Système nerveux

2 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une stimulation magnétique du cerveau après une hypoxie. Selon les procédures, elles subissent une privation d'oxygène de quarante minutes à six semaines, quatorze jours de stimulation magnétique et des tests comportementaux, sous sédation profonde. Le porteur décrit des inconforts transitoires liés à l'hypoxie, à la stimulation et aux injections, et affirme que le cervelet ne peut être étudié hors d'un système nerveux entier. La plupart des souris sont mises à mort pour prélever le cerveau, tandis que 180 femelles ayant servi de mères sont renvoyées à l'élevage pour être réutilisées.

Objectifs

Notre projet testera les effets neurologiques de la stimulation cérébrale non invasive pour améliorer les déficits fonctionnels. Ces connaissances permettront d'optimiser des protocoles de stimulation et trouver des traitements potentiels. Nous analyserons les effets de différents patrons de stimulation magnétique répétée à faible intensité (LIrTMS), qui modifient la plasticité neuronale et améliorent le comportement chez les animaux pathologiques. Les fonctions cérébrales seront évaluées avec des tests de comportement, et les modifications structurales et fonctionnelles chez les mêmes animaux pour minimiser le nombre d’animaux utilisé. Ce traitement peut changer la signalisation cellulaire, modifier des réseaux neuronaux, et provoquer une réparation post-lésionnelle dans le cerveau.

Bénéfices attendus

Nous cherchons des protocoles pour traiter une pathologie commune chez l’Homme, l’hypoxie cérébrale. Nous étudierons le cervelet parce qu’il est particulièrement sensible à l’hypoxie; sa structure, sa fonction et son développement sont très bien décrits; son dommage lors du développement est associé avec les maladies neurodéveloppementales; et il est touché par le vieillissement.

Procédures

4 interventions au maximum. Procédure 1 : 40 minutes d’hypoxie ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 30 minutes/jour, un maximum de 12 jours ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes Procédure 2 : hypoxie 6h/jour x 10 jours ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 30 minutes/jour, un maximum de 14 jours ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes Procédure 3 : hébergement en cages hypoxie pendant 6 semaines, hypoxie intermittente 6h/jour ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 60 minutes dans 1 journée ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes

Impact sur les animaux

Les interventions individuellement induisent une douleur en deca de la douleur engendrée par une simple injection faite selon le bon pratique vétérinaire. La succession de ces interventions nous emmène à demander l’autorisation du projet avec degré de gravité modérée. Les effets indésirables possible sont : inconfort transitoire en début d’hypoxie ; inconfort lors de la stimulation; inconfort lors des tests de comportement ; inconfort lors de l’injection d’anesthésiants et analgésiants. La surveillance quotidienne permet de s’assurer du bien être des animaux et lorsqu’un point limite (comme décrit) est atteint, les responsables du projet sont avertis et prennent une décision sur le devenir de l’animal, en lien avec la structure du bien être animal, et le vétérinaire référent.

Devenir

Nos études sont designés pour obtenir un maximum d'information biologique et comportemental d'un nombre minimum de souris. La plupart des souris sujet à l'hypoxie et la stimulation non invasive est testé en comportement puis perfusé, et les cerveaux des autres sont prélévé pour les études moléculaires. 180 souris femelles, les mères des portées des nouveaux-nés impliqués, seront remis dans l’animalerie, pour qu’elles soient re-utilisées pour l’élevage et diminuer donc le nombre total d’animaux.

Remplacement

Comme toute structure du système nerveux central, les connexions complexes entre les neurones ne peuvent pas être entièrement remplacé par des méthodes de culture ni des modèles mathématiques. Les déficits de comportement dus à une mutation associée avec les troubles autistique, ou à la suite d'une hypoxie perinatale, et l'amélioration de ces déficits ne peuvent être étudiés hors contexte de l'ensemble du système nerveux et donc avec des animaux vivants.

Réduction

2700 animaux total seront impliqués dans cette étude de 4 années. Nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaire pour les trois procédures, pour diminuer le nombre d'animaux utilisé. Les tests de comportement nécessitent normalement 10 animaux par groupe, et les études d'expression génique nécessitent 5 animaux par groupe.Un calcul de puissance a été fait pour déterminer ces nombres d'animaux.

Raffinement

Avant le début des interventions, nous habituons les animaux au contact humain en pratiquant du « handling » quotidien pendant une semaine ; ceci diminue leur peur et leur angoisse. Pendant la stimulation non invasive (LIrTMS) les animaux ne montrent aucun signe d’angoisse. Les animaux sont hébergés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Les points limites sont définis pour chaque procédure, en cas de dérèglement physiologique ou souffrance de l’animal. Tout acte invasive est fait uniquement après administration des médicaments analgésique ou anésthetiques adaptés.

Choix des espèces

La souris est très utilisée pour des expériences sur le système nerveux car cette espèce partage un nombre de propriétés biologiques avec l'Homme. Sa petite taille et l'existence des lignées de souris transgénique facilitent les aspects pratiques de l'expérimentation. Il existe de protocoles standardisés du comportement, ce qui permet de mieux comparer les résultats obtenus par différentes équipes de recherche. La majorité des animaux seront utilisés pendant les premier mois de développement postnatal, les âges clés pendant le développement du cerveau. Les ages ont été choisi pour être équivalentes au 1) le 3ème trimestre de gestation chez l’Homme ; 2) jeune adulte ; ou 3) adulte agé.

3 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour enregistrer l'activité de leur cortex pendant des tâches visuomotrices. Chaque animal subit deux chirurgies d'implantation d'électrodes d'environ douze heures, une IRM sous anesthésie, une restriction hydrique partielle entraînant une perte de poids, et une contention quotidienne en chaise d'une à trois heures, cinq jours par semaine, pendant quatorze à quarante-huit mois. Le porteur décrit un stress lié à la capture à la canne, au masque de contention et à l'isolement post-opératoire, ainsi qu'un risque de douleur et d'infection autour des électrodes. Le champ structuré du devenir est vide, et le texte indique que les animaux sont mis à mort pour vérifier la position des électrodes, sauf ceux réutilisés dans un autre projet ou, pour les femelles, renvoyés à l'élevage.

Objectifs

Les comportements sensorimoteurs résultent de traitements parallèles dans de multiples aires cérébrales. Le cortex pariétal « associatif » joue un rôle central dans les transformations sensorimotrices, mais les aires longtemps considérées comme purement visuelles peuvent être modulées par un mouvement de la main, et les aires considérées purement motrices peuvent être activées par des stimuli visuels. Cela suggère l’intervention de nombreuses boucles proactives et rétroactives entre les aires pendant ces comportements. Ce projet a pour but d’explorer les dynamiques intra- et inter-aires des réseaux corticaux fronto-pariétaux impliqués dans la planification de l’action et les processus attentionnels nécessaires à la mise en place et l’exécution des comportements sensorimoteurs. Ces dynamiques sont largement influencées par l'état du cerveau et ce projet les comparera au cours de différents états cérébraux allant de l'anesthésie et de l'état de repos à l'attention sélective et aux différents niveaux de prévisibilité. Pour cela, nous utiliserons des techniques d’enregistrements électrophysiologiques intracorticaux (potentiels d’actions des neurones individuels et potentiels de champs locaux). Les données seront recueillies chez des macaques rhésus en utilisant des matrices d’électrodes laminaires chroniques. Deux aires motrices et deux aires pariétales ayant une complémentarité fonctionnelle somatosensorielle et visuelle seront enregistrées simultanément. Ce modèle animal sera utilisé pour l’analogie qu’il partage avec l’homme au niveau de la structuration du réseau fronto-pariétal, de l’organisation laminaire des couches corticales, et de la coordination sensorimotrice et visuelle lors de l’exécution motrice. Les données recueillies seront partagées avec la communauté scientifique, pour permettre de compléter et étendre les connaissances existantes sur l'organisation corticale, au-delà de nos objectifs scientifiques dans ce projet spécifique. Elles pourront notamment permettre d’étendre et d’affiner les modèles computationnels récents pour décrire les réseaux corticaux qui sous-tendent l’attention et la planification du mouvement.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu, à court et moyen terme, est l’élargissement des connaissances sur les réseaux fronto-pariétaux impliqués dans les comportements sensorimoteurs. Le jeu de données récolté sera d’une précision spatiale et temporelle inédite et couvrira différents états cérébraux. Les objectifs sont de : (i) Caractériser les réseaux fronto-pariétaux fonctionnels. Cela comprend la dynamique des réseaux intra-couches corticales, inter-couches corticales et inter-aires, et cela au travers de différents états cognitifs allant de l’anesthésie à l’attention sélective au cours de la réalisation d’une tâche visuomotrice. (ii) Quantifier la contribution des réseaux fronto-pariétaux à la communication neuronale ascendante et descendante. (iii) Caractériser la dynamique des activités neuronales unitaires dans et à travers différentes aires fronto-pariétales et couches corticales. Cela comprend les fréquences et la variabilité d’occurrence des potentiels d’action des neurones supposés excitateurs et inhibiteurs. Ces informations pourront être comparées à celles rapportées pour les aires sensorielles des primates et d'autres espèces de mammifères. (iv) Fournir ces jeux de données à la communauté scientifique pour contraindre/valider/étendre les modèles computationnels existants.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Déplacement au centre IRM pour acquisition d'images, sous anesthésie, 1 fois pour une durée d'environ 4h. - Chirurgies d'implantation de matrices d'électrodes, sous anesthésie, 2 chirurgies pour une durée d'environ 12h chacune. - La prise quotidienne de l'animal en chaise pour entrainement et enregistrements électrophysiologiques, environ 1h30 (jusqu'à 3h), 5 jours par semaine, durant 14 à 48 mois. - La prise de l'animal en chaise pour microstimulations, 20 sessions d'environ 1h30 (jusqu'à 3h). - La prise de l'animal en chaise pour enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie gazeuse, 20 sessions (habituation + enregistrement) d'environ 2h (jusqu'à 3h).

Impact sur les animaux

Ce projet utilisera des macaques rhésus qui entreront dans une procédure avec une sévérité classée modérée. La plupart des étapes de la procédure utilisée sera susceptible de créer une nuisance aux animaux. i) Les premières fois où les animaux seront mis en chaise pour leur venu dans le laboratoire pourront causer du stress lié à la prise de l’animal à l’aide d’une canne et à son déplacement depuis sa cage d’hébergement jusqu’à la chaise primate. Cela durera d’une à deux semaines bien qu’une habituation des animaux à la canne soit préalablement réalisée. ii) La restriction des mouvements de la tête des animaux à l’aide d’une masque de contention, nécessaire pour l’enregistrement des mouvements oculaires et électrophysiologiques, sera également source de stress lors des premières mises en place du masque. Pour cela, le masque est constitué de pièces détachables permettant de procéder à une habituation progressive. Nous pouvons tout de même prévoir plusieurs semaines de stress liées à la mise en contention dans le masque. iii) La restriction hydrique partielle liée au besoin expérimental pourra engendrer une perte de poids durant toute la durée de l’expérience. Les animaux seront donc pesés au minimum deux fois par semaine et surveillés quotidiennement afin de prévenir toute perte anormale de poids. iv) Malgré le traitement antidouleur, l’anesthésie et l’intubation de l’animal nécessaires aux procédures d’IRM et de chirurgie d’implantation des matrices d’électrodes pourront créer de la douleur post-opératoire à l’animal durant plusieurs jours. v) Malgré la médication post-chirurgicale et l’inspection/nettoyage quotidien de la zone opérée, l’animal pourrait ressentir de la douleur et développer une infection liée à l’implantation des matrices d’électrodes. vi) Afin de laisser l’animal cicatriser, il devra être isolé durant une semaine du contact physique de ses congénères après l’opération d’implantation des matrices d’électrodes et cela pourrait créer du stress. vii) Durant les enregistrements sous anesthésie partielle mais pendant lesquels l’état d’éveil sera maintenu, un masque délivrant le gaz anesthésique sera fixé à la tête de l’animal et cela pourrait augmenter le niveau de stress de l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort. L'objectif de la mis a mort est de prélever le cerveau de l'animal en fin de projet afin de préciser par une analyse post-mortem la localisation et l'état de préservation des zones corticales ayant fait l'objet des enregistrements électrophysiologiques. En particulier, deux scenarios peuvent nécessiter une analyse post-mortem de la localisation et l'état de préservation des zones enregistrées. 1) Les données obtenues chez différents animaux sont très dissimilaire, mettent en question la bonne implantation dans les zones ciblées, ou le bon positionnement des matrices sur une zone corticale permettent une implantation perpendiculaire aux couches corticales. 2) Une mauvaise qualité des signaux électrophysiologiques, ou une forte détérioration des signaux à travers le période d’enregistrement peut suggérer un dommage important du tissue cortical autour des matrices. Cela sera important à considérer pour l’analyse des données, et pour une future utilisation du même dispositif chez d'autres animaux. Si chez certains animaux, après la fin de l'enregistrement des données, on estime qu'il n'est pas nécessaire de procéder à une vérification post-mortem, les animaux seront gardés en vie. Dans ce cas, le connecteur et les câbles pour les matrices seront coupés, laissant les matrices en place. La base de connecteur, sera explantée du crâne et la peau sera fermée et suturée. Apres une récupération complete de leur état de santé et de bien-être général, les animaux gardés en vie peuvent 1) si possible, être inclus dans un autre projet basé sur un dispositif expérimental similaire, permettant d’éviter l’utilisation des autres animaux naïfs. Les animaux réutilisés seront déjà habitués au contexte expérimental (interactions quotidiennes avec l’homme, mise en chaise, travail dans le dispositif expérimental). Sinon, 2) en particulier les femelles peuvent retourner dans un établissement éleveur pour être inclues dans une programme d’élevage.

Remplacement

Le projet implique l'utilisation d'animaux car à ce jour, il n'existe pas d'alternatives expérimentales permettant de répondre aux objectifs. Aucune simulation informatique ou culture cellulaire ne peut remplacer le modèle animal vivant pour l'étude des substrats neuronaux de comportements visuomoteurs complexes. Les techniques électrophysiologiques utilisées dans le projet, permettant une mesure de l'activité de neurones unitaires, bien qu'utilisées en milieu clinique, restent trop invasives pour être utilisées chez l'homme pour des approches expérimentales.

Réduction

Les procédures chirurgicales prévues comportent un certain risque. En outre, la qualité des enregistrements à long terme est difficile à évaluer, car l'implant que nous utiliserons est récent. Nous prévoyons d'inclure un maximum de trois animaux dans cette étude. Si nous obtenons suffisamment de données (neurophysiologiques et séances comportementales) pour une analyse statistique satisfaisante chez deux animaux, nous n'utiliserons pas de troisième animal. Pour chaque animal, l’enregistrement avec plusieurs matrices multi-électrodes permettra de mesurer l’activité de populations neuronales dans plusieurs structures corticales. Le nombre de neurones enregistrés peut varier d’une matrice à l’autre en fonction du succès de la procédure d’implantation. La richesse des enregistrements multi-électrodes offre la possibilité de réaliser de très nombreux types d’analyses portant sur les potentiels d’actions de neurones isolés (modulation de fréquence de décharges ou de synchronisation entre neurones dans différentes périodes de la tâche ou dans différentes structures), sur les populations de neurones (distribution spatiale de l’activité, moyennes de populations), sur les potentiels de champs locaux (LFP) et sur la synchronisation entre LFP et potentiels d’actions. La répétition des séances d’enregistrement sur une durée de 2 à 12 mois a pour objectif d’augmenter le nombre de neurones différents enregistrés dans chaque structure. Cette augmentation permet d’augmenter la puissance statistique de nos analyses, et d'évaluer la stabilité des modulations neuronales et comportementales détectées à travers plusieurs mois. La durée totale des enregistrements pour un animal est étroitement dépendante de la qualité du signal lors des premiers enregistrements et de sa stabilité sur long terme. De fait, elle ne peut être définie à priori.

Raffinement

La cage et volière de l’animal est enrichi de perchoirs, de cordes et de jeux suspendus, pour favoriser les comportements exploratoires de l'animal et aussi le retour à une activité normale en période post-chirurgicale. Après un délai minimal d'une semaine et selon l'état de récupération, l'animal sera sorti en chaise afin de reprendre une routine qui lui est familière. Les méthodes de renforcement positif (training et habituation) seront utilisées afin de réduire le stress des sujets. Le IRM anatomique pre-chirurgicale permet de mieux planifier l’implantation des matrices chroniques, pour bien atteindre les aires corticales ciblées. L'utilisation du masque de contention au lieu d’un plot de tête fixée sur l’os est moins invasive. Les matrices multi-électrodes de nouvelle génération permettent des enregistrements simultanés de neurones dans différentes aires et couches corticales, ce qui implique une réduction d'études et de sujets utilisés, comparé aux recherches effectuées avec des électrodes simples. Le connecteur pour l’implant dans le deuxième hémisphère sera connecté sur la même base de connecteur, déjà fixée sur l’os.

Choix des espèces

L’espèce macaque rhésus est l’espèce de primate non humain utilisée préférentiellement par des laboratoires de recherche étudiant les processus visuomoteurs. Ce choix s’appuie sur la proximité des systèmes visuel (vision diurne binoculaire et trichromatique) et moteur (utilisation du bras pour saisir et manipuler les objets) ainsi que celle de l’anatomie fonctionnelle du cerveau entre les macaques et l’homme. L’utilisation répandue des singes rhésus a permis l’optimisation des procédures d’entraînement ainsi que celle de la gestion de leur alimentation, de leur hébergement et des soins vétérinaires. Les macaques rhésus s’adaptent rapidement aux protocoles de conditionnement comportemental et présentent des performances comportementales très similaires à celles observées chez l’homme. Les animaux seront utilisés au stade de jeune adulte/adulte. A ce stade du développement, les animaux ne sont plus en croissance et leurs besoins physiologiques sont stabilisés. Cela permet un contrôle plus précis des protocoles expérimentaux, que ce soit en termes de volume des récompenses utilisées pour l'apprentissage par renforcement, de contrôle du régime alimentaire dans la cage ou de localisation des structures cérébrales cibles pour les implants chirurgicaux. Par ailleurs, les animaux étant encore jeunes, ils présentent une meilleure tolérance aux procédures expérimentales et une meilleure récupération suite aux procédures nécessitant une anesthésie.

1 402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées à des additifs alimentaires de la vie in utero à l'âge adulte, elles subissent deux tests comportementaux au sevrage et huit à l'âge adulte, dont le porteur ne précise pas la nature. Il affirme que ces tests ne durent que quelques minutes et n'induisent pas de stress majeur, et que l'exposition alimentaire ne peut être étudiée que sur des animaux vivants. Toutes les souris sont mises à mort pour des analyses biochimiques et cellulaires.

Objectifs

Le projet porte sur l’étude de l’impact d’une exposition chronique à des additifs alimentaires sur la mise en place du cerveau et de ses fonctions depuis la vie in utero jusqu’à l’âge adulte, en observant la régulation et les fonctions microgliales ainsi que le développement cérébral et le comportement

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats permettra de mettre en avant l’importance de la période périnatale ou non dans l’exposition aux additifs alimentaires, d'explorer le devenir périnatal des additifs alimentaires, et d’en évaluer les effets sur les fonctions cérébrales des descendants, jusque dans leurs intéractions directes. Ceci permettra de d’accroitre les connaissances scientifiques sur les additifs alimentaires qui sont largement critiqués voir prohibés dans l’alimentation et de valider ou non leur lien avec des altérations comportementales, neurologiques et moléculaires.

Procédures

Tests comportementaux au sevrage (2 tests) et à l’age adulte (8 tests) – quelques minutes par test

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux.

Devenir

tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de réaliser des analyses biochimiques et cellulaires lors des différents temps d'exposition proposés dans le projet.

Remplacement

L’étude de l’exposition à des additifs alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au mieux grâce à l’utilisation de tests statistiques montrant la différence entre plusieurs groupes.

Raffinement

Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux l'inconfort (manipulation régulière et hébergement en cage collective avec enrichissement, utilisation d'antalgiques) des animaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent et reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier notamment le cerveau et son fonctionnement (test comportementaux et électrophysiologie). Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6. Les souris mâles et femelles reproducteurs seront utilisées à l’âge adulte (8 semaines) afin qu’ils soient capables de procréer et leurs descendants seront utilisés au sevrage ou à l’âge de 3 mois selon les procédures. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition périnatale suivie d’une exposition post-sevrage sur le développement des fonctions cérébrale, ainsi que son maintien chez l’adulte.

550 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de fixation d'une pièce métallique sur le crâne, une restriction hydrique et, pour une partie, une perfusion intracardiaque terminale, afin d'enregistrer l'activité de neurones pendant des tâches olfactives. Les souris sont maintenues assoiffées, la totalité de leur eau quotidienne servant de récompense pour les faire travailler dans le dispositif, où elles doivent aussi éviter des bouffées d'air ou d'eau salée. Le porteur affirme que la souris est le seul mammifère au système olfactif proche de l'humain et qu'aucune approche in vitro ou in silico ne peut répondre à ses questions.

Objectifs

Les odeurs ont une capacité unique à nous transporter dans des moments reculés de notre passé, notamment ceux associés à des émotions fortes. Elles jouent également un rôle très important dans les choix que nous faisons au jour le jour, notamment lorsqu’il s’agit de notre alimentation. Mais qu'est-ce qui, dans le système olfactif, confère aux odeurs ces propriétés particulières ? Dans cette étude, nous étudierons les voies anatomiques et les mécanismes physiologiques par lesquels les odeurs laissent une empreinte émotionnelle si forte dans nos mémoires.

Bénéfices attendus

Cette recherche peut fournir des indications importantes sur les mécanismes neuronaux qui attachent une valence hédonique à un objet. Dans de nombreux troubles neurodégénératifs, à mesure que la maladie progresse (en particulier dans le cas de la dégénérescence du lobe frontal), les patients souffrent car ils sont moins connectés au monde qui les entoure. La valeur qu'ils attribuent à différents éléments peut être déformée, ce qui peut entraîner des changements radicaux dans leur personnalité, inquiétants pour eux et leurs proches. Si cette recherche permet de découvrir l'ensemble des connexions qui attribuent une valeur émotionnelle aux odeurs, elle peut donner un aperçu de la physiopathologie de ces troubles. Outre les maladies neurodégénératives, des études récentes ont également montré que les enfants atteints de troubles du spectre autistique (TSA) n'adaptent pas leur comportement de reniflage lorsqu'on leur présente des substances odorantes aversives ou appétissantes, alors que les enfants au développement normal le font. Cela suggère une déconnexion entre l'intégration des informations sensorielles et les processus de mémoire émotionnelle dans les TSA, et ce travail pourrait permettre de comprendre comment les odeurs se voient attribuer une signification émotionnelle qui conduit à un comportement adaptatif.

Procédures

Dans cette étude, toutes les souris (550) subiront une intervention chirurgicale. Certaines souris (490) seront fixées à la tête et soumises à une restriction hydrique, et d'autres seront perfusées par voie intracardiaque à la fin de l'étude (460).

Impact sur les animaux

Dans cette étude, les souris seront placées dans un appareil comportemental dans lequel elles devront utiliser leur odorat pour trouver une récompense hydrique et éviter les petites bouffées d'air ou d'eau salée. Afin de pouvoir présenter les odeurs aux souris de manière précise et juste devant leur nez, nous devrons maintenir les souris au sein du dispositif comportemental qui permet de délivrer les odeurs. Ce maintien sera réalisé à l'aide d'une petite fixation métallique attachée à leur crâne au préalable. Pour les motiver à effectuer des tâches dans l'appareil, la totalité de l'apport en eau quotidien nécessaire aux souris sera fournie pendant les tests comportementaux.

Devenir

Sur les 490 souris soumises à une restriction hydrique, 90 seront mis à mort et 400 seront gardé en vie. Sur les 550 (y compris les 490 de la restriction hydrique) animaux qui subissent une intervention chirurgicale, 90 (le même 90 que la restriction hydrique) seront mis à mort et 460 seront gardés en vie. Ces 460 pourront être mises à mort et utilisé pour contrôles histologiques en fin d’expérimentation.

Remplacement

La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront une tâche comportementale : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est de 550 souris sur 5 ans. Les techniques d’enregistrement (électrodes très fines et lentilles à gradients d'indices) que nous prévoyons d’utiliser permettent de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés car un grand volume de données pourra être collecté sur plusieurs jours au sein d’un même animal. Ce nombre sera réduit davantage grâce à nos études pilotes qui permettront une optimisation des paramètres de nos expériences.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début de leur entraînement, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L'accoutumance à l'expérimentateur et aux conditions expérimentales permettra également aux animaux d'accomplir les tâches comportementales avec un minimum de stress.

Choix des espèces

Ce projet vise à comprendre les mécanismes neuronaux qui explique comment la valence hédonique d'une odeur affecte son encodage dans le cortex olfactif, et comment cette information est acheminée pour guider les comportements adaptatifs. Le cerveau doit donc être intact pour que les connections entre les différentes aires cérébrales soient maintenues et que nous puissions étudier leur interactions réciproques. De plus, nous étudions le fonctionnement des circuits neuronaux alors même que la souris est en train d’apprendre et d'exprimer leur préférences olfactifs : il nous faut donc travailler avec des animaux vivants et vigiles. La souris est la seule espèce de mammifère qui possède un système olfactif très similaire à celui des humains dans lequel nous pouvons entraîner les animaux à s'approcher et à éviter différentes odeurs tout en enregistrant et en manipulant l'activité dans des groupes de neurones génétiquement et anatomiquement circonscrits. La boîte à outils pour ces manipulations chez la souris est bien plus développée que pour tout autre organisme modèle. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. Par précaution par rapport à ce dernier point, nous utiliserons uniquement des animaux dont le poids est compris entre 20 et 45g.

1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Chaque animal reçoit des injections induisant une encéphalomyélite, modèle de sclérose en plaques, dont le porteur décrit les signes attendus, une faiblesse pouvant aller jusqu'à la paralysie des membres. Les souris sont suivies par un score clinique pendant 28 jours puis tuées pour prélever cerveau, moelle épinière et organes. Le porteur affirme que ce modèle est la seule alternative adaptée à l'étude des mécanismes immunitaires de la maladie.

Objectifs

Notre projet a pour objectif général de caractériser la composante immunitaire de l’inflammation chronique. Celle-ci est liée à des pathologies aussi diverses que les cancers, les maladies cardio-vasculaires et les maladies autoimmunes, notamment la sclérose en plaques (SEP), maladie autoimmune du système nerveux central (SNC), touchant plus de 100.000 personnes en France et 3 millions dans le monde. Il a en effet été montré que chez des patients atteints de SEP, les lymphocytes T régulateurs (Treg) perdent leur fonction suppressive. De plus, dans un environnement inflammatoire, l’identité même des Tregs est modifiée, menant à des modifications épigénétiques et phénotypiques, et aboutissant à une perte de leur capacité régulatrice. La compréhension de ces phénomènes pourrait pourtant permettre de mieux comprendre le déficit fonctionnel des Treg au cours de la SEP, et de définir des cibles thérapeutiques et donc de nouveaux traitements de cette pathologie. Les modèles animaux de SEP permettent, contrairement à ce qui est possible chez les patients, d’étudier l’inflammation locale. L’objectif de ce projet est d’étudier les modifications d’identité des Tregs au cours de l’inflammation chronique dans un modèle de SEP, l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE) chez la souris.

Bénéfices attendus

La SEP est une maladie extrêmement invalidante, réduisant l’espérance de vie, induisant un coût social important et touchant plus de 3 millions de patients dans le monde. Les traitements actuels permettent dans certains cas de ralentir la progression de cette pathologie, mais l’arsenal thérapeutique n’est encore pas assez développé, et bon nombre de patents ne répondent pas, ou plus, aux traitements. Cette pathologie a pour origine un dysfonctionnement du système immunitaire dont les mécanismes ne sont pas encore bien identifiés. Les recherches portant sur la compréhension de ces mécanismes immunologiques sont indispensables à l’élaboration de nouveaux traitements de la SEP. Le système immunitaire formant un système complexe dont la globalité n’est pas pleinement reproductible in vitro, les modèles animaux de cette maladie permettent de mieux comprendre les étapes cellulaires et moléculaires à l’origine de l’initiation, du développement et de l’entretien des atteints du SNC caractérisant la SEP et menant au handicap qui en résulte. Les bénéfices attendus de notre projet sont, à court terme, de comprendre les mécanismes immunitaires de l’inflammation chronique du SNC dans le modèle d‘EAE pour, à plus long terme, définir des cibles thérapeutiques qui constitueront la base de nouveau traitements de la SEP chez les patients.

Procédures

2 injections sous cutanées et 2 injections intra-péritonéales en 2 jours, sur animaux vigiles, d'une durée de moins d'une minute par injection. Un prélèvement de sang rétro-orbitaire sous anesthésie générale (1 à 2 minutes pour le prélèvement, environ 1h d'anesthésie) une semaine avant le début des injections et un prélèvement de sang intra-cardiaque (1 à 2 minutes de prélèvement) sous anesthésie générale terminale également en fin d'expérimentation. Les traitements seront réalisés quotidiennement par voie orale (moins de 2 minutes) ou intra-péritonéale (moins de 1 minute) dans un volume maximum de 0.2 ml et dilués dans de l’eau ou du PBS, au maximum pendant toute la durée de l’expérience, soit 28 jours. Le scoring (environ 2 minutes par souris) sera effectué par examen clinique des animaux : simple observation de la queue (flaccidité ou non), des pattes postérieures et antérieures (mobiles ou non). L’état général des animaux sera évalué à chaque scoring. Le scoring sera réalisé trois fois par semaine pendant 28 jours.

Impact sur les animaux

Les effets attendus sont les signes cliniques de l’EAE : perte de mobilité (faiblesse à paralysie des membres postérieurs et antérieurs) réversibles après 2 semaines en absence de traitement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Ceci permettra d'effectuer de nombreux prélèvements d'organes (cerveau, rate, moelle épinière, ganglions, moelle osseuse et sang) et de réaliser de nombreuses analyses in vitro complémentaires aux résultats cliniques obtenus.

Remplacement

Notre projet porte sur la compréhension de la physiopathologie d’une maladie autoimmune inflammatoire, la SEP. Aucun système in vitro ou in silico ne peut à l’heure actuelle reproduire la complexité des mécanismes cellulaires et moléculaires initiant et entretenant cette pathologie. Les modèles animaux de SEP, dont le principal est l’EAE, miment le développement de l’autoimmunité et le declenchement de l’inflammation chronique du SNC. Ils sont ainsi la seule alternative adaptée à l’étude des mécanismes immunitaires de la SEP.

Réduction

Cette étude utilisera un total de 1200 animaux. Le nombre de souris nécessaires dans chaque procédure est défini sur la base d'un calcul de puissance et des études réalisées historiquement dans le laboratoire. Le nombre de souris défini pour chaque groupe devrait être suffisant pour obtenir des données statistiquement exploitables. Nous avons tenu également compte d'une possible perte d'animaux liée à la procédure expérimentale. Des analyses statistiques seront réalisées pour obtenir une interprétation fiable des résultats. Sur les animaux seront prélevés sur chaque animal le sang, le cerveau, la moelle épinière la rate, les ganglions et la moelle osseuse afin d’obtenir un maximum d’information sur l’homéostasie immunologique dans les différents tissus et limiter ainsi la répétition d'expériences.

Raffinement

Les souris sont maintenues en groupe de plusieurs individus afin de respecter leurs besoins sociaux. Elles sont hébergées dans des cages enrichies avec du coton et des igloos pour améliorer leur bien-être. Une période d’adaptation est respectée avant le début de la procédure pour réduire le stress des animaux lié à leur transport. Toutes les conditions sont réunies pour prendre en compte la douleur des animaux, notamment avec la mise en place d'une anesthésie. Des points limites ont été définis pour limiter la souffrance des animaux sans remettre en cause les objectifs du projet et les données obtenues. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers et les expérimentateurs, Le score clinique précis des souris et évalué 3 fois par semaine par les expérimentateurs. L’euthanasie se fera sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le modèle de l’EAE existe chez la souris, le rat et le primate non humain. Il reproduit les signes cliniques, histologiques et immunologiques de la maladie humaine, la SEP. Le choix de la souris est de plus justifié par l’existence d’outils biotechnologiques (anticorps, dosage de molécules..) adapté à cette espèce. L’induction de l’EAE se fera sur des animaux de 5-10 semaines. Les scores cliniques de l’EAE seront évalués pendant 2 à 8 semaines après l'induction. L'âge des souris au moment de leur utilisation est déterminé par la maturation du système immunitaire