Système nerveux

620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par perfusion transcardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des injections virales par stéréotaxie et l'implantation d'une fibre optique ou d'une électrode, puis est mis à jeun pour être motivé lors de tâches cognitives sous imagerie cérébrale. Le porteur invoque la déclaration de Bâle et affirme qu'aucune lignée cellulaire ne reproduit le cerveau intact. Les bénéfices annoncés pour la schizophrénie ou l'autisme relèvent de perspectives de recherche fondamentale.

Objectifs

Des preuves expérimentales de plus en plus nombreuses indiquent que le dysfonctionnement du cortex préfrontal est à l'origine de déficiences cognitives et d'autres symptômes de la schizophrénie, de l'autisme, de la dépression, de la douleur chronique et d'autres troubles. Cependant, nous ne comprenons pas comment les circuits du cortex préfrontal fonctionnent normalement ni comment ils se dérèglent dans ces troubles. Nos objectifs sont 1) de caractériser les schémas anormaux d'activité des circuits qui peuvent se produire dans le cortex préfrontal et contribuer aux symptômes de ces troubles, et 2) d'identifier les mécanismes tels que la neuromodulation, la connectivité synaptique, les oscillations cérébrales, etc. qui contribuent aux schémas d'activité normaux et pathologiques. Nous espérons que ces études nous permettront d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces troubles. Ce projet se subdivise en 2 objectifs : 1. Analyser la dynamique neuronale et 2. l’importance fonctionnelle d’interneurones spécifiques pendant des comportements dépendant du cortex préfrontal in vivo.

Bénéfices attendus

Les maladies du cerveau ont des répercussions majeures sur la santé des individus, leur autonomie, leur éducation, leur emploi, leur mobilité et leurs relations personnelles, ce qui représente un lourd fardeau social et économique. Il est d'une importance fondamentale de comprendre les propriétés de base qui régissent la force, la gamme dynamique, l'étendue spatiale, la localisation anatomique et les composants moléculaires des connexions synaptiques entre des types de neurones spécifiques formant un réseau neuronal dans des états normaux et pathologiques. Plus précisément, on pense que le dysfonctionnement du cortex préfrontal est à l'origine de déficiences cognitives et d'autres symptômes de la schizophrénie, de l'autisme, de la dépression, de la douleur chronique et d'autres troubles. Cependant, nous ne comprenons pas comment les circuits du cortex préfrontal fonctionnent normalement ni comment ils se dérèglent dans ces troubles. Nos objectifs sont 1) de caractériser les schémas normaux et anormaux d'activité des circuits qui peuvent se produire dans le cortex préfrontal et contribuer aux symptômes de ces troubles, et 2) d'identifier les mécanismes tels que la neuromodulation, la connectivité synaptique, les oscillations cérébrales, etc. qui contribuent aux schémas d'activité normaux et pathologiques. Nous espérons que ces études nous permettront d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces troubles. Grâce à l'utilisation de souris génétiquement modifiées, nous serons en mesure de cibler des types de cellules et des réseaux spécifiques afin de fournir un cadre physiopathologique permettant de comprendre les maladies du cerveau.

Procédures

Procedure 1 : Imagerie calcique in vivo avec ou sans enregistrement électrophysiologique d'animaux éveillés se déplaçant librement pendant des tâches cognitives. Cette procédure utilisera 300 souris transgéniques, toutes les souris subiront insertion de gènes dans des souris adultes en utilisant des vecteurs viraux injectés par stéréotaxie (pour 30-40 minutes par animal), implantation de fibre optique pour imagerie et/ou d'un electrode (pour 30 minutes d’intervention), imagerie calcique in vivo et enregistrement de l’activité électrophysiologie sur des animaux libres de leurs mouvements s’il y a une electrode pendant la tâche de flexibilité cognitive (pour 1 à 3 heures d’intervention), et perfusion transcardiaque pour fixation de tissus. Procedure 2 : Stimulation in vivo avec ou sans enregistrement électrophysiologique d'animaux éveillés et libres de leurs mouvements pendant des tâches cognitives. Cette procédure utilisera 320 souris transgéniques, toutes les souris subiront insertion de gènes dans des souris adultes en utilisant des vecteurs viraux injectés par stéréotaxie (pour 30-40 minutes par animal), implantation de fibre optique pour imagerie et/ou d'un electrode (pour 30 minutes d’intervention), in vivo calcium imagerie et enregistrement de l’activité électrophysiologie sur des animaux libres de leurs mouvements s’il y a une electrode pendant la tâche de flexibilité cognitive (pour 1 à 3 heures d’intervention), et perfusion transcardiaque pour fixation de tissus. Ces expériences peuvent impliquer des injections IP de substances pharmacologiques, la mise à jeun des animaux pour les motiver associée à une tache comportementale (6 jours; n = 300)

Impact sur les animaux

En général, toutes les interventions sont bien tolérées par l'animal et n'affectent pas le phénotype général de la souris. Concernant la chirurgie des implants les nuisances comprennent douleur post opératoire, risque potentiel d’infection et de perte de l’implant. En ce qui concerne les expériences comportementales, les nuisances peuvent inclure stress de la msie à jeun associés à l’isolement et, stress de la manipulation.

Devenir

Procedure 1: Nous enregistrerons l'activité du cerveau de souris (300 souris) éveillées liée à des comportements normaux ou pathologiques. Procedure 2 : Nous manipulerons l'activité du cerveau de souris éveillées (320 souris) liée à des comportements normaux ou pathologiques. Ces expériences nécessitent des analyses anatomiques post-mortem (localisation anatomique des implants, injection de virus, expression de différents gènes). Il est donc nécessaire de prélever le cerveau. Dans ce but, tous les animaux seront mis à mort après fixation par perfusion transcardiaque.

Remplacement

Il n’y a pas d’autres alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car des modèles adéquats du circuit cortical contenant le nombre, les types et la localisation appropriés de récepteurs dans les réseaux excitateurs et inhibiteurs ne sont pas disponibles. L'objectif de nos expériences est de découvrir les actions des gènes, des neuromodulateurs et des médicaments sur les circuits neuronaux dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie des neurones des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, ces expériences ne seraient pas possibles avec la culture cellulaire. De plus, il n'existe aucun modèle remplaçant l'utilisation d'animaux qui permettrait d'étudier les phénomènes comportementaux et cognitifs proposés ici. Les procédures expérimentales maximiseront donc le bien-être des animaux en appliquant les principes de remplacement, de réduction et de raffinement. Plus précisément, le remplacement partiel/relatif des animaux sera exercé par la mise en œuvre de plusieurs techniques employées à partir d'un seul animal (c'est-à-dire l'imagerie calcique in vivo et les enregistrements électrophysiologiques) afin de maximiser la collecte de données.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (n = 620) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux seront implantés pour l'électrophysiologie et la photométrie par fibre simultanément, ou l'électrophysiologie et l'optogénétique simultanément afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur le même animal. Nos compétences chirurgicales permettront également de réduire le nombre de victimes chez les animaux et de minimiser les dommages durables. Toutefois, les avantages de la réutilisation des animaux seront mis en balance avec les effets négatifs sur leur bien-être, en tenant compte de l'expérience de toute une vie de l'animal. En outre, notre expertise dans l'entraînement des souris à la tâche de flexibilité cognitive réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon, et donc la signification statistique, dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Toutes les mesures visant à atténuer ou à minimiser la douleur, la souffrance, l'angoisse ou les dommages durables subis par l'animal seront prises. Les protocoles expérimentaux ont été affinés en faisant appel aux pratiques vétérinaires les plus modernes et en prévoyant des périodes de récupération pour réduire le stress et la souffrance des animaux. Plus précisément, la souffrance des animaux est évitée ou réduite au minimum. La douleur et/ou la détresse des animaux seront, le cas échéant, réduites par la sédation, l'analgésie, l'anesthésie ou tout autre moyen approprié pour réduire la douleur ou la détresse, conformément aux pratiques vétérinaires reconnues. Cette action respectera les principes de la déclaration de Bâle (www.basel-declaration.org), qui défend l'idée que les expérimentations animales dans la recherche fondamentale et appliquée doivent être planifiées et réalisées avec un soin extrême et qui contribue à fournir à la société des informations ouvertes et transparentes sur les expérimentations animales.

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits neuronaux chez la souris sont similaires à celles d’autres mammifères. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. Les phénotypes sont normaux, non dommageables. Les animaux reproducteurs sont maintenus au stade homozygote donc il n’y a pas la nécessité de les génotyper. Si jamais le besoin se crée, il consiste en un prélèvement de queue sur des animaux anesthésiés par isoflurane et marqués par un tatouage au niveau des phalanges avant sevrage. Pour les expérimentations des males transgéniques homozygotes sont croisées avec des femelles commerciales. En effet il est recommandé de réaliser les expérimentations sur des animaux hétérozygotes. Animaux adultes seront utilisés pour toutes le procedures. Toutes les procédures nécessitent des interventions chirurgicales qui ne peuvent être pratiquées que sur des animaux adultes. En outre, toutes les expériences seront réalisées chez des souris adultes, lorsque les circuits corticaux préfrontaux ont atteint un stade de maturation final. Nos animaux sont identifiables par tatouage des phalanges selon la nomenclature universelle. Aucun animal ne sera genotype pour ce projet.

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par perfusion intracardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation de deux à quatre heures, une partie recevant des injections virales et une craniotomie, puis est maintenu tête fixée pour enregistrer l'activité cérébrale pendant l'éveil et le sommeil. Le porteur décrit une habituation progressive à la contention pour limiter le stress, et affirme qu'il n'existe pas d'alternative aux modèles animaux pour étudier la perception sensorielle à l'échelle cellulaire. Les bénéfices relèvent de la recherche fondamentale, avec un lien seulement "indirect" évoqué vers l'autisme.

Objectifs

La plupart de nos expériences sensorielles relèvent d’une exploration active du monde, tels la locomotion, les mouvements oculaires, le toucher. Face à une affluence d'informations, nous sélectionnons les plus pertinentes pour une décision rapide; en fonction du contexte, seules celles nécessaires à une action adaptée sont traitées, les autres filtrées. Mieux comprendre notre perception sensorielle du monde est un enjeu majeur des neurosciences modernes. Le système des vibrisses (moustaches) du rongeur est un système de choix pour étudier le traitement des informations sensorielles car il possède une organisation anatomique très précise. Les rongeurs en outre utilisent leurs vibrisses de façon active pour explorer leur environnement en les faisant bouger volontairement. Des mouvements rapides des vibrisses sont également observés lors du sommeil paradoxal, permettant de faire un parallèle avec les mouvements rapides des yeux chez l’humain lors de cette même phase de sommeil. Les informations sensorielles relatives à la déflection des vibrisses chez le rongeur sont transmises de la périphérie au cortex par plusieurs voies. Toutefois, la nature du message codé par chacune de ces voies reste mal connue et sujet de controverse, notamment au niveau du thalamus, une structure cérébrale centrale par laquelle les informations sensorielles transitent avant d’atteindre le cortex. Dans cette étude, nous voulons révéler sous quelles conditions physiologiques les différentes voies sensorielles transmettent efficacement cette information. Pour répondre à cette question, nous proposons d'étudier les réponses sensorielles au niveau du thalamus dans un contexte comportemental pertinent pour la souris au cours des différents états de vigilance de l’animal.

Bénéfices attendus

Le thalamus est une structure essentielle au fonctionnement du cortex cérébral, où se déroulent les opérations cérébrales les plus élaborées. Il est composé de plusieurs noyaux dont la fonction dans le traitement de l’information sensorielle reste imprécise à ce jour. En combinant des enregistrements électrophysiologiques intracérébraux chez la souris et des techniques de manipulation ciblée de neurones du réseau sensoriel, nous pourrons identifier le rôle clé de ces noyaux dans ce réseau chez un animal en comportement. Les bénéfices escomptés seront une meilleure compréhension des mécanismes du traitement de l’information sensorielle par le cerveau, ce qui relève de la recherche fondamentale. De plus, le thalamus étant essentiel à la perception sensorielle et aux processus attentionnels, les résultats attendus pourront révéler la base neuronale des opérations délétères dans les troubles du spectre autistique et contribuer ainsi indirectement à une meilleure compréhension de cette maladie. Ensuite, ce projet apportera un éclairage nouveau sur la fonction du sommeil. Des travaux chez l’homme ont montré que le cerveau peut réaliser une tâche cognitive lors du sommeil paradoxal : les réponses évoquées à l’écoute de son propre nom sont différentes de celles évoquées par un nom inconnu. Cependant, nos connaissances sur ce sujet restent très limitées. Ce projet constitue une première étape vers la compréhension du traitement différentiel des informations sensorielles et des processus sensorimoteurs et cognitifs au cours des différents états d’éveil et de sommeil afin de comprendre comment sont traitées ces informations dans un cerveau éveillé versus non conscient.

Procédures

Aucun prélèvement, aucune manipulation douloureuse ne sera réalisé sur un animal vigile, toutes les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie profonde et analgésie appropriée. Interventions sous anesthésie - Une chirurgie d’implantation (2 à 4 heures) sera réalisée sur tous les animaux sous anesthésie (n=270). - Une Injection localisée d’adéno-virus associés (AAVs) ou de traceurs conventionnels sous contrôle électrophysiologique et sous anesthésie (4 à 6 heures); cette intervention concerne n= 194/270 souris. - Une craniotomie sous anesthésie gazeuse et Buprénorphine (< 2 heures) sera pratiquée sur n= 168/270 souris. L'ensemble des trois interventions seront réalisées sur moins de la moitié (122/270) des souris. - Enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie pour 50% des souris de la procédure #2 (une journée), suivis de la perfusion de l'animal : pas de réveil de l'animal - Tous les animaux (n=270) seront anesthésiés (s'ils ne le sont pas déjà) et perfusés en intracardiaque (30 minutes). Manipulations de l'animal vigile, spécifique à la Procédure #1 - Plusieurs sessions journalières de handling (10 min) pendant tout le temps de la procédure (2 à 3 mois) - Habituation à la contention, journalière, pendant 20-30 jours. Elle dure de 1 min le premier jour à 4h les derniers jours. - Enregistrements électrophysiologiques, session de 3 à 4 heures pendant 1 à 7 jours successifs - Optogénétique, stimulation lumineuse, pulses de 20 à 100ms pendant 1 à 10 sec, répétées modérément et aléatoirement lors des sessions d'enregistrements. - Stimulations sensorielles, quelques secondes, répétées modérément et aléatoirement lors des sessions d'habituation et d'enregistrements.

Impact sur les animaux

Aucun prélèvement, aucune manipulation douloureuse ne sera réalisé sur un animal vigile, toutes les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie profonde et analgésie appropriée. Une chirurgie d’implantation de 2 à 4 heures sera réalisée sur tous les animaux sous anesthésie. Ensuite, après 5 jours de repos, 194/270 animaux seront à nouveau anesthésiés 4 à 6 heures pour une injection localisée d’AAVs ou de traceurs conventionnels sous contrôle électrophysiologique. Quatre à 8 semaines après, une anesthésie gazeuse (avec Buprénorphine) inférieure à 2h sera pratiquée sur 168/270 animaux pour réaliser les craniotomies. Les trois interventions seront réalisées sur moins de la moitié (122/270) des souris. Ce projet nécessite des enregistrements électrophysiologiques sur la souris vigile. L’immobilisation est une source de stress pour la plupart des animaux. Dans ce projet, la souris est partiellement immobilisée : elle est placée dans un tube de carton sur un petit matelas doux et absorbant (changé régulièrement), sa tête maintenue de manière indolore par un système de contention. Contrairement aux protocoles de contention utilisés pour induire un stress, le corps et les pattes de la souris ne sont ici pas contenus ou immobilisés : elle est libre de bouger, ajuster sa posture, se toiletter. Dans le but de juguler le stress de l’animal, nous procédons à une habituation adaptée, douce et très progressive, au système de contention, que nous alternons avec de nombreuses périodes de "handling" de l’animal. La répétition des manipulations, toujours récompensées, permet à l’animal d’appréhender le caractère prédictif et non douloureux de la contention, ainsi que d’associer les sessions de travail à la récompense.

Devenir

Une perfusion intracardiaque d’une solution de paraformaldéhyde 4% sera réalisée à la fin de chacune des procédures, sur tous les animaux. Cette procédure permet de fixer le cerveau de l’animal en vue d’une étude immunohistochimique afin de valider la position des enregistrements électrophysiologiques, l’étendue de la transfection virale ou le traçage de voies anatomiques.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas d’alternative à l’utilisation de modèles animaux pour l’approche des mécanismes de la perception sensorielle. La neuropsychologie humaine, la modélisation théorique des fonctions cognitives de haut niveau, ainsi que les cultures de neurones ne constituent pas actuellement une alternative pour l’étude des processus de perception sensorielle et de la vigilance à l’échelle cellulaire. L’étude des mécanismes neurophysiologiques des processus cognitifs se faisait jusqu’à maintenant essentiellement chez des modèles primates non-humains. Avec cette étude nous voulons profiter des avantages qu’apporte la souris (modèles génétiques et identification des neurones plus aisée) pour raffiner notre compréhension des processus sensorimoteurs à un niveau cellulaire.

Réduction

La technique de l’animal tête-fixée est un modèle unique qui permet de réduire considérablement le nombre de souris nécessaires pour une étude donnée - un même animal participe à plusieurs sessions d’enregistrements, jusqu’à 7 jours consécutifs - les différents tests comportementaux que nous proposons pourront être réalisés sur chacune des souris, évitant la multiplication des groupes d’animaux - la multiplicité des données recueillies sur chaque animal : activité de plusieurs régions cérébrales, au cours de différents états de vigilance et comportements (et nos données sont partagées avec nos collaborateurs) - chaque souris est son propre contrôle pour toutes les procédures, divisant par deux le nombre d’animaux nécessaires et permettant d'appliquer des tests statistiques pour mesures répétées, plus puissants (donc moins de souris nécessaires), paramétriques : test-t de Student ou ANOVA (selon le nombre de groupes à comparer) ou non paramétriques au regard de la normalité de la distribution des valeurs : Wilcoxon et Friedman. Le nombre d’animaux sera également réduit par l’utilisation de tests statistiques basés sur des modèles GLM (modèles linéaires généralisés) qui prennent en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre animaux. - Les injections virales ou de traceurs sont réalisées sous contrôle électrophysiologique limitant ainsi drastiquement les erreurs de localisation, et diminuant de facto drastiquement le nombre d’animaux inexploitables car injectés en dehors de la zone d’intérêt. - La procédure #2 vise à établir sur des animaux non contraints le protocole d’injection le plus efficace de façon à réduire significativement le nombre d’animaux utilisés dans la Procédure #1. - Pour la procédure #1, nous estimons, de par notre expérience, à 20 le nombre de souris "contrôles" nécessaires pour chaque région d’intérêt et à 22 les souris transfectées (dont 15 souris porteuses du virus associé à la Rhodopsine et 7 souris "contrôle" pour le virus, virus associé au fluorophore seul) nécessaires pour chaque région d’intérêt. Ces estimations tiennent compte de la diversité neuronale dans les régions d’intérêt. Pour chaque étude, nous commençons avec un nombre restreint d'animaux (n=3 à 6), i.e. étude pilote, et poursuivons seulement si les réponses aux protocoles de transfection et de stimulation lumineuse sont optimales. Les données acquises avec le projet DR#03330 permettent de diminuer le nombre d’animaux.

Raffinement

1- La technique de la souris tête-fixée a été développée dans un souci de raffinement et avec une attention particulière au bien-être de nos souris a- pour réaliser des enregistrements au cours du cycle veille-sommeil naturel de l’animal b- sans générer de douleur. Toutes les interventions chirurgicales étant réalisées sous anesthésie c- en prenant soin de juguler le stress de l’animal par une habituation adaptée, douce et très progressive, au système de contention d- avec de nombreuses périodes de "handling" de l’animal e- des jouets sont placés dans leur cage afin qu’ils disposent d’un environnement enrichi. Après chaque manipulation (habituation ou handling) l’animal retourne dans sa cage et est récompensé. La procédure d’habituation permet à la souris de se familiariser avec la contention par la tête. La répétition des manipulations, toujours récompensées, permet à l’animal d’appréhender le caractère prédictif et non douloureux de la contention, ainsi que d’associer les sessions de travail à la récompense. e- des jouets sont placés dans leur cage afin qu’ils disposent d’un environnement enrichi. 2- Les injections virales sont classiquement réalisées uniquement sur la base de coordonnées stéréotaxiques calculées pour un individu moyen. Or, premièrement, chaque animal diffère de cette moyenne, et deuxièmement nous visons des structures sous-corticales de petit volume (d’autant plus petit chez la souris). Nous proposons donc de réaliser les injections virales sous contrôle électrophysiologique limitant ainsi drastiquement les erreurs de localisation, et diminuant de facto drastiquement le nombre d’animaux inexploitables car injectés en dehors de la zone d’intérêt.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme modèle d'étude car il existe présentement des outils moléculaires et génétiques développés chez la souris uniquement, donc non disponibles à ce jour pour d’autres espèces animales. Par exemple, la technique d’optogénétique permet d’activer ou d’inactiver de manière spécifique une région cérébrale. L’impact d’une telle manipulation sur l’activité des régions cérébrales étudiées peut être quantifié, et le rôle fonctionnel de ces régions peut être élucidé. Nous aurons ainsi la possibilité de comparer directement l’activité électrophysiologique, les réponses sensorielles et le comportement chez les mêmes souris avant et pendant manipulation d'une région cible. Chaque animal devient ainsi son propre contrôle, ce qui limite le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étude. Nous travaillons avec des animaux de 8 à 16 semaines c'est-à-dire de jeunes adultes ayant atteint leur maturité cérébrale.

3 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de composés par plusieurs voies et, pour une partie, une chirurgie stéréotaxique implantant une fibre optique ou une canule, avec douleur post-opératoire et risque d'infection déclarés, pour caractériser des modèles murins d'autisme et tester des traitements. Le porteur affirme que l'autisme, dont le diagnostic repose sur le comportement, "ne peut être modélisé qu'au niveau de l'animal entier". Les bénéfices thérapeutiques annoncés restent formulés comme une perspective.

Objectifs

La prise en charge des patients souffrant de troubles autistiques requière le développement de nouveaux traitements pharmacologiques permettant de soulager leurs déficits comportementaux. Le projet proposé a pour objet (1) une meilleure compréhension des substrats biologiques de ces pathologies, (2) la mise à disposition de la communauté scientifique des modèles animaux des troubles autistiques présentant une bonne homologie avec les conditions cliniques et (3) l’évaluation in vivo, dans ces modèles, de nouvelles stratégies thérapeutiques, tout ceci à des fins strictement scientifiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permetra une meilleur compréhension des gènes impliqués dans le développement de l'autisme et permetra de proposer de nouvelles solution thérapeutique pour soulager la pathologie.

Procédures

Une partie des animaux de nos procédures expérimentales seront soumis à des injections chroniques (14 jours) de composés par voie intrapéritonéale et per-nasale. Nous allons également étudiés des animaux qui recevront une administration unique de composés par voie intracerebroventriculaire. Enfin, un groupe d’animaux subUne partie des animaux de nos procédures expérimentales seront soumis à des injections chroniques (14 jours) de composés par voie intrapéritonéale et per-nasale. Nous allons également étudiés des animaux qui recevront une administration unique de composés par voie intracerebroventriculaire. Enfin, un groupe d’animaux subiront une chirurgie stéréotaxique dans le but d’implanter une fibre optique ou une canule d’injection. Les composés seront ensuite injectés soit via la canule d’injection soit par voie intrapéritonéale dans le cadre des souris implanté avec une fibre optiqueiront une chirurgie stéréotaxique dans le but d’implanter une fibre optique ou une canule d’injection. Les composés seront ensuite injectés soit via la canule d’injection soit par voie intrapéritonéale dans le cadre des souris implanté avec une fibre optique

Impact sur les animaux

Pour le groupe d’animaux soumis à des administration répétées d’agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale, on ne peut pas exclure une inflammation au niveau du site d’injection. Pour les animaux subissant une administration per-nasale, à l’exception d’un inconfort, ce type d’injection n’est pas connue pour générer d’effets indésirables. L’administration de composés par voie intracérébroventriculaire sera réalisé sous anesthésie gazeuse. On peut donc s’attendre à une douleur modérée au niveau du site d’injection ainsi qu’un inconfort au réveil de l’anesthésie. Les animaux subissant une chirurgie stéréotaxique, présenteront une douleur post-opératoire, les conséquences d’une anesthésie et un risque de complication post-opératoire (hémorragie, infection).

Devenir

A la fin de chaque expérience, les animaux seront mis a mort pour des expériences ex-vivo ultérieur

Remplacement

La compréhension des mécanismes causaux de l’autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du répertoire comportemental des animaux modèles permet de vérifier que ces modèles valident bien le critère de validité d’aspect pour la pathologie autistique, et aussi d’évaluer le cas échéant l’efficacité d’une approche thérapeutique. L’évaluation des effets bénéfiques d’un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu’au niveau comportemental : en effet, il n’existe pas de marqueur biologique pour l’autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.

Réduction

Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée en maintenant une puissance statistique d’au moins 0.9 pour une taille d’effet f de cohen égale à 0.25 à un seuil de significativité de 0.05.

Raffinement

Nous prendrons en charge l’ensemble des contraintes que subissent les animaux au cours des expériences. Concernant l’hébergement, les souris seront hébergées en groupe sociaux de 2 à 4 individus, en leurs mettant à disposition le matériel nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et en manipulant quotidiennement les animaux par le même expérimentateur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons les animaux des deux sexes, nous testerons chaque animal dans différentes tâches et nous utiliserons les tests statistiques adéquats. Pendant les expériences, nous suivront quotidiennement le bien-être de nos animaux en particulier leurs poids, leur posture et leur point d’injection. Pour réaliser les chirurgies, nous mettront en place une procédure d’anesthésie adéquate (anesthésique associé à un analgésique) ainsi qu’un suivi post-opératoire renforcé. En effet, nous donnerons un traitement anti-inflammatoire à nos animaux pour réduire la douleur et un suivi journalier de la cicatrisation de la plaie ainsi qu’un suivi journalier du poids et de la posture des animaux sera effectué. Nous mettrons en place des points limites adaptés afin d’éviter de faire souffrir inutilement les animaux. Nous ne pouvons toutefois pas nous passer du modèle animal car l’autisme est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant tout son répertoire comportemental.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux, chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique. Plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées sont disponibles pour modéliser cette pathologie au niveau préclinique. Les déficits comportementaux détectés chez ces souris modèles sont suffisamment importants et robustes pour permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les éventuels déficits comportementaux fixés.

2 700 souris, soit 1 200 adultes et 1 500 souriceaux, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes reçoivent une vingtaine d'injections, sont maintenus tête fixée jusqu'à une heure et équipés d'électrodes cérébrales, avant une perfusion cardiaque terminale, pour étudier le rôle de l'ocytocine dans les comportements maternels. Le porteur indique que les souriceaux sont brièvement séparés de leur mère, parfois sédatés, puis tués car ils ne peuvent être gardés sans elle. Il affirme que l'étude d'animaux vigiles en comportement rend l'in vitro et l'in silico impossibles.

Objectifs

L’ocytocine (OXT) est un neuropeptide synthétisé par les neurones du noyau paraventriculaire de l’hypothalamus (PVN), principalement connu pour son rôle dans la lactation et l’accouchement suite à sa libération dans la circulation sanguine. Cependant, des études récentes mettent en évidence les effets de l’OXT sur le système nerveux central, notamment sur les comportements sociaux et maternels. Chez les rongeurs, l’olfaction joue un rôle central pour les interactions entre individus et en particulier entre adultes et leurs progénitures. Dans le système olfactif, le cortex piriforme (PIR) est un des premiers et principal relais en aval du bulbe olfactif. Il présente chez la souris une densité exceptionnelle de récepteurs à l’OXT par rapport à d’autres régions cérébrales, notamment chez les femelles, avec une densité accrue chez les mères par rapport à des femelles vierges. Aux vues de cette forte expression chez les mères, nous avons fait l’hypothèse que l’OXT dans le PIR est nécessaire à la mise en place de comportements maternels chez des souris femelles. Afin de tester cette hypothèse, nous souhaitons réaliser des expériences en présence de souriceaux âgés de 1 à 10 jours, et manipuler la transmission oxytocinergique dans le PIR pour tester le rôle de l’OXT au niveau comportemental ainsi qu’au niveau des réponses neuronales.

Bénéfices attendus

Chez les Mammifères, la mise en place des comportements maternels est essentielle pour la survie des petits et de l’espèce en général. Chez l’Homme, il est notamment connu que le lien entre mère et enfant est facilité par la neurohormone nommée oxytocine, libérée dans la circulation sanguine de la mère lors de l’accouchement. Nous savons également que les odeurs jouent un rôle important et bénéfique dans le lien entre mère et enfant, un lien qui peut être affecté dans certaines situations, notamment lors de certains accouchements par césarienne (les taux d’oxytocine libérés sont alors plus limités). Ce projet permettra de mieux comprendre comment le cerveau s’adapte lorsqu’il s’agit de mettre en place des comportements maternels et le rôle des odeurs dans ce processus. A terme, il pourrait permettre de mettre en place des stratégies pour faciliter l’établissement de ces comportements chez l’Homme dans des situations problématiques liées à la maternité. Cette perspective est d’autant plus réaliste que l’administration d’ocytocine par voie intranasale est déjà réalisée chez des enfants autistes pour améliorer leurs relations sociales.

Procédures

Les souris seront utilisées lors de tâches comportementales en présence de souriceaux. Elles seront soumises à des injections et à des phases de contentions pendant les périodes d'habituation et d'expérimentation (environ 20 injections par souris, moins de 3min par injection/jour). Afin de pouvoir présenter les odeurs aux souris de manière précise et juste devant leur nez, nous devrons maintenir certaines souris au sein du dispositif comportemental qui permet de délivrer les odeurs. Ce maintien sera réalisé à l'aide d'une petite fixation métallique attachée à leur crâne au préalable. La durée de contentention par maintien de la tête en position fixe n'excédera pas 1h et sera réalisée après une habituation progressive. A la fin de l'expérimentation, les souris seront soumises à une perfusion afin de préserver les tissus cérébraux et d'effectuer des contrôles histologiques (durée de la procédure inférieure à 20min, réalisée sous traitement anesthésique et analgésique).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet seront mises en présence de souriceaux (ou d’odeurs de souriceaux) et nous observerons leur comportement pour quantifier leur capacité à en prendre soin. Les souriceaux pourront être brièvement séparés de leur mère le temps de réaliser ces tests, ce qui correspond à un stress modéré car réduit dans la durée. Pour limiter ce stress, nous prévoyons aussi de sédater ou anesthésier les souriceaux, ce qui nécessite d’injecter des substances médicamenteuses via des injections sous-cutanées réalisées à l’aide d’aiguilles très fines. Afin de pouvoir tester le rôle de l’ocytocine dans ces comportements, nous utiliserons des méthodes qui permettent de cibler les neurones capables de libérer de l’ocytocine ou bien les neurones qui répondent à l’ocytocine lorsqu’elle a été libérée. Pour cela, nous devrons faire exprimer des molécules spécifiques dans le cerveau des souris adultes grâce à l’expression d’adénovirus injectés au préalable (injections réalisées dans un autre établissement) et des injections d’agents pharmacologiques seront nécessaires. Ces injections représentent potentiellement une légère nuisance pour les animaux car elles nécessitent de les maintenir immobiles pendant la durée de l’injection (contention). Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. Les souris pourront être connectées via un câble fin au système d’enregistrement ce qui peut générer une légère gêne. De plus, les odeurs étant très volatiles, il nous faudra maintenir la tête des souris proches de la source d’odeurs dans certaines expériences, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée.

Devenir

Les 1200 souris adultes pourront être mises à mort par perfusion intracardiaque réalisée sous anesthésie générale avec traitement antidouleur adapté. La préservation du tissu nécessite que cette procédure de perfusion soit réalisée et permet ainsi de réaliser des contrôles histologiques en fin d’expérimentation. Cette procédure, en utilisant la voie circulatoire sanguine, favorise la pénétration du fixateur dans les tissus de manière homogène et suffisamment rapide pour empêcher la détérioration du tissu cérébral en condition d'anoxie (normalement engendrée par l'arrêt cardiaque). Les 1500 souriceaux seront aussi euthanasiés à la fin des procédures car ils ne peuvent être gardés en absence de leur mère.

Remplacement

La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront des comportements maternels : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est de 2700 (1200 souris adultes et 1500 souriceaux) sur 5 ans. Nous prévoyons de minimiser ce nombre en utilisant les mêmes souris dans des tests comportementaux différents, avec ou sans intervention sur le système ocytocinergique. Pour chaque condition testée, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions valables sur le plan statistique et tenant compte des aléas liés à ces approches expérimentales complexes. Ce nombre sera réduit davantage grâce à nos études pilotes qui permettront une optimisation des paramètres de nos expériences et raffiner notre approche statistique.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début des tests comportementaux, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux procédures qu’ils vont rencontrer (notamment aux contentions et injections). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris.

Choix des espèces

Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans une fonction cognitive complexe, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. L’effet positif de l’oxytocine sur les comportements sociaux a notamment été montré aussi bien chez la souris que chez l’Homme. Les odeurs jouent un rôle important dans le lien mère-progéniture, aussi bien chez l'Homme que chez la Souris. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. Des souriceaux entre P1 et P10 seront utilisés comme stimuli au cours des expérimentations car elles visent à comprendre les bases neurobiologiques des comportements maternels.

4 790 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés dans leur cerveau par stéréotaxie, sur des embryons via une laparotomie de la mère, sur des nouveau-nés ou sur des adultes, avant des tests comportementaux non précisés puis la mise à mort par exsanguination. Le porteur indique que les chirurgies peuvent provoquer une douleur modérée et que les nouveau-nés atteignant un point limite sont mis à mort par décapitation avant quinze jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité du tissu et que l'étude ne peut être menée qu'in vivo.

Objectifs

Depuis la découverte de la barrière hémato-encéphalique par Paul Erhlich à la fin du XIXe siècle, le cerveau a été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, tels que le microbiote intestinal, les cellules et signaux immunitaires systémiques ou encore le cycle jour/nuit. Parallèlement, les zones barrières du cerveau, comme les méninges et les plexus choroïdes, ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes. Les plexus choroïdes constituent la barrière sang-fluide céphalorachidien, l'une des frontières séparant le cerveau de la périphérie. Ils sont situés dans chacun des quatre ventricules du cerveau et sont adjacents à des zones impliquées dans la neurogenèse. D'un point de vue structurel, les plexus choroïdes sont composés d'un réseau de capillaires sanguins fenêtrés entourés d'une monocouche de cellules épithéliales et peuplés entre les deux par une grande variété de cellules immunitaires. Les principaux rôles physiologiques des plexus choroïdes sont la production de liquide céphalorachidien, qui débarrasse le cerveau des déchets métaboliques et des agrégats de protéines, ainsi que la production et le passage contrôlé du sang au cerveau de diverses molécules de signalisation, notamment des hormones et des facteurs neurotrophiques. Les molécules sécrétées par les plexus choroïdes façonnent l'activité du cerveau, par exemple en modulant la neurogenèse et la fonction des cellules immunitaires microgliales localisées dans le cerveau, ce qui rend les plexus choroïdes cruciaux pour l'homéostasie du cerveau. Des travaux antérieurs et d’autres travaux préliminaires ont montré que le niveau d’expression de certains gènes exprimés par l’épithélium des plexus choroïdes varient en fonction de l’âge et notamment au cours du vieillissement, et en réponse aux variations environnementales telles que celles du microbiote et du cycle circadien. Notre but est de mieux comprendre comment ces facteurs influent sur la biologie des plexus choroïdes et la fonction du cerveau.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra l’identification des facteurs produits par les plexus choroïdes et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité neuronale en fonction de l’âge, depuis la naissance et au cours du vieillissement, en fonction des facteurs environnementaux que représentent les variations de la composition du microbiote et celles du cycle circadien. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que constitue les plexus choroïdes et qui reste encore très peu étudiée et d’identifier de nouveaux mécanismes via lesquels les plexus choroïdes modulent la fonction du cerveau. A terme, ce projet pourrait permettre la mise au point d’immunothérapie afin de mieux lutter notamment contre les maladies dégénératives associées au vieillissement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : - soit une laparotomie sur femelle gestante (durée de la procédure : 45 min à 1h), - soit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau par stéréotaxie (durée de la procédure : incluse dans la durée de la laparotomie quand réalisée sur embryons, 5 à 10 min sur nouveau-nés, 30 min à 1h sur adulte). 12 jours (dans le cas des nouveau-nés injectés à la période embryonnaire) à 12 semaines (adultes) après chirurgie, les animaux seront mis à mort par exsanguination sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux adultes auront été avant mise à mort (4 à 8 semaines après chirurgie) impliqués dans des tests de comportement non invasifs.

Impact sur les animaux

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par une injection de buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. De la lidocaïne sera appliquée sur les zones à inciser. De l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie. Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Devenir

Les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les géniteurs qui n’auront pas subi de chirurgie (procédures 1 et 2) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 après 6 mois de reproduction. Les femelles gestantes qui auront subi une laparotomie (procédure 1) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 au moment de la séparation avec les nouveau-nés P6 ou P21. La mise à mort des souris auxquelles auront été injectés les vecteurs viraux (procédure 2) aura lieu par perfusion de PBS (exsanguination) sous anesthésie générale profonde et analgésie afin de prélever les tissus nettoyés du sang et à analyser post-mortem. Si un animal atteint les points limites définis, il sera mis à mort par exposition croissante en CO2 (jeunes de plus de 15 jours et adultes) ou par décapitation (nouveau-nés de moins de 15 jours).

Remplacement

Notre but est d’étudier comment les cellules situées au niveau des plexus choroïdes, agissent sur le cerveau, en condition physiologique, au cours du développement, du vieillissement et en réponse aux variations de composition du microbiote et du cycle circadien. Les plexus choroïdes sont un tissu composé d’un endothélium fenêtré, de cellules épithéliales, de cellules de type neuronal, de cellules mésenchymateuses et de cellules immunitaires. Les cellules immunitaires du système périphérique pourraient induire l’expression de facteurs produits par les cellules des plexus choroïdes qui pourraient eux-mêmes moduler l’activité neuronale du cerveau. Il n’existe aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité́ d’un organisme ou d’un tissu avec ses composantes endothéliale, épithéliale, neuronale, mésenchymateuse et immunitaire. De plus, nous étudions la physiologie des plexus choroïdes en fonction de l’âge et des variations des facteurs environnementaux tels que le microbiote et le cycle circadien, ce qui ne peut être étudié qu’in vivo.

Réduction

Nous souhaitons étudier les gènes des plexus choroïdes et du cerveau qui auront montré par une précédente approche transcriptomique des différences d’expression considérables en fonction des paramètres comparés. Les quantités d’animaux utilisées pour mener à bien notre projet sont établies en tenant compte de notre précédente expérience et de tests statistiques (test ANOVA, source SHADE). Les 4 plexus choroïdes d’un animal doivent être groupés pour pouvoir réaliser une analyse moléculaire ou transcriptomique sur ces petits tissus. Seuls 10 microlitres de liquide céphalo-rachidien peuvent être prélevés à partir du cerveau d’une souris, ce qui ne permet qu’un seul type d’analyse. Les analyses moléculaires du liquide céphalo-rachidien, des plexus choroïdes et des zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les mêmes animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (adultes). Nous prévoyons pour chaque groupe, 4 animaux par analyse. Le sexe des animaux pouvant influer sur les phénotypes observés, des mâles et femelles seront inclus (ratio 1/1). Des triplicatas d’expérience seront réalisés pour permettre l’obtention de résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 3 groupes comparés (P6, P21 et adultes) : les effectifs proposés (36 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.07 (effets considérables à extrêmes). - 2 groupes comparés (adultes jeunes et âgés) : les effectifs proposés (24 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.65 (effets très forts à considérables). - 6 groupes comparés (4h cycle fixe et 2h cycle perturbé) : les effectifs proposés (72 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.85 (effets très forts à considérables). - 4 groupes comparés (P21 et adultes, conventionnels et axéniques) : les effectifs proposés (48 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.97 (effets considérables à extrêmes). Ces résultats nous permettront d’identifier les différences majeures dans la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau en fonction de l’âge, du microbiote et du cycle circadien, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant et quelques heures après leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par des administrations d’analgésiques (buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur ; lidocaïne appliquée sur les zones à inciser ; de l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie). Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives et notamment des maladies dégénératives car de nombreuses lignées sont disponibles, invalidées pour de nombreux gènes d'intérêt et/ou génétiquement manipulable après injection de vecteurs viraux. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproductions facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. Il est aisé d’en manipuler le microbiote. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le phénotype induit par les vecteurs viraux n’est analysable qu’au minimum 10 jours après injection. Afin d’étudier comment la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau évoluent avec l’âge, nous injecterons les vecteurs viraux à des souris embryonnaires afin d’en étudier les effets chez les souris : (i) âgées de 6 jours, stade important avec la mise en place du système immunitaire et de nombreuses variations métaboliques en réponse à l’allaitement maternel, (ii) âgées de 21 jours qui correspond à la période du sevrage avec d’importantes variations métaboliques et du microbiote qui devient mature, (iii) adultes, âgées de 7 à 12 semaines, qui seront notre point de référence physiologique. De la même manière, nous étudierons les effets du microbiote en injectant les vecteurs viraux à des souris âgées de 3-4 jours afin d’en étudier les effets lorsqu’elles auront 21 jours ou qu’elles seront adultes et les effets du vieillissement en injectant les vecteurs viraux à des souris adultes jeunes de 7 à 12 semaines et âgées de 10 à 20 mois.