des muscles chez l'Homme. En complément de l’examen clinique, il aide au diagnostic de différentes pathologies nerveuses et musculaires. L'EMG est utilisée chez la Souris pour étudier les maladies neuromusculaires. Après stimulation électrique du nerf sciatique, la réponse électrique au niveau du muscle du pied est enregistrée. Deux ondes sont présentes dans cette réponse électrique, une onde motrice (onde M), correspondant à la réponse du muscle à la stimulation des fibres motrices du nerf sciatique, et une onde sensitive (onde H) correspondant à la réponse du muscle à la stimulation des fibres sensorielles du nerf sciatique. Cette onde H est difficile à détecter à l’heure actuelle. L'objectif de ce projet est d'améliorer la détection de cette onde grâce à un électromyographe plus performant et des modifications du protocole d’enregistrement. Pour valider cette nouvelle méthode d’enregistrement, nous souhaitons mesurer l'onde H chez des souris génétiquement modifiées qui présentent une diminution de l’amplitude de l’onde H à partir de l’âge de 5 semaines et qui sont utilisées pour la recherche de nouvelles thérapies contre l'ataxie de Friedreich.

Bénéfices attendus

L'optimisation de la mesure de l'onde H permettra d'améliorer la détection de la dégénérescence des neurones sensitifs et ainsi de mieux caractériser l'effet de potentiels traitements sur cette dégénérescence présente dans l'ataxie de Friedreich. En améliorant la qualité des études précliniques, nous augmenterons les possibilités de trouver une thérapie efficace chez l'Homme pour traiter l'ataxie de Friedreich.

Procédures

Les animaux seront soumis aus interventions suivantes: - Injection intra-péritonéale du mélange kétamine - xylazine (durée = 5 secondes). - Electromyographie permettant la mesure neurophysiologique de la fonction motrice et sensorielle (durée = 10 minutes). - Injection sous-cutanée d'antisedan (durée = 5 secondes).

Impact sur les animaux

Les souris génétiquement modifiées permettant d'étudier l'ataxie de Friedreich, présentent une mortalité liée à l'apparition de crises épileptiques à partir de l'âge de 20 semaines, âge qui ne sera pas atteint au cours de notre protocole, les animaux étant euthanasiés à l'âge de 15 semaines. Par ailleurs, des déficits de coordination motrice apparaissent à l' âge de 5 semaines. Ces déficits augmentent au cours du temps et à l'âge de 15 semaines, ces animaux présentent des troubles de la démarche marqués mais non délétères. De la nourriture en gelée sera placée sur le sol de la cage durant toute l'étude. Ce modèle a été décrit de manière précise par une équipe de recherche sur notre site, notamment dans son décours et sa sévérité. Lors de l'EMG, si un animal commence à se réveiller au cours du test, l'expérience sera immédiatement stoppée. Si un animal présente des difficultés respiratoires, l'expérience sera également stoppée.

Devenir

Les souris utilisées commencent à mourir à l'âge de 20 semaines. Tous les animaux seront mis à mort à l'âge de 15 semaines.

Remplacement

L'électromyographie est couramment utilisée chez l'homme pour étudier les neuropathies. Ces neuropathies sont généralement associées à des troubles moteurs visibles. Les modèles murins de ces neuropathies présentent également des troubles moteurs. Pour étudier l'efficacité thérapeutique d'une molécule d'intérêt, ces troubles moteurs sont évalués au cours du temps et les mesures électromyographiques viennent compléter les phénotypes observés. Nous ne disposons actuellement d'aucun modèle in vitro ou in silico permettant de déterminer l'impact d'une mutation génétique sur la coordination motrice. Il est donc indispensable de pouvoir réaliser des mesures électromyographiques sur l'animal.

Réduction

Pour cette étude, nous avons prévu d'utiliser 12 animaux par groupe expérimental. Ce nombre de 12 animaux par groupe a été établi par étude de puissance sur les mesures électromyographiques réalisées précédemment dans notre laboratoire. Il constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux utilisés. La latence et l'amplitude de l'onde H seront les paramètres analysés et nous comparerons les résultats obtenus chez les souris génétiquement modifiées avec ceux obtenus chez les souris non génétiquement modifiées. Nous utiliserons 24 souris au total pour cette étude.

Raffinement

Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placé dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole et à la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement d'un modèle d'intérêt pour étudier l'ataxie de Friedreich. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les souris utilisées pour modéliser l'ataxie de Friedreich montrent une diminution progressive de l'amplitude de l'onde H à partir de l'âge de 5 semaines. Un premier EMG sera réalisé à l'âge de 5 semaines, avant que l'amplitude de l'onde H ne commence à diminuer. Un deuxième EMG sera réalisé à l'âge de 15 semaines, lorsque l'amplitude de l'onde H est fortement diminuée chez ces souris. Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole , à l'âge de 15 semaines, avant l'apparition des crises d'épilepsie.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent l'implantation chirurgicale d'un micro-endoscope au-dessus du nerf optique sous anesthésie, une partie recevant en plus du tamoxifène ou une injection d'AAV dans la rétine, avant des séances d'imagerie répétées jusqu'à dix fois dans l'année, certaines sur animal éveillé. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer une inflammation et une douleur transitoire et que l'injection dans l'œil peut le léser. Il affirme que l'étude du couplage neurovasculaire exige de travailler sur "l'animal entier et normal" et que de nombreuses données in vitro se sont "révélées fausses".

Objectifs

Le but du projet de notre équipe est d’analyser les bases cellulaires de l'hyperémie fonctionnelle dans le nerf optique, c'est à dire le lien entre l’activation nerveuse et l’augmentation réflexe du flux sanguin, lien qui est à la source de l’imagerie fonctionnelle cérébrale de type fIRM chez l’homme. Plus précisément, nous souhaitons caractériser les différents types cellulaires participant à la régulation de ce phénomène. Pour cela, nous irons étudier dans le nerf optique de souris anesthésiées, sédatées ou éveillées, les liens entre les réponses cellulaires et vasculaires, suite à des stimulations visuelles.

Bénéfices attendus

Dans la plupart des neuropathies optiques l’atteinte fonctionnelle cellulaire précède la mort cellulaire. La réponse de l’électrorétinogramme est un bon marqueur non-invasif du signal de sortie généré par les cellules ganglionnaires et son altération reflète un dysfonctionnement de ces cellules. Notre projet permettra de caractériser le signal de sortie de cellules (en direction du cerveau) au niveau de la partie intracrânienne et myélinisée du nerf optique in situ. Nous étudierons la propagation électrique du signal nerveux, le couplage neurovasculaire et la réponse métabolique du nerf au cours d’une stimulation visuelle physiologique. Cette approche, jamais tentée précédemment, sera établie dans un premier temps chez l’animal normal, aboutissant à l’établissement d’un nouvel outil préclinique. Dans un deuxième temps, cet outil permettra de comparer le fonctionnement du nerf optique intracrânien normal et pathologique, et surtout, de tester diverses approches de neuroprotection.

Procédures

Une partie des animaux (120 animaux) recevra une dose de tamoxifène injectée par voie intra péritonéale sur 3 jours (1 injection/jour). Tous les animaux subiront une seule procédure chirurgicale d’une heure sous anesthésie profonde et en conditions stériles. La chirurgie d'environ 1h consistera en l’implantation d’un micro endoscope au-dessus du nerf optique. Pour cela les animaux recevront des doses d’analgésiques avant et après la chirurgie. Une partie des animaux (80 animaux) recevra une unique injection d’AAV dans la rétine d’un seul œil, sous anesthésie gazeuse. L’injection ne dure que 10 minutes. Les animaux sont observés en microscopie biphotonique éveillés, sédatés ou anesthésiés. Les animaux observés éveillés effectuent au préalable une habituation progressive de plusieurs jours au poste d’enregistrement. Les cessions d’enregistrements durent au maximum 2 heures. Les animaux reçoivent juste avant l’enregistrement une injection de colorants par voie intra veineuse rétro-orbitale, sous anesthésie générale. Durant les cessions, les animaux peuvent être soumis à des stimulations visuelles de 1 à 30 secondes : grille contrastée sur un écran placé devant l’œil de l’animal. Les animaux seront observés jusqu’à 10 fois selon les observations, durant l’année qui suit la procédure chirurgicale. Après les cessions d'imagerie, une partie de animaux (60 souris) est mise à mort lors d'une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde pour pouvoir prélever leurs cerveaux. A la fin du projet tous les animaux sont mis à mort.

Impact sur les animaux

- L'injection de tamoxifène intrapéritonéale pourra induire une perte de poids transitoire. - L'acte chirurgical pourra provoquer une inflammation locale ainsi qu'une douleur transitoire. - L'injection d'AAV dans le vitré de l'oeil peut entrainer une lésion de l'oeil si le geste n'est pas effectué correctement. - L'imagerie peut provoquer un stress durant le temps de l'expérience particulièrement chez l'animal éveillé. – Lors d'une perfusion intra-cardiaque, un animal peut souffrir si l'anesthésie n'est pas suffisante.

Devenir

Les animaux sont tous euthanasiés à la fin du projet, selon différentes méthodes en fonction des besoins expérimentaux, pour vérifier l'exactitude des données obtenue en imagerie.

Remplacement

Jusqu’à présent, le nerf optique a été étudié in vitro. Toutes études métaboliques et celles s’attaquant à la régulation du flux sanguin nécessitent de travailler chez l’animal entier et normal. En effet, une grande partie des données obtenues in vitro se sont révélées fausses ou non utilisables en recherche clinique.

Réduction

Nous utiliserons 360 animaux dans notre projet. Les procédures mises en place pour ce projet participent à réduire le nombre d'animaux en expérimentation, en utilisant une technique comme l'injection d'AAV qui nous permet de marquer d'autres types cellulaires de manière peu invasive et sans utiliser plus d'animaux, et en travaillant sur des animaux chroniques qui sont réutilisés pour plusieurs expériences d'imagerie (jusqu'à 10 expériences / animal). Par ailleurs, nous nous engageons à réduire l'utilisation d'animaux autant que possible en développant les analyses statistiques et les modèles mathématiques.

Raffinement

Durant notre projet, nous prêterons attention à raffiner la méthodologie utilisée : - en améliorant les conditions expérimentales par l'administration d'anesthésiques (kétamine/médétomidine, dexmédétomidine et lidocaïne) et analgésiques (buprénorphine) chaque fois que nécessaire (chirurgie, soins postopératoires, injection dans l'oeil et imagerie sous anesthésie/sédation) - en introduisant des points limites à chaque acte expérimental qui permettent d'éviter toute souffrance à l'animal et sa mise à mort lorsque celle-ci ne peut être prise en charge - en garantissant des conditions d'hébergement appropriées aux animaux (ajouts d'enrichissements dans les cages et contrôle stricte des paramètres environnementaux) - en effectuant une surveillance quotidienne du bien-être des animaux, par un personnel formé et une surveillance régulière par un membre de la SBEA.

Choix des espèces

Il n'existe pas de méthode alternative possible à l'utilisation d'animaux vivants dans l’étude du couplage neurovasculaire. La souris est la seule espèce de mammifère chez laquelle il est aisé de générer des animaux transgéniques. Les souris seront utilisées entre P45 et 2 ans. Il est nécessaire d’utiliser des animaux chez lesquels les processus régulant le couplage neurovasculaire sont matures.

524 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour modéliser l'autisme, elles apprennent une tâche comportementale de 200 essais par jour sous contention partielle de la tête, avec un accès à l'eau restreint à un hydrogel pour les motiver et une perte de poids plafonnée à 10 pour cent. Le porteur décrit ces contraintes comme brèves et réversibles et n'attend pas d'effet indésirable majeur. Il affirme qu'un modèle animal est "absolument nécessaire" pour reproduire la complexité des circuits neuronaux et écarte les approches sur cellules ou sur la mouche.

Objectifs

L’autisme est un trouble neurodéveloppemental caractérisé par des déficits sociaux, des comportements stéréotypés répétitifs et les réactions sensorielles atypiques. Il est estimé qu'à l'échelle mondiale, environ un enfant sur 54 est atteint d'autisme. Malgré la prévalence du trouble du spectre de l'autisme (TSA), les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent les anomalies du comportement ne sont pas bien compris. Une meilleure compréhension de la base neurobiologique des TSA est cruciale pour la gestion des symptômes des TSA et pour le développement d'approches thérapeutiques innovantes, ainsi que pour l'identification de biomarqueurs diagnostiques. L'objectif global de ce projet est de développer de nouveaux biomarqueurs physiologiques et comportementaux chez les modèles génétiques murins de TSA. Ces mesures seront ensuite utilisées pour le développement et l'élucidation de nouvelles approches thérapeutiques. Dans cette étude, nous avons choisi de nous concentrer sur une région du cerveau qui est très bien conservée entre la souris et l'homme. Pour mener à bien nos études, nous proposons de développer et d'exploiter une nouvelle tâche comportementale qui nous permettra d’identifier, à la fois les altérations comportementales ainsi que les modifications physiologiques liées à une altération du fonctionnement du cerveau des souris portant certaines modifications génétiques lié à l’autisme. Ces mesures nous permettront, par la suite, mesures physiologiques afin de mettre en évidence les mécanismes cellulaires et physiologiques associés aux altérations comportementales et cognitives liées à l’autisme. Enfin, nous testerons la capacité de cette tâche à mesurer les conséquences d'une intervention pharmacologique. Pour cette dernière, nous utiliserons une molécule expérimentale qui a déjà été testée dans des essais cliniques chez l'homme et dont le profil de sécurité et la pharmacocinétique sont bien définis.

Bénéfices attendus

Des études de dépistage à grande échelle menées aux États-Unis suggèrent que la prévalence de l'autisme est de 1 enfant sur 54. Bien qu'il n'existe pas d'études de cette ampleur en Europe, la prévalence de l'autisme est probablement similaire. Les symptômes sensoriels affectent la grande majorité des personnes atteintes d'autisme et ont des conséquences fortement négatives sur la vie quotidienne des personnes concernées, comme la capacité à s'intégrer dans une salle de classe, à tolérer certains vêtements, à manger certains aliments. Ces symptômes sont une source majeure de stress pour les familles concernées. La compréhension des processus neurophysiologiques qui sous-tendent les difficultés sensorielles peut apporter des informations importantes sur la façon dont le fonctionnement du cerveau est altéré dans l'autisme. De telles études peuvent conduire à l'élucidation des mécanismes moléculaires, cellulaires et des circuits qui sous-tendent les perturbations sensorielles, révélant ainsi de nouvelles cibles pour le développement de traitements pharmacologiques visant à améliorer des symptômes tels que la surcharge sensorielle ou l'hyperréactivité sensorielle, ou de biomarqueurs permettant d'évaluer le succès de traitements expérimentaux dans un cadre préclinique. De telles études nécessitent des approches invasives et des manipulations qui ne sont pas possibles dans un cadre clinique. Nous pensons que notre étude permettra de mieux comprendre les types de cellules et les circuits impliqués dans l'altération de la perception sensorielle tactile. Elle fournira des biomarqueurs précliniques pour l'évaluation de nouveaux médicaments expérimentaux. Elle nous permettra d'évaluer l'efficacité d'un médicament expérimental existant qui a été proposé comme traitement de l'autisme. Notre étude a le fort potentiel de fournir des informations qui, à terme, amélioreront la vie des personnes diagnostiquées autistes. Ces connaissances peuvent également renforcer l'autonomie et bien être des personnes autistes en leur permettant de comprendre pourquoi elles se sentent comme elles le font dans certaines situations.

Procédures

Pour comprendre les mécanismes neurobiologiques sous-jacent de l'autisme, les animaux apprendront à effectuer une tâche comportementale non aversive , basé sur les récompenses, où ils subiront une session de 200 essais par jour. En même temps, nous effectuons des mesures physiologiques afin d'enregistrer l'activité des neurones du cerveau. Afin de permettre cet enregistrement, les animaux sont entraînés à accepter une contention partielle (immobilisation de la tête). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de la tête. Cette habituation commencera par une exploration libre de la chambre d'enregistrement, puis se poursuivra par une très brève immobilisation initiale. L'habituation se poursuivra très progressivement pendant une semaine, permettant à l'animal d'apprendre que cette immobilisation sera brève et réversible. Lorsqu'ils seront à l'aise dans le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l'entraînement à la tâche comportementale commencera. Pendant cette période, chaque animal restera dans le dispositif pendant 30 minutes, une fois par jour.

Impact sur les animaux

Nous ne prévoyons pas d'effet indésirable majeur. Pour réaliser les expériences, les animaux doivent être motivés à consommer de l'eau. Pour cette raison, leur accès à l'eau pendant la journée sera limitée et uniquement sous forme d’hydrogel. Des études antérieures suggèrent que la souris est capable d'adapter son comportement et sa physiologie lorsqu'elle se trouve dans des régions arides. Nos études préliminaires n'ont montré aucune conséquence négative de cette restriction. D'autre part, les animaux seront habitués à une contention partielle (immobilisation de la tête). Cette habituation se poursuit très progressivement, permettant à l'animal de s'adapter à cette contrainte et d'apprendre que cette manipulation sera brève et réversible. Cet apprentissage très progressif est nécessaire afin de réduire au maximum le stress lié à une contention partielle et le rythme d'entraînement est adapté pour chaque animal.

Devenir

À la fin des expériences comportementales, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie.

Remplacement

Les expériences proposées dans cette étude nécessitent des circuits intacts et des mesures à la fois physiologiques et comportementaux. Un modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité de ces interactions neuronales et ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas adaptées à notre objectif expérimental car il s’agit d’une population clinique fragile et car les approches invasives sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Les circuits neuronaux sont bien conservés chez les différentes espèces mammifères et sont donc susceptibles d'être fonctionnellement similaires chez les rongeurs et les humains. L’utilisation des modèles de plus faible sensibilité neuronale (tels que la mouche à vinaigre) n’est pas adapté à notre projet, parce que cet organisme manque la structure cérébrale ciblée par notre étude.

Réduction

Une conception expérimentale soignée garantira la reproductibilité des résultats et, avec des techniques d'analyse statistique appropriées, l'utilisation d'animaux sera réduite au minimum. Une première étude pilote a été réalisée pour établir les protocoles comportementaux ainsi que les protocoles techniques nécessaires au suivi des réponses neuronales. Cette première étude nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser ces expériences et avoir des résultats statistiquement valides. Cela nous a permis d'assurer la crédibilité de nos résultats avant de procéder à l'étude principale. Les données comportementales et physiologiques seront recueillies auprès des mêmes animaux. Tous les animaux seront d'abord soumis à la tâche de détection tactile, puis seront entraînés à la tâche de discrimination tactile. Les neurones pyramidaux et inhibiteurs seront suivis simultanément et distingués par l'expression de rapporteurs spécifiques. Ces mesures nous permettront de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés dans l'étude et de mesurer simultanément plusieurs paramètres.

Raffinement

Dans cette étude, nous tiendrons compte de toutes les connaissances disponibles concernant le bien-être des animaux et nous surveillerons systématiquement les animaux pour détecter tout signe de douleur, de souffrance ou de détresse. Les expériences seront conçues et menées de la manière la plus humaine possible. Des souris transgéniques seront utilisées pour explorer les déficits neurophysiologiques chez les modèles de souris de l’autisme. Aucune souffrance inhérente n'est prévue pour les souches utilisées lors de ces expériences. Le bien-être des animaux est impératif pour cette étude, car les expériences comportementales exigent que les animaux se sentent à l’aise et ne sont pas soumis à une douleur ou une détresse inutile ce qui peut être préjudiciable à l'interprétation de notre expérience. Afin de minimiser la douleur, la souffrance, l'angoisse ou les dommages durables pour les animaux, toutes les procédures seront effectuées avec une technique soigneuse et un équipement adapté, par un personnel autorisé, compétent et formé de manière appropriée. Tous les animaux seront manipulés en utilisant les techniques les moins stressantes possibles, conformément à la littérature : des tunnels de cages domestiques seront utilisés pour transférer les animaux et une fois que les animaux seront habitués à l'expérimentateur, ils seront manipulés en utilisant la technique qui prend en compte le bien- être de l’animal. Tous les animaux seront pesés quotidiennement et la ration d’eau sera ajustée afin de s'assurer qu'ils ne dépassent jamais une perte de poids de 10%. Un tube et du matériel de nidification seront placés dans chaque cage afin de s'assurer que tous les comportements normaux des animaux se poursuivent. Les animaux sont hébergés en cage collective. Les animaux seront progressivement habitués à la contention partielle afin de réduire à minimum le stress.

Choix des espèces

Ce modèle (la souris transgénique) a été sélectionné pour rester cohérent avec les études antérieures utilisant les modèles genetiques de troubles neurodéveloppementaux. Les rongeurs ont un système neuronal très développé, présentent des comportements compliqués et sont considérés comme une espèce modèle pour les études concernant une variété de réponses comportementales. De plus, à ce jour la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible, en routine, de modifier le génome afin de créer des modèles de maladies humaines. L'étiologie de l'autisme a une forte base génétique. Les modèles transgéniques impliquant la manipulation (suppression ou modification des gènes à haut risque pour l'autisme) sont considérés comme les modèles ayant une forte « valeur de construction ». 8 semaines au début de la procédure expérimentale. Justification: Conformément aux études précédentes, les animaux auront 8 à 10 semaines au début de la période de apprentissage.