Système nerveux
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Etude chez la souris des effets neurophysiologiques d’une maladie causée par une mutation d’un canal calcique (EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
438 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 81 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modélisant une maladie cérébelleuse infantile, elles subissent des chirurgies stéréotaxiques et des implantations d'électrodes crâniennes pour enregistrer l'activité cérébrale, et présentent ataxie et crises d'épilepsie. Le porteur indique que la chirurgie d'électrodes peut induire une douleur modérée et évoque l'attente des patients et cliniciens. Il justifie le recours à la souris par l'impossibilité de reproduire in vitro ou in silico les réseaux de neurones du cervelet.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact physiopathologique d’une mutation gain de fonction d’un canal calcique décrite dans une maladie cérébelleuse infantile. Seules les études in vivo et ex vivo peuvent permettre de déterminer l’impact de cette mutation sur le(s) dysfonctionnement(s) neurologique(s) observé chez les patients atteints de cette maladie. Pour ce projet, nous utiliserons un modèle murin chez lequel l'expression de la mutation causale pourra être induite. Il s’agit du premier modèle animal de cette maladie et l’attente des patients et cliniciens est considérable, d’une part pour mieux comprendre cette pathologie, et d’autre part pour évaluer les traitements possibles.
Bénéfices attendus
Identifier les mécanismes pathogéniques dans l'atrophie cérébelleuse infantile. Préciser le rôle du canal calcique dans le développement du cerveau, du cervelet en particulier. Valider le modèle murin en tant que modèle préclinique de la maladie permettant d'évaluer des pistes thérapeutiques dans l'atrophie cérébelleuse infantile.
Procédures
Pour ce projet, 294 animaux seront évalués pour leurs capacités motrices et cognitives dans des tests standards. 70 animaux subiront une injection i.v. d'adénovirus codant pour la cre recombinase par chirurgie « stéréotaxique » pour induire l'expression du canal calcique mutant dans le cerveau et le cervelet. Les autres animaux évalués dans cette 'procédure comportementale' sont issus de croisements permettant une expression conditionnelle de la mutation du canal. Ces différents tests, potentiellement générateurs de stress, se dérouleront sur une période d'environ 1 mois. 81 animaux subiront une chirurgie pour l'implantation crânienne d'électrodes pour l'enregistrement d’électroencéphalogramme (EEG). Sur ces animaux, l'EEG sera enregistré sur une période d'environ 1 mois, à raison d'une séance de 6 heures par semaine. 63 animaux participeront à une étude longitudinale des paramètres anatomofonctionnels par échographie photoacoustique du cerveau et du cervelet. Les mesures seront réalisées lors de courtes séances (15 min) d'acquisition sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Pour des animaux porteurs de la mutation, on peut s'attendre à des défauts neurologiques précoces qui vont résulter en une atrophie cérébelleuse et des troubles fonctionnels cérébelleux de type ataxie, ainsi que des crises épileptiques de type généralisée (absence). Nos procédures expérimentales pourront conduire à des effets indésirables. (i) les études comportementales du suivi locomoteur de l'ataxie pourront résulter en un stress des animaux lié à la préhension manuelle et la découverte de l'environnement expérimental que nous atténuerons par une habituation de ces animaux aux dites procédures. (ii) le suivi par échographie/photoacoustique à haute résolution des éventuelles dysmorphies cérébrales et cérébelleuses est une approche non invasive et non douloureuse. Comme en (i), le stress subi par les animaux se limite à la préhension par l'expérimentateur pour une courte période (15 min/animal). (iii) Le suivi du phénotype épileptique par enregistrement électroencéphalographique (EEG) peut induire une douleur modérée puisqu'il implique une chirurgie pour la pose d'électrodes intracraniennes.
Devenir
L'ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau et le cervelet, seront prélevés pour des analyses immunohistologiques.
Remplacement
Le développement et la caractérisation d'un modèle souris est incontournable pour l'analyse physio/pathophysiologique de l'ataxie cérébelleuse. Son utilisation sera toutefois strictement limitée aux expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d'organes) ne pouvant être réalisées sur les modèles in vitro et in silico de la pathologie. Les conséquences fonctionnelles de cette mutation sur l'activité du canal calcique seront étudiées dans des expériences d'électrophysiologie sur lignées cellulaires et des approches in silico seront développées pour modéliser les conséquences de cette mutation sur l'excitabilité neuronale. Ces stratégies in vitro et in silico permettent de comprendre l'impact du canal muté à l'échelle cellulaire mais pas à l'échelle de l'organe entier, à savoir le cerveau, puisque les réseaux de neurones mis en place lors du neurodéveloppement ne peuvent pas être obtenus en culture ni par modélisation informatique. Quant aux études phénotypiques, par exemple les conséquences motrices d'anomalies du cervelet, elles nécessitent encore aujourd'hui de réaliser des expériences sur l'animal vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 438) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement relevant. Nous avons défini une stratégie de croisement que nous espérons la plus optimale possible. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire. Nous réaliserons dans la mesure du possible l'expérimentation comportementale (in vivo), et les analyses anatomique, tissulaire, cellulaire, sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis.
Raffinement
Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué quotidiennement. Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille de score pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésique et pour les scores les plus important, la mise à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal le mieux adapté pour i) modéliser de manière inductible la maladie neurologique étudiée et ii) développer l'ensemble des investigations anatomomorphologiques et fonctionnelles des atteintes cérébelleuses associées à la pathologie. La possibilité de contrôler l'expression de la mutation par la recombinase Cre (lignées de souris driver, injection de virus codant pour la recombinase Cre) est également un atout majeur justifiant l'intérêt de modéliser cette pathologie dans l'espèce souris. Les connaissances actuelles sur ce modèle permettent de répondre au mieux à la règle des 3 R. Utilisation de jeunes adultes et d'adultes pour étudier les conséquences neurodéveloppementales de l'expression de la mutation d'intérêt, en particulier les conséquences sur le développement et la physiologie du cervelet.
Rôle de l’innervation cutanée dans le développement des neurofibromes dans la neurofibromatose de type 1
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
234 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 174 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris génétiquement modifiées développant des neurofibromes cutanés, elles reçoivent des injections intradermiques répétées de vecteurs viraux et des dénervations chimiques de la peau, sous anesthésies générales répétées. Le porteur affirme n'attendre aucun effet nuisible et décrit des tumeurs superficielles de taille limitée. Il indique qu'à sa connaissance aucun autre modèle animal ni système in vitro ne reproduit le développement de ces neurofibromes.
Objectifs
La NF1 est une maladie génétique qui affecte 1 sur 3000 naissances. Le gène responsable de cette maladie est nommé Nf1. C’est un gène suppresseur de tumeur qui ne fonctionne plus en raison d’une mutation. Il commande la fabrication d’une protéine : la neurofibromine. En l’absence de cette protéine (lorsque le gène Nf1 est muté), des tumeurs le plus souvent bégnines se développent. Tous les patients NF1, hommes et femmes, développent des neurofibromes cutanés (NFc), des tumeurs bégnines qui se développent au niveau des terminaisons nerveuses dans la peau. Les NFc, apparaissent généralement à partir de la puberté et leur nombre et taille ne cesse d’augmenter avec l’âge, de sorte que les patients peuvent en développer des milliers. Les mécanismes qui gouvernent le développement des NFc restent mal connus. Le rôle de l'innervation dans leur développement n’a jamais été exploré et constitue une nouvelle piste mécanistique et thérapeutique. Enfin, une meilleure compréhension des mécanismes d'interaction entre les nerfs et leur microenvironnement immunitaire dans la peau permettra de mieux comprendre la pathophysiologie d'autres atteintes cutanées comme le psoriasis et la dermatite atopique. Le but de ce projet est d’explorer l’hypothèse selon laquelle l’innervation cutanée contrôle le développement des NFc. Pour cela nous utiliseront le modèle murin de NF1 (NF1-KO) qui développe des NFc avec pour objectif de proposer des nouveaux traitements ciblant l’innervation des NFc.
Bénéfices attendus
Les mécanismes qui gouvernent le développement de NFc restent mal connus. Le rôle de l'innervation dans leur développement n'a jamais été exploré et constitue une nouvelle piste mécanistique et thérapeutique. Enfin, une meilleure compréhension des mécanismes d'intéraction entre les nerfs et leur microenvironement immunitaire dans la peau permettra de mieux comprendre la pathophysiologie d'autres atteintes cutanés comme le psoriasis et la dermatite atopique.
Procédures
Procédures 2, 3, 4 et 5 (3, 4 et 5, selon le mode d’injection choisi lors de la procédure 2) : Dépôt local des vecteurs viraux pour tracer l'innervation et pour éliminer les neurones qui innervent les neurofibromes, durée de l’intervention : 30 min pour le dépôt + 45 min d’absorption de l’adénovirus par souris (total de 1h15 par souris), 6 dépôts par souris, sous anesthésie générale. Procédures 2, 3, 4 et 5 (3, 4 et 5, selon le mode d’injection choisi lors de la procédure 2) : Injection intradermique locale des vecteurs viraux pour tracer l'innervation et pour éliminer les neurones qui innervent les neurofibromes, durée de l’intervention : 30 min d’injection par souris, 6 injections par souris, 6 x 2 (12) injections par souris (6 au jour 1 et 6 au jour 2), sous anesthésie générale. Procédure 4 : Dénervation cutanée locale des neurones sensoriels d'origine pharmacologique, utilisée pour étudier l'innervation sensorielle de peau sans pour autant induire de phénomènes douloureux, durée de l’intervention : 30 min d’injection par souris, 6 x 2 (12) injections intradermiques par souris (6 au jour 1 et 6 au jour 2), sous anesthésie générale. Procédure 5 : Dénervation cutanée globale des neurones sympathiques d'origine pharmacologique, utilisée pour étudier l'innervation sympathique de peau sans pour autant d'induire des phénomènes douloureux, durée de l’intervention : 20 min d’injection par souris, 1 x 3 (3) injections intrapéritonéales par souris (1 au jour 1, 1 au jour 2 et 1 au jour 3), sous anesthésie générale. Procédures 2, 3, 4 et 5 : Suivi du développement des NFc sous la lampe à épifluorescence : 20 min pour raser, épiler et prendre une photo du dos de la souris, 2 fois par semaine pendant la durée du suivi, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Aucun effet nusible ou indésirable n'est attendu en prenant en compte des travaux similaires récemment publiés. De plus, les NFc développés par les souris de notre modèle d'étude sont des tumeurs qui restent superficielles et se développent en région dorsale à partir de 2 mois et jusqu’à 6 mois. Elles sont plates et peuvent atteindre un diamètre de quelques millimètres mais leur épaisseur demeure très fine (de l’ordre de 1 mm maximum), ce qui les rends non détectables à l’œil nu sans utilisation d’une loupe à épifluorescence. Leur volume est donc négligeable par rapport à celui de la souris. Leur nombre peut être d’une quinzaine par souris.
Devenir
A la fin de chaque expérience tous les animaux seront mis à mort par injection létale de Dolethal, puis la peau disséquée et analysée.
Remplacement
Pour le Remplacement ; à notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des NFc et permettant d’étudier leur innervation.
Réduction
Pour la Réduction ; cette étude, de par sa nouveauté, nécessite des mises au point. Nous estimons que 20 souris adultes seront nécessaire pour la procédure expérimentale 2 ce qui permettra, par la suite, de réduire le nombre total d’animaux inclus dans ce projet. Ce nombre de 20 souris a été defini afin de mettre au point le mode d’injection (injection intradermique : ID ou transcutanée : T), le temps de diffusion (2 ou 3 semaines) et le type de virus utilisé (virus sans tropisme : ST ou avec tropisme axonal : TA). Nous possédons déjà une grande expertise d’analyse cellulaire et moléculaire des NFc et de manipulation des nerfs périphériques (microdissections, injections des vecteurs d’expression et des colorants). Pour la procédure expérimentale 4, 12 souris seront nécessaires pour effectuer les mises au point, ce nombre plus faible que pour la partie précédente est lié au fait que la technique utilisée d'ablation des nerfs sensoriels à l'aide de la résinifératoxine est un modèle efficace et bien documenté dans la littérature. De la même facon et pour les mêmes raisons, 12 souris seront nécessaires pour effectuer les mises au point de la procédure expérimentale 5. Nous estimons la reproductibilité des résultats avec les techniques des procédures expérimentales 4 et 5 à 80% donc nous attendons un groupe de 9-10 animaux pour etre analysé.
Raffinement
Pour le Raffinement ; nous considérons qu’une fois les mises au point validés, les variations liées à l’expérimentateur et la méthodologie seront faibles (+/- 5%) ce qui conduira a une reproductibilité des resultats d'environ 95% . Nous surveillerons régulièrement l’état de santé des animaux afin de déceler tout signe de souffrance avérée et si tel est le cas nous effectuerons une mise à mort compassionnelle. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés dans des cages contenant du coton ainsi que des maisons et rouleaux en carton. Contrairement aux patients NF1, les souris de notre modèle d'étude NF1-KO développent des NFc dont la taille est limitée (les tumeurs ne sont pas visibles à l’œil nu sans utilisation d’une loupe à épifluorescence) n’entrainant donc pas de phénotype dommageable. Au cours de l’anesthésie générale, pour éviter l’hypothermie, les souris seront maintenues sur un tapis chauffant. Leurs yeux seront également enduits d’un onguent ophtalmique dès la perte de conscience afin de prévenir un dessèchement de la cornée. A la suite de chaque procédure impliquant une anesthésie générale, les souris endormies seront gardées seules dans une cage propre séparée jusqu’à leur réveil.
Choix des espèces
Nous avons récemment concu le modèle de souris génétiquement modifiées qui récapitule fidèlement le développement des NFc (NF1-KO) et qui sera utilisé dans ce projet. A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, permettant d’étudier les NFc et leur innervation Animaux adultes agés entre 2-6 mois. Le developpement des NFc a lieu pendant cette période.
Etude des altérations du développement du cortex cérébral dans un modèle de prématurité chez la souris (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une chirurgie d'électroporation in utero de 30 minutes, puis la moitié des portées est placée huit jours dans un air appauvri en oxygène pour modéliser la grande prématurité. Le porteur signale une mortalité fœtale pouvant atteindre 10 % et des déficits cognitifs possibles chez les souriceaux. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de reconstituer in vitro les connexions nerveuses entre régions du cerveau.
Objectifs
Contexte de l’étude : La grande prématurité résulte fréquemment en des périodes de manque d'oxygène (appelées périodes d'hypoxie) du fait notamment de l’immaturité des poumons, et aboutit donc à des perturbations profondes de la capacité du cerveau à utiliser et produire de l'énergie (on parle de capacité métabolique), et à des lésions diffuses du cerveau. Bien que le cerveau du nouveau-né présente une capacité à se réparer supérieure à celle du cerveau adulte, des études récentes suggèrent que cette réparation pourrait être imparfaite ou même inadaptée. Ainsi, la probabilité d’apparition de troubles cognitifs est très fortement augmentée à l'adolescence, chez les enfants grands prématurés par rapport à ceux nés à terme, possiblement du fait de la mise en place de réseaux neuronaux anormaux. Objectif du projet : Cette étude a pour but de tester comment les perturbations survenant autour de la naissance et notamment de périodes de manque d'oxygène à la naissance, entraînent une perturbation durable de l’activité métabolique cérébrale, et notamment de l’activité des mitochondries, qui sont les organelles responsables de l’essentiel de la production d’énergie cellulaire. Ces perturbations métaboliques entraîneraient à long terme des anomalies du développement des réseaux neuronaux qui peuvent expliquer la survenue plus tard dans la vie de troubles neurologiques variés. Ce projet utilisera un modèle murin de naissance très prématurée (manque d'oxygène chronique à la naissance), combiné à une méthode chirurgicale permettant d’exprimer des protéines fluorescentes dans des populations ciblées de neurones du cortex cérébral chez la souris. Il permettra de répondre en même temps à deux questions : - Quelles sont les conséquences d'un manque d'oxygène chronique à la naissance sur le développement à long terme du cerveau - Est-ce que ces défauts sont associés à un défaut métabolique persistant dans ces neurones.
Bénéfices attendus
Ce projet a une double finalité, à la fois fondamentale et translationnelle (préclinique) : - Sur un plan translationnel, ce projet permettra de mieux prédire les conséquences à long terme de lésions cérébrales survenant tôt dans la vie (pendant la période périnatale). Les données issues de ce projet permettront également de comprendre quels sont les mécanismes qui font que la réparation cérébrale n’est pas totalement efficace, ce qui pourra conduire à l’identification d’indicateurs biologiques ou de pistes thérapeutiques ultérieures. - Sur un plan fondamental, ce projet pourra fournir des hypothèses de recherche et des pistes de mécanismes cellulaires pour les chercheurs travaillant sur l’étude du développement cérébral.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie péri/post-opératoire, appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes Après la naissance, la moitié des animaux (femelles et portée) seront soumis pendant 8 jours à un environnement appauvri en oxygène Les prélèvements seront réalisés postmortem pour l’étude du cerveau par histologie. La mise à mort sera réalisée par une éthode dérogatoire seule à même de préserver les tissus cérébraux.
Impact sur les animaux
Pour les femelles : La procédure permettant l'expression de marqueurs fluorescents dans les neurones et mitochondries, implique une approche chirurgicale invasive avec réveil. Dans de rares cas, nous pouvons observer une difficulté de mise bas. Les infections sont en théorie possibles, mais en pratique jamais observées suite au respect des règles d’asepsie. Pour les souriceaux : Une mortalité fœtale (estimée à 10 pour cent maximum des embryons sur lesquels la procédure est effectuée est constatée, bien qu’il soit difficile de déterminer si la résorption fétale résulte de l’élimination spontanée de fétus surnuméraires pendant la gestation, ou d’une mortalité liée à la procédure chirurgicale. La procédure n’a pas de conséquence sur le développement du souriceau. Une réduction périnatale de l'oxygène ambiant (hypoxie) entraîne un retard de croissance et des lésions cérébrales diffuses. Après la période de réduction de l'oxygène ambiant, les souriceaux rattrapent leur retard de croissance et les lésions cérébrales apparaissent réparées au niveau macroscopique. Des altérations à long terme de la connectivité cérébrale résultant de l’hypoxie périnatale peuvent en théorie entraîner des déficits cognitifs (défauts d’apprentissage, d’activité spontanée et de comportements sociaux) qui peuvent être détectés lors de tests de comportement mais sont généralement impossibles à détecter dans l’observation de comportements spontanés de souris élevées en cage.
Devenir
Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique. Une réutilisation des femelles n'ayant pas subi de procédure chirurgicale sera envisagée, notamment comme souris allaitante pour les expériences suivantes. Une utilisation des souriceaux surnuméraires sera envisagée, notamment pour la collecte de tissus. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements post mortem.
Remplacement
Les hypothèses de travail ont été au préalable validées dans des modèles in vitro et justifient à présent de confirmer par une approche in vivo, incontournable pour ce projet de recherche. En effet, les séquelles neurologiques observées suite à une oxygénation insufisante, dépendent de mécanismes complexes (interactions cellulaires, rôle de la réponse immunitaire, inflammation tissulaire) impossibles à reproduire in vitro d’où la nécessité d’un modèle animal pour étudier la pathologie. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de reconstituer totalement la complexité des connections nerveuses entre régions du cerveau, qui est l’objet de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base de notre expérience préalable. Certains animaux devront être exclus de l’analyse à postériori pour des raisons techniques (mauvaise qualité du marquage des neurones et des mitochondries qu'ils contiennent ou de préparation histologique). Les animaux seront traités deux à deux (deux femelles, soit deux portées, en parallèle : groupe expérimental et groupe témoin) et les portées seront analysés au fur et à mesure afin d’atteindre au plus vite le nombre d’animaux cible de l’étude, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement. De plus l’étude est prévue sur 4 âges correspondant à 4 stades de développement distincts, mais nous commencerons par les âges J11 et J45 qui correspondent aux effets les plus forts attendus dans notre étude. Dans le cas où les résultats à ces âges invalideraient notre hypothèse (étude négative), nous arrêterions l’étude sans procéder à l’étude des autres âges. L’analyse des projections nerveuses sera réalisée sur des cohortes d’animaux des deux sexes, par un test statistique de type ANOVA à plusieurs facteurs. Cette analyse permettra de déterminer la part de la condition expérimentale (normoxie/hypoxie), du sexe, de l’environnement, et leur interaction, sur le phénotype observé. Nous tirerons par conséquent un maximum d’information des animaux inclus dans l’étude. La méthode d’échantillonnage utilisée permet non seulement un échantillonnage homogène de notre région d’intérêt, mais aussi l’utilisation des mêmes cerveaux pour des marquages immunohistochimiques variés, permettant de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Enfin, un système de préservation de toutes les séries de coupes non utilisées a été mis en place pour optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance, au moyen notamment d’un enrichissement varié stimulant la nidation. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort des animaux. Les femelles seront échangées tous les 2 jours entre les cages normoxiques et hypoxiques, afin de préserver la quantité et la qualité du lait qu’elles produisent pour nourrir leurs souriceaux, et de minimiser au maximum le stress conséquent à la procédure sur les animaux. Une méthode d’imagerie et d’analyse innovante sera utilisée pour tirer encore plus d’information par animal, en permettant d’observer les projections axonales dans l’ensemble des régions du cortex.
Choix des espèces
L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales ainsi que dans le développement et le fonctionnement du cortex cérébral. Par ailleurs, les méthodes ont été établies dans cette espèce ce qui nous assure que le projet est faisable et permettra de répondre à la problématique scientifique. Les femelles gestantes seront des adultes entre 8 et 24 semaines, selon la disponibilité des animaux chez le fournisseur agréé. Les souriceaux seront utilisés aux âges suivants afin d'étudier les effets d'une réduction de l'oxygène ambiant à des étapes clés de la mise en place des réseaux de neurones du cerveau: - J(our après la naissance) 11, correspondant à la fin de la période de réduction de l'oxygène ambiant. - J21, correspondant à l’âge ou les connections nerveuses sont établies, mais où elles sont encore immatures - J45, correspondant à un âge où les connections nerveuses maturent. Cet âge est également pertinent car il correspond à la maturité sexuelle chez les souris (adolescence/jeune adulte), qui est un âge auquel plusieurs maladies neuropsychiatriques sont détectées (par exemple schizophrénie) - J90-J120, correspondant à un stade adulte et qui est également le stade où nous observons des déficits comportementaux.
Evaluation des effets d’un traitement pharmacologique dans un modèle murin de troubles neurodégénératifs
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 128 léger. Souris transgéniques modélisant la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent des injections intrapéritonéales pendant un à dix jours puis passent une batterie de tests comportementaux évaluant anxiété, mémoire et interactions sociales. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable de la molécule, déjà commercialisée chez l'humain. Le descriptif des bénéfices et du remplacement reste bref, l'essentiel de la justification portant sur la fidélité du modèle murin aux symptômes humains.
Objectifs
Ce projet a le but d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement pharmacologique dans un modèle murin de troubles neurodégénératifs, la maladie d'Alzheimer. Cette molécule est un activateur des canaux pour le potassium et n’a pas d’effets nocifs importants à la dose utilisée dans le projet. L’objectif final du projet est d’identifier une nouvelle approche thérapeutique pour la maladie d'Alzheimer avec une molecule déjà existante.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de voir l’efficacité thérapeutique d’une molécule pour un nouveau potentiel traitement de la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales pendant une période de courte durée (1 ou 10 jours) et ensuite leurs comportements seront analysés pour déterminer leurs altérations comportementales. Les animaux sont soumis à une batterie de test comportementaux afin d’évaluer l’effet du traitement sur l’anxiété, la mémoire, les interactions sociales et la réponse sensorielle pour une durée totale de 5 jours.
Impact sur les animaux
Cette molécule est déjà sur le marché chez l’homme pour des pathologies musculaires. En outre, aucun effet indésirable n’est attendu sur les animaux suite au traitement de 10 jours avec cette molécule. Des travaux précédents ont montrés aucune perte de poids, ni altération comportemental suggérant une altération du bien-être animal. Au contraire, des données préliminaires chez un autre modèle murine ont montré une récupération de certains troubles comportementaux suite à un traitement aigu ou chronique avec la même molécule.
Devenir
Les animaux passés en tests de comportement seront sacrifiés par inhalation de CO2. Les expériences de comportements pouvant induire des modifications cérébrales et donc interférer avec les paramètres à mesurer, seuls les animaux non testés seront sacrifiés et leur cerveaux prélevés pour des études de tissus.
Remplacement
Notre projet doit impérativement être réalisé chez un modèle murin pour permettre l’évaluation des effets thérapeutiques du traitement proposé. Le but de ce projet est l’évaluation des altérations comportementales des souris génétiquement modifiées étant donné que celles-ci représentent les symptômes à traiter de cette pathologie.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé par des études pilotes précédentes avec des souris d’une autre lignée génétiquement altérés. Ces études ont démontré que n=12 est nécessaire pour obtenir une différence significative entre souris transgéniques et leur congénères WT dans la plupart des tests comportementaux et n=8 pour les principales altérations cérébrales. Cette différence significative est la base pour évaluer les effets thérapeutiques de la molécule dans le modèle murin et doit donc être utilisé pour ce projet.
Raffinement
Pour limiter au maximum le stress des animaux, ceux-ci sont habitués à l’expérimentateur (le même pendant toute la durée de l’expérience) et aux différents dispositifs utilisés. Les substances injectées n’ont à ce jour pas montré d’effet néfaste sur l’état général des animaux. Néanmoins, pour chaque expérimentation, les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler d’éventuels comportements pouvant traduire une souffrance de l’animal. Parmi ces critères : perte de poids, agressivité vis-à-vis des congénères, automutilation, diminution de l’activité des animaux en cage d’hébergement, respiration anormale (une description détaillant les points limites est fournie dans la grille de score attachée). Dans la mesure où l’animal présenterait une de ces caractéristiques, il sera isolé de ses congénères, la procedure sera arrêté et l’évolution du poids, du pelage et de la mobilité dans la cage sera surveillée. S’il ne récupère pas des paramètres normaux, le vétérinaire sera contacté afin de s’assurer qu’il ne s’agit pas d’un problème plus grave de nature infectieuse par exemple. Il sera alors exclu de l’étude et des analyses statistiques. Si jugé nécessaire sur la base de l’évaluation des points limites, l’animal en souffrance sera sacrifié par dislocation cervicale et sa mort vérifié par l’absence de respiration et de reflexes principaux. Concernant l’hébergement, les animaux sont maintenus dans des cages collectives de 3 à 10 individus (leur taille varie en fonction du nombre) avec comme enrichissement des carrés de coton (Nestlets) pour permettre la construction du nid. Chaque personne manipulant les animaux possède la formation à l’expérimentation animale (concepteur ou opérateur) et suit régulièrement la formation continue en expérimentation animale. En plus, tout le nouveau personnel reçoit un entrainement supplémentaire dans la manipulation des animaux par la responsable de l’animalerie avant d’être admis à participer au déroulement pratique du projet de recherche.
Choix des espèces
Des souris transgeniques et leurs congénères de type sauvage seront utilisés dans ce projet. Les mutations concernent les gènes codant pour le précurseur de l’amyloïde et la preseniline. Ces mutations sont nécessaires pour induire de façon precoce les principales caractéristiques (plaques amyloïdes) de la maladie d’Alzheimer. Les souris transgeniques ne présentent pas d’altérations développementales majeures par rapport à leurs congénères de type sauvage. Ce modèle nous permet d’avoir des souris présentant des déficits comparables avec les symptômes chez l’humain de façon constante évitant toute manipulation supplémentaire des animaux. Les animaux vont être utilisés à un stade adulte (entre 3 et 4 mois). L’utilisation de l’âge adulte nous permettra de vérifier la puissance du potentiel thérapeutique de notre traitement pharmacologique en vérifiant ses effets à un âge où l’apparition des plaques amyloïdes commence à s’agglutiner chez les souris transgéniques.
Etude in vivo des propriétés analgésiques d’une nouvelle classe de ligands du récepteur 5-HT7 de la sérotonine
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de formaline et d'adjuvant de Freund dans la patte pour provoquer une inflammation douloureuse, puis subissent des tests de douleur, immersion de la queue dans l'eau à 50 °C et stimulation des coussinets au filament de Von Frey. Le porteur indique que ces tests ne provoquent pas de lésion et justifie le recours à l'animal par la nécessité d'un "organisme entier" pour étudier le circuit de la douleur. Les bénéfices annoncés, un antidouleur sans effets secondaires, restent formulés comme un objectif de développement.
Objectifs
L’objectif du projet est de valider l’efficacité, l’innocuité et les avantages thérapeutiques de nouvelles petites molécules qui ciblent un récepteur de la sérotonine, le récepteur 5-HT7. La sérotonine, également appelé 5-hydroxytryptamine, est un neuromodulateur impliqué dans de nombreux processus cognitifs tel que l’apprentissage et la mémoire, mais également dans la régulation de comportements comme l’humeur, l’anxiété, l’appétit et la thermorégulation. Le récepteur 5-HT7 de la sérotonine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) exprimé par plusieurs organes et particulièrement dans le système nerveux central et le système nerveux périphérique (ganglions de la racine dorsal, moelle épinière, cerveau). Par sa localisation, il est impliqué dans de nombreuses pathologies neurodégénératives et neuro-inflammatoires, ainsi que dans le circuit de la douleur. Les ligands actuels ciblant le récepteur 5-HT7 possèdent des limitations en termes de sélectivité et de biodisponibilité. C’est pourquoi, nous avons initié un programme de synthèse de nouvelles molécules. Des études pharmacologiques in vitro montrent que ces molécules sont plus sélectives et très affines pour le récepteur 5-HT7. L’objectif est maintenant d’évaluer leur efficacité pour le traitement de la douleur dans des modèles précliniques. Il existe des traitements de la douleur, basés sur l’utilisation d’antidépresseurs, antiépileptiques, ou bien sur l’utilisation de molécules plus fortes, tels que les opioïdes et les dérivés morphiniques. Cependant, seul 50% des patients répondent à ces traitements et la plupart du temps, les traitements qui soulagent les douleurs induisent des effets secondaires indésirables. Ainsi, notre objectif est de poursuivre le développement de nos molécules qui ciblent spécifiquement le récepteur 5-HT7 de la sérotonine, afin de développer un candidat médicament pouvant être utiliser dans le traitement de la douleur sans induire d’effet secondaires indésirables. Ce projet nécessite l'utilisation de l'animal afin de considérer un organisme entier et de confronter nos ligands à la complexité des mécanismes neurologiques mis en jeu dans la réponse de douleur. Les protocoles cellulaires, utilisés au préalable, ne sont pas assez complexes et représentatifs des interactions entre cellules cérébrales et périphériques ainsi que des chemins neuronaux impliqués dans le circuit de la douleur.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal attendu du projet est le développement de molécules thérapeutiques, visant le récepteur 5-HT7 de la sérotonine, décrit dans l’item 5.5.1, pour le traitement de la douleur sans induction d’effets secondaires indésirables. Le développement pharmacologique de nos candidats médicaments pourrait non seulement avoir un impact sur la santé et le bien-être des patients mais également avoir un impact économique considérable puisque les douleurs sont la cause de la plupart des arrêts maladies.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Une administration unique des ligands et composés par injection sous-cutanée dans la nuque des animaux - Une administration unique de Formalin (formaldéhyde) en sous cutanée sur le dessus de la patte arrière - Une administration unique d’adjuvant de Freund (CFA, émulsion d’huile minérale et de mycobactérie inactivées par chauffage) au niveau des coussinets plantaires - Prélèvement de sang par ponction intracardiaque Les tests comportementaux de classe modérée réalisés sur les animaux seront les suivants : -Test « tail immersion » : pour évaluer la sensibilité de l’animal à la température par une réponse spinale, le test d’immersion de la queue sera réalisé. La partie inférieure de la queue de la souris sera immergée dans un bain-marie dans lequel la température de l’eau est stable et maintenue à 50°C. L’expérimentateur relèvera le temps nécessaire à la souris pour relever la queue. A la fin de l’expérience, d’une durée maximale de 20 secondes pour éviter tout risque de brûlure, la queue sera soigneusement séchée. A la suite du test d'immersion de la queue, chaque animal est observé individuellement selon la grille d'évaluation critère n°3 (3.4.13). Nous avons constaté que le temps de 20 secondes à 50°C ne génère pas de lésion. Compte tenu de la classe modérée de cette procédure, les animaux seront observés selon la grille d'évaluation (3.4.13) pour une durée de 3 jours suivant le test. -Test de Von Frey : Avant la procédure, les animaux sont habitués aux boîtes tests posées sur une grille métallique permettant de visualiser facilement le dessous des pattes. La méchanoréception basale est évaluée. Des tiges plastiques calibrées (eg. Von Frey Hair) de diamètres croissants, sont appliquées sur les coussinets du rongeur en exerçant des pressions croissantes (0.007g à 2g). La pression exercée avec ces tiges ne peut en aucun cas provoquer une lésion de la zone testée. Le temps de réaction du retrait de la patte est observé, reflétant ainsi la sensibilité tactile du rongeur. Cette procédure sera reproduite 24 heures après l’induction d’une inflammation locale des coussinets suite à une injection plantaire sous-cutanée avec l’adjuvant complet de Freund (10µl). Lors de cette procédure, le test de « Von Frey Hair » sera réalisé 3 fois sur une durée de 4 jours.
Impact sur les animaux
Les procédures mises en œuvres seront de classes modérées. Notre stratégie est thérapeutique et a pour but de tester les propriétés anti-nociceptive de ligands du récepteur 5-HT7. Ainsi, aucun effet indésirable n’est prévu sur les animaux lors de l’administration des composés. Si des signes de souffrances apparaissent au-delà des tests (>2h), un score sera établi afin de définir la marche à suivre. L’administration de Formalin, induit une inflammation au niveau du site d’injection. L’adjuvant complet de Freund (CFA, émulsion d’huile minérale et de mycobactéries inactivées par chauffage) est un mélange classiquement utilisé en immunologie afin de déclencher une réponse inflammatoire non spécifique et durable (>5 jours). Son injection au niveau des coussinets plantaires induit localement un œdème et une sensibilité tactile accrue dans la zone affectée. Cette hypersensibilité est mesurée grâce au système « Von Frey Hair » permettant de vérifier la sensibilité tactile de type méchanoréception. Les prélèvements de sang par ponction intracardiaque sont réalisés sous anesthésie gazeuse d’isoflurane et entraînent le décès de l’animal. Les prélèvements d’organes sont ensuite réalisés.
Devenir
Afin de pouvoir récolter des échantillons (sang et organes) pour analyser l'effet des différents ligands , les animaux seront mis à mort par inhalation de CO2 à l'issue de chaque procédures.
Remplacement
L’objectif du projet, évaluer l’effet analgésique de différents ligands du récepteur 5-HT7, nécessite l'utilisation de l'animal afin de considérer un organisme entier et de confronter nos ligands à la complexité des mécanimses neurologiques mis en jeu dans la réponse de douleur. Les protocoles cellulaires, utilisés au préalable, ne sont pas assez complexes et représentatifs des interactions entre cellules cérébrales, entre cellules cérébrales et périphériques ainsi que des chemins neuronaux impliqués dans les mécanismes de douleur et d'anti-douleur.
Réduction
Les approches comportementales nécessitent une cohortes de 10 animaux minimun par groupe. Cette étude se focalisera sur 5 ligands à tester. Chaque expérience sera réalisée deux fois indépendamment afin d'assurer la validité statistique des résultats. cependant, si une molécule s'avère inefficace ou toxique elle sera abandonnée.
Raffinement
Les animaux seront suivis tout au long des procédures. En effet, l'aspect général extérieur de l'animal (posture, pelage, démarche, faciès, yeux) sera observ et associé au suivit des critères évalués par la grille de score adaptée aux procédures. Si des animaux présentent des signes de souffrance (point limite: score=2 pour un critère de la grille, ils seront mis à mort en accord avec le responsable du bien être animal de ce projet. Dans le cas où 2 animaux minimum sont mis à mort et font parti du même groupe experimental (même traitement), alors ce groupe entier sera retiré de la procédure en cours.
Choix des espèces
La souris de fond génétique C57BL/6 est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies du système nerveux central. L’existence de nombreuses lignées transgéniques sur fond C57BL/6 et la disposition d’outils moléculaires spécifiques (eg. anticorps spécifiques, sondes moléculaires …) ont apporté ces dernières années une meilleure compréhension des neuropathologies et ont conduit aux développements de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous souhaiterions par la suite approfondir notre étude en utilisant des souris inactivées pour le gène du récepteur 5-HT7 (5-HT7 KO) également sur fond C57BL/6, afin de déterminer la spécificité du rôle des ligands et discriminer l’implication des autres récepteurs de la sérotonine dans les résultats observés. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (8 à 14 semaines) afin de garantir un système nerveux central mature et un comportement adulte stable.
Etude de la communication entre le cervelet et le cortex cérébral chez la souris: implications pour la schizophrénie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des chirurgies cérébrales pour pose d'électrodes, une restriction hydrique d'un mois et des tests comportementaux, dont certains ne sont pas précisés, sur un modèle de schizophrénie. Le porteur signale des crises d'épilepsie possibles sous stress et une perte de poids liée à la restriction en eau. Il affirme que l'étude d'un circuit cérébral intact rend la souris nécessaire.
Objectifs
Ce projet a pour but de disséquer le fonctionnement et de comprendre les altérations de la communication entre deux régions du cerveau dont les dysfonctions ont été identifiées dans les symptômes associés à la schizophrénie chez l'homme. Ces études seront réalisées sur un modèle murin de schizophrénie et des souris contrôles. Ainsi nous allons identifier les réseaux neuronaux impliqués dans cette voie et les étudier dans des tâches comportementales adaptées à l'étude de la schizophrénie. Nous chercherons ainsi à identifier des stimulations cérébrales via le cervelet capables de compenser les altérations observées chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre les interactions entre le cervelet et le cortex préfrontal chez la souris dans le contexte de l'étude d'un trouble neurodévelopmental, la schizophrénie. Les voies anatomiques impliquées dans le traitement temporel (intervalle de temps) chez la souris sont les mêmes que chez l'homme et cette propriété est particulièrement affectée chez les patients schizophrènes. En plus du progrès des connaissances dans la communication cérébello-corticale, nous testerons des protocoles de stimulation cérébrales (via le cervelet) capables de compenser les déficits de notre modèle murin de schizophrénie. L'objectif ultime du projet est d'utiliser ces résultats pour raffiner les protocoles cliniques de stimulation magnétique transranienne (rTMS) en collaboration avec des cliniciens.
Procédures
Un groupe d'animaux subira trois tests comportementaux sur une durée de une semaine. Ils auront subit une incision abdominale. Un second groupe subira un test comportemental pendant un mois nécessitant une restriction hydrique (alimentation en eau une fois par jour). Un troisième groupe subira une intervention chirurgicale d'une durée de 1 heure sous anesthésie et analgésie profonde. Un quatrième groupe subira une intervention chirurgicale d'une durée de 2 heures sous anesthésie et analgésie profonde, puis le même test comportemental que le second groupe. Ce groupe recevra une injection intra-abdominale journalière durant 8 jours. Un cinquième groupe subira une intervention chirurgicale d'une durée de 2 heures sous anesthésie et analgésie profonde, puis le même test comportemental que le second groupe. Ce groupe recevra des stimulations lumineuses pendant la tâche comportentale au niveau d'une aire cérébrale pendant 8 jours.
Impact sur les animaux
- Les animaux transgéniques peuvent présenter dans des conditions de stress intense un phénotype dommageable de type crises d'épilepsie. Une attention toute particulière sera donc portée sur l'environnement de test. - Une perte de poids consécutifs à la restriction hydrique lors de la tâche de prédiction temporelle pourrait survenir. - Des saignements consécutifs à la chirurgie réalisée pour l'insertion des éléctrodes d'enregistrement pourraient survenir. - Des effets positifs liés à l'utilisaiton d'antipsychotiques
Devenir
Dans les procédures conduisant à des enregistrements ou des anayses neuroanatomiques, les animaux sont mis à mort afin de réaliser des analyses tissulaires et histologiques.
Remplacement
Ces expériences ont pour but de comprendre comment le traitement de l'information dans les différentes zones du cervelet conduit à la régulation de la coordination motrice via la communication avec le cortex cérébral. Ainsi, le système biologique doit être intact pour pouvoir être étudié. L'utilisation de l'électrophysiologie in vivo sur la souris est nécessaire dans notre cas car l'étude doit s'effectuer sur un circuit intact pouvant impliquer des aires corticales situées à une grande distance (système impossible à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire par exemple)
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et assurer que les résultats seront statistiquement fiables. Nous avons défini une stratégie de croisement que nous espérons la plus optimale possible. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et produire des résultats spécifiques de genre. Nous réaliserons dans la mesure du possible l'expérimentation comportementale (in vivo), et les analyses anatomique, tissulaire, cellulaire, sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis. La validation du modèle SynII Ko pour l'étude de certains symptômes de schizophrénie chez la souris conditionnera la poursuite du projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leur besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans les cages pour favoriser la nidation et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué quotidiennement. Des points limites spécifiques ont été définis pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésique.
Choix des espèces
De nombreux travaux ont démontré que les souris, notamment adultse, étaient un modèle d’étude valide pour les maladies neuro-développementales. Lorsque des modèles pharmacologiques ou génétiques existent, les mêmes structures cérébrales sont impliquées et certains symptômes sont comparables. Par exemple, des études ont été réalisées à la fois chez des patients schizophrènes et des rongeurs chez lesquels la voie de la dopamine est altérée. Ces animaux reproduisent des symptômes de la schizophrénie (altération dans les tests d’interactions sociale ou de détection d’intervalles temporels) et les mêmes altérations dans les enregistrements cérébraux ont été observés chez l'homme et l'animal. De plus, des stimulations du cervelet, une aire cérébrale, ont permis de compenser une partie des déficits dans les deux espèces.
Evaluation de nouveaux composés pharmacologiques ciblant les hétéromères opioïdes mu-delta pour soulager les douleurs neuropathiques (établissement 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2432 souris vont être utilisées, dont 848 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie subit une lésion partielle du nerf sciatique qui provoque une douleur neuropathique irréversible, avant des injections quotidiennes et des tests de sensibilité, pour évaluer des composés analgésiques. Le porteur indique que les administrations répétées peuvent provoquer constipation, tolérance, addiction et dépression respiratoire. Une partie des souris est tuée pour analyse des tissus, l'autre transférée vers l'établissement partenaire du projet.
Objectifs
La douleur neuropathique affecte 8 à 10% de la population et, dans nombre de cas, est réfractaire aux traitments actuellement disponibles. Les hétéromères opioïdes mu-delta représentent une nouvelle entité fonctionnelle formée par l'association des récepteurs mu et delta opioïdes. Les données de la litérature indique que l'activation de ces hétéromères induit une analgésie associée à moins d'effets indésirables telles que tolérance et dépendance. Toutefois, les ligands actuellement disponibles présentent de sérieuses limitations soit ils ne passent pas la barrière hématoencéphalique, ce qui limite leur potentiel pour la clinique, soit ils manquent de sélectivité. Le CYM51010 réduit la sensation douleureuse en conditions neuropathiques mais active les récepteurs mu ou delta non associés. Le MP135 présente une séléctivité accrue mais également des effets indésirables forts chez l'animal naïf. Son efficacité n'a par ailleurs pas été évaluée en conditions neuropathiques. Notre projet a pour but de synthétiser des dérivés du CYM51010 qui soient sélectifs des hétéromères mu-delta, présentent une analgésie forte avec peu d'effets indésirables tels que tolérance, dépendance et dépression respiratoire. L'évaluation des molécules sera réalisée en souris naïves ou neuropathiques après lésion partielle du nerf sciatique. Ces nouveaux composés seront comparés à la morphine, composé de référence en clinique, et aux deux petites molécules ciblant les hétéromères mu-delta déjà disponibles, le CYM51010 et le MP135. L'utilisation de lignées de souris déficientes pour l'un ou l'autre récepteur permettra de vérifier la sélectivité des composés. Finalement, l'utilisation de nos lignées génétiquement modifiées exprimant des versions fluorescentes des récepteur mu et delta permettra d'étudier in vivo les mécanismes sous-jacents à l'action des composés, notamment leur internalisation . L'objectif est à terme de proposer de nouveaux composés pour traiter la douleur chronique.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront une meilleure connaissance du rôle physiopathologique des hétéromères mu-delta. L’obtention de composés sélectifs des hétéromères permettra de les cibler in vivo, d’isoler et d’étudier leur contribution spécifique à différents processus dont la nociception. Cet aspect est très fondamental car il permettra d’engager une étude mécanistique des voies de signalisation et des circuits neuronaux impliqués. Ceci est impossible actuellement car les composés existants activent également les récepteurs non associés. D’autre part, obtenir des composés sélectifs permettra, nous l’espérons, d’obtenir une bonne réponse analgésique avec moins d’effets secondaires et d’ouvrir une nouvelle voie thérapeutique.
Procédures
Un groupe de souris adultes sera testé quotidiennement pendant 10 secondes sur une durée de 15 jours et recevra une injection quotidienne d’une durée de 10 secondes pendant 10 jours (soit au total 3 minutes de test et moins de 2 minutes d’injection sur une période de 15 jours). A l'issue de cette période, une partie d'entre elles sera testées pendant 30 minutes dans un second test. Un deuxième groupe de souris adultes subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes, recevra après la chirurgie une injection quotidienne de 10 secondes pendant 10 jours et sera testé 20 fois dans deux tests de durée respective de 10 secondes et 3 minutes (soit au total 63 minutes de test et moins de 2 minutes d’injection sur une période de 35 jours). A l'issue de cette période, une partie d'entre elles seront testées pendant 30 minutes dans un troisième test. Un troisième groupe de souris adultes subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes et sera testé 10 fois dans deux tests de durée respective de 10 secondes et 3 minutes (soit au total 32 minutes de test sur une période de 35 jours). A l'issue de cette période, elles seront testées pendant 4heures dans un troisième test
Impact sur les animaux
La lésion partielle du nerf sciatique induit une douleur de type neuropathique non réversible qui se traduit par une sensibilité accrue au froid transitoire et sensibilité mécanique augmentée de façon persistente. Pour cette raison, l'efficacité des composés sera tout d'abord testés en souris non douloureuses afin de réduire le nombre d'animaux subissant cette procédure. L'administration répétée des composés pourra induire de la constipation, tolérance, addiction et dépression respiratoire. Les trois derniers sont l’objet de l’étude. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable.
Devenir
une partie des animaux est euthanasiée à la fin de chaque procédure pour analyse des tissus in vitro, une autre partie est transférée dans l'établissement partenaire du projet
Remplacement
L'effet analgésique et les effets indésirables des composés ne peuvent être évalués que sur organisme entier et vivant et ne peuvent être mesurés par une approche en cellules ou en organoïdes.
Réduction
le nombre d’animaux nécessaires au projet a été évalué mathématiquement pour permettre d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes de 2-5 animaux du même sexe pour respecter leur besoins d'interaction sociale et leur cage enrichie avec des carrés de coton pour favoriser le comportement de nidation. Le changement de litière se fait avec des tunels pour éviter la prise par la queue et reduire le stress des animaux. L'apparition éventuelle de signes de souffrance ou de détresse est surveillée quotidiennement en portant une attention particulière à tout changement de l’état général (perte de poids supérieure à 15%, défaut de toilettage, plaie ouverte, blessure, déshydratation) ainsi qu'à l'état comportemental (prostration, dos arqué, réticence au déplacement, léthargie, agressivité). Avant toute procédure expérimentale, une phase d'habituation à l'expérimentateur est réalisée. Dans les tests comportementaux, un seuil maximal de stimulation est déterminé (point limite afin d'éviter une souffrance à l'animal ou des dommages tissulaires) même en absence de réaction de l'animal. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale et du gel oculaire est apliqué durant la procédure. Un suivi postopératoire quotidien (pesée, observation de l'œdème inflammatoire) est effectué pendant 3 jours.
Choix des espèces
la souris a été choisie car ces animaux peuvent être modifiés génétiquement et cette espèce est un modèle validé du comportement humain pour les questions abordées dans ce projet. L'utilisation des souris génétiquement modifiées n'exprimant que le récepteur opioïde mu ou delta permet d'évaluer la sélectivité des composés pharmacologiques à tester et celle des animaux exprimant une version fluorescente des récepteurs mu et delta permet de visualiser directement les changements dans leur distribution induits par les traitements. Ces lignées de souris ont déjà été utilisées avec succès pour évaluer des traitements de la douleur neuropathique et la distribution des récepteurs en conditions physiopathologiques. L'étude comportementale nécessite le développement complet du système nerveux soit des souris agées de 6 semaines ou plus
Mécanismes contrôlant la perte de cellules souches neurales dans le cerveau adulte de Danio rerio
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
14 250 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Le porteur leur électropore des plasmides dans les cellules souches neurales sous anesthésie, les expose à des traitements dans l'eau et en irradie une partie aux rayons X pour provoquer de la mort cellulaire. Tous sont mis à mort pour prélever le télencéphale, le porteur reconnaissant un manque de données sur les analgésiques efficaces chez cette espèce. Il affirme que la culture cellulaire détruit l'organisation de la niche et que les cellules isolées montrent des comportements "aberrants" absents in vivo.
Objectifs
Notre but est de comprendre quels mécanismes moléculaires et cellulaires contrôlent la perte des cellules souches neurales adultes dans le cerveau des vertébrés.
Bénéfices attendus
Dans son ensemble, ce projet permettra de caractériser les deux mécanismes principaux de perte de CSNs dans le cerveau adulte en conditions physiologiques : la division symétrique neurogénique, et la transdifférenciation. Ces mécanismes seront des candidats intéressants de dysfonction en conditions pathologiques de perte de CSNs, comme le vieillissement ou certains troubles du comportement.
Procédures
Procédures 2, 3, 4, 6 et 9 : les animaux seront soumis, une fois dans leurs vies et sous anesthésie, à une procédure d’electroporation de plasmides dans les cellules souches neurales. Cette manipulation prend environ 1 à 2 min par poisson. Procédures 5 et 7 : les animaux seront donc soumis à un traitement administré dans l’eau de nage. Cette manipulation prend moins d’une minute par lot de poisson car il s’agit ‘juste’ de les transférer d’un bac a un autre (dans lequel a déjà été dilué le traitement). Il y a ensuite la durée du traitement mais sans action car les poissons sont libres de nager dans leurs bacs. Procédure 10 : les animaux seront soumis à une relativement faible irradiation aux rayons X de 80Gy afin d’induire une légère augmentation des évènements de mort cellulaire. Cette manipulation se passe en plusieurs ‘étapes’ : le transfert des poissons dans des bacs isothermes (moins d’une minute pour transférer les poissons dans un aquarium avec 3cm de hauteur) et le traitement dans l’irradiateur des poissons (dans leur aquarium) qui dure un maximum de 57 min pour une dose de 80Gy.
Impact sur les animaux
Nous ne prévoyons aucun effet indésirable ou nuisance sur les animaux. Si un effet indésirable inattendu apparait nous arrêtons cette expérience et mettrons a mort les animaux.
Devenir
Tous les animaux doivent être mis à mort afin de prélever le télencéphale pour l’analyser.
Remplacement
Nous souhaitons comprendre un aspect fondamental de la biologie des cellules souches neurales (CSNs), à savoir comment ces cellules peuvent être perdues dans le cerveau adulte. Le travail sur CSNs en culture, bien que techniquement possible, a révélé que les CSNs isolées montraient des comportements aberrants jamais observés in vivo, notamment concernant leur mode de division. Ce paramètre impacte de façon directe le maintien ou la déplétion des populations souches. Par ailleurs, à l’heure actuelle, la transdifférenciation, pourtant importante in vivo n’a pas été observée in vitro. Enfin, par imagerie intravitale, il a été démontré que les choix de destins des CSNs sont contrôlés à l’échelle de la population et impliquent une coordination spatio-temporelle entre cellules au sein de leur niche. Toute approche in vitro détruit cette niche et cette organisation spatiale.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, nous limiterons précisément le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Concernant les procédures de traçage et d’électroporation, différents articles publiés ces dernières années montrent que le comptage d’environ 150 cellules sur un minimum de 10 animaux est suffisant pour rendre compte des choix effectués, de façon comparable à un comptage de la population globale. Ces valeurs suffisent à mesurer une différence statistiquement significative du nombre (test de Student) et de la proportion (test de Fischer) des choix de destin entre des CSNs contrôles et manipulées. Nous travaillerons donc dans chaque cas avec 10 animaux et uniquement si besoin certaines expériences seront répétées (maximum 3 répétitions). Concernant l’utilisation d’inhibiteur pharmacologique, nous travaillerons avec 10 animaux par condition ce qui suffit à mesurer une différence statistiquement significative du nombre (test de Student) et de la proportion (test exacte de Fisher) de CSNs activées versus non-activées entre des animaux contrôles et des conditions de blocage des voies de signalisation.
Raffinement
Les manipulations, invasives ou nécessitant une immobilisation temporaire seront conduites sur animaux anesthésiés. Les inductions (tamoxifène, doxycycline) seront administrées dans l’eau de nage. Les animaux sont toujours maintenus en groupe afin de garantir leurs bien-être. Nous suivrons quotidiennement les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une mise à mort. Chez Danio rerio, il y a un manque d’information sur les effets et la spécificité des produits « classiques » analgésiques. Cependant, une étude récente suggère l’utilisation de lidocaine 2-5 mg/ml dans le bain de réveil. Nous suivrons cette procédure aussi souvent que possible.
Choix des espèces
Nous avons choisi le poisson téléostéen Danio rerio. Le cerveau adulte de Danio rerio, à la différence des modèles « classiques » mammifères, maintient un grand nombre de CSNs. Utiliser cette espèce permet donc d’avoir accès à un beaucoup plus grand nombre de CSN par animal. Ces cellules sont également organisées en une monocouche superficielle au lieu d’être profondes, permettant des approches in toto qui évitent de perdre des cellules comme lorsqu’un organe est analysé sur coupes. Ces deux points répondent au principe de « réduction ». Par ailleurs, les CSNs de Danio rerio sont identiques aux cellules souches des mammifères (cellules gliales, quiescentes, capables d’auto-renouvellement et de multipotence, et dont l’état d’activation est contrôlé par la voie de signalisation Notch). Les résultats obtenus seront donc directement transposables aux mammifères. Tous les animaux seront utilisés à l’âge adulte jeune (3 mois post-fécondation [mpf]), car nous travaillons sur la biologie des CSNs adultes. Les premiers signes de ralentissement de l’activité des CSNs sont observés in vivo à environ 5-6 mpf, et il est important également de nous placer avant ce stade.
Création et caractérisation de deux lignées de souris invalidées pour les récepteurs aux glucocorticoïdes MR et GR dans la cellule de Schwann : Etude de leur rôle sur la myélinisation périphérique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur crée deux lignées invalidées pour des récepteurs hormonaux dans les cellules de Schwann, leur fait passer des tests comportementaux portant sur les capacités motrices puis prélève leurs nerfs sciatiques après une perfusion transcardiaque sans réveil. Il indique que la suppression du récepteur GR pourrait entraîner une démyélinisation et un handicap moteur, l'étude s'arrêtant alors aux points limites. Il reconnaît utiliser aussi des cultures de cellules de Schwann in vitro, mais affirme qu'elles ne reproduisent pas finement la myélinisation d'un axone chez l'animal.
Objectifs
La myélinisation permet d'augmenter la vitesse de l'influx nerveux. Elle est assurée par les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique. Les hormones glucocorticoïdes ont été décrites comme agissant sur la myélinisation, mais leurs effets semblent varier selon les modèles d’études. Ces hormones exercent leurs actions principalement par leur liaison à deux protéines, le récepteur aux glucocorticoïde, (GR) et le récepteur aux Minéralocorticoïde (MR), et sont d'une importance cruciale en physiologie et pathologie (stress, métabolisme immunité). Le but de ce projet est de comprendre l’implication des glucocorticoïdes et de leur deux récepteurs, MR et GR sur le développement et le maintien de la gaine de myéline autour des axones des nerfs périphériques chez la souris en utilisant des modèles d'inactivation des gènes codant pour le MR, le GR ou les deux en même temps chez la souris spécifiquement dans la cellule de Schwann. Nous avons déjà réalisé l'inactivation du gène du MR seul dans le cellule de Schwann. A ce niveau de notre étude, les altérations de la myélinisation chez ces souris ne semblent pas provoquer de dommage chez les animaux. Les deux récepteurs MR et GR présentent une forte similarité de structure et leurs actions sont parfois redondantes, c'est pourquoi la stratégie consistant à inactiver chez la souris chacun des deux récepteurs, puis les deux ensembles a été utilisée récemment par d'autres laboratoire, notamment dans le cerveau et le coeur. Notre étude analysera ainsi les conséquences fonctionnelles de l'inactivation du gène de chacun de ces récepteurs , ou des deux ensemble, sur les capacités motrices des souris à différents stades de vie grâce à des tests non invasifs validés par des études antérieures. Une analyse moléculaire et histologique sera aussi réalisée sur les nerfs sciatiques de ces animaux en post mortem. Cette étude nécessitera 1400 souris pendant 5 ans.
Bénéfices attendus
Ce projet s’appuie aussi par la démonstration récente au laboratoire de la présence des récepteurs MR et GR fonctionnels dans des cultures de cellules de Schwann. Mais ces modèles in vitro ne permettent par contre pas de reproduire finement la structure et la fonction d’une cellule de Schwann myélinisant un axone chez l'animal. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l'effet des hormones glucocorticoïdes sur la myélinisation périphérique. Les hormones glucocorticoïdes étant impliquées dans la physiologie du stress et de l'immunité, le stress chronique étant un problème majeur de santé publique, et les traitements par des glucocorticoïdes synthétiques étant largement utilisés, ce qui démontre ainsi l'importance d'étudier l'implication de leur récepteur GR dans la myélinisation périphérique. L'intérêt de ce projet est souligné par le fait que l'effet des hormones glucocorticoïdes sur la myélinisation est encore peu étudiée à ce jour.
Procédures
Les animaux proviendront d'une création d'une nouvelle lignée, ils subiront des tests comportementaux et prélèvement de tissus, notamment des nerfs sciatiques sur animal mort. La perfusion transcardiaque pour les études morphomogiques est une procédure sous anesthésie générale sans réveil qui entraine la mort immédiate de l'animal.
Impact sur les animaux
Nous avons déjà observé que l'inactivation du gène du MR dans la cellule de Schwann ne s'accompagne pas d'un phénotype domageable. Par contre, l'excision dans la cellule de Schwann du gène du GR qui est d'une importance cruciale dans de nombreux tissus pourrait s'accompagner d'une démyélinisation entrainant un handicap moteur chez l'animal. Dans cette éventualité, notre étude s'arrêtera au stade où l'animal présentera un certain nombre de points limites définis dans les procédures. Il en est de même concernant la double inactivation ds gènes du MR et du GR dans la cellule de Schwann.
Devenir
A l'issue des deux procédures, les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
En complément de ces études in vivo, nous utilisons des méthodes in vitro de culture de cellules (lignées établies et cultures primaires de cellules de Schwann de souris) afin d’identifier les cibles moléculaires du MR et du GR, nous permettant de mieux comprendre le rôle de ces gènes sur la myéline et dans ce cas là de remplacer le modèle animal.
Réduction
Nous allons utiliser le minimum d’animaux en expérimentation (10 pour les échantillons biologiques et 5 pour les analyses morphologiques) en prélevant le maximum de tissus biologiques sur chaque animal et en utilisant les tests statistiques non paramétriques (car on ne peut pas s'attendre à une distribution normale des valeurs au vu du nombre d'échantillons) afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les résultats obtenus dans les différentes conditions expérimentales seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les manipulations se font dans une pièce dédiée au comportement dans la zone expérimentale de l'animalerie. Les animaux issus d'une même portée sont hébergés dans les mêmes cages contenant du matériel de nidification. L'enrichissement est renforcé pour d'éventuels mâles isolés avec des dômes et des kleenex. Au minimum 4 heures s'écoulent entre chaque test de nature différente, et au maximum 2 tests seront effectués dans la même journée. Si des animaux se déplacent avec difficulté, du gel alimentaire sera mis à disposition. Des points limites avec une grille de scores ont été définis pour la gestion de la douleur de l'animal.
Choix des espèces
Les souris sont des mammifères suffisamment proches de l’Homme pour servir à l’évaluation de l’implication des voies de signalisation des glucocorticoïdes sur le développement et le maintien de la gaine de myéline périphérique. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de ces voies ont été principalement développés pour le rat et la souris. L’analyse comportementale ainsi que les techniques biochimiques et histologiques envisagées pour étudier le statut myélinique nous permettrons d’apporter des réponses claires quant à l’implication du MR et du GR sur le développement de la gaine de myéline mais aussi sur sa stabilité à l’âge adulte. Nous utiliserons des souris âgées de 14 jours à 6 mois, afin de pouvoir étudier la myélinisation (entre la naissance et P21) et le maintien des gaines de myéline formées au stade jeune adulte (12 semaines) et adulte (6 mois).
Effets d’une exposition périnatale à l’acide perfluorooctanesulfonique (ou PFOS) sur la physiologie de la myéline
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
70 souris, dont dix femelles gestantes et leurs petits, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur expose les mères à un polluant perfluoré, le PFOS, dans l'eau de boisson de la gestation au sevrage, puis euthanasie tous les souriceaux à 21 jours pour prélever leurs tissus. Il indique n'attendre aucune souffrance notable et s'appuie sur des données non publiées chez le rat. Il justifie le passage à la souris in vivo par les limites de ses précédents modèles ex vivo et sur têtard de xénope.
Objectifs
Depuis une trentaine d'années, l'incidence de la sclérose en plaques (SEP) est en constante augmentation dans les pays développés. Des facteurs environnementaux sont suspectés de favoriser le développement et/ou la progression de la SEP. Notre hypothèse centrale est qu'une exposition à des perturbateurs endocriniens, notamment les retardateurs de flammes que nous retrouvons dans notre environnement quotidien (revêtement des poeles, vêtements déperlants...) comme les fluorofactants, peut interférer avec le processus de formation de la myéline. En particulier, ces polluants chimiques étant liposolubles, notre hypothèse de travail est qu'ils s'accumulent dans les structures riches en lipides, comme la myéline, et destabilisent ainsi sa structure et sa fonctionnalité. Ce projet vise à comprendre dans quelle mesure certains perturbateurs endocriniens auxquels nous sommes tous exposés, les perfluorés (PFOS), affecte l’intégrité de la membrane myélinique. Il s'agit de la première étude visant à montrer un lien entre une exposition environnementale à un polluant chimique de type perturbateur endocrinien et la formation de la myéline. Ainsi, nous souhaitons explorer le rôle de l’acide perfluorooctanesulfonique ou PFOS dans la génération de nouveaux précurseurs oligodendrocytaires (OPCs) et la myélinisation chez le jeune souriceau. Pour ce faire, nous déterminerons les effets cellulaires au sein de la zone sous-ventriculaire, niche neurogénique majeure chez les mammifères pour la production d'OPCs. De plus, nous déterminerons si les PFOS s'accumulent dans les faisceaux de substance blanche et altère la composition en lipides de la membrane myélinique par des expériences innovantes d'imagerie par spectroscopie de masse. Les résultats de cette étude pilote devraient aboutir à un faisceau d'arguments visant à soutenir l'hypothèse d'un lien entre une exposition développementale à certains perturbateurs endocriniens et la génération de cellules myélinisante
Bénéfices attendus
Cette approche in vivo menée chez la souris postnatale viendra compléter nos données récemment obtenues à l’aide de modèle ex vivo chez la souris (neurosphères, explants de cervelet) et in vivo chez le têtard de xénope. Plus largement, notre projet démontrera (ou non) si une exposition environnementale pendant le développement - à certains perturbateurs endocriniens, comme les perfluorés -modifie le profile lipidique de la membrane myélinique et la fragilise. Les bénéfices de cette étude pilote sont doubles : (i) une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires aboutissant à la production d'oligodendrocytes matures, processus susceptibles d'être affectés par les perfluorés chez tous les mammifères, y compris chez l'homme et (ii) l'apport d'une nouvelle voie d'étude témoignant du rôle néfaste des polluants environnementaux - auxquels nous sommes tous exposés tout au long de la vie - sur la stabilité de la myéline qui pourrait ainsi expliquer l'augmentation des cas de SEP via l'inhibition de la capacité à générer une myéline fonctionnelle.
Procédures
Les femelles recevront la molécule dans l'eau de boisson à partir du 15eme jour de gestation jusqu'au sevrage de la portée , les petits seront exposés in utero et lors de la lactation (de E15 à P21). A P21, tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement.
Impact sur les animaux
Notre procédure unique soumise ici dans le cadre de ce projet pilote est considéré comme légère. Les animaux seront étroitement surveillés. Le poids des nouveau-nés sera suivi 2-3 fois par semaine. Si trop d’effets négatifs sont observés (prostration, non-alimentation, blessure), l’animal sera euthanasié et retiré du groupe expérimental. Cependant, cette expérience ne devrait pas induire de souffrance ou d'effets néfastes ni sur la femelle en gestation/lactation ni sur les petits jusqu'au stade de 21 jours après la naissance. Dans le cadre du projet européen ENDpoiNTs , auxquels nous participons , notre collaborateur a récolté un ensemble de données (pas encore publiées) chez le rat montrant que des doses orales de la molécule utilisée en dessous de 2mg/kg bw sont bien tolérées par l’animal, notamment sans conséquences délétères en période néonatale. De plus, un ensemble de publications confirme également l’absence de problèmes chez les rongeurs en période postnatale pour des doses autour de 2mg/kg bw, donné soit dans le régime alimentaire, soit dans l’eau de boisson, soit par gavage. Les dommages attendus sont donc réellement réduits. Les femelles gestantes seront regroupées par 2 ou 3 par cage. De plus, ne sachant pas si le PFOS modifie le goût de l’eau, la quantité d’eau absorbée par les mères gestantes et en lactation sera mesurée en pesant 2 à 3 fois par semaine les biberons. Ainsi, la prise hydrique des animaux exposés à la molécule pourra être comparée aux animaux contrôles. Cependant, aucun changement dans la consommation hydrique n’est attendue. En effet, une précédente étude menée chez la rate a montré que la consommation d’eau ne différait pas entre les animaux contrôles et traités.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car des prélèvements de tissus et analyses sont nécessaires post-mortem impliquant donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Dans une étude antérieure récente, nous avons accumulé des données à l'aide de modèles ex vivo (culture chez la souris) et in vivo (tétard de xénope) afin de répondre à un effort de remplacement et de réduction. Cependant, la nouvelle question qui découle de nos résultats prometteurs - obtenus par ces approches - nous incite à utiliser le modèle murin in vivo afin de reproduire au mieux les conditions d'une exposition environnementale aux perturbateurs endocriniens lors de la période périnatale et d'examiner les conséquences sur la physiologie de la myéline. Avec notre approche ex vivo précédemment décrite, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés afin de répondre à notre question première, celle des effets des perfluorés sur la génération d'oligodendrocytes myélinisants et la remyélinisation. Désormais, nous devons valider in vivo chez la souris nos résultats car nos précédents modèles ex vivo ne nous permettent pas de répondre à la problématique de l'accumulation des perfluorés dans la substance blanche ni de ses conséquences sur la stabilité de la myéline. Par ailleurs, le modèle du tétard de xénope a permis de montrer un effet de cette molécule sur la remyélinisation au niveau du nerf optique. En revanche, nous souhaitons étudier en amont les mécanismes cellulaires à l'origine de la génération de nouveaux précurseurs oligodendrocytaires. Pour ce faire, nous nous focalisons sur la zone sous-ventriculaire chez la souris où sont concentrées les cellules souches neurales à l'origine des OPCs. Cette niche est parfaitement définie en terme de types cellulaires chez la souris, contrairement au xénope. De plus, la composition en lipides n'est pas connue chez le xénope alors qu'elle est parfaitement définie chez la souris. Or, nous voulons étudier l'influence d'une accumulation potentielle du perturbateur sur le profil lipidomique. Ceci nous pousse à explorer le lipidome chez la souris. Nous souhaitons ainsi étudier l'influence des perfluorés sur le choix du destin cellulaire des cellules souches neurales et a fortiori sur la génération des précuseurs oligodendrocytaires qui migrent ensuite dans le corps calleux où ils se différentient en oligodendrocytes myélinisants. Ce modèle in vivo nous permettra d'étudier l'impact des perfluorés sur toutes les étapes du lignage oligodendrocytaire, de la cellule souche à l'oligodendrocyte mature.
Réduction
Avec notre approche ex vivo précédemment décrite, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés afin de répondre à notre question première, celle des effets des perfluorés sur la génération d'oligodendrocytes myélinisants et la remyélinisation. Désormais, nous devons valider in vivo chez la souris nos résultats car nos précédents modèles ex vivo ne nous permettent pas de répondre à la problématique de l'accumulation des perfluorés dans la substance blanche ni de ses conséquences sur la stabilité de la myéline. Nous avons volontairement restreint le nombre d'animaux utilisés dans ce projet afin de s'en tenir au strict minimum pour obtenir rapidement des résultats préliminaires qui devraient nous conforter dans notre hypothèse, à savoir que les PFOS, de part leur propriété hydrophobe et liposoluble, s’accumulent dans la gaine de myéline, structure riche en lipides. Ainsi, la membrane myélinique serait modifiée en sa composition lipidiques ce qui pourrait entraîner une déstabilisation de celle-ci, favorisant ainsi sa vulnérabilité. Au cours d’une précédente expérience, nous avons exposé des mères gestantes (de E15 à P21) à un autre perturbateur endocrinien, le bisphénol F. Les résultats ont mis en évidence qu’un nombre de 8 souriceaux par groupe était nécessaire et suffisant pour obtenir des données statistiques significatives et robustes. Dans l'actuelle procédure, nous estimons donc à 8 le nombre de souris par condition (contrôle versus PFOS). Trois expériences seront réalisées à l'issu de cette procédure, chacune composée de 8 animaux contrôlés et 8 animaux traités. Cependant, compte tenu que le nombre de petits par portée pour les souris C57bL/6 n'est pas prédictible à l'avance (en moyenne 5 à 6 petits), nous préférons envisager une marge de 20% pour le calcul du nombre de petits afinde pallier cette variabilité. Ainsi nous augmentons notre besoin à 10 souris P21 par groupe et donc 10 femelles gestantes, soit 70 animaux au total.
Raffinement
Les indicateurs comme la prostration, détectée par les animaliers ou par l’expérimentateur, l’absence d’alimentation (la diminution des quantités de nourriture disponible entre deux nourrissage est vérifiée par les animaliers), des symptômes apparents de gêne ou de douleur (irritations, grattement, léchage) ou enfin des troubles du comportement (agressivité, sur-léchage, agitation anormale ou hyperréactivité) sont particulièrement suivis. Dans le cas où un ou plusieurs des symptômes cités varie de manière significative, l’animal est dans un premier temps sorti de la procédure, et/ou euthanasié dans les cas les plus extrêmes. Une bonne maîtrise de la procédure et un suivi assidu des groupes expérimentaux doit prémunir de la survenue d’incidents de ce type. Comme déjà mentionné, nous ne nous attendons pas à un phénotype sévère. Cependant, il n'est pas à exclure que des cas isolés réagissent plus fortement au traitement. En particulier, pour les nouveaux-nés, une attention particulière sera portée au suivi hebdomadaire du poids. Tout signe d'atteinte du système nerveux central (inclinaison de la tête, spasmes, convulsions, troubles de l'équilibre) entraînera systématiquement le retrait de l'animal de la procédure et son euthanasie. Les femelles gestantes et en lactation seront placées par 2 ou 3 par cage. Elles ne seront donc pas isolées et garderont ainsi des contacts sociaux. De plus, les femelles pourront s’entraider durant la lactation et ce, jusqu’au sevrage des petits. Durant toute la durée du traitement (de E15 à P21), l’environnement des animaux sera enrichi à l’aide de papier kraft et d’une maisonnette en carton. Les femelles pourront également construire leur nid avec du coton.
Choix des espèces
Le modèle biologique choisi est la souris (Mus musculus). Ce choix est dicté par plusieurs raisons -théoriques : la souris étant l’espèce animale la plus étudiée en expérimentation animale, les connaissances accumulées par la communauté scientifique ont permis d’identifier de nombreux mécanismes physiologiques et comportementaux impliqués dans le maintien de la balance énergétique et le vieillissement. Par ailleurs, l’utilisation des outils de séquençage à haut débit a permis un assemblage complet du génome de la souris, constituant un outil essentiel dans la détermination des gènes impliqués dans les processus étudiés. Pratiques : étant de petite taille, la souris est un modèle facile à maintenir en animalerie, avec un taux de reproduction élevé. Par ailleurs, tous les protocoles utilisés dans les projets de recherche ont été optimisés pour la souris, avec un contrôle maximum des paramètres vitaux. La souche C57bL/6 est notre souche de référence. La procédure sera réalisée sur des souris à P21 afin d'étudier les effets à court terme d’une exposition périnatale à un perturbateur endrocrinien sur la physiologie de la myéline. 60 nouveau-nés sont prévus afin de réaliser trois analyses pilotes post-mortem faisant appel à des expériences d'immunohistochimie, d’imagerie par spectrométrie de masse et d'analyses lipidomiques par spectrométrie de masse après extraction de la myéline. De plus, la procédure fait appel à de jeunes femelles gestantes afin de générer les nouveau-nés impliqués dans la procédure. Au sein d’un même cage, deux à trois femelles gestantes seront exposées soit à l’eau de boisson standard soit à l’eau supplémentée avec le perturbateur. A P21, les animaux d’une même condition (contrôle versus traité) seront sexés puis divisés en 3 groupes (chaque groupe correspondant à une expérience). Pour chaque condition expérimentale, nous attendons 30 souriceaux. Ainsi, les 30 souriceaux issus des 5 femelles contrôle ou traitées seront mélangés et répartis en 3 groupes selon leur poids et leur développement, le but étant d’avoir trois groupes expérimentaux homogènes. Dans cette procédure, nous débuterons l’exposition des embryons à E15, juste avant que le système endocrinien du souriceau ne devienne autonome. Les souriceaux seront exposés jusqu’à P21, stade post-développemental où la myélinisation est maximale.
KO thermique frequence Modélisation numérique de l’interaction des champs RF sur les récepteurs thermiques – Mécanismes et expérimentations vivo (MOTHERR1 )
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système nerveux
135 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plus lourde est l'implantation chirurgicale de capteurs télémétriques dans l'abdomen, dont le porteur reconnaît qu'elle peut provoquer décès sous anesthésie, infection ou arrêt cardiaque, l'hébergement en cage individuelle affectant en outre le bien-être social des souris. Elles sont ensuite exposées de façon répétée à des champs radiofréquences puis mises à mort pour analyser les organes de la thermorégulation. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est possible tant que la cible moléculaire n'est pas identifiée.
Objectifs
Les champs radiofréquences (RF) deviennent de plus en plus ubiquitaires. Au-delà des interrogations soulevées par le public, cela justifie de rechercher s’il existe un risque même faible, de telles expositions à faible niveau, répétées ou continues. A faible intensité, il a été montré par plusieurs équipes qu’une exposition chronique ou répétitive à des RF de faible niveau à 900MHz - 1 à 30 V/m - peut produire des réponses chez la souris semblables à celles provoquées par le froid. L’objectif de notre projet est de préciser l’effet des champs RF dans ces réponses en étudiant les mécanismes biologiques impliqués chez les souris exposées de façon répétée aux champs radiofréquences (RF) et en identifiant les cibles moléculaires responsables des changements observés. Ce projet vise à vérifier quels récepteurs thermiques sont à l'origine des comportements manifestés par les animaux exposés. Plus spécifiquement les questions abordées dans ce projet sont: 1) Est-ce que le phénomène de vasoconstriction observé chez les animaux exposés se produit dans la même plage de température lorsque la température ambiante augmente et lorsqu'elle diminue ? 2) Est-ce que cet effet se produit aussi chez des souris privées d’un gène pour un récepteur thermique (souris mutantes) ? 3) Dans quelle gamme de fréquences cet effet est-il observable ? Dans ce projet, 135 souris adultes seront utilisées, 108 mâles et 27 femelles.
Bénéfices attendus
L’identification de la cible moléculaire d’interaction du champ RF permettra d’envisager d’une part les possibles conséquences sanitaires des effets des RF sur la régulation thermique chez les animaux, d’une part l’éventuelle extrapolabilité ou non à l’homme des effets observés.
Procédures
Une implantation intra-péritonéale de capteurs télémétriques sera effectuée sur 119 souris, 92 mâles dont 14 mutées sur le gène TRPM8 et 27 femelles dont 14 mutées sur le gène TRPM8. La durée d'intervention est d'environ une demi-heure. Les souris doivent être hébergées isolément en cage individuelle en post-opératoire (4 jours, 119 souris), ou sur 2 jours pour les mesures de température par caméra infra-rouge (16 souris).
Impact sur les animaux
L’acte le plus sévère sur une partie des animaux est la chirurgie d’implantation de capteurs télémétriques. Les effets indésirables attendus sont une mauvaise réaction à l’anesthésie (décès), et dans les 3 à 4 jours post-opératoires une agressivité des congénères, une infection de la plaie, sous-cutanée ou du péritoine, un possible lâchage de suture nécessitant une reprise chirurgicale. Un arrêt cardiaque post-chirurgical ou une rupture de suture dans les 24h ont quelquefois été observés dans nos expérimentations antérieures. L’exposition au champ RF ne produit a priori pas d’effet indésirable attendu. La fragilité post-opératoire nécessite 3 à 4 jours d'hébergement en cage individuelle et les mesures de température par caméra infra-rouge sur 48h nécessitent également un hébergement en cage individuelle. Cet isolement en cage individuelle supérieur à 24h a un retentissement sur le bien-être social des souris.
Devenir
A la fin de la période d’exposition, les animaux seront mis à mort pour étudier les modifications tissulaires et moléculaires des organes impliqués dans la régulation thermique.
Remplacement
Les premiers objectifs de cette étude visent à préciser les cibles moléculaires ou tissulaires des effets observés sur la régulation thermique lors d’expositions répétées à des champs RF. Ceci permettra lorsqu’elles auront été identifiées d’envisager des études in vitro pour explorer les paramètres efficaces de ces effets. D’ici là, la réaction de régulation thermique étant un effet systémique global, cet effet ne peut pas être observé par des méthodes in vitro tant que la cible d’interaction moléculaire ou cellulaire n’est pas clairement identifiée, et il n’existe pas de modèle tissulaire partiel qui éviterait de rechercher cet effet in vivo.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires à une bonne compréhension des mécanismes mis en jeu, des études in vitro et une modélisation en dynamique moléculaire sont envisagées dans ce projet. Ces travaux devraient permettre de cibler plus rapidement les paramètres efficaces de l’effet étudié et ainsi limiter le nombre d’expérimentations in vivo effectuées à cette fin. De plus, plusieurs expérimentations sont conditionnées aux résultats antérieurs, et ne seront donc pas effectuées lorsqu’elles n’ont pas d’utilité. A la fin de la période d’exposition, les animaux seront mis à mort. Pour optimiser l’utilisation des animaux et limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, de nombreux échantillons de tissus seront prélevés pour réaliser des analyses biochimiques et immunohistochimiques.
Raffinement
Ce projet sera réalisé dans des chambres réverbérantes, où les animaux seront hébergés pendant l’exposition. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier, des tubes colorés et des bâtons en bois à ronger seront également disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Les protocoles expérimentaux limiteront fortement l’intensité et la durée de l’inconfort ou de l’angoisse des souris qui seront utilisées par l’utilisation d’antalgiques pré et post-opératoires, et permettront de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaires, pour obtenir des résultats concluants. Des procédures d’anesthésie et de mise à mort éviteront toute douleur ou angoisse prolongées. Une surveillance régulière permet également de détecter toute souffrance aigue et d’anticiper l’aggravation de l’état des animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans la recherche fondamentale et bien documentée dans la bibliographie. Ce qui permet des comparaisons de nos résultats avec ceux obtenus précédemment concernant les effets thermiques des champs RF dans la litérature scientifique. L’équipe possède une expertise en toxicologie expérimentale, ainsi que dans le domaine des effets des champs RF et de la régulation thermique. L’équipe dispose ainsi des compétences et de l’équipement nécessaires à l’exposition des souris aux RF et à l’évaluation des effets précités.
Etude du rôle des récepteurs astrocytaires mGluR5 dans la transmission synaptique, la plasticité synaptique à long-terme et la mémoire chez la souris adulte.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections répétées de tamoxifène, une chirurgie crânienne avec deux craniotomies pour injecter un virus dans les deux hippocampes, l'implantation d'une lentille miniature puis des tests comportementaux sur cinq semaines, avant décapitation ou perfusion intracardiaque. Le porteur vise à comprendre le rôle des récepteurs astrocytaires mGluR5 dans la mémoire de la souris adulte, les retombées pour des maladies comme Alzheimer restant renvoyées au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme que l'étude in vivo est "indispensable" et qu'aucune technique sans animaux ne peut se substituer à la souris.
Objectifs
De nombreuses études indiquent que l’astrocyte joue un rôle clé au cours de la communication neuronale aussi appelée transmission synaptique. En effet, cette cellule gliale détecte l’information transmise au niveau de la synapse (zone de communication entre deux neurones) et en retour régule la communication neurone-neurone via la libération de gliotransmetteurs. Nous avons précédemment montré que l’astrocyte était capable de réguler l’efficacité de la transmission synaptique chez l’animal juvénile, notamment grâce à l’activation du récepteur astrocytaire glutamatergique mGluR5. Cependant, afin d’aller plus loin dans la compréhension du transfert d’information dans l’hippocampe, une région cérébrale jouant un rôle clef dans la mémoire, il est donc nécessaire de déterminer si ce processus est toujours présent à l’âge adulte. Les objectifs de ce projet sont donc de déterminer la contribution des récepteurs mGluR5 astrocytaires dans la transmission synaptique, ainsi que dans les processus de mémoire chez la souris adulte.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires sous-tendant la mémoire et l’apprentissage. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercutions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
-Injections intra-péritonéales de tamoxifène : Ces injections seront réalisées sur animal vigile. Les animaux recevront au total soit 5 ou 8 injections sur 5 ou 8 jours consécutifs. Chaque injection durera moins d’une minute. En fonction du protocole choisi, 120 ou 860 animaux seront concernés. -Chirurgie pour injections intra-hippocampiques : les animaux seront anesthésiés sous isoflurane durant toute la chirurgie (soit environ 1h par animal). Elle consiste en une incision de la peau au niveau du crâne, puis deux craniotomies permettant la descente de l’électrode d’injection au niveau des deux hippocampes. Les animaux subiront donc au total 2 injections (5min chacune). 400 ou la totalité des animaux seront concernés en fonction du protocole choisi. -Implantation du système nVista INSCOPIX : Les animaux seront anesthésiés sous isoflurane pendant 1h30 environ. Les craniotomies déjà effectuées pour les injections virales seront réutilisées pour l’implantation de la lentille intégrée. Un animal sera implanté une seule fois. Le système sera laissé en place le temps de réaliser les tests comportementaux (soit 5 semaines après la chirurgie). Au total, 160 animaux sont concernés. -Anesthésie pour perfusion : Les animaux vigiles recevront une injection intra-péritonéale unique d’un mélange kétamine/xylazine (
Impact sur les animaux
Suite aux différentes procédures, une douleur ainsi qu’une perte de poids peuvent survenir dans des cas très rares. Pour prévenir ces phénomènes, du méloxicam (5 mg/kg) sera injecté en préemptif par voie sous-cutanée. Si nécessaire, l’injection sera renouvelée 24 heures après la chirurgie pour calmer la douleur. La plaie chirurgicale sera observée quotidiennement afin de déceler les traces d’infection au niveau du site opératoire (rougeur, enflure, écoulement, saignement). Si la plaie présente un de ces signes, nous appliquerons du Picri-Baume® (spray désinfectant et cicatrisant à base de cire d’abeille) quotidiennement, jusqu’à complète cicatrisation et pendant 7 jours maximum. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort par inhalation de CO2. Les animaux seront observés quotidiennement et la douleur sera évaluée jusqu’à J2 après chirurgie selon la grille d’évaluation, organisée selon 5 grands critères : apparence physique, comportement non provoqué, changements de poids corporel, la locomotion ou encore l’aspect de la plaie. Si l’animal présente des signes de douleur, nous injecterons immédiatement en sous-cutané du Méloxicam (5 mg/kg) pour calmer la douleur (score entre 5 et 9). Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort par inhalation de CO2.
Devenir
A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques/procédures subies et seront de ce fait mis à mort.
Remplacement
Travaillant sur les interactions des cellules neuronales et astrocytaires, il est impossible de recourir à des modèles bioinformatiques ou à des cellules en culture. L’étude in vivo et sur tranches aigües de cerveau est donc indispensable. De plus, la souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la plasticité synaptique à long terme (base cellulaire de la mémoire). Nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problème au cours de la chirurgie, pipette utilisée pour injecter le virus bouchée, injection dans la mauvaise structure cérébrale, problème au moment de la dissection, problème rencontré au moment de l’expérience d’électrophysiologie). Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles. Si au cours du projet nous observons que les résultats sont similaires entre les mâles et les femelles, nous poolerons les données obtenues ce qui permettra de REDUIRE de moitié le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Dispositions d’hébergement : Pour chacune des études, les animaux seront placés dans des cages enrichies (carrés de cellulose lab’nest et sizzle nest), au nombre de 4-5 par cage. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle de lumière inversé. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière effectué chaque semaine. Dispositions visant à réduire la douleur : Si l’animal présente des signes de douleur au cours de l’expérimentation, nous administrerons immédiatement en sous-cutané de méloxicam (5 mg/kg) pour calmer la douleur (score entre 5 et 9). Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort par inhalation de CO2.
Choix des espèces
Le modèle utilisé est la souris. La souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la plasticité synaptique à long terme (base cellulaire de la mémoire). Ce modèle permet de produire des tranches aiguës de cerveau afin de réaliser des études d’électrophysiologie et d’imagerie. Les souris C57BL6/J seront réceptionnées à l’âge de 6 semaines afin d’être âgés de 7 semaines minimum au moment des injections intra cérébrales. Ensuite, les diverses études seront réalisées 5 à 9 semaines après les injections intra cérébrales. Les questions que nous posons concernent le stade adulte, c’est pourquoi les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 12 à 16 semaines.