Système nerveux

822 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans la moelle épinière ou le cerveau sous anesthésie et subissent des tests de force musculaire, avant une perfusion intracardiaque mortelle permettant de prélever la moelle épinière, pour évaluer une protéine censée protéger les motoneurones dans la sclérose latérale amyotrophique. Le porteur indique que les souris mutées présentent dès huit semaines une baisse de force musculaire et un léger comportement dépressif. Il affirme que la production de ces données précliniques sur l'animal est nécessaire pour soutenir une demande d'essai clinique.

Objectifs

Les motoneurones (MN) de la moelle épinière contrôlent les mouvements volontaires ainsi que la respiration. Dans la sclérose amyotrophique latérale (SLA), ces cellules dégénèrent ce qui entraîne des troubles moteurs. Notre laboratoire a montré que la protéine EN1 exprimée et sécrétée par les interneurones de la moelle épinière est importante pour la survie des MN. Une injection intrathécale unique de la protéine recombinante hEN1 permet de bloquer pendant 3 mois la neurodégénérescence, et des injections répétées de hEN1 permettent de maintenir l’effet neuroprotecteur sur une durée plus longue. Ce projet a pour objectif de produire des données précliniques sur l’activité neuroprotectrice de hEN1 permettant de soutenir une demande d’essai clinique évaluant le recours à hEN1 dans le traitement de la SLA, ainsi que d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques. Nous chercherons à : 1) tester l’activité de nos lots de protéine hEN1 afin d’évaluer leur conformité et permettre ainsi leur utilisation; 2) décortiquer les mécanismes d’action de hEN1; 3) déterminer si l’effet neuroprotecteur de hEN1 implique une action sur les synapses inhibitrices des MN ; et 4) évaluer l’impact de l’hyperactivité des MN corticaux sur la mort des MN spinaux. Nous prévoyons donc d’injecter la protéine hEN1 par voie intrathécale, ainsi que des virus encodant la protéine dans le cerveau de souris par injection stéréotaxique. Ces injections seront suivies d’études comportementales, physiologiques et histologiques.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies neurodégénératives est en constante augmentation à l’échelle planétaire. En France, la SLA affecte actuellement 5000 à 7000 patients, avec une incidence annuelle proche de 2,5 pour 100 000 habitants. Chez les patients atteints de SLA, les motoneurones (MN) de la moelle épinière contrôlant les mouvements volontaires ainsi que la respiration dégénèrent, ce qui entraîne des troubles moteurs. L’espérance de vie des patients est en général inférieure à 5 ans après établissement du diagnostic. Cette maladie est progressive et fatale. A ce jour, il n’existe pas de traitement pour cette pathologie. En plus de la lourde souffrance pour les patients et leurs proches, le coût de prise en charge pour la santé publique est important. La protéine recombinante humaine Engrailed 1 (hEN1) promeut la survie des MN. Ce projet aidera à comprendre les mécanismes qui sous-tendent la mort des MN chez les souris et de caractériser le mécanisme d’action de hEN1 sur la survie des MN. Ce projet servira aussi à évaluer la conformité de nos lots de hEN1 en amont de leur libération pour injection chez le patient. L’ensemble de ces expériences est d’une importance critique pour permettre la soumission une demande d’essai clinique de Phase I/II visant à évaluer la sûreté mais également l’activité d’une thérapie innovante pour le traitement de la SLA reposant sur l’injection intrathécale de hEN1.

Procédures

Les injections intrathécale se déroulent en conditions d’asepsie et d’anesthésie générale. La procédure dure en moyenne environ 15 minutes. Un maximum de 640 souris sur 5 ans seront soumis à cette procédure. Les injections stéréotaxique intracérébrale se déroulent en conditions d’asepsie et d’anesthésie générale. La procédure dure en moyenne environ 1 heure. Les animaux utilisés seront âgés de 30 jours. Un maximum de 16 souris seront soumis à cette procédure. Les enregistrements électrophysiologiques in vivo seront réalisées sous anesthésie générale. Les animaux seront âgés de 4,5 mois. La procédure prend en moyenne environ 2 heures. Un maximum de 24 souris seront soumis à cette procédure. Les évaluations de la force musculaire par tests moteurs seront réalisées sur animaux vigiles. Les animaux seront âgés de 6 semaines à 4,5 mois. Environs 15 minutes sont nécessaires pour la réalisation des 3 tests pour un animal donné. Un maximum de 552 souris seront soumis à cette procédure. Les perfusions intracardiaque seront réalisées sous anesthésie générale et prennent environ 15 minutes. L’ensemble des animaux utilisés (i.e. un maximum de 822 souris) seront soumis à cette procédure.

Impact sur les animaux

Nos expériences nécessitent des procédures de classe modérée. Pour toutes nos expériences, les souris sont anesthésiées selon les bonnes pratiques vétérinaires. Cependant, et même si notre laboratoire a acquis une solide expérience en la matière, suite à une injection intrathécale ou intracérébrale ou à une enregistrement électrophysiologique, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite, une posture voutée, des problèmes digestifs, une hyperactivité, et des difficultés respiratoires. Les souris En1+/- ont été caractérisées au laboratoire et sont actuellement utilisées dans le cadre d’autres projets. Elles présentent à partir de l’âge de 24 semaines de légères modifications de leur activité locomotrice et un léger comportement dépressif. Elles présentent à partir de l’âge de 8 semaines une baisse de force musculaire, mais ne manifestent cependant aucun point limite, au moins jusqu’à l’âge de 15 mois. Les souris Gephyrin-RFP ne présentent pas de phénotype dommageable. Nous attendons donc que les souris En1+/- ::Gephyrin-RFP que nous obtiendrons dans le cadre du croisement des 2 lignées présentent un phénotype dommageable au même niveau que la lignée En1+/-. Néanmoins, une fois ce croisement obtenu, une vérification de phénotype sera réalisée.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur moelle épinière collectée afin de permettre des analyses histochimiques visant à évaluer l’effet neuroprotecteur de hEN1 sur les MNs spinaux ou caractériser l’expression de L1, de Piwil1 ou du rapporteur fluorescent Gephyrin-RFP.

Remplacement

Nos expériences devant permettre de soutenir une demande d’essai clinique, il est nécessaire qu’elles soient réalisées sur l’animal. De plus, l’expérimentation in vitro ne présente pas le contexte tridimensionnel et physiologique nécessaire à la caractérisation de l’activité neuroprotectrice de hEN1. Enfin, nos travaux ont pour objectif d’évaluer les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de la mort des MNs dans la SLA, ce qui implique d’avoir recours à un modèle animal offrant ainsi un contexte physiologique pertinent pour l’étude de l’origine des déficits observés chez les patients. Dans ce cadre précis, la souris s’avère être un modèle de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques.

Réduction

Nos travaux précédents réalisés sur des animaux soumis à une injection intrathécale ainsi qu’à une évaluation comportementale nous ont permis de démontrer qu’un nombre de 8 souris par condition expérimentale permet d’obtenir une puissance statistique satisfaisante malgré d’éventuels « drops out » ou de mauvaise réalisation de l’injection. Cependant, lorsque des animaux sont utilisés dans le seul but de permettre des analyses histologiques, nos résultats antérieurs indiquent que 6 souris par groupe constituent un nombre minimum d’animaux pour une puissance statistique suffisante (www.stasticalsolutions.net/pssTtest_calc.php). Les procédures ont été optimisées afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser, grâce notamment à une réalisation séquentielle de nos expériences évitant l’initiation de travaux avant la caractérisation complète des outils et méthodes utilisés. Nous utiliserons mâles et femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à générer dans le cadre de l’élevage maintenu au sein de notre animalerie.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, combinée à un traitement analgésique. Après une chirurgie, les animaux seront transférés dans une cage elle-même chauffée grâce à un matelas chauffant jusqu’à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leurs groupes d’origine afin d’éviter le stress lié à l’isolement et observés et pesés chaque jour pendant cinq jours. Ensuite, en plus d’une inspection visuelle quotidienne, des relevés de poids seront réalisés au moins 2 fois par semaine et d’éventuels signes de douleur seront recherchés. Si les animaux montrent de tels signes, ils recevront un traitement adapté.

Choix des espèces

La souris est une des espèces majoritairement utilisées dans le domaine scientifique pour l'étude des maladies neurodégénératives. Son utilisation permet ainsi une comparaison directe des résultats obtenus avec les données disponibles dans la littérature scientifique. De plus, un grand nombre de modèles de SLA ont été générés et caractérisés chez la souris. La génétique de la souris est très documentée et proche de l’homme ce qui en fait un modèle privilégié pour nos travaux visant à préparer une demande d’essai clinique. Ce projet vise à caractériser le rôle neuroprotecteur de EN1 dans un modèle murin de la SLA ainsi qu’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent la mort des MNs spinaux chez la souris En1+/-. Les premiers signes de neurodégénérescence étant observés à l’âge de 3 mois, nous prévoyons d’injecter la protéine hEN1 à cet âge afin de pouvoir évaluer sa capacité à bloquer le phénomène dégénératif. Certaines de nos expériences seront également réalisées à des stades plus précoces (à partir de l’âge de 1 mois), afin de caractériser les déficits moléculaires intervenant en amont de la mort des MNs.

4776 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à trois chirurgies stéréotaxiques du cerveau puis une imagerie terminale d'environ deux heures sous anesthésie, avant d'être tuées, pour développer des techniques de microscopie et cartographier l'espace extracellulaire du cerveau sain et malade. Le porteur décrit surtout les nuisances liées à la chirurgie et au transport vers le centre d'imagerie. Il affirme qu'obtenir ces données sur l'animal sain et pathologique passe par des modèles reproduisant la complexité des maladies humaines.

Objectifs

Comprendre le fonctionnement cérébral est un enjeu sociétal majeur tant pour la connaissance générale de cet organe encore bien mystérieux que pour notre capacité à combattre et traiter les maladies neurologiques et psychiatriques. La compréhension de la vie intracellulaire des cellules cérébrales, comme les neurones, a connu une expansion incroyable au cours des dernières décennies, ouvrant par exemple la voie à des manipulations de l’activité des réseaux neuronaux. Cependant, le coeur de l’activité d’un réseau neuronal qu’est le passage d’information d’une cellule à l’autre à travers le milieu extracellulaire, reste malheureusement un processus très peu compris. La compréhension de cet environnement, où toutes les molécules de l’information cérébrale passent, reste très limitée à cause d’un manque de technologie permettant son étude en condition vivante. Le projet repose sur une capacité à développer de nouvelles approches de microscopie à haute résolution au service de l’étude de la communication cérébrale. Il a pour objectif de comprendre le fonctionnement cérébral en décryptant comment l’environnement extracellulaire du cerveau contrôle la communication entre cellules dans un contexte physiologique et dans des maladies neurodégénératives et psychiatriques. En effet, combattre les maladies neurologiques et psychiatriques nécessite une compréhension fine des désordres moléculaires en place, jusqu’à la diffusion des molécules à visée thérapeutique. L’utilisation du modèle rongeur permet d’acquérir des connaissances et de favoriser leur transfert à la clinique humaine.

Bénéfices attendus

Nous proposons d’utiliser deux nouvelles approches de microscopie super résolutive développées dans nos laboratoires pour fournir une description détaillée de l’espace extracellulaire et du réseau structurel de la matrice extracellulaire dans le tissu sain et pathologique : technique d’imagerie de nano-objets uniques (suivi des nanotubes/nanoparticules de carbone). Ces approches permettront de composer, à une échelle nanométrique, une carte de l’espace extracellulaire et de sa matrice dans les régions d’intérêt. C’est pourquoi, nous proposons à travers cette étude qui regroupe quatre laboratoires de caractériser l’espace extracellulaire via des technologies nouvelles et inédites de microscopie de super-résolution

Procédures

Chirurgie stéréotaxique (1h maximum), au maximum 3 chirurgies stéréotaxiques pour les modèles pathologiques sur 4 mois. Anesthésie pendant la chirurgie (1h) et en terminal pour l'imagerie (en moyenne 2h), une fois par animal.

Impact sur les animaux

Ils sont représentés par l’utilisation de la chirurgie stéréotaxique, mais bien cadrés par l’utilisation d’analgésiques adaptés et d’un suivi régulier des animaux. Ils sont aussi liés au transport des animaux entre leur hébergement et le centre d'imagerie, mais réduits au minimum dans le temps, avec un respect du maintien de la température.

Devenir

A l'issu des procédures tous les animaux seront euthanasiés soit à des fins d'imagerie (tranches) soit après l'imagerie in vivo.

Remplacement

L'étude de l'espace extracellulaire a connu des avancées récentes, grâce au développement de techniques comme la microscopie en super résolution appliquée aux modèles ex vivo. Pour compléter les connaissances sur le sujet il est nécessaire d'obtenir des données sur l'animal sain et pathologique, à travers des modèles animaux réalisés chez le rongeur. Nous souhaitons caractériser l’espace extracellulaire sain et pathologique, nécessitant l’utilisation de modèles animaux pouvant mimer la complexité des maladies chez l’humain. Pour la partie expérimentale sur tranche des tests de Student seront pratiqués, en revanche pour les études sur les modèles in vivo la comparaison des groupes sera effectuée grâce à une ANOVA.

Réduction

Cette étude concerne un consortium composé de 4 laboratoires français qui à la fin de l’étude récupèreront des échantillons afin d’effectuer des études histologiques ou biochimiques, complétant ainsi les études in vivo et ainsi la base de données scientifiques, limitant l’expérimentation animale à cette seule étude.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Ils sont acclimatés pendant deux semaines avant l'expérimentation. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité.

Choix des espèces

L'utilisation de souris dans le développement d'outil de microscopie en super résolution est pertinente dans cette phase de notre projet. En effet, la taille réduite de l'animal, son cycle de vie court et la disponibilté des modèles pathologiques permettent d'optimiser le développement d'outils pour l'imagerie in vivo de l'environnement extracellulaire. Les animaux seront utilisés à l'âge de 2 mois et jusqu'a 6 mois, pour permettre de travailler avec des animaux sains et pathologiques adultes.

540 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une à trois chirurgies cérébrales pour implanter cathéter, électrodes ou fibres optiques, et 520 d'entre eux s'auto-administrent de la cocaïne chaque jour pendant deux à trois mois, pour étudier les effets d'une stimulation cérébrale profonde sur l'addiction. Le porteur indique que les rats peuvent perdre du poids, se gêner du bloc de ciment dentaire fixé sur le crâne et se battre entre partenaires de cage. Il affirme que l'étude des comportements de consommation exige un animal vigile et libre de ses mouvements, faisant du rat un modèle qu'il juge irremplaçable.

Objectifs

L'addiction, notamment à la cocaïne, est une maladie psychiatrique pour laquelle il n'existe pas de médication efficace. Ainsi, les approches chirurgicales, telles que la stimulation cérébrale profonde (SCP) sont désormais envisagées pour réduire les comportements addictifs liés à la consommation de drogues. La SCP consiste en l’implantation d’électrodes de stimulation dans des zones profondes du cerveau afin de normaliser l’activité neuronale, responsable de comportements pathologiques en injectant des impulsions électriques à haute fréquence. Bien qu’utilisée avec succès chez l’homme, notamment pour la maladie de Parkinson et la dépression, les mécanismes cellulaires responsables des effets bénéfiques de la SCP restent largement méconnus. Nos données récentes obtenues chez le rat indiquent que la SCP du noyau subthalamique permet de réduire certains comportements pathologiques liés à l’auto-administration de cocaïne. Le but de ce projet est de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables des effets bénéfiques de la SCP sur les comportements de type addiction chez le rat.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de découvrir quels sont les substrats cellulaires et moléculaires du STN ciblés par le SCP pour produire ses effets bénéfiques sur les comportements addictifs. Pour cela, nous utiliserons un nouveau protocole comportemental, qui recrée fidèlement les conditions observées chez l'humain, en permettant l'observation concomitante de l'émergence de l'escalade de la cocaïne et de sa recherche compulsive. Les enregistrements électrophysiologiques sur tranches permettront de caractériser les neuroadaptations induites par la cocaïne dans le NST et de déterminer comment celles-ci sont affectées par la SCP. Ce projet permettra également de caractériser le rôle de la connexion préfrontale-NST dans les comportements addictifs. Ce projet générera des résultats à fort impact translationnel, apportant de nouvelles perspectives sur la physiopathologie de l’addiction, et confirmera le potentiel de la SCP du NST pour le traitement de cette pathologie.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet seront soumis au moins une fois à un acte chirurgical, réalisé sous anesthésie générale et analgésie adaptée. 180 animaux seront soumis à un seul acte (160 implantés avec un cathéter, 45 min ; 20 injectés avec un virus, 60min). 180 animaux seront soumis à deux actes (implantation de cathéter, 45min, + électrodes de stimulation, 90min). 180 animaux seront soumis à trois actes chirurgicaux chirurgies (injection de virus, 60min, + implantation de fibres optiques, 90min, + cathéter, 45min). 520 animaux s'auto-administreront la cocaïne quotidiennement durant 2-3 mois, entre 2h et 8h par jour.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les conséquences ‘classiques’ à court terme des interventions chirurgicales. Dans les jours suivant l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids, présenter une activité réduite. Dans le cas de l’implantation d’électrodes ou de fibres optiques, les animaux peuvent ressentir une gêne due au poids du chapeau protecteur fait en ciment dentaire. Plus rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. Les animaux sont suivis quotidiennement les jours suivant l’opération afin d’anticiper et de soulager une nuisance potentielle. En général, ces nuisances s’estompent en 2-3 jours. Les animaux sont isolés durant cette période. Un autre type de nuisance, pouvant engendrer du stress, est l’appariement fait entre les animaux de façon aléatoire à la réception des individus. Lorsque l’alimentation devient contrôlée (les animaux ne sont pas restreints, mais pas ad libitum), un sujet très dominant peut empêcher son partenaire de cage de s’alimenter correctement. Enfin, les matériaux utilisés pour fabriquer et maintenir les cathéters, électrodes, ou fibres optiques, peuvent parfois provoquer des ‘bagarres’ entre partenaires de cage. En effet, les éléments en plastique, plus ou moins mous, les constituant, peuvent être ‘rongés’ par l’un des rats, provoquant ainsi une gêne et/ou un stress chez l’autre individu. Suivant les sessions d’auto-administration durant le protocole PIE, les animaux présentent une hyperactivité marquée, qui s’estompe en moins d’une heure (la dose i.v. de cocaïne est faible). Les symptômes de manque (perte de poids, agressivité…) sont rares, car les animaux ont accès tous les jours à la cocaïne.

Devenir

Afin d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques ex vivo, sur tranches, tous les animaux du projet seront mis à mort pendant ou à la fin de des procédures.

Remplacement

Ce projet a pour but d'étudier l'état fonctionnel d'un réseau cérébral dans une pathologie précise. L'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigil et libre de ses mouvements et choix. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, ne pouvant être remplacé pour ce genre d’étude.

Réduction

Notre approche, visant à réaliser des enregistrements électrophysiologiques chez des animaux préalablement soumis à un protocole comportemental, permet à elle seule de réduire le nombre d’animaux. Toutefois, dans l’optique de ne pas utiliser d’animaux plus que nécessaire, nous analyserons régulièrement les données expérimentales. Nous effectuerons a posteriori des tests de puissance statistique afin de calculer la robustesse statistique de nos résultats. Après obtention d’un effet robuste pour une condition donnée, nous cesserons de tester cette condition expérimentale. Par expérience, 10 animaux sont nécessaires par condition testée pour permettre de mettre en évidence un effet comportemental dans les protocoles d'auto-administration de drogues ; ce nombre prenant en compte l’exclusion de certains individus suite à d’éventuels problèmes inhérents à ce type d’étude (infection, cathéter bouché etc…). Pour les études combinant auto-administration et SCP et/ou de l'optogénétique, 15 animaux par condition testée sont nécessaires pour anticiper de possibles mauvais placements d'électrodes/fibres.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par 2 dans leur cage à l'animalerie, avec accès ad libitum à l'eau. La nourriture sera contrôlée afin de garder les animaux motivés. Les cages sont enrichies grâce à la présence d'objets divers et variés (bâtonnets en bois, rouleau en carton…changés régulièrement afin de diversifier au maximum l'environnement des animaux). La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si besoin par injection d'analgésiques spécifiques. L'état de santé général de tous les animaux de l'étude est suivi quotidiennement, ce qui nous permet de réagir immédiatement et de manière appropriée en cas de besoin. En cas de souffrance (prostration, poils hérissés, absence de toilettage, dos courbé...) et/ou de perte importante de poids, l’animal sera isolé et aura accès ad libitum à une nourriture enrichie. Un traitement antidouleur pourra être administré si besoin (méloxicam 0,5mg/kg, 0,25ml, sc). Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie appropriée.

Choix des espèces

Le rat est un modèle animal de choix pour l'étude de l'addiction. Les modèles comportementaux de référence sont connus et maîtrisés, et il existe de nombreux tests comportementaux permettant de tester les différents symptômes de la pathologie. Par ailleurs, l'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigile et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, puisqu'il s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l'homme. Afin d'améliorer la qualité des enregistrements électrophysiologiques, et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous réaliserons nos expériences chez de jeunes adultes 7-8 semaines (environ 200g), un stade du développement cérébral en adéquation avec notre question scientifique.

572 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous subissent une chirurgie d'injection intracérébrale, 180 reçoivent une canule fixée au crâne reliée à une source lumineuse, et 540 sont soumis à une restriction alimentaire jusqu'à douze semaines pour les maintenir à 90 à 95 % de leur poids, afin d'étudier comment le cerveau calcule la valeur d'une décision. Le porteur indique que la chirurgie présente des risques d'infection, d'hypothermie et de douleur. Il affirme que ces fonctions cognitives ne peuvent s'étudier que sur des "organismes entiers" et retient le rat pour ses capacités jugées "plus évoluées que la souris".

Objectifs

Chaque jour, nous prenons des décisions pour maximiser la récompense. Pour y parvenir, nous et les autres animaux devons déterminer la valeur des différentes options. Les preuves suggèrent que cette évaluation n'est pas nécessairement guidée par la valeur absolue ou attendue d'une option, mais au contraire, les valeurs de décision sont souvent relatives et dépendent du contexte dans lequel elles sont présentées. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre comment la valeur est calculée dans le cerveau des mammifères pour guider la prise de décision en s'appuyant sur l'existence de processus cognitifs de base similaires chez les rongeurs et les humains.

Bénéfices attendus

Ce projet fournira une compréhension importante de la façon dont la valeur est calculée dans le cerveau pour guider la prise de décision. Un certain nombre de troubles neuropsychiatriques sont caractérisés par des déficits cognitifs, y compris de faibles capacités de prise de décision. Cette recherche nous permet d'examiner comment le cerveau prend des décisions et comment la communication entre les régions corticales oriente nos décisions. Par conséquent, ce projet améliorera non seulement notre compréhension fondamentale des processus cognitifs complexes, mais il pourrait également nous aider à mieux comprendre les troubles neuropsychiatriques impliquant des déficits dans la prise de décision.

Procédures

Dans ce projet, tous les rats subiront une intervention chirurgicale pour une injection intracérébrale et 180 rats seront également implantés avec une petite canule fixée au crâne. Pour ces 180 rats, une source lumineuse sera connectée à la canule pendant la tâche comportementale. Tous les rats seront mis à mort pour des analyses post-mortem. La majorité des rats (540/572) recevront également un entraînement comportemental, qui nécessite une restriction alimentaire pour une durée maximale de 12 semaines.

Impact sur les animaux

Tous les rats subiront une intervention chirurgicale qui présente des risques potentiels d'infection, d'hypothermie, et de douleur. Les tâches cognitives nécessitent une restriction alimentaire légère pendant 12 semaines. Chaque jour, les rats sont pesés et reçoivent une quantité de nourriture allouée pour les maintenir à 90-95% de leur poids normal (~ 12-15 grammes de nourriture par jour).

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives complexes ne peuvent, par définition, s’étudier que chez les organismes entiers. L'utilisation d'animaux dans ce projet est nécessaire car nous ne pouvons pas mener ces expériences sur des sujets humains. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche in silico faisant appel à la modélisation informatique est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous avons calculé le nombre de rats minimal par groupe (15 rats/groupe) pour obtenir des résultats significatifs et exploitable. Donc le nombre total d'animaux requis pour ce projet est de 512 rats sur 5 ans. Le recours à des méthodes réversibles permet de limiter fortement le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

Les rats sont hébergés dans des cages collectives avec un milieu enrichi (un tunnel, matériel de nidation, et un bâton à ronger), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière (vérifié chaque jour). Pour les procédures chirurgicales, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi post-opératoire sera effectué quotidiennement pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites associés à des actions sont identifiés (ex. critères de perte de poids, comportement anormal) pour le cas où les mesures de prises en charge de la douleur et de l’inconfort pouvant résulter de l’étape chirurgicale ne seraient pas suffisantes.

Choix des espèces

D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont en effet largement conservés à travers les espèces de mammifères. De plus de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rongeur des aptitudes cognitives complexes. Les rats ont été sélectionnés pour ce projet car ils sont grégaires, intelligents et présentent de nombreuses capacités comportementales similaires aux sujets humains. Les analyses anatomiques et fonctionnelles détaillées utilisées dans ces expériences s'appuient sur une richesse de connaissances sur la structure anatomique et la neurochimie du rat. Par ailleurs, le rat est généralement considéré comme ayant des capacités cognitives plus évoluées que la souris et la taille supérieure du rat nous permet de réaliser des interventions plus spécifiques au niveau central. Nous utilisons pour ce projet de jeunes adultes âgés de deux mois environ au début des expériences. Le projet consiste à identifier les principes de fonctionnement des circuits neuronaux sous-tendant la prise de décision. Les animaux utilisés seront donc tous adultes âgés de deux mois environ au début des expériences.

303 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie de lésion du cerveau par injection d'une toxine et la pose d'un cadre métallique sur le crâne, puis des séances d'imagerie et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé, pour étudier la connectivité cérébrale dans deux modèles de la maladie de Parkinson. Le porteur indique que la chirurgie de lésion réduit la motivation à se nourrir pendant une semaine environ. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit la complexité du cerveau, ce qui rend selon lui le modèle animal "indispensable".

Objectifs

La maladie de Parkinson touche jusqu'à 4% des personnes âgées 65 ans ou plus et est la deuxième maladie neurodégénérative la plus répandue. Elle est causée par une perte de neurones dopaminergiques entraînant des symptômes moteurs et non-moteurs. La reconstitution des niveaux normaux de dopamine via l’administration d'un médicament est le traitement le plus courant de la maladie de Parkinson. Le médicament atténue de nombreux symptômes, mais pas tous, induit des mouvements musculaires incontrôlables, avec un taux d'incidence rapporté de jusqu' à 80%, après 5 à 10 ans de traitement chronique. La physiopathologie de la maladie de Parkinson et de ces mouvements incontrôlables induits par le médicament n'est pas entièrement comprise, mais des dérèglements structurels et fonctionnels des réseaux neuronaux cortico-sous-corticaux et des modifications du réseau et de la connectivité du cerveau ont été observés. Les techniques de neuro-imagerie fournissent des informations importantes sur la physiopathologie de la maladie de Parkinson, les mécanismes compensatoires potentiels et les effets liés au traitement. L’objectif de ce projet est d’évaluer, chez la souris, si la connectivité fonctionnelle des réseaux neuronaux est modifiée en fonction de l’état de dépletion de dopamine et de sa reconstitution. Nous utiliserons une technique d'imagerie de l'échographie rapide dans un modèle murin de lésion et un modèle murin génétique de maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier une modification de connectivité fonctionelle des réseaux neuronaux et des connectivité fonctionelles dans deux modèles différents de souris de la maladie de Parkinson. Cette technique sera hautement transposable puisqu'elle mésure le même paramètre physiologique, c'est-à-dire les changements de la perfusion cérébrale, que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle clinique et puisqu'elle produira des profils de réseau en corrélation avec la progression de la maladie et la réponse au traitement. Bien que le projet proposé soit une première étape pour déchiffrer les changements du connectome dans le cerveau de souris malades par rapport au cerveau de souris saines, nous envisageons que l'imagerie pourrait être utilisée dans le développement de médicaments, comme prédicteur de l'efficacité des médicaments et pour cribler de nouveaux candidats médicaments dans des modèles précliniques.

Procédures

Certaines souris subiront une chirurgie de lésion à l'aide d' une drogue et de preparation pour imagerie. Une partie des animaux sera soumise à des études d'imagerie fonctionnelle après une injection aiguë ou chronique de médicaments dopaminergiques. D'autres animaux subiront une évaluation comportementale par plusieurs tests comportmentaux. En tout, 240 souris subiront une chirurgie d'une durée de 20-30 min.

Impact sur les animaux

Certaines souris subiront une chirurgie : le montage d' un cadre metallique sur le crane, et d'autres subiront une opération supplémentaire : la chirurgie de lésion à l'aide d' une drogue. La chirurgie des lésions rendra les animaux moins motivés de se nourrir pendant environ une semaine.

Devenir

Tous les animaux seront mise à mort pour des analyses de tissus post mortem. Pour la fixation du cerveau, une perfusion intracardiaque avec une solution de paraformaldehyde sera utilisée et la procédure sera realisée sous une anesthésie générale profonde. Les tissus sont prélevés sur animaux morts.

Remplacement

Remplacement : A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire la complexité du cerveau, ce qui rend l’utilisation d’un modèle animal indispensable à la réalisation de ce projet. L’analyse de la connectivité sur animal éveillé n’a été mise au point à ce jour que chez la souris.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum nécessaire permettant une analyse statistique robuste des résultats grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes. Nous estimons que N=12 animaux sont suffisants par groupe. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Raffinement : Pour éviter toute souffrance, les procédures de chirurgie se feront sous analgésie et anesthesia générale. Les séances d'imagerie seront réalisées sur animal anesthesie et vigile dont la tête sera immobilisée mais dont le mouvement des pattes ne sera pas entravé ; des séances d'habituation seront effectuées au préalable. Les souris seront observées régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur,souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques.

Choix des espèces

Cette étude vise à étudier la connectivité cérébrale. Le cerveau est un organe dont le fonctionnement est extrêmement complexe, qu’on ne sait pas encore modéliser dans une boite de pétri ou sur ordinateur. Donc, nous devons faire appel à des modèles animaux. Notre choix s’est porté sur la souris car l’étude d’imagerie par ultrasons chez l’animal éveillé a été mise au point seulement dans cette espèce. Les animaux ayant atteint un poids corporel de 30 gr (âgés d'environ 4-6 mois) seront soumis à une chirurgie d'injection intracrânienne de 6-OHDA, les tests comportementaux auront lieu 3 semaines après, pour toutes les groupes expérimentaux.

380 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes, ils reçoivent de fortes doses de fentanyl ou d'autres opioïdes puis l'antidote, pour comparer les effets respiratoires et leur réversion. Le porteur indique attendre une sédation pouvant aller jusqu'au coma, une rigidité musculaire et, du fait des doses choisies, possiblement la mort. Il affirme que ces effets sur le système respiratoire ne peuvent s'étudier que sur un "animal entier".

Objectifs

Le fentanyl est un opioïde synthétique peropératoire dont l’efficacité analgésique en comparaison à l’intensité des effets secondaires est à l'origine de l'essor de son utilisation en particulier en anesthésie mais aussi dans la prise en charge de la douleur. L’utilisation du fentanyl exposerait néanmoins au risque de toxicité opioïde typique avec survenue d’un trouble de conscience et d’une dépression respiratoire ainsi qu’un risque de dépendance et d’abus. De plus, on observe une rigidité thoracique et diaphragmatique survenant très rapidement après injection, durant près de 15 min et pouvant conduire au décès rapide en l’absence de prise en charge immédiate et optimale. Il a par ailleurs été rapporté la nécessité de plus grandes doses de naloxone, l’antidote utilisé pour reverser les effets des opioïdes. Depuis récemment, le Center for Disease Control (CDC) américain considère que les opioïdes représentent désormais la première cause de mort toxique aux États-Unis, avec une contribution supérieure à 85% du fentanyl et de ses dérivés aux décès. Les effets neurorespiratoires délétères observés en clinique en cas de surdosage par les dérivvés du fentanyl ainsi que la particularité des décès qui leur sont attribués (survenue dans les minutes suivant l'injection d'une forte dose, rigidité musculaire entrainant la paralysie des muscles respiratoires), nous ont conduits à concevoir ce travail expérimental chez le rat, avec pour objectifs d’abord, de caractériser de façon comparative, la réponse ventilatoire et diaphragmatique après administration d’une dose élevée de différentes molécules opioïdes. Ensuite, on étudiera l’efficacité de la réversion de leurs effets neurorespiratoires respectifs par l'antidote de référence.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément les mécanismes et les spécificités de la toxicité neuro-respiratoire à la suite d'overdose aux dérivés opioïdes et ainsi permettre l'optimisation ou le développement de nouvelles thérapeutiques pour la prise en charge des patients intoxiqués.

Procédures

Pour les animaux de la procédure 1 : Procédure chirurgicale (30 mins) et injection de substances (1-2 injections; 5 - 10 secondes). Pour les animaux de la procédure 2 : Procédure chirurgicale (30 mins), injection de la substance étudée (1 injection; 5 secondes) et prélevements sur animaux vigiles (8 prélèvements; environ 1 min). Pour les animaux de la procédure 3 : Procédure chirurgicale (45 mins) et injection de substances (1-2 injections; 5 - 10 secondes).

Impact sur les animaux

En raison du contexte d’exposition des animaux et des effets recherchés dans ce projet, on s’attend à plusieurs effets secondaires à l’utilisation des dérivés opioides y compris : Sédation allant d’une réduction de l’activité locomotrice jusqu’au coma, myoclonies, rigidité musculaire, ou encore l'élévation non contrôlée de la queue. De part le choix de la dose, on s’attend possiblement au décès. La présence de ces effets, leur durée ainsi que leur intensité varient en fonction de l’opioïde utilisé. De plus, les procédures 2 et 3 nécessiteront l'hébergement en cage individuelle des rats à la suite de leur chirurgie et jusqu'à la fin de la procédure.

Devenir

La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de l'appareillage de télémétrie ou de l'atteinte d'un point limite (atteinte du volume sanguin de prélèvement maximal autorisé) qui requiert la mise à mort des animaux.

Remplacement

L’ensemble des procédures ne sont pas remplaçables par des expériences in silico ou in vitro, en raison d’une approche physiopathologique du système respiratoire intégrée sur animal entier.

Réduction

Par nos expériences passées sur les mêmes modèles animaux, il est estimé qu’un groupe de 6 animaux exploitables est suffisant pour appliquer une analyse statistique et mettre en évidence des différences le cas échéant. Ce nombre est prédéterminé à l’aide du logiciel InVivoStat® (Essex, Royaume-Uni). Pour tous les tests, une valeur de p

Raffinement

Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié et la mise en place de points limites adaptés permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par des antalgiques dans la limite du possible pour ne pas interférer avec l’expérience en cours et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire. L'ensemble des chirurgies de ce projet sera réalisé sous anesthésie générale associé à une analgésie péri-opératoire. Enfin, une ouate en silicone sera utilisée en post-opératoire pour permettre une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement.

Choix des espèces

La quasi-totalité des études expérimentales in vivo effectuées sur les dérivés opioïdes ainsi que sur la physiologie neurorespiratoire a été faite chez le rongeur, et principalement chez le rat. De plus, le rat est un bon modèle pour les études de pharmacocinétique ayant un métabolisme semblable à celui de l’Homme. De par sa taille, les prélèvements sanguins, ainsi que la pose des sondes de télémétrie sont plus aisés et donc plus reproductibles. Enfin, les prélèvements sanguins peuvent se faire de manière repetée sur un même animal permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire dans ces études. Nous utiliserons des rats Sprague-Dawley adultes, âgés de 8 à 9 semaines (jeunes adultes, poids : 250-350 g) au moment de l’expérimentation. Ce stade de développement a été choisi par analogie avec la littérature.