Système nerveux
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Etude de la modulation de la neurotransmission chimique par les ultrasons de basse énergie chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
75 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacun subit une craniotomie et l'implantation stéréotaxique d'une sonde de microdialyse couplée à un émetteur d'ultrasons, pour mesurer les effets de la neurostimulation par ultrasons de basse énergie sur trois structures du cerveau. Le porteur affirme que l'application des ultrasons et la microdialyse ne sont pas douloureuses, l'ensemble se déroulant sous anesthésie longue. Il indique avoir écarté la souris, dont le cerveau trop petit compliquerait le positionnement des sondes, et juge l'organisme entier nécessaire pour étudier la focalisation du faisceau.
Objectifs
La neurostimulation par ultrasons à basse énergie (Low-Energy Ultra-Sound ou LEUS pour l’abréviation anglaise) suscite un intérêt thérapeutique récent. Les LEUS focalisés offrent des possibilités de neurostimulation ciblée sur une région cérébrale spécifique avec une résolution spatiale de l’ordre du mm3. Dans le passé, il a été possible de déclencher des mouvements de membres, de vibrisses, d’yeux ou de faire dilater les pupilles par neurostimulation LEUS. Cependant, très peu d’équipes ont étudié les mécanismes des réponses induites par la neurostimulation LEUS. Une étude fondamentale est donc requise afin de comprendre les mécanismes de stimulation en vue d’applications cliniques de cette technologie. Il a été montré que les effets mécaniques des LEUS induisent une modification transitoire de la perméabilité membranaire des ions, ainsi qu’une modification des dynamiques calciques sur des modèles cellulaires, avec un processus similaire à une libération neuronale de transmetteurs. Il est également possible de reproduire in vivo des effets observés en cultures in vitro. Comme la modulation calcique est une approche thérapeutique intéressante dans le traitement de maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson ou la maladie de Huntington, le projet a pour objectif : 1) D’intégrer le système LEUS à des outils utilisés en neurosciences (ici, à la microdialyse, technique d’échantillonnage extracellulaire utilisée chez l’animal ou chez l’homme) 2) De montrer que la stimulation LEUS peut moduler la libération de neurotransmetteurs. La présente demande inclut la partie du projet portant sur trois régions dopaminergiques : hippocampe, noyau accumbens et striatum, afin de caractériser les variations spatiotemporelles des taux de dopamine induites par LEUS.
Bénéfices attendus
La neurostimulation ou la neuromodulation fait partie des approches basées sur la transmission d’une énergie au cerveau pathologique qui ont pour but de modifier l’activité neuronale pour traiter des pathologies diverses comme la maladie de Parkinson, l’épilepsie, la dépression, la schizophrénie par exemple. Certaines techniques comme la “deep brain stimulation” (DBS), la « transcranial magnetic stimulation” (TMS), la « transcranial direct and analog current stimulation » (tDCS ou tACS) sont d’ailleurs connues et utilisées pour faire libérer la dopamine chez l’animal et chez l’homme et certaines sont mêmes utilisées en routine dans des protocoles bien définis et approuvés. Cependant, ces approches sont soit invasives et peuvent induire des complications post-opératoires (DBS), soit manquent d’une spécificité spatiale (TMS et tDCS ou tACS). La neurostimulation LEUS, basée sur la focalisation précise d’une onde à ultrasons de basse énergie, permettrait de s’affranchir de ces contraintes techniques. Comme les effets sont moins connus que les autres neurostimulations de par le développement plus récent de la technologie LEUS, le projet a pour objectif de montrer en termes de neuromodulation ce que peut apporter cette technologie sur des animaux sains puisque très peu de données sont disponibles. Les expériences réalisées dans le projet permettront une étude approfondie de la LEUS dans des zones cérébrales définies et les données obtenues sur la dopamine seront ensuite comparées à celles de la littérature scientifique portant sur d’autres techniques de neuromodulation. Elles permettront enfin de déterminer les nouvelles pistes thérapeutiques pour la poursuite de l’étude de la neurostimulation LEUS.
Procédures
Les 75 rats seront utilisés sous anesthésie générale, une seule fois sur une journée, dans le cadre de deux procédures sans réveil. Les 15 premiers animaux serviront pour optimiser les paramètes de stimulation LEUS (procédure n°1), les 60 autres animaux seront employées pour quantifier les effets neurochimiques de la stimulation LEUS dans trois structures cérébrales d’intérêt (procédure n°2). L’animal ressentira une légere douleur lors de l’induction de l’anesthésie mais ce geste sera réalisé par un expérimentateur formé afin de minimiser cette douleur. La bonne profondeur d’anesthésie vérifiée, une sonde de microdialyse couplé à un transducteur LEUS sera ensuite implantée dans le cerveau de manière stéréotaxique, après une fine craniotomie. La microdialyse est une technique d’échantillonage des composés cérébraux, mais sans aucun prélèvelement du liquide céphalo-rachidien. L’application des LEUS ne sera pas douloureuse non plus car elle n’est pas invasive. Aucune douleur ne sera ressentie par l’animal qui sera sous anesthésie générale durant cette procédure.
Impact sur les animaux
Les expériences seront réalisées sur des animaux sains anesthésiés et utilisés sans réveil. Les protocoles de stimulation cérébrale par ultra-sons n’entraîneront aucune douleur. L’anesthésique utilisé permettra une anesthésie longue (5h), ce qui sera au-delà de la durée maximale des expériences à réaliser.
Devenir
Aucun animal ne sera maintenu en vie à la fin du projet. Néanmoins, même si cela est très peu probable, si nous avions des animaux non utilisés (absence imprévue, prolongée et simultanée des deux expérimentateurs), les animaux seraient proposés aux autres expérimentateurs de notre animalerie.
Remplacement
Les premières données in vitro ont montré leurs limites à expliquer tous les effets LEUS, il est nécessaire de pouvoir comparer cette approche de stimulation à basse énergie aux données de la littérature obtenues avec d’autres types de stimulation (stimulation transcrânienne par exemple) qui ont montré des bénéfices thérapeutiques chez l’homme. De plus, pour faciliter l’étude de la focalisation d’un faisceau, nous devons disposer d’une structure cérébrale entière avec l’ensemble des afférences.
Réduction
75 animaux au maximum devraient être utilisés. Ce nombre est basé sur notre propre expérience et sur les statistiques appliquées à la microdialyse (ANOVA, mesures répétées, après consultation antérieure d’un biostatisticien). Nous prévoyons d’utiliser 15 animaux pour tester les paramètres de stimulation dans la procédure n°1 puis 60 animaux (10 animaux par groupe, 3 groupes de traitement LEUS + 3 groupes sham) avec les paramètres retenus pour la procédure n°2. Néanmoins, en nous basant sur une antérieure utilisant un autre type de neurotransmission par ultrasons, on espère pouvoir atteindre au moins 50% de libération de dopamine à la suite d’une stimulation LEUS, ce qui permettra de réduire le nombre des animaux à utiliser. Des analyses statistiques intermédiaires seront effectuées dès que les effectifs atteindront 5 puis 8 animaux par groupe afin de ne pas employer plus d’animaux que nécessaire. De plus, si une sonde de microdialyse était défectueuse pendant l’expérience et en fonction de l’étape d’implantation, nous implanterions la sonde de rechange soit dans la zone souhaitée, soit dans l’hémisphère opposé, ce qui aidera également à réduire le nombre d’animaux utilisés par groupe.
Raffinement
Nous effectuerons les expérimentations de mesures neurochimiques avant, pendant et après la neurostimulation de basse énergie sur des animaux anesthésiés, ce qui limitera la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux utilisés. En plus de notre démarche stricte de suivi quotidien du bien-être des animaux, nous ferons attention à n’ajouter aucun stress supplémentaire à l’expérimentation. Outre la douleur liée à l’injection de l’anesthésique général, nous réduirons les éventuels réflexes observés lors de l’incision de la peau par de la lidocaïne appliquée localement au niveau de la zone à inciser, nous injecterons du sérum physiologique à mi-parcours de l’expérimentation pour prévenir une éventuelle déshydratation. Nous utiliserons une procédure d’anesthésie qui associe un antidote prévenant les éventuels surdosages et qui respecte le bien-être animal tout en permettant à l’expérimentateur de faire face à une éventuelle complication anesthésique.
Choix des espèces
Notre choix s'est orienté vers le modèle rat qui est un modèle classique d'étude du fonctionnement du cerveau en lien avec des stimulations cérébrales. De plus, chez le rat adulte, l’anatomie, les réseaux neuronaux et la neurophysiologie sont maintenant bien caractérisés et de nombreux tests ont été développés pour mesurer les fonctions neurochimiques dans les meilleures conditions possibles et en réponse aux exigences de l'expérimentation animale. Le modèle rat possède enfin les grands principes d’organisation anatomique conservés chez l’homme et les rats ont une taille cérébrale qui permet d’étudier de nombreuses aires cérébrales retrouvées également chez l’homme : striatum dorsal, noyau accumbens et hippocampe dorsal ciblés dans notre projet. Vu la taille de son cerveau, une souris n’est pas un modèle retenu dans notre étude puisqu’il présenterait des difficultés expérimentales supplémentaires telles que l’encombrement des sondes de microdialyse vis-à-vis du positionnement du transducteur ultrasonore. Les rats utilisés seront des jeunes adultes sexuellement matures, de plus de 2 mois (entre 280 et 320 g)
Impact du stress néonatal de séparation maternelle sur le comportement de contagion à la douleur
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
384 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des ratons sont séparés de leur mère trois heures par jour de J2 à J12, et des rats "démonstrateurs" reçoivent dans une patte un agent inflammatoire provoquant une douleur aiguë ou un œdème persistant deux semaines, pour mesurer par un test de transfert social de la douleur l'empathie liée à un stress néonatal. Le porteur présente ce modèle comme celui d'une prématurité humaine et indique surveiller le bien-être des animaux non-humains. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reconstitue les réseaux neuronaux de l'empathie et de la douleur.
Objectifs
Dans le cadre de l’utilisation d’un modèle animal mimiquant les conséquences d’une prématurité chez l’humain, le but du projet est d’affiner la compréhension de l’impact d’un stress de séparation maternelle précoce (SMP) sur certains processus émotionnels associés à la douleur. L’objectif du projet est donc d’évaluer chez le rat, les conséquences d’une SMP sur les interactions sociales ainsi que sur l’empathie à la douleur à l’aide du test de « transfert sociale de la douleur » qui a été validé dans la littérature comme étant un bon indicateur de l’empathie chez ce dernier.
Bénéfices attendus
Le modèle de séparation maternelle néonatale a permis de décrypter nombre de mécanismes et d’altérations du système nerveux qui sont retrouvés chez les enfants prématurés humains. Dans ce cadre, cette étude permettra de mieux comprendre l’impact d’un stress néonatal non douloureux (i.e. une séparation précoce avec la mère) sur les processus cognitifs et émotionnels associés à la douleur chez un jeune individu encore en pleine maturation durant une période critique de son développement.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis au protocole de SMP et seront séparés de leur mère 3 heures par jour du deuxième au douzième jour postanal. Pour le test de transfert social de la douleur, les animaux « démonstrateurs » recevront une injection sur une patte arrière d’agents inflammatoires créant soit une douleur aigue soit une douleur prolongée sous anesthésie générale d’une durée maximale de 5 minutes. Des tests d’évaluation de la douleur (durée de 5 à 10min) et n’induisant pas de stress accru chez l’animal, seront effectués à la suite du test de transfert (test unique d’une durée de 45 min) puis à nouveau 1x/h pendant 4h pour un premier groupe expérimental et 1x/J pendant deux semaines en plus pour le deuxième groupe ainsi que le groupe contrôle. Le nombre total de tests de douleur pour le protocole "douleur aigüe" est de 10 tests. Pour le protocole "douleur prolongée", les animaux sont en plus testés 1 fois par jour durant deux semaines ce qui fait un total de 36 tests.
Impact sur les animaux
La séparation maternelle induit au niveau comportemental une anxiété accrue chez la mère. Les injections du premier agent inflammatoire provoquent une douleur temporaire, qui s’arrêtent spontanément au bout d’une heure, celles du second provoquent un œdème cutané dont la sévérité sera surveillée et qui se résorbe après deux semaines. Les tests d’évaluation de la douleur prévus sont courts (de 5 à 10min) et n’induisent qu’un stress mineur chez l’animal.
Devenir
A la fin de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les comportements sociaux, l'empathie et la douleur étant des processus intégrés impliquant différentes structures sensorielles, cognitives et émotionnelles, ce projet nécessite l’étude de sujets vivants dotés d’un cortex développé. Il n’existe pas encore de modèles alternatifs in silico ou in vitro capable restaurer les réseaux neuronaux impliqués dans les comportements observés.
Réduction
Le nombre d’animaux est basé sur l’expertise de l’équipe vis-à-vis des différentes procédures et prend en compte les variabilités interindividuelles) pour obtenir des résultats statistiquement significatifs lors des tests utilisés pour évaluer l’impact du stress néonatal de séparation maternelle sur le comportement de contagion à la douleur chez le rat. Le projet évaluera également les différences entre les mâles et les femelles, qui ont été démontrées pour les réponses à la douleur et dans différents modèles de stress périnataux.
Raffinement
Les animaux sont suivis quotidiennement par les zootechniciens de l’animalerie et par les expérimentateurs afin d’être alertés dès les premiers signes de dégradation du bien-être animal en portant une attention particulière à tout changement de l’état général (perte de poids supérieure à 10%, défaut de toilettage, plaie ouverte, blessure) ainsi qu'à l'état comportemental (prostration, dos arqué, réticence au déplacement, léthargie, agressivité, vocalises). Si des changements sont observés, le vétérinaire sera contacté pour prendre la décision adéquate : soins, retrait de l’animal de l’étude ou mise à mort de l’animal. Durant la séparation maternelle, les ratons sont placés sous lampes chauffantes afin d’éviter toute hypothermie. Les injections des produits inflammatoires dans la patte se font sous anesthésie gazeuse afin de limiter tout stress chez l’animal. Le poids des animaux est mesuré hebdomadairement, et quotidiennement suite aux injections. Les tests nociceptifs sont effectués après une semaine d’habituation afin de réduire le stress. L’étude portant sur la douleur, celle-ci ne pourra pas être prise en charge lors des tests comportementaux. Des points limites ont été mis en place pour éviter d’éventuelles souffrance inutiles dépassant le cadre de l’étude.
Choix des espèces
Des études précédentes ayant étant réalisées sur le rat, ce modèle animal sera conservé dans le cadre de ce projet car son comportement est bien connu. Le modèle de séparation a déjà été bien décrit et caractérisé chez cette espèce, permettant ainsi de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus le modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3e trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3e trimestre de gestation. L’étude des comportements complexes comme les comportements sociaux ou l’empathie implique que l’étude porte sur une espèce qui possèdent les fonctions et capacités cognitives nécessaire à l’expression de ces derniers, ce qui est le cas chez le rat. Afin de mesurer l’impact à long terme de cette séparation maternelle, les tests comportementaux seront ensuite effectués à l’âge adulte. Les animaux seront donc utilisés entre 2 jours et 2 mois dans cette étude.
CRAFT (CeRveAu – Folate –Toxique)
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704 rats vont être utilisés, la quasi-totalité tués à l'issue et les 64 mâles reproducteurs transférés vers l'enseignement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes sont gavées de dioxine, une molécule tératogène, et leurs ratons subissent des tests comportementaux d'anxiété, d'activité et de sociabilité, pour étudier l'effet combiné d'une carence en folate et d'un polluant sur le développement cérébral et les troubles du spectre autistique. Le porteur indique un risque de perte de nouveau-nés et de malformations graves, et reconnaît qu'aucune donnée n'existe sur l'effet synergique recherché. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne rend compte des effets liés au sexe ni de ceux sur la descendance et juge l'organisme entier nécessaire.
Objectifs
Selon l’OMS, l’exposition aux perturbateurs endocriniens et la carence en folate (vitamine B9) représentent des problèmes majeurs de santé publique, d’autant plus que cette dernière représente l'une des carences nutritionnelles les plus fréquentes. Selon la dernière étude ESTEBAN publiée par Santé Publique France en 2019, la prévalence du risque de déficit en folates sériques chez les femmes en âge de procréer a quasiment double ces dix dernières années. Les effets délétères de la carence en folate sur le développement du tube neural sont largement décrits et ont conduit aux recommandations de l’OMS visant à supplémenter les femmes en période péri-conceptionnelle en prévention du spina bifida (anomalie de fermeture du tube neural). En accord avec l’hypothèse de la programmation fœtale, la carence précoce en folate a également un impact sur le développement cognitif de l’enfant et l’apparition de troubles du spectre autistique (dont fait partie l'autisme). L’exposition chronique aux polluants environnementaux en période de procréation, de gestation et périnatale joue également un rôle déterminant dans le développement de ces pathologies neurologiques. Les toxiques environnementaux et les perturbateurs endocriniens réduisent l’expression des gènes des transporteurs du folate. Ceci signifie qu’une exposition chronique à de telles molécules (nombreuses et de nature variée) pourrait contribuer à la carence cérébrale en folate par défaut de transport à travers les interfaces sang-cerveau (barrière hématoencéphalique et plexus choroïdes). Notre projet vise à tester l’hypothèse selon laquelle une carence précoce en folate peut être amplifiée par l’exposition à des facteurs environnementaux entraînant une altération du développement cérébral postnatal, en affectant le transport des folates au niveau des interfaces sang-cerveau. Les objectifs sont donc les suivants : 1. Quel est l’impact respectif et combiné d’une déficience précoce en folate et de l’exposition à un polluant (la dioxine) sur le contenu en folate et les intermédiaires de son métabolisme, et la neurogenèse postnatale dans le cerveau ? 2. Cet effet respectif et combiné de la déficience et de l’exposition résulte-t-il d’une altération du transport de folate au niveau des interfaces sang-cerveau ? 3. L’altération du transport de folate peut-elle constituer un test prédictif de toxicité sur le développement cérébral ?
Bénéfices attendus
Notre projet vise à étudier les interactions entre deux facteurs d’exposition : un déficit nutritionnel (déficit en folate) et une exposition à un polluant chimique et leurs conséquences sur le développement cérébral. Il présente un intérêt particulier pour illustrer la pertinence de ces interactions en santé publique dans la mesure où il ouvre la voie à des solutions de prévention des impacts de cette double exposition sur l’apparition de désordre neurologiques, notamment les troubles du spectre autistique.
Procédures
L'ensemble des femelles de la pré-étude et de la phase 2 (soit au total 12+52 animaux) recevront soit de l’huile de maïs neutre, soit de la dioxine diluée dans de l’huile de maïs, par gavage gastrique, à raison d’une prise au 8ème jour et une seconde au 15ème jour de gestation. De plus, les femelles de la phase 2 uniquement (N=52) subiront un unique prélèvement sanguin par une incision au bout de la queue sous anesthésie à l’isoflurane 4%/air, 3 jours avant les accouplements. Le prélèvement ne dépassera pas les 2 minutes par animal. Enfin, les ratons de la série 2 (N=288) réaliseront différents tests comportementaux permettant d’étudier les différents traits des troubles du spectre autistique (hyperanxiété, hyperactivité, stéréotypies et comportement social anormal). La durée des tests n’excèdera pas 30 minutes par raton, et ils seront replacés dans leur cage d’hébergement entre chaque test. Lors de ces tests, une partie est réalisée de manière précoce (avant J14), et dans ce cas, un même raton n'est retiré que 2x maximum par jour de la portée afin de réaliser ces tests (maximum 3h entre les 2 tests). Les animaux seront hébergés à 2 individus par cage à l'âge adulte et les ratons issus de la reproduction seront séparés selon le sexe à l'âge de J30. Seuls les pères seront individualisés dans des cages d'hébergement, après la reproduction. Avant le sevrage, les animaux utilisés pour les tests comportementaux sont retirés au maximum 5 minutes pour les tests, et leur manipulation se fera avec précaution et par du personnel habitué et habilité. Un raton passera au total 120 minutes dans les tests de comportement. Les ratons issus des reproductions de la phase 2 (séries 3 et 4) seront séparés pour leur hébergement selon leur sexe à partir de J30, à raison de 2 animaux par cage.
Impact sur les animaux
La dioxine (TCDD, 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxine) est classée comme molécule tératogène. Nous estimons que ce traitement peut perturber le devenir des embryons, voire entraîner des malformations à la naissance. La dose utilisée dans le cadre de ce protocole sera inférieure à la dose létale 50 orale estimée à 20 µg/kg chez le rat (fiche de données de sécurité Sigma-Aldrich) et déterminée grâce à la phase 1 (pré-étude) et les recommandations des partenaires du projet CRAFT dans lequel s'inscrit ce protocole, experts reconnus de la mise en œuvre de modèles murins d'exposition chronique à la dioxine. Concernant la carence en folate dont nous avons l'expertise à travers les modèles animaux développés dans notre laboratoire depuis plusieurs années, il existe un très faible risque (moins de 15%) de perte de nouveau-nés et d’apparition de malformations graves. Concernant l'effet synergique de la carence en folate et l'exposition à la dioxine, il n'existe aucune donnée dans la littérature. La phase 1 du projet permet d'anticiper les effets liés à la dose de dioxine administrée aux femelles. La dose la moins toxique et permettant l'activation du AhR et l'induction le CYP1A1 sera utilisée pour la phase 2. Dans le cas où le nombre de ratons dans une portée n'est pas suffisant et que des réadoptions de femelles du même groupe ne sont pas envisageables, nous adapterons le protocole en fonction.
Devenir
L’ensemble des femelles reproductrices et descendants (N=704), hormis les mâles reproducteurs (N=64) qui peuvent être replacés, sont mis à mort à différentes périodes du protocole (J3, J21, J65, J120). Les animaux classés en procédure légère comprennent les mères des groupes contrôles et les petits issus de ces mères (17 mères Ctrl (4 pour la phase 1 + 13 pour la phase 2) + 170 ratons issus de ces femelles (estimation de 10 ratons par portée), soit un total de 187 animaux classés en procédure légère). Le reste des animaux de ce projet sont classés en procédure modérée du fait des effets de la carence en folate et/ou de la dioxine. Cela comprend 2 groupes de 4 femelles de la phase 1 (soit 8 animaux), 3 groupes de 13 femelles de la phase 2 (soit 39 animaux), ainsi que les ratons issus de ces femelles (avec toujours une estimation de 10 ratons par femelle), soit 470 ratons (80 pour la phase 1 et 390 pour la phase 2). Pour la procédure modérée, nous avons donc 517 animaux. Les ratons de la série 3 effectueront des tests de comportement dont les tests précoces qui s’enchaîneront rapidement, ce qui fait que les ratons seront manipulés fréquemment. Un retour à la litière maternelle et du repos entre chaque test est prévu afin de ne pas engendrer de mal-être chez l’animal, et de ne pas influencer les tests de comportement réalisés. Les autres animaux ne subiront aucune procédure (ni tests de comportement, ni prélèvement sanguin). Les femelles des groupes de la phase 2 uniquement auront un unique prélèvement sanguin 3 jours avant l’accouplement grâce à une petite incision au bout de la queue et sous anesthésie à l’isoflurane 4%/air, ainsi que 2 gavages (neutre ou en présence de dioxine), c'est pourquoi elles font partie de la classe modérée. Les mâles reproducteurs n'étant utilisés que pour la reproduction, ils seront replacés à l’issue du protocole.
Remplacement
Pour la partie « Carence en folate », il existe des modèles cellulaires basés sur l'utilisation de milieux de culture spécifiques. Cependant, ce type d’expérimentation ne permet pas de discriminer les effets liés au sexe des individus, ni de voir de potentiels effets sur le développement de la descendance (effets transgénérationnels). Il en va de même pour les modèles cellulaires traités à la dioxine. Il serait tout à fait envisageable de combiner les 2 modèles cellulaires afin de voir l’effet combiné des 2 traitements, et c’est ce qui est réalisé en parallèle du modèle animal. En revanche, il ne nous permet toujours pas d’apprécier les différences liées au sexe, ni les effets transgénérationnels. Compte-tenu des traitements des femelles, il n’existe pas actuellement de modèle de remplacement mimant la carence en folate combinée à l’exposition à la dioxine sur organisme entier et de manière transgénérationnelle.
Réduction
Afin de limiter l’utilisation des animaux à des fins scientifiques, les mâles reproducteurs de ce protocole seront replacés à des fins d’enseignements. Enfin, il s’agit ici d’une phase de caractérisation du modèle, nous permettant de vérifier les effets de la carence sur une nouvelle souche et de réaliser l’ensemble des analyses biochimiques, de biologie moléculaire sur les prélèvements tissulaires et les microvaisseaux cérébraux isolés. Ce protocole contient également des tests de comportement qui permettront d’apprécier les traits des troubles du spectre autistique (hyperactivité, hyperanxiété, stéréotypies et comportement social anormal). L’effectif total des animaux inclus dans ce projet a été calculé pour que les résultats atteignent la puissance statistique de 0.8 classiquement utilisée dans ce type d’étude. Les ratons d’une même portée n’étant pas considérés comme des sujets indépendants, c’est la portée qui sera dès lors considérée comme unité expérimentale ainsi que la littérature le préconise.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux sont acclimatés pendant 10 jours à leur nouveau lieu d’hébergement. Ce dernier est en alternance jour/nuit de 12h. Les animaux sont hébergés à 2 animaux par cage et auront des buchettes en bois pour entretenir leurs réflexes de rongeurs (sauf pour les ratons, puisqu’ils feront des tests comportementaux). Les pesées des animaux se font toutes les semaines au moment du change des cages d’hébergement et un suivi quotidien du bien-être est également réalisé. À la suite des prélèvements sanguins, les soins primaires sont effectués par le technicien en expérimentation animale (nettoyage de l'incision avec un savon antiseptique et désinfection à la chlorhexidine). Aucune de nos procédures expérimentales n’est censée provoquer de blessure ou de douleur. Si des signes de souffrance apparaissent, une surveillance accrue sera réalisée, et une petite coupelle contenant du lait concentré et du méloxicam sera donnée. À la suite des accouplements et à la détection de la fécondation, les femelles sont séparées et du matériel pour la nidification sera déposé dans la cage. De plus, à la suite du traitement des mères (carence et/ou administration de dioxine), il est préférable de limiter la portée pour le bien-être de la mère et des ratons. Un nombre trop élevé pourrait mener à une absence de lien mère-raton et générer un mal être chez ses animaux. Sur toute la duréée du projet, des points limites appropriés et précoces ont été élaborés, à savoir la perte de poids (ou l'absence de prise de poids pour les femelles en période de gestation) pour l'ensemble des animaux, ainsi que l'aspect des selles pour les femelles traitées.
Choix des espèces
Le projet de recherche fait appel à des analyses histologiques, biochimiques et moléculaires en lien avec des régimes nutritionnels spécifiques et l’exposition à un polluant chimique. Il se concentre notamment sur le développement cérébral qui est altéré à la suite d’une carence nutritionnelle en folate, et qui pourrait l’être encore davantage avec une exposition à un polluant. L’effet synergique de ces 2 facteurs d’exposition pourrait être à l’origine de l’apparition de désordres neurologiques. Les conséquences de cette interaction seront analysées sur le cerveau des descendants, le foie, les reins et les surrénales, la graisse et sur le plasma de tous les animaux impliqués dans l’étude. Ces observations ne peuvent pas être réalisées à l’aide de modèles cellulaires, et dans la littérature scientifique, l’utilisation des rats est reconnue comme étant un bon modèle pour ce type d’études. De plus, il s’agit du modèle précédemment utilisé pour l’étude des conséquences des carences gestationnelles en folate au sein du laboratoire. Les femelles adultes sont utilisées à l’âge de 2 mois car elles seront soumises à des régimes spécifiques 1 mois avant l’accouplement, pendant la gestation, et jusqu’à la période de sevrage des ratons. Le traitement à la dioxine se fait uniquement pendant la gestation. Les mâles reproducteurs seront replacés pour d’autres protocoles ou des travaux pratiques, car non nécessaires aux analyses biochimiques. Les ratons quant à eux, seront utilisés à l’âge de 3 jours (J3, période de forte plasticité cérébrale), 21 jours (J21, période de sevrage) et 65 jours (J65, période de maturité cérébrale), car il s’agit des périodes les plus adaptées pour étudier toutes les structures cérébrales qui sont encore en phase de développement et de maturation neuronale en période post-natale, notamment le cervelet.
Aide à la production de modèle de rat pour le Syndrome de Down et la Maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 1400 femelles reçoivent une injection d'hormone de synchronisation et 700 subissent une insémination artificielle par chirurgie, le sperme étant injecté directement dans les cornes utérines sous anesthésie, pour augmenter la production de lignées difficiles de rats modèles du syndrome de Down et de la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique que les femelles sont tuées lorsqu'elles ne peuvent plus servir à la reproduction, soit quatre semaines après la chirurgie, soit après le sevrage de leur portée. Il affirme qu'aucune alternative n'existe pour l'étude du cerveau et conclut que seul l'organisme vivant dans son intégrité permet cette recherche.
Objectifs
Nous réalisons des croisements afin de générer différents modèles de rat pour le Syndrome de Down (SD) et la Maladie d’Alzheimer (MA). Le but est d’étudier les mécanismes de la MA dans un contexte du SD. En effet, les personnes atteintes du SD présentent un risque élevé de développer une démence de type Alzheimer. Cependant, nous rencontrons d’importantes difficultés de production sur certains de nos croisements, ce qui rend la constitution de nos groupes expérimentaux compliquée. L’objectif de ce projet est donc de mettre en place des procédures nous permettant d’augmenter nos chances de production, afin de générer un nombre suffisant d’animaux pour constituer nos groupes expérimentaux. Nous souhaitons ainsi synchroniser les femelles par l’injection d’une hormone avant de les mettre en accouplement. Cela a pour but d’augmenter nos chances qu’elles soient dans la phase de leur cycle la plus propice à leur accouplement. Nous souhaitons également réaliser des inséminations artificielles. Cela consiste à injecter du sperme directement dans les cornes utérines de femelles lors d’une petite chirurgie. Le but de cette procédure est d’augmenter le nombre potentiel de portées obtenues.
Bénéfices attendus
L’objectif de se projet est de mettre en place des procédures nous permettant d’augmenter le nombre d’animaux produits sur nos croisements difficiles. Ces croisements permettent de générer des modèles de rats de SD et MA combinés. Le premier bénéfice de la mise en place de ces procédures, sera une mise en œuvre plus facile de nos études du fait d’un nombre plus important d’animaux produits. A noter que la plupart du temps, les études que nous réalisons nécessitent de générer plusieurs groupes expérimentaux afin d’avoir des effectifs finaux suffisant pour chaque modification génétique et chaque sexe pour pouvoir analyser et interprêter nos résultats de façon fiable. De ce fait, si nous sommes en mesures de produire un nombre plus important d’animaux, nous pourrons constituer des groupes expérimentaux de taille plus importante et donc atteindre les effectifs nécessaires pour nos études plus rapidement. Cela représente un gain important de temps, mais surtout, nous devrions pouvoir réduire le nombre de groupes expérimentaux à produire et donc par conséquent, nous utiliserons moins d’animaux pour produire ces derniers. Par ailleurs, la caractérisation de ces modèles SD-MA a pour but de nous permettre de mieux comprendre les mécanismes de la MA dans un contexte du SD. Ces mécanismes pourraient également s’appliquer aux personnes de la population générale affectées par la MA. A long termes, cela pourrait potentiellement permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la MA. Ces modèles peuvent donc également nous permettre de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, avec une application potentielle à l’Homme.
Procédures
Deux procédures sont prévues dans ce projet. La première consiste en une injection d’une hormone chez des femelles avant qu’elles ne soient mise en accouplement. Cette procédure concerne 1400 femelles sur 5 ans. La procédure dure entre 30s-1min environ. Une femelle peut être injectée plusieurs fois puisqu’elle peut être utilisée pour la production de plusieurs groupes expérimentaux. Le nombre d’injection reçu par une femelle dépendra donc du nombre de fois où elle sera mise en accouplement. Un délai de minimum de 2-3 semaines entre chaque injection est respecté. La seconde procédure qui est l’insémination artificielle comporte plusieurs étapes. Les femelles reçoivent ainsi 2 injections, l’une d’hormone et l’autre d’anesthésique, chacune dure entre 30s-1min. Elles sont par la suite soumises à un acte chirurgical réalisé sous anesthésie générale afin d’injecter du sperme directement dans les cornes utérines. La chirurgie dure en moyenne 10 min par femelle et concerne 700 femelles sur 5 ans. Chaque animal sera opéré une seule fois.
Impact sur les animaux
La procédure d’injection (hormone et anesthésique) est très brève et ne génère qu’une douleur minime liée à l’introduction de l’aiguille. Elle peut également induire un léger stress de courte durée chez l’animal, notamment du fait de la contention nécessaire pour pouvoir effectuer l’injection. Par ailleurs, les animaux sont surveillés après l’injection, afin de s’assurer que cette dernière n’induit pas l’apparition de rougeurs, gonflement ou démengaisons au niveau du site d’injection. Des signes d’inconfort peuvent être observés après l’acte chirurgical bien que cela soit très rare. Les animaux soumis à la chirurgie seront donc surveillés afin de mettre en évidence toutes modifications dans leur apparence et comportement traduisant une souffrance. La chirurgie peut potentiellement induire l’apparition de rougeurs, gonflement, écoulement voir des automutilations qui seront à surveiller.
Devenir
L’ensemble des animaux prévu dans ce projet seront mis à mort. Pour les femelles utilisées dans la cadre de la synchronisation, elles sont mises à mort lorsqu’elles ne peuvent plus être utilisées pour la reproduction. Celles qui seront utilisée pour l’insémination artificielle (acte chirurgical), seront mises à mort soit 4 semaines après la chirurgie si elles sont non gestantes, soit après sevrage de leur portée, environ 7-8 semaines après la chirugie.
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucune alternatice à l’utilisation des animaux pour les études concernant le cerveau. La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires des pathologies génétiques et neurodégénératives requiert l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo.
Réduction
Cette demande concerne la mise en place de procédures nous permettant d’optimiser nos productions d’animaux dans le cadre de lignées difficiles. Les connaissances que nous avons acquis sur ces lignées nous permettent d’estimer que le nombre néssaire de femelles à synchroniser (injection d’hormone) en vue d’accouplements naturels est de l’ordre de 15 à 25 femelles en fonction des croisements réalisés. Concernant les inséminations artificielles (acte chirurgical), un nombre maximal de 10 femelles sont utilisées pour chaque insémination. Par ailleurs, les femelles synchronisées qui ne sont pas pseudogestantes le jour de la chirurgie peuvent être réutilisées afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Un repos d’un délai minimum de 2-3 semaines est alors observé avant la prochaine utilisation. A noter que le nombre d’animaux utilisés dans chaque procédure devra être optimisé en fonction des besoins expérimentaux des différentes études mises en oeuvre.
Raffinement
Les animaux restent sous surveillance après leur injection d’hormone dans le cadre de la synchronisation ou d’anesthésique en vue de la chirurgie pour l’insémination artificielle, afin d’observer l’absence de souffrance. Le degré de sévérité de l’injection est de classe légère. Les points de surveillance sont les suivants : rougeurs, gonflement, traces de griffures au site de l’injection si l’animal se gratte. Dans le cadre de la chirurgie pour l’insémination artificielle, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil complet en bonne forme, dans leur cage placée sur une platine chauffante à 30°C. Cette dernière est utilisée afin d’éviter tous risques d’hypothermie liés à l’anesthésie. Les points de surveillances pour le suivi post-opératoire sont les suivants : apparence et comportement de l’animal (poil hérissé, animal prostré…), aspect du site de chirurgie (rougeur, gonflement, écoulement, automutilation…). Si un animal présente un signe d’inconfort post-chirurgical, un traitement anti-inflammatoire sera mis en place. S’il ne suffit pas, le vétérinaire de l’institut sera consulté pour la mise en place d’un traitement plus spécifique. Si un aucun traitement n’est envisageable, l’animal sera mis à mort. Par ailleurs, les animaux seront principalement hébergés en groupes sociaux, le rat étant une espèce très sociable, à l’exception des rates allaitantes pour des raisons de réglementation d’hébergement. De l’enrichissement est également présent dans les cages (nids, bois à ronger et croquettes).
Choix des espèces
Le rat est physiologiquement et génétiquement plus proche de l’Homme que ne l’est la souris. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique du rat sont bien connues. De plus, ce sont de petits mammifères à reproduction rapide. L’évolution des techniques de génétique permet maintenant de réaliser facilement des modications génétiques chez le rat. De plus, les meilleures capacités d’apprentissage et d’adaptation du rat, comparé à la souris, en font un meilleur modèle pour l’étude de la maladie d’Alzheimer et des déficiences cognitives liées au Syndrome de Down. Les animaux utilisés dans nos procédures sont des rats adultes en âge de procréer. Ils peuvent ainsi être utilisés à partir de l’âge de 9-10 semaines et ceux jusqu’à l’âge d’environ 12 mois, cependant cela varie d’un individu à l’autre, en effet un animal avec une bonne reproduction pourra être utilisé plus longtemps.
Effet de l’intensité lumineuse sur le développement et la croissance de Sepia officinalis
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
700 seiches juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les animaux subissent une exposition lumineuse continue de douze heures pouvant induire un stress, puis sont anesthésiés et tués pour prélever cerveau, lobe optique et yeux. L'objectif relève de la recherche fondamentale sur l'effet de la lumière sur le développement de la seiche. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative in vitro pour étudier un "organisme entier".
Objectifs
L’intensité lumineuse et le type de lumière ont des effets sur le développement du système nerveux. Ce projet a pour objectif de tester l’effet de l’éclairement sur le développement et la croissance après éclosion des juvéniles de seiche, Sepia officinalis, une espèce de mollusque aux comportements élaborés. Il s’agit plus précisément de déterminer si la photosensibilité et la neurogenèse varie lorsque l’animal est éclairé par des sources lumineuses artificielles différentes en terme quantitatif (intensité) et qualitatif (LED versus néons T5). Ce projet permettra de mieux comprendre comment le développement du système nerveux central (cerveau et lobes optiques de la seiche) peut être modifié par la source lumineuse afin d’inférer des hypothèses évolutives et fonctionnelles sur l’influence du facteur lumière sur l’acquisition de comportements élaborés.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’identifier si la lumière est un facteur important voire essentiel au développement et à la croissance du système neuro/photosensoriel permettant la mise en place des capacités cognitives chez la seiche dont le système nerveux est analogue à celui des vertébrés. Les résultats attendus sont de déterminer l’intensité et le type de lumière permettant une mise en place du système nerveux sans « défaut » et a contrario de voir si certains types et intensité lumineuses sont néfastes pour la neurogenèse et donc les comportements. Par ailleurs, les résultats permettront d’optimiser les conditions d’élevage de cet animal d’intérêt économique pour lequel aucune aquaculture n’est encore possible
Procédures
Les animaux ne subissent aucune intervention avant leur mise à mort. Lorsqu’ils sont retirés des bacs, ils sont immédiatement transférés dans un récipient, anesthésiés, puis mis à mort
Impact sur les animaux
L’irradiation continue sur 12h peut induire un stress.
Devenir
Pour étudier l’expression des gènes dans les tissus, il est nécessaire que les organes soient extraits et fixés, ce qui implique la mise à mort des animaux. Il n’est pas possible de prélever une partie de l’animal sans causer des dommages irréversibles (pas de survie après prélèvement des yeux, du cerveau entre autres).
Remplacement
Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui cherche à déterminer, par une approche physiologique globale, l’effet de la lumière sur le développement et la croissance des organes photosensibles (cerveau, lobe optique, yeux) d’un organisme entier, en lien avec le comportement. Il n’y a pas d’alternative in vitro à l’heure actuelle.
Réduction
Le nombre de juvéniles est réduit mais optimisé pour cette expérimentation afin d’éviter de la répéter ultérieurement si les résultats n’étaient pas satisfaisants. Le nombre de 5 échantillons est le minimum adéquat pour garantir une puissance statistique suffisante pour examiner les variations d’expression. Les « qualités » des échantillons sont très inégales. Le nombre d’animaux prend donc en compte ce fait ainsi que le nombre de gènes à tester, et les variabilités intra expérimentales (correspondant à la variabilité biologique) afin de respecter les limites acceptables de la validité scientifique. Pour les estimations de neurogenèse, la variabilité interindividuelle peut être plus importante et les différences attendues entre deux intensités sont faibles. Chaque étape de prélèvement nécessite donc au total 20 individus. Nous utiliserons le test de Wilcoxon-Mann-Whitney pour estimer s’il y a une différence significative entre les niveaux d’expression hauts et bas pour un point donné.
Raffinement
Les juvéniles éclos auront un enrichissement environnemental varié à disposition dans les bacs sous la forme de cachette diverses (tube et pièces de PVC, « cabanes »…) leur permettant de se cacher comme en milieu naturel. Ils sont nourris à satiété avec des crevettes de taille adaptée (mysis sp.). L’intensité lumineuse maximale appliquée reste inférieure à l’irradiation maximale en plein soleil. Les constantes physico-chimiques (température, salinité, pH, oxygène) sont contrôlées quotidiennement sur toute la durée du développement. Une observation quotidienne permet de s’assurer du bon état physiologique, morphologique et comportemental des juvéniles. Les animaux qui présenteraient des anomalies comportementales (flottaison, immobilisme, blessure), seront écartés et immédiatement mis à mort par surdose d’éthanol. Une grille de suivi des animaux et une table scorée pour les manifestations de stress et de souffrance est mise en place et permet de décider de l’intervention (voir annexe). Au bout d’une semaine (puis 2, 3, 4 et 8), 20 juvéniles sont prélevés dans chaque bac. Afin de limiter le stress et la souffrance supposée des juvéniles, ils sont transférés délicatement et rapidement dans un récipient contenant de l’eau de mer du système d’élevage jusqu’à une salle adjacente où la mise à mort sera réalisée. Le récipient est mis sur glace ce qui permet un refroidissement progressif, et une anesthésie des animaux par le froid. Ils sont observés jusqu’à constatation d’une léthargie (relâchement pupillaire, le relâchement des bras et du manteau) puis une fois la mort confirmée (arrêt respiratoire); les juvéniles sont alors placés dans le fixateur.
Choix des espèces
La seiche européenne est le seul mollusque possédant un cerveau et des yeux performants, qui pond des œufs sur nos côtes. Contrairement à d’autres espèces de céphalopodes comme les pieuvres, son développement est court (
Essai d’une thérapie combinée cellulaire et optogénétique pour le remplacement de photorécepteurs chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
295 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des rats immunodéficients porteurs d'une dégénérescence rétinienne reçoivent une greffe de cellules sous la rétine par chirurgie oculaire, puis des examens d'imagerie et d'électrorétinographie sous anesthésie et des tests visuels, avant d'être tués pour analyser la rétine. L'objectif est de tester une thérapie combinée cellulaire et optogénétique censée restaurer la vision. Le porteur affirme que cette évaluation "ne peut être réalisée que chez l'animal".
Objectifs
Ce projet a pour objectif de valider le potentiel de restauration visuelle de cellules rétiniennes appelées photorécepteurs rendues artificiellement sensibles à la lumière grâce à la présence d’une protéine microbienne. Ces photorécepteurs sont obtenus in vitro à partir de cellules souches humaines appelées cellules iPS suivant une méthode établie dans notre équipe. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer dans un modèle de rats présentant une dégénération de la rétine similaire à celle observée chez l’homme et immunodéficient, le potentiel thérapeutique de ces cellules. Nos études précédentes ont montré la nécessité de sélectionner une population homogène de cellules à transplanter et permis de valider un système de sélection des photorécepteurs par tri magnétique. Nos premières études de transplantation dans un modèle murin de dégénération de la rétine, ont démontré que ces cellules survivent dans la rétine, peuvent devenir des photorécepteurs (cellules rétiniennes) matures, et se connecter aux autres neurones de la rétine de l'hôte. En revanche, aucune amélioration significative de la vision n’a pu être observée. La maturation de ces cellules greffées en photorécepteurs fonctionnels restant un obstacle, nous avons combiné notre approche de thérapie cellulaire avec l’optogénétique, dans le but de conférer artificiellement aux cellules transplantables une sensibilité à la lumière. L’objectif de ce projet est donc de tester le potentiel de restauration visuelle de ces cellules modifiées après transplantation dans une modèle de perte visuelle liée à une dégénérescence des photorécepteurs.
Bénéfices attendus
Les travaux de thérapie cellulaire humaines de ces dernières années utilisant des photorécepteurs dérivés de cellules souches pluripotentes ont permis d’établir sa faisabilité en termes de survie et d’intégration dans le tissus hôte des cellules transplantées. En revanche, la plupart des études témoignent d’une absence ou d’une faible récupération fonctionnelle, liée notamment à un défaut de maturation des cellules transplantées. L’approche proposée ici vise à contourner cet obstacle à l’aide de cellules rendues photosensibles artificiellement par une approche d’optogénétique qui devrait permettre d’observer une récupération fonctionnelle beaucoup plus importante.
Procédures
Trois groupes d’animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste en l’injection intraoculaire (sous la rétine) de deux types de cellules différentes (2 groupes) en suspensions ou de solution tampon(1 groupe) ; cette opération dure 15 à 20 minutes. Cet opération n’est réalisée qu’une seule fois. Tous les animaux feront l’objet d’un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique) et d’un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permette l’étude de la fonction de ce tissu; ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes; l’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Ces examens seront réalisé une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps) Les animaux réaliseront également des tests comportementaux à l’état vigil sans contrainte particulière. ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants.
Impact sur les animaux
Très peu d’effets indésirables sont attendus pour ce projet. Les nuisances ou effets indésirables possibles de l’étape chirurgicale consistant en la transplantation cellulaire dans l’espace sous-rétinien sont une douleur oculaire et péri-oculaire dans une courte période post-opératoire. Les procédures post-opératoire (tests visuels, imagerie) n’ont pas d’effets indésirables avérés. Dans de rares cas, une inflammation anormale de l’œil peut être observée en post-opératoire.
Devenir
A la suite de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (intégration au tissus de l’hôte, etc…).
Remplacement
Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une récupération fonctionnelle visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d’animaux pour cette étude est de 295 réparti en trois groupes distincts. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30% (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Cet effectif a été déterminé à l’aide d’un calcul de puissance permettant une analyse statistiquement robuste et ainsi l’interprétation fiable des données obtenues.
Raffinement
L’alopécie précoce des animaux de phénotype « Nude » peut se traduire par une petite accumulation de poils sous la paupière, source d’irritation oculaire et potentielle source d’infection locale si elle n’est pas traitée. Les procédures prévoient une surveillance accrue de ces animaux et un nettoyage des yeux au sérum physiologique en cas de besoin. Les procédures utilisées comportent plusieurs tests comportementaux qui n’ont pas d’effets indésirables avérés ou documentés et ne génèrent pas de douleur avérée. Les actes, test ou examen (imagerie, ERG) qui nécessitent l’immobilité complète de l’animal sont réalisées sous anesthésie générale pour éviter tout stress de l’animal qui pourrait être provoqué par une contention stricte. le risque d’une légère irritation de la surface oculaire ne pouvant pas être totalement exclue, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant les 24h suivant les différents actes (réveil post-anesthésie, état de la surface oculaire après les électrorétinogrammes, signe d’inflammation, etc…). Le geste chirurgical, qui peut générer une nuisance ou douleur temporaire est géré en pré et post-opératoire par un traitement analgésique (Buprénorphine puis AINS longue durée (métacam). Les animaux sont élevés en cages de stabulation avec enrichissement pour toute la durée du protocole (bâton à ronger, lambeaux de papier kraft), nourriture et abreuvement à volonté. De manière plus spécifique, tout signe extérieur d’inflammation oculaire sera recherché (gonflement, paupière fermée, grattage) suite au geste chirurgical et examens d’imagerie ; les signes de comportement anormal signe de souffrance seront recherché (réaction violente à la manipulation ; vocalisation) Les points limites sont : Une perte de poids supérieure ou égale à 20% Apparence : Traces de blessures importantes ; tout signe d’inflammation ou d’infection de l’œil avec une fermeture prolongée de l’oeil ou augmentation du volume de l’oeil opéré (x2) ou abcès et écoulement ; l'observation d'un de ces points limites entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal par inhalation de CO2 et élongation cervicale.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études précliniques. Ce choix permettra une comparaison des résultats obtenus avec ceux de la littérature. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Nous utiliserons une lignée particulière, chez laquelle le système immunitaire est altéré, Ce modèle permet l’étude de xénogreffes (greffe entre donneur et hôte d'espèces différentes) sur le long-terme en réduisant drastiquement le rejet des cellules transplantées normalement provoqué par une forte réponse immunitaire (xénogreffe). Il permet également d’éviter les traitements anti-rejets potentiellement toxiques à long terme ; Les animaux sont inclus dans l’étude à l’âge de 3 mois, stade auquel la dégénérescence de la rétine est effective et l’ensemble des procédures s’étalera sur une durée de 6 mois (étude jusqu'à 6 mois post-transplantation) donc jusqu’à un âge maximal de 9 mois.
Évaluation de molécules à visée thérapeutique dans des modèles murins de neuropathie périphérique induite par une atteinte du nerf sciatique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 612
1 224 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit sous anesthésie une ligature, un écrasement ou une compression du nerf sciatique pour provoquer une douleur neuropathique, évaluée ensuite par la réponse à des stimuli mécaniques ou thermiques. Le porteur indique qu'aucun antidouleur n'est envisageable puisqu'il s'agit d'un modèle de douleur, et qu'un animal en douleur très importante sera tué immédiatement. Sur le remplacement, il juge le modèle animal "incontournable" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne prend en compte l'"organisme entier".
Objectifs
Les neuropathies périphériques sont des atteintes du système nerveux somatosensoriel dont les causes sont nombreuses. Les douleurs neuropathiques périphériques sont la conséquence d’une lésion du système nerveux périphérique et peuvent concerner un plexus (arrachement du plexus brachial), une racine (sciatique) ou une atteinte tronculaire (atteinte du médian, du péronier ou atteinte plus diffuse des nerfs périphériques). Elles sont caractérisées par des paresthésies (fourmillements, jambes sans repos), des engourdissements, des douleurs diffuses musculaires et névralgiques (déchirures, broiement), des sensations de brûlures causées par une hyperalgésie thermique (hyper-réactivité à des variations de température), souvent concomitante à une hypersensibilité aux stimuli mécaniques; ces douleurs sont ressenties aux extrémités des membres et sont extrêmement invalidantes. Des phénomènes de douleurs neuropathiques sont observées aujourd’hui chez 8 % de la population générale et constituent de ce fait un enjeu clinique important. Cependant, les traitements thérapeutiques actuels pour diminuer la douleur chez ces personnes sont insuffisants et peu efficaces sur la durée, du fait également des effets indésirables qu’ils génèrent. Il est donc nécessaire d’identifier de nouvelles thérapies pour prévenir et/ou traiter la neuropathie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet, si une molécule se révélait efficace, serait de mettre sur le marché une molécule permettant aux patients atteints de cette pathologie de réduire voire effacer l'inconfort associées à cette pathologie, ainsi que de retrouver une sensibilité aux niveaux des membres atteints.
Procédures
Les animaux subiront une anesthésie, ainsi qu'une chirurgie (ligature, écrasement ou compression du nerf sciatique). Cette chirurgie aura lieu une seule fois dans la vie de l'animal et durera environ 20minutes. La sensibilité et/ou la douleur sera évaluée suite à cette chirurgie soit par évaluation du temps de réponse à un stimuli mécanique et/ou thermique selon la thématique.
Impact sur les animaux
Les chirurgies effectuées pour induire les douleurs peuvent générer des douleurs chez l'animal en post-opératoire. L'utilisation d'anti-douleur n'est pas evisageable dans ce cas particulier puisqu'il s'agit de modèle de douleur. L'environnement sera fortement enrichit pour augmenter le confort de l'animal, sa surveillance sera quotidienne. Si une observation clinique permettait de révèlait une douleur très importante chez l'animal alors ce dernier sera mis à mort immédiatement.
Devenir
3 lots de 40 animaux issus des procédures 1, 2 et 3 seront inclus dans les procédures 4 et 5 pour imagerie puis seront mis à mort . Tous les autres animaux des autres procédures seront mis à mort.
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux de neuropathies périphériques est incontournable si nous voulons préciser les mécanismes sous-jacents à son développement lors de certaines maladies chroniques ou traitements thérapeutiques lourds. Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro ou mathématique capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de la maladie chronique. L’utilisation de modèles murins déjà établis dans la littérature et décris pour leur pertinence dans ce domaine de la recherche biomédicale est une étape nécessaire pour valider l’efficacité thérapeutique et la tolérance de nouvelles molécules ou thérapies candidates en clinique humaine.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d'expérience.
Raffinement
Les souris seront hébergés selon la directive 2010/63 avec un milieu enrichi (coton, igloos...). Des points limites ont également été définis et seront appliqués si l'état clinique des animaux le nécessite.
Choix des espèces
La souris et le rat se sont rapidement imposés au cours du temps comme des modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Dans le domaine particulier de la recherche fondamentale et appliquée sur la douleur et les pathologies associées, l’essentiel de la littérature est obtenue chez ces deux espèces pour diverses raisons (i) scientifiques, les mécanismes moléculaires et cellulaires décrits dans ces espèces sont retrouvés chez l’homme et (ii) pour un intérêt pratique (faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et très bonne adaptation aux conditions expérimentales) ; l’intérêt majeur étant en premier lieu, l’historique de la connaissance de ces animaux, chez lesquels l’essentiel des traitements utilisés en clinique humaine de la douleur aujourd’hui ont été évalués et validés. De jeunes adultes (6-10 semaines) seront utilisés dans ce projet, il s’agit de jeunes animaux qui sont généralement choisis dans les études de pharmacologie et qui répondent bien à l’expérimentation. Tous les animaux auront le même âge au début de chacune des études
Induction d’une anosmie à long terme chez le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
56 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit une injection de méthimazole pour détruire sa muqueuse olfactive et le rendre anosmique, puis passe un test de discrimination de deux odeurs sous restriction alimentaire, avant d'être tué pour analyse des tissus. Le porteur indique que la perte d'odorat peut perturber la prise alimentaire et le poids, suivis quotidiennement. L'objectif affiché est de valider ce modèle d'anosmie pour tester ensuite des implants olfactifs.
Objectifs
L'anosmie, ou perte complète de l’odorat, est une maladie qui affecte gravement la qualité de vie, étant donné l’importance de ce sens pour la prise alimentaire et les interactions sociales. L'anosmie est également liée à un risque accru de dépression et de décès, et peut handicaper les individus face aux dangers (nourriture avariée, fuite de gaz…). On estime que 5% de la population générale est anosmique. Par rapport à d'autres pertes sensorielles telles que la cécité ou la surdité, l'anosmie a attiré peu d'attention en partie parce qu'il s'agit d'une condition socialement « invisible ». La pandémie de COVID-19 a considérablement augmenté le nombre de personnes touchées par la perte d'odorat et a sensibilisé le grand public à ce sujet. Toutefois, il n'existe actuellement aucun traitement pour l'anosmie de longue durée, en dehors de l'entraînement olfactif, dont le bénéfice est significatif (surtout pour les anosmies causées par une infection virale) mais limité. L'implant olfactif représente une approche prometteuse pour traiter l'anosmie, toutefois il est nécessaire d'évaluer un tel dispositif sur des modèles animaux in vivo. Notre objectif est dans un premier temps d’induire une anosmie à long terme chez des rats afin de pouvoir par la suite tester des implants olfactifs qui seraient adaptables chez l'homme. L'anosmie sera induite pharmacologiquement par injection de méthimazole, composé connu pour produire une altération de la muqueuse olfactive. Nous avons choisi le rat, qui a un système olfactif dont l’organisation est proche de celle de l’Humain et qui permettra de tester l'efficacité d'un implant olfactif.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider un modèle d'anosmie induite chez le rat. Notre objectif est dans un premier temps d’induire une anosmie à long terme chez des rats afin de pouvoir par la suite tester des dispositifs de récupération olfactive.
Procédures
Les rats recevront une injection intra-peritoneale en début de protocole (1 injection/animal) qui doit altérer la muqueuse olfactive et diminuer significativement leur odorat. Afin de tester l'efficacité de cette méthode, les rats seront soumis à un test olfactif dans lequel ils doivent discriminer 2 odeurs. Pour cela, ils sont soumis à un test olfactif dans une cage dédiée à laquelle ils seront habitués au préalable. Deux odeurs sont présentées l'une récompensée par une boulette de sucre, l'autre non récompensée. Quand le rat sait quelle odeur prédit une récompense (son comportement l'indique) alors on considère qu'il discrimine bien les deux odeurs. Pour que le rat soit motivé à aller chercher sa récompense, on réduit sa nourriture. Cette réduction peut conduire à une perte de poids que l'on contrôle. La restriction dure environ 10 jours , le test olfactif 5 à 10 jours environ.
Impact sur les animaux
Le composé injecté peut présenter une toxicité qui devra être évaluée pré et post-mortem. L’anosmie chez le rat peut perturber la prise alimentaire, celle-ci ainsi que le poids des animaux devront être contrôlée quotidiennement suite au traitement.
Devenir
Analyse des tissus après euthanasie après 3 jours de traitement afin de voir si l'injection a bien conduit à une altération de la muqueuse olfactive: 12 rats traités / 12 rats véhicule maximum Analyse comportementale puis analyse histologique après euthanasie après 30 jours de traitement pour évaluer la durabilité du traitement: 16 rats traités / 16 rats véhicule maximum
Remplacement
Cette étude ne peut être remplacée par d’autre moyen, comme la culture cellulaire, car nous regardons le comportement de l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au minimum en optimisant au maximum les groupes expérimentaux. Pour une première approche histologique (3 jours), l'analyse est qualitative et un nombre d'animaux réduit sera utilisé. Cette procédure nous permettra de tester avec un nombre réduit d'animaux les éventuels effets indésirables et l'efficacité de notre traitement avant de décider si nous pouvons réaliser notre projet. Pour les test olfactifs, des tests statistiques montrent qu'une différence en fonction du traitement peut être observée avec un nombre d'animaux de 6 traités versus 6 controles. Nous prévoyons 2 groupes.
Raffinement
Tout sera mis en oeuvre afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux. Le bien-être animal est pour nous primordial vis-à-vis de l’animal mais aussi de nos expérimentations. Le stress modifie les capacités olfactives des animaux, ainsi les résultats de comportement ne peuvent être valable que si l’animal est bien portant. L’anosmie chez le rat peut perturber la prise alimentaire, celle-ci ainsi que le poids des animaux devront être contrôlée quotidiennement suite au traitement. Les tests olfactifs seront réalisés en condition de restriction alimentaire en s'assurant au préalable que l'état des animaux le permet. L’eau est disponible à volonté. Des points limites spécifique d’évaluation de la douleur à chaque procédure sera mise en place. Nous proposerons un autre type de nourriture si nous notons une dénutrition (gel nutritif ou nourriture enrichie en graisse et en sucre). Si l'animal présente une forte baisse du poids >15% malgré un régime adapté il est sera euthanasié s'il n'y a pas d'amélioration de son état. Une quantité de nourriture, mesurée par rapport au poids de l'animal, est donnée chaque jour aux animaux à heure fixe. Si l'animal présente une forte baisse du poids >15% il est remis sur un régime à volonté et le test est arrêté jusqu'à récupération. S’il y a l’apparition d’un mal être sévère (poil hérissé, catatonie, trouble du comportement...) et/ou une perte de poids de l’animal supérieure à 15% sans reprise malgré des soins particuliers (surveillance, nourriture en gel, réchauffement le cas échéant) au bout de 3-4 jours, l’animal sera euthanasié. Si une douleur est visible, elle sera soulagée par un analgésique, si la douleur persiste plus de 2 jours, l'animal sera euthanasié. Les cages sont agrémentées d’un nid végétal et d'objets pour le confort de l'animal.
Choix des espèces
Les rats ont de très bonnes capacités olfactives, ils peuvent apprendre facilement les odeurs. Le système olfactif est très conservé avec l'évolution, et les rats ont un système olfactif très similaire à celui de l'homme et sont de bons modèles pour tester l'implant olfactif sur lequel nous allons travailler. Les animaux sont utilisés à l'age adulte pour ne pas intérférer avec le développement.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris, modèle de la maladie d'Alzheimer, subit sous anesthésie une injection de molécules directement dans le cerveau après incision du crâne et pose d'agrafes, puis des prélèvements sanguins, avant d'être tuée pour découper le cerveau en tranches. Le porteur indique que ces lignées développent plaques, déficits de mémoire, troubles moteurs et mort prématurée dès l'âge de six mois. Sur le remplacement, il affirme que les cultures cellulaires ne conviennent pas et que l'étude des réseaux neuronaux exige un "organisme entier".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie qui, en entrainant la mort des neurones du cerveau, altère la mémoire. L'objectif de ce projet est de permettre une meilleure compréhension des modifications de l’activité des neurones associés à la MA et d’évaluer l’efficacité / toxicité de molécules en développement sur ces modifications. Pour cela, nous utiliserons différents modèles de souris qui miment la maladie. Ce projet de 5 ans comporte 1 procédure qui consiste à administrer directement au niveau du cerveau, sur animal préalablement anesthésié et analgésié, des molécules en développement afin d’évaluer leur action contre les symptômes de la MA.
Bénéfices attendus
Ce projet scientifique associé à notre plateforme d’enregistrement de l’activité des neurones sur des coupes de cerveau permettra de mettre en évidence les modifications de l’activité des neurones associés à des modèles de la MA et de tester les effets protecteurs de molécules en développement sur les modifications du réseau de neurones impliqués dans la MA. Ce projet permettra ainsi d'approfondir les connaissances actuels sur les déficits neuronaux liés à la MA et ainsi de permettre le développement de nouvelles molécules chez l'Homme afin de traiter ces déficits.
Procédures
Procédure chirurgicale: -Administration d’anti inflammatoire (par exemple, Type Carprofene, 10 mg/Kg SC) ou de morphinique (Type Buprénorphine, Buprecare, 0,03 mg/kg; SC) 30 minutes avant l’anesthésie. (maximum 5 minutes) -Anesthésie de la souris par inhalation (induction : 4-5% isoflurane sous 1 litre d'air et maintien 0.5-1.5% d’isoflurane sous 1 litre d'air) (maximum 5 minutes) -Application d’un gel ophtalmique (type Ocrygel) dès que l’animal est endormi afin d’éviter le dessèchement de la cornée. (maximum 2 minutes) -Injection d’un analgésique local en sous-cutané au niveau de la zone à inciser (maximum 2 minutes) -Placement de la souris profondément endormie dans le cadre stéréotaxique dont les barres d’oreilles ont été enduites d’un analgésique local (maximum 5 minutes). -Vérification du niveau d’anesthésie de l’animal en permanence en observant son rythme respiratoire et en testant le réflexe du retrait (maximum 2 minutes) -Incision de la peau (envion1.5 cm) au-dessus du crâne et nettoyage/désinfection de l’épicrâne (Type Vétédine) (maximum10 minutes). -Fermeture de la plaie à l’aide d’agrafes (maximum 5 minutes) Lors de l’expérimentation, des prélèvements sanguins pourront être effectués 1 fois par semaine maximum sur animal vigile ou anesthésié selon les méthodes réglementaires (au maximum 5 minutes).
Impact sur les animaux
Le premier modèle de souris utilisé pour ce projet présente une accumulation spontanée et progressive d’un peptide dans le cerveau, formant des plaques. Jusqu'à l'âge de 8-9 mois, les plaques ne sont pas observées au niveau du cerveau. Au cours de cette période "pré-plaque" de la maladie, un déficit de mémoire a été mis en évidence dans ce modèle. A l'âge de 11-12 mois les plaques commencent à apparaitre dans le cerveau. Les 2 autres modèles de souris utilisés pour ce projet sont caractérisés par une modification progressive de la composition d’une protéine présente dans le cerveau dès l'âge de 3 mois, entraînant des déficits de mémoire. Ces souris développent progressivement des problèmes de locomotion, une perte de poids, et un décès prématuré dès l'âge de 6 mois. Suite à l’administration des molécules en développement dans le cerveau, les animaux peuvent présenter des signes de douleur malgré les précautions prises pendant la phase de chirurgie (analgésiques, anesthésiques) et en post-opératoire (anti-douleurs et antibiotiques si besoin). Dans ce cas, les points limites préalablement définis permettront d’assurer un suivi de l’état général des animaux et de mettre en place des interventions précoces.
Devenir
Les animaux inclus dans une procédure expérimentale seront tous mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrales sur ces coupes.
Remplacement
L'organisation des réseaux neuronaux peut être étudiée sur des coupes cérébrales de rongeurs par électrophysiologie. Ces expériences ne peuvent pas être reproduites, ni étudiées dans des modèles de cultures cellulaires in vitro. Une meilleure compréhension des pathologies du système nerveux central nécessite donc l’étude des réseaux neuronaux sur un organisme entier. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect éthique de la règle des 3 R.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des test statistiques. Nous adapterons les tests statistiques en fonction des observations.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (nids végétaux, copeaux de bois à grignoter, contact visuel et olfactif entre les animaux, commutation progressive de la lumière et interactions fréquentes avec les humains…). Avant la chirurgie, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Pendant la chirurgie, des mesures seront mises en place afin de réduire au maximum la douleur : anesthésiques (en pré-opératoire) et analgésiques (en pré- et post-opératoire), gel ophtalmique, maintien d'une température constante (tapis chauffant)...Si besoin, les animaux recevront une antibiothérapie adaptée. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé après la phase d’opération pendant 3 jours. Une période de récupération post-chirurgicale d’au moins 10 jours sera respectée. Dès réception des animaux, une observation journalière sera mise en place. Des points limites préalablement définis et adaptés permettront d’assurer un suivi de l’état général des animaux (souffrance, angoisse…) et de préserver leur bien-être. En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérite de la douleur observée. L'atteinte d'un point limite entraînera la mise en place d'interventions précoces et adaptées et des procédures de modifications de soins pourront être mises en oeuvre en cas de besoin comme détaillé dans la fiche de suivi et dans la procédure expérimentale. Les animaux exprimant des signes permanents de douleur seront exclus de l’étude et mis à mort immédiatement, sur décision du directeur de l'étude et/ou du vétérinaire désigné
Choix des espèces
Nos expérimentations sont réalisées chez la souris, petit rongeur dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour une large communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Pour l'étude des déficits de la maladie d'Alzheimer, la souris représente un modèle de choix pertinent car il existe des modèles transgéniques, bien décrits dans la littérature et couramment utilisés pour tester l'effet de composés en développement sur le fonctionnement cérébral. Les animaux seront utilisés de l'âge de 4 semaines à 40 semaines afin de couvrir tous les âges, du jeune à l'adulte et tous les stades de la pathologie.
Identification et caractérisation de biomarqueurs en imagerie dans les modèles rongeurs de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit dans le cerveau des injections de toxines qui détruisent des voies nerveuses pour reproduire la maladie de Parkinson, certains recevant en plus une canule intracérébrale, puis subit des tests comportementaux incluant une restriction alimentaire et un choc électrique de 0,7 mA. Le porteur indique que les lésions provoquent un déficit moteur ou cognitif et une perte de poids chez les animaux les plus atteints, et que tous seront tués après les évaluations d'imagerie. L'objectif est d'identifier des marqueurs en IRM, les retombées cliniques restant renvoyées au conditionnel.
Objectifs
La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par les classiques signes moteurs permettant le diagnostic mais également par des troubles cognitifs et comportementaux, plus variables dans leur apparition et leur expression, mais ayant un impact considérable sur l’autonomie et la qualité de vie des patients ainsi que sur les décisions thérapeutiques. Pourtant, leur prise en charge reste limitée et requiert une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, notamment via l’identification de biomarqueurs. Les biomarqueurs sont des indicateurs des processus pathogènes et sont des outils précieux tant pour faciliter le diagnostic précoce, que pour suivre l’évolution de la pathologie ou l’efficacité d’un traitement. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ses explorations anatomiques et fonctionnelles, combinée à des méthodes spécifiques d’analyse a récemment permis de mettre en évidence des marqueurs de certains des troubles observés en pratique clinique. Cependant son utilisation reste encore marginale notamment pour le diagnostic, et le lien entre ces marqueurs d’imagerie et l’histologie reste à établir. Cette corrélation est indispensable tant à la compréhension des mécanismes sous-jacents qu’à la validation de ces marqueurs en tant que Biomarqueurs de la pathologie. L’utilisation de modèles animaux est le moyen le plus adapté pour mener ce type d’études. Cependant, ils ne miment que partiellement la pathologie humaine et chaque modèle présentent des avantages et des limites. Il convient donc de valider les résultats obtenus sur plusieurs modèles complémentaires pouvant représenter les différents aspects physiopathologiques de la maladie. Le présent projet vise d’abord à étudier plusieurs de ces modèles afin de reproduire les différents troubles moteurs et non moteurs associés à la pathologie (Caractérisation comportementale). Les objectifs seront ensuite d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Enfin, en fonction des résultats de cette première partie (et des résultats in vitro fait en parallèle), certains de ces modèles seront reproduits afin de tester l’effet de stratégies thérapeutiques (Administration intra-cérébrale ou périphérique). Un modèle de démence induite par une déplétion cholinergique centrale sera aussi utilisé comme contrôle positif de déclin cognitif sévère afin de contrôler l’efficacité de ces stratégies.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM ou TEP) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Ces biomarqueurs pourraient être validés et utilisés en clinique pour aider au diagnostic de certains troubles, le suivi non invasif de l'évolution de la pathologie et/ou de l'effet des traitements. L'étude des mécanismes sous jacents permettra l'idenitfication de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dont l'efficacité sera testée.
Procédures
Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales visant à injecter des toxines pour induire des lésions cérébrales (30 minutes). Certains d'entre eux subiront à nouveau une procédure chirurgicale pour l'implantation d'une canule d'administation cérébrale (30 minutes). Certains animaux subiront des injections sous-cutanées ou intra-péritonéales (Maximum 2/jours pendant 4 semaines). Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux dont certains nécessitent une restriction alimentaire avec rationnement, ou la délivrance d'un choc electrique (0,7 mA - 2 sec, 1 seule fois)
Impact sur les animaux
Les toxines injectées induisent une dégénérescence des voies cérébrales dopaninergiques et/ou cholinergiques, un déficit du contrôle moteur et/ou cognitif est donc attendu et étudié dans ce projet. Une perte de poids corporel peut aussi être observée chez certains animaux plus sévérement lésés. L'anesthésie subie lors de la chirurgie ou de l'imagerie en IRM pourrait être mal tolérée par certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. La restriction alimentaire associée au touchscreen pourrait être mal tolérée par certains animaux. La pose de canule intracérébrale et les injections de traitments pourraient être mal tolérées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin des évaluations en imagerie in vivo ou après l'evaluation des effets thérapeutiques sur ces variables
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux pour étudier la physiopathologie de troubles cognitifs et comportementaux. Cependant pour limiter l’utilisation d’animaux, l'étude de la potentielle toxicité, des mécanismes d'action et l’efficacité des molécules thérapeutiques testées seront étudiés en parallèle sur un modèle cellulaire (Remplacement).
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé au minimum sur la base d'un test de puissance. L'analyse statistiques des données débutera par une étude de la normalité et de l'homogénéité des variances. Selon la distribution des valeurs, des tests paramétriques (ANOVA puis Test de Fisher pour la compariason 2 à 2) ou non paramètriques (Kruskal-Wallis et Wil-Coxon test pour la comparaison 2 à 2) seront utilisés. Les mêmes animaux seront réutilisés pour l'analyse comportementale et l'imagerie cérébrale à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux seront réutilisés pour différentes évaluations (Comportement et Imagerie) à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem.
Raffinement
Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises (Raffinement).
Choix des espèces
Parmi les petits rongeurs, le rat est l’espèce la mieux adaptée pour l’évaluation des troubles cognitifs et psycho-comportementaux. Par ailleurs, les modèles expérimentaux choisis ont été décrits chez le rat. Les rats utilisés auront 8-10 semaines. Cet âge a été choisi en raison de la référence utilisé pour l’ATLAS cérébral de rat et la précision de localisation des repères stéréotaxiques pour les injections cérébrales.
Evaluation de médicaments bloquant spécifiquement un récepteur des messagers chimiques activant les neurones en tant qu’antiépileptique au cours du développement chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
224 ratons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Âgés de 10 à 15 jours, ils reçoivent par chirurgie une électrode sur le crâne, puis une injection déclenche des crises épileptiques avec convulsions tonico-cloniques ou des spasmes, pour tester trois médicaments contre l'épilepsie du nourrisson. Le porteur affirme que la perte de conscience pendant les crises limite la souffrance et que les spasmes ne seraient pas douloureux, chaque raton étant tué après l'enregistrement pour des prélèvements. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle cellulaire ni numérique ne reproduit le tissu cérébral en développement.
Objectifs
Le terme épilepsie recouvre un groupe de pathologies neurologiques se caractérisant par des crises épileptiques (convulsions et perte de conscience principalement) spontanées et récurrentes. Elles sont dues à une activité électrique anormale du cerveau. On estime à environ 70 millions le nombre de patients atteints dans le monde. Il s’agit aussi de l’atteinte neurologique chronique la plus fréquente chez le nourrisson et l’enfant. On estime que plus de la moitié des formes d’épilepsies infantiles sont résistantes aux traitements médicamenteux. Enfin, plus de 50% des enfants ayant déclaré une épilepsie avant l’âge de 1 an présenteront des troubles de la mémoire ou de l'apprentissage, responsable de déficiences intellectuelles perceptibles à l’âge adulte et ce même si l’épilepsie est traitée par des médicaments. Le développement de nouvelles voies de traitement adaptées aux nourrissons est donc nécessaire. Au cours de la première année de vie, le cerveau est plus à risque de générer des crises d’épilepsies. En effet, la communication entre les cellules nerveuses est très active et peu contrôlée. Cela est dû à l’un des récepteurs aux messagers chimiques activant les neurones, dont une forme très active est très présente au début de la vie. Cette forme active de récepteur pourrait être impliquée dans le risque important d’apparition de crises d’épilepsie chez les nourrissons. En effet, elle est notamment retrouvée en grande quantité dans le cerveau de ratons après induction de crises épileptiques expérimentales. De plus, des premières études avec des médicaments ciblant ce récepteur en particulier ont montré une bonne efficacité malgré des effets secondaires, dans des modèles d’épilepsie expérimentales chez le raton. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de 3 médicaments ciblant spécifiquement la forme plus active de ce récepteur dans deux modèles d’épilepsies infantiles dont un modèle de spasmes qui est le syndrome le plus fréquent.
Bénéfices attendus
Il est important de noter qu'il existe actuellement très peu de médicaments anti-épileptiques utilisés chez les nourrissons, de par le faible nombre d'études visant à mettre sur le marché des médicaments pour ces derniers. De plus, les médicaments disponibles ont été mis sur le marché il y a longtemps, reflétant des exigences réglementaires anciennes. Il y a donc un besoin crucial en de nouveaux médicaments adaptés aux nourrissons. Ce projet s'inscrit dans cette dynamique et il a pour but de valider l’utilisation de médicaments ciblant spécifiquement la forme plus active d’un récepteur aux messager chimiques activant les neurones, présents en grande quantité chez le nourrisson, comme traitement de l'épilepsie infantile, et notamment du syndrome de spasmes spécifiques au nourrisson.
Procédures
Des ratons âgés de 10 jours de vie et de 15 jours de vie seront utilisés dans ce projet qui comporte deux expériences, chacune en 3 parties. Chaque raton ne participera qu’à une seule des deux expériences. L'expérience 1 comportera : 1) la pose d'une électrode électroencéphalographique (EEG) par chirurgie sur le crane de l'animal anesthésié, durée de 30 à 45 minutes; 2) le traitement de l'animal vigile par un des 3 médicaments testés ou du sérum physiologique, 24h après la chirurgie, par une unique injection dans le ventre, durée d'environ 5 min; 3) l'induction d'une crise épileptique séquentielle chez l'animal vigile, 1h après le traitement, par une injection unique dans le ventre d'une molécule induisant des convulsions. Les manifestations de cette crise seront enregistrées pendant 1h : comportement de l’animal (contractions musculaires et convulsiosn) par vidéo et activité électrique du cerveau via l’électrode EEG. (implantée 1 jour avant). L'expérience 2 comportera les deux mêmes premières parties que l’expérience 1 (pose l'électrode EEG et traitement). La troisième partie consistera en l'induction de spasmes épileptiques chez l'animal vigile, 1h après le traitement, par une injection unique dans le ventre d'une molécule excitatrice des neurones. Les manifestations des spasmes seront suivies comme pour l’expérience 1 mais pendant 1h30 : comportement enregistré en vidéo et activité électrique du cerveau enregistré par l’électrode EEG.
Impact sur les animaux
Les nuisances qui peuvent apparaitre chez l’animal impliqué dans ce projet sont les mêmes pour les deux expériences. Ainsi, la pose de l'électrode EEG chez l'animal anesthésié par chirurgie pourrait provoquer l'apparition de douleurs ou d'infection cutanée en post-opératoire. Ce sont cependant deux éléments extrêmement rares. Nous utiliserons deux modèles d'épilepsie induites qui peuvent chacun être la responsable de l’apparition de stress ou de douleurs. Dans le modèle de crise épileptique séquentielle (expérience 1), l'animal expérimentera des secousses musculaires involontaires et brèves (myoclonies) puis le raidissement et la contraction de l'ensemble de ses muscles (crise tonico-clonique). Cependant ces manifestations comportementales sont associées à une perte de conscience qui limite grandement l'apparition de souffrance chez l'animal. En ce qui concerne le second modèle d'épilepsie, modèle de spasmes épileptiques, l'animal expérimentera des mouvements de replis et/ou de contractions de ses membres et des contractions des autres muscles. Ces manifestations pourraient être à l'origine d'un stress mais ne seront pas douloureuses car elles sont beaucoup moins intenses que celles du premier modèle.
Devenir
Le devenir de tous les ratons est le même qu'ils aient été utilisés dans le modèle de crises épileptiques séquentielles ou de spasmes épileptiques. A l'issu de l'enregistrement des manifestations comportementales et des signaux EEG (1h ou 1h30 selon le modèle d’épilepsie) induite dans les deux modèles d’épilepsie expérimentale, le raton est euthanasié afin de réaliser des prélèvements biologiques, nécessaire pour évaluer l'effet du traitement médicamenteux.
Remplacement
Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel de médicaments agissant sur une forme très active d'un récepteur aux messagers chimiques activant les cellules nerveuses dans le cerveau. Cette forme est présente de façon abondante au début du développement et diminue par la suite. Il est donc nécessaire d'évaluer l'effet des médicaments à deux âges différents chez l'animal (10 et 15 jours de vie), correspondant à une expression différente de ce récepteur. De plus, l'évaluation de l'effet des médicaments doit se faire avec des paramètres qui sont le plus proche de ceux utilisés lors du traitement des malades. Il faut donc évaluer l'effet sur les manifestations comportementales classiques des crises épileptiques séquentielles et des spasmes épileptiques ainsi que sur le tissu cérébral après l'induction de ces deux types d'épilepsies. Or, il n'existe pas à leur heure actuelle de modèle reposant sur la culture cellulaire ou de modèles numériques qui modélisent de façon complète et fiable le tissu cérébral en développement, ni qui permettrait d'obtenir le type de données évoquées ci-avant. Cela justifie donc l'approche d'expérimentation animale que nous proposons.
Réduction
Le principe de réduction a été pris en compte pour définir le nombre d'animaux à utiliser dans ce projet. Ainsi, nous avons prévu de réaliser nos deux expériences avec dans un premier temps des groupes de 7 ratons par âge (un groupe de ratons âgés de 10 jour et un autre âgés de 15 jours) et par traitement (1 groupe par médicament évalué et 1 groupe avec du sérum physiologique comme contrôle) pour un total de 8 groupes, soit 56 ratons pour chaque modèle d'épilepsie donc 112 ratons au total. Une fois les données obtenues pour l'ensemble de ces animaux, nous évaluerons l'efficacité de chaque médicament au moyen de tests statistiques. Si les résultats semblent concluants ou qu'ils pourraient le devenir en augmentant le nombre d'animaux étudiés, nous réaliserons une seconde série d'expériences avec de nouveaux des groupes de 7 ratons. L'évaluation statistique intermédiaire se fera pour chaque traitement de façon indépendante afin de poursuivre les expériences que pour les médicaments prometteurs et ainsi réduire au mieux le nombre d'animaux impliqués dans ce projet de recherche. Ainsi, le nombre maximum d’animaux pouvant être impliqué dans le projet sera de 224 ratons.
Raffinement
Le bien-être de l'animal et son maintien ont été pris en compte lors de la conception de ce projet. Ainsi, nous suivons l'animal tout au long de sa vie et de son inclusion dans notre projet de recherche au moyen d'une grille de scores permettant de quantifier l’apparition de stress, inconfort ou douleur. Ce suivi permet de mettre en place, si besoin, une prise en charge de la douleur par exemple si elle apparait après à la pose de l'électrode EEG par chirurgie. De plus, nous avons prévu d'utiliser tous les ratons d'une même portée ce qui permet de conserver des conditions d'hébergement "naturel" et de ne pas induire de stress. Ainsi une mère et ses petits sont hébergés dans une cage contenant litière, eau et croquette à disposition. Du papier est mis à disposition de la mère afin qu'elle bâtisse un nid ainsi qu'un tunnel en plastique pouvant aussi lui servir de nid. Ce tunnel est fait d'un plastique transparent rouge que l'animal considère opaque mais qui permet son observation et le suivi des animaux.
Choix des espèces
Le modèle de crise épileptique séquentielle et celui des spasmes épileptiques infantiles sont deux modèles reconnus dans la littérature scientifique, couramment utilisé dans les études précliniques évaluant des médicaments contre l'épilepsie. Ces deux modèles sont décrits dans la littérature scientifique chez le rat, rongeur plus grand que la souris donc plus facile à manipuler et plus résistant aux effets néfastes des modèles. De plus, il n’existe pas à l’heure actuelle de modèles reposant sur la culture cellulaire ou de modèles numériques qui permettraient d’évaluer de façon fidèle l’effet de molécules bloquant spécifiquement la forme active d’un récepteur aux messagers chimiques activant les cellules nerveuses et ce à différents moments du développement cérébral. Ainsi, le rat est l’animal le plus pertinent dans ce projet expérimental. L’objectif de ce projet de recherche est d'évaluer le potentiel de médicaments ciblant la forme la plus active d'un récepteur aux messagers chimiques activant les cellules nerveuses comme anti-épileptique pour le nourrisson. Pour cela, il faut évaluer l'effet de ces médicaments au cours du développement du cerveau puisque l'expression de la forme active du récepteur diminue avec celui-ci. Nous allons donc utiliser des ratons âgés de 10 jours et des ratons âgés de 15 jours qui présentent une forte et une faible expression respectivement de la forme active du récepteur que nous ciblons avec les médicaments. De plus, les deux âges étudiés correspondent à deux étapes du développement du cerveau chez l'Homme, à savoir le nourrisson et le bébé d'environ 1 an, ce qui nous permettra de comparer l'efficacité des médicaments au cours du développement.
Mécanismes neurobiologiques et rôle des acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la prévention des altérations cognitives et émotionnelles suite à un stress chronique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
3 092 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'une heure, un protocole de défaite sociale où chacune est mise cinq minutes par jour pendant dix jours au contact d'un agresseur pouvant la blesser, et un test de peur conditionnée, pour étudier l'effet des oméga-3 sur les suites d'un stress chronique. Le porteur reconnaît que la défaite sociale et la chirurgie peuvent nuire aux animaux, ensuite tués pour prélever des structures cérébrales. Sur le remplacement, il affirme que l'étude des régimes alimentaires et des comportements exige des animaux vivants et vigiles.
Objectifs
Le rôle des oméga-3 sur le fonctionnement cérébral et la santé mentale est étudié depuis presque 10 ans. Le laboratoire a notamment démontré qu’une carence en oméga-3 exacerbe les comportements de type anxieux et dépressif chez l’animal, tandis qu’une supplémentation en oméga-3 les diminue. Ces études précliniques sont en accord avec les données chez l’homme, des essais cliniques montrant qu’une supplémentation en oméga-3 améliorerait certains symptômes dépressifs. Ainsi, une supplémentation en oméga-3 peut constituer une alternative intéressante dans la prévention des troubles de l’humeur, mais les mécanismes qui sous-tendent les effets positifs des oméga-3 dans les troubles de l’humeur restent encore très mal connus. Notre laboratoire a récemment ouvert une nouvelle hypothèse, en démontrant que les apports en oméga-3 avaient un impact direct sur la plasticité synaptique ainsi que l'arborisation dendritique. La plasticité synaptique regroupe les phénomènes qui confèrent au cerveau sa capacité de s’adapter à l’environnement, par des modifications de la connectivité entre les neurones, au niveau des synapses. Les différentes formes de plasticités synaptiques sont indispensables aux mécanismes d’apprentissage et d’évolution. De plus en plus d’études suggèrent que les troubles de l’humeur sont associés à des dysfonctionnements dans les processus de plasticité synaptique et ces dysfonctionnements pourraient être à l’origine des symptômes neuropsychiatriques des troubles de l’humeur. Les oméga-3 sont des modulateurs importants des fonctions synaptiques, car, faisant partie des éléments structurels des membranes plasmiques, ils modulent la dynamique membranaire ainsi que la fonctionnalité et le trafic des protéines transmembranaires présentes à la synapse.
Bénéfices attendus
L’objectif de notre projet est désormais d’aller plus loin dans la compréhension des mécanismes neurobiologiques par lesquels les oméga-3 contenus dans l’alimentation permettent de protéger les animaux. L’objectif à long terme de ce projet est de transférer les connaissances acquises chez le rongeur à l’homme pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et nutritionnelles. Ces données pré-cliniques nous permettrons de comprendre un peu plus en quoi la nutrition influence les fonctions cognitives et la physiologie de la transmission synaptique. De plus, des applications thérapeutiques peuvent être envisagées, en particulier pour déterminer si une thérapie nutritionnelle peut atténuer les pathologies liées au stress chronique, comme par exemple les troubles de stress post-traumatiques. De façon similaire, des stratégies préventives, liées à une nutrition adaptée et équilibrée en lipides, pourraient être envisagées afin de limiter, réduire ou même d'endiguer l'apparition de troubles dépressifs et/ou anxieux.
Procédures
1 - procédures chirurgicales - durant 1h d'opération / 2 - protocole de défaite sociale - 5 minutes pendant 10 jours / 3 - test de peur conditionnée - 5 minutes par jour pendant 3 jours.
Impact sur les animaux
Le protocole de défaite sociale ainsi que les interventions chirurgicales sont susceptibles d'induire des nuisances sur les animaux. Au cours de la défaite sociale, les 5 minutes en contact avec l'agresseurs représentent un délai conséquent pouvant être source de blessures. L'attention des expérimentateurs est tout particulièrement maximale à ce moment là, et en cas d'attaques trop fortes mettant en danger la vie de la souris, les animaux sont séparés. Au cours de la chirurgie tous les moyens sont mis en oeuvre pour respecter les conditions d'aseptie mais le risque d'infection n'est pas négligeable, justifiant un suivi post-opératoire strict. Le test de peur conditionné est une source de stress pour les animaux, une attention particulière est apportée au animaux avant, pendant et après l'expérience. Le reste des procédures ne représente pas de nuisances pour les animaux. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.
Remplacement
L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence nutritionnelle en omega-3 sur la physiologie neuronale et microgliale chez la souris pendant le développement. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien.
Raffinement
Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille et peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Les expériences de comportement et d’électrophysiologie sont facilement mises en œuvre d’un point de vue technique sur les souris. La souche de souris utilisée (C57/Bl6J) constitue un modèle d’étude particulièrement intéressant et informatif dans le cadre de la défaite sociale notamment car c’est la souche communément utilisée pour les protocoles de défaite sociale, et de ce fait les résultats de ce projet seront donc plus faciles à intégrer dans la littérature déjà existante. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui peut s’avérer nécessaire pour la poursuite à long terme de notre projet. Les souris C57Bl6/j arriveront dans notre animalerie à l’âge de 3 semaines, juste après le sevrage. Les régimes alimentaires démarreront après 3-7 jours d'acclimatation et se poursuivront pendant 8 semaines jusqu'aux expériences de comportement. Les souris CD1 seront d’anciens mâles reproducteurs et arriveront donc à l’âge adulte. Les souris issues de la reproduction intramuros seront sevrées à l'âge de P21. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Les expériences de comportement démarreront sur des animaux âgés de 12 semaines afin de voir les effets à long terme des différentes expériences.