Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
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- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude de molécules pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux dans un modèle d’AVC hémorragique intracérébrale chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
605 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de la tête leur injecte de la collagénase pour provoquer une hémorragie cérébrale, suivie d'IRM, de tests de score neurologique et de force d'agrippement, puis d'une perfusion intracardiaque létale pour prélever le cerveau. Le porteur indique que le modèle peut entraîner des pertes d'équilibre, une faiblesse musculaire, une désorientation et une perte de poids. Il précise que le projet fait l'objet de financements industriels et affirme qu'aucune méthode alternative n'apporterait le même niveau d'information.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de tester cinq stratégies thérapeutiques dont leurs mécanismes d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’hémorragie : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. L’effet de nos cinq stratégies thérapeutiques seront évalués en utilisant un modèle d’AVC hémorragique chez le rat par gavage (per-os), par administration intrapéritonéale (i.p) ou bien par injection directe sur le site hémorragique pour chaque traitement. Nous chercherons également à comparer l’effet de ces stratégies thérapeutiques à 2 doses différentes afin de déterminer laquelle permet d’obtenir une réduction du déficit sensorimoteur ainsi que du volume hémorragique.
Bénéfices attendus
Ce projet fait l’objet de plusieurs financements industriels afin d'étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant la réduction du déficit sensorimoteur, limiter la lésion ainsi que l’inflammation causé par un saignement cérébral. Chez l’homme, les hémorragies intracérébrales spontanées (HICS), non traumatique, résulte d’une irruption importante de sang dans le parenchyme cérébral, suite à une rupture de micro-vaisseaux. Cette étude pourra mettre en évidence de nouvelles stratégies thérapeutiques pharmacologiques dans la lutte contre ce type d’AVC hémorragiques, n’ayant aujourd’hui aucun traitement de référence permettant de réduire les effets délétères d’un hématome sur le parenchyme cérébral.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la collagénase, provoquant ainsi une hémorragie dans le cerveau. Cet act chirugical durera 15 minutes. Pour les groupes traités par injection directement sur le site hemorragique, une seconde pipette sera insérée au même endroit ou la collagénase a été injectée, 20 minutes post-AVC. Cet acte durera 6 minutes. A J+1 et J+14, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 8 minutes et suiveront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+22 post hémorragie. La mesure du score neurologique durera 10 minutes. En prenant compte des temps de récupération, la mesure de la force d’agrippement durera entre 25 et 30 minutes. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC hémorragique à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire. L'hémorragie cérébrale provoque une désorientation au moment du réveil post-chirurgical. Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après l'hémorragie. Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Lors de l'administration des traitements par voie intrapéritonéale, la contention et l'injection peuvent engendrer un stress et une douleur. Un acte rapide réalisé avec du matériel adéquat par du personnel compétent limite drastiquement cette douleur et le traumatisme provoqué.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que le rat est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, le rat est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 10 rats par groupe (+ 10%), ce qui nous permettra de déceler des différences significatives. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.
Raffinement
Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les rats seront en groupes sociaux avec un ou plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et buchette en bois), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi biquotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. L'expérimentateur ou l'animalier pèsera chaque animal et veillera à ce que les points limites ne soient pas dépassés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue à 37.5°C grâce à un système de couverture chauffante, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Chaque site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, puis à une désinfection à la Chlorexidine et enfin l’application d’une analgésie locale. Lors de la phase de réveil, les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 2 heures avant d’être remis en cage par 2. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Le rat (Rattus norvegicus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’hémorragie intracérébrale. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines soit un poids de 300g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’hémorragie.
Impact de la délocalisation cytoplasmique de la protéine FUS dans les oligodendrocytes sur le développement de symptômes moteurs modélisant la sclérose latérale amyotrophique et la démence frontotemporale
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
606 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 580 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation modélisant la sclérose latérale amyotrophique, sont suivies jusqu'à douze mois avec des tests moteurs, comportementaux et de mémoire, reçoivent pour certaines un traitement par la cuprizone dans l'alimentation, puis sont tuées à la fin du projet. Le porteur indique que les symptômes moteurs ne sont pas visibles à l'œil nu et n'entraînent pas de paralysie, et que le traitement provoque une perte de poids restant en principe sous 15 %. Il affirme qu'aucun système de coculture ni modèle cellulaire n'est assez complexe pour étudier ces interactions du système nerveux.
Objectifs
La sclérose latérale amytrophique est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs et entraine la paralysie progressive du patient jusqu'à la mort. Nous soupçonnons d'autres types cellulaires d'être impliqués dans la maladie, notamment des cellules de soutien des neurones moteurs. Ces cellules de soutien ont pour rôle de mettre en place une gaine autour des neurones afin d'accélérer l'influx nerveux et de nourrir les neurones. L'objectif de ce projet est d'établir si ces cellules de soutien sont affectées par la maladie, si leur fonction en est altérée, et si elles sont responsables de la mort des neurones moteur.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'affiner les connaissances que nous avons de la SLA, et de préciser la fonction de certaines protéines mutées dans cette maladie, ainsi que les types cellulaires affectés. Ces connaissances auront un impact bénéfique sur les patients et sur leur prise en charge.
Procédures
Certains des animaux de ce projet seront suivis longitudinalement pendant 12mois. Ils réaliseront un test moteur d'une durée de 3x5 minutes tous les deux mois , un test comportemental d'une durée de 5 minutes à 5 et 10 mois, et un test de mémoire à 10 mois d'une durée de 5 minutes + 3x5 minutes + 5 minutes, avec 15 minutes de repos entre chaque partie du test. D'autres animaux de ce projet seront traités à l'âge de 3 mois pendant 6 semaines, puis le traitement sera interrompu pendant 6 nouvelles semaines. Ces animaux traités réaliseront 3 tests moteurs de 5 minutes espacés de 6 semaines (avant le début du traitement, après les 6 semaines de traitement et 6 semaines après l'arrêt du traitement), ainsi que 3 tests comportementaux d'une durée de 5 minutes espacés de 6 semaines (avant le début du traitement, après les 6 semaines de traitement et 6 semaines après l'arrêt du traitement).
Impact sur les animaux
La mutation entraine un phénotype moteur visible à l'aide de tests spécifiques. Les premiers symptômes apparaissent aux alentours de 5 mois et atteignent leur pic à 10 mois. Ces symptômes ne sont pas visibles à l'oeil nu et n'entrainent pas la paralysie de l'animal. Les animaux mutés présentent également une hyperactivité et hypersociabilité visibles à 5 mois seulement. Le traitement entraine chez ces animaux une légère perte de poids qui n'excède normalement pas un 15% du poids initial.
Devenir
Les animaux produits seront gardés en vie pour réaliser le projet puis seront mis à mort à la fin de celui ci.
Remplacement
Nous voulons étudier le rôle d'un type cellulaire spécifique dans le déclenchement, la propagation et la gravité de la neurodégéneresnce observée dans la Sclérose Latérale Amyotrophique. Cet objectif exige d'étudier l'interaction entre différents types cellulaires, ainsi que l'impact que ces altérations ont sur le développement des symptômes moteurs et comportementaux. Il n'existe à ce jour pas de système de coculture assez complexe pour modéliser les interactions cellulaires du système nerveux. De plus, aucun modèle cellulaire ne permet d'étudier l'apparition et la gravité des symptômes, c'est pourquoi l'utilisation d'un modèle murin est nécessaire.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux dans ce projet, les animaux destinés aux analyses biochimiques ou histologiques seront au préalable inclus dans les études comportementales. Le nombre de souris tient compte des tests statistiques utilisés lors de l'analyse des résultats ainsi que de la variabilité interindividuelle de ces modèles génétiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés à plusieurs dans les cages, et des enrichissements (cabanes, bouts de bois, cotons) sont mis à leur disposition. Le traitement à la cuprizone se fera par l'alimentation afin de supprimer le stress lié aux injections. Nous avons également favorisé des tests moteurs et cognitifs non invasifs. L'enrichissement de l'environnement des animaux (bâtonnets à ronger, matériel de nidification maisons en carton...), le maintien des intéractions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront de s'assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée. Des points limites permettant de soustraire l'animal à la souffrance ont été établis
Choix des espèces
Dans le domaine de recherche sur la SLA, le modèle animal le plus pertinent reste encore à l’heure actuelle la souris. En effet, l’utilisation d’invertébrés comme la drosophile ou le nématode se heurte à une organisation du système nerveux qui n’a pas la complexité requise et ne permet pas de répondre aux questions cliniques posées. De plus, notre laboratoire a une grande expertise avec les modèles murins de la SLA. Nous avons le matériel chirurgical et les équipements dédiés aux études impliquant des souris mais aussi, et surtout, l'expertise nécessaire pour surveiller l'état de la souris. Pour le suivi longitudinal, les animaux les plus agés auront un an. Pour le traitement, les animaux seront utilisés à 3 mois qui est l'âge où le traitement a montré le plus de différences entre les animaux génétiquement modifiés et les animaux non OGM.
Effet d’un stabilisateur dopaminergique sur les comportements compulsifs associés à la prise d’alcool chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 80 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont soumis à deux mois d'alcoolisation avec évaluation d'une consommation incontrôlée, maintenus isolés, reçoivent des injections sous-cutanées d'un stabilisateur dopaminergique, puis sont tués par dose létale d'anesthésique pour prélèvement du cerveau. Le porteur reconnaît que le modèle de consommation d'alcool et l'isolement augmentent le niveau d'anxiété des rats, et renvoie les retombées thérapeutiques contre l'addiction à un "moyen terme" conditionnel. Il affirme qu'"il n'existe pas de méthodes alternatives" sans animaux pour évaluer un tel traitement.
Objectifs
L’addiction à l'alcool est associée à des problèmes de la communication entre les neurones impliquant la dopamine. Malheureusement, ces dysfonctionnements sont encore mal compris, ce qui empêche de trouver des médicaments efficaces pour traiter cette maladie. Il a été récemment montré qu’une prise excessive et incontrôlée d’alcool chez le rat était liée à une anomalie bien précise de cette communication liée à la dopamine. De manière intéressante, des stabilisateurs chimiques de cette communication sont en cours de développement et ils pourraient corriger cette anomalie dopaminergique. L'objectif du projet est donc de tester si ces stabilisateurs dopaminergiques peuvent réduire la prise excessive et incontrôlée d'alcool chez le rat.
Bénéfices attendus
Ouvrira la voie vers de nouvelles stratégies thérapeutiques et le développement à moyen terme de nouvelles molècules contre l'addiction à l'alcool, avec de plus amples études si les résulats sont positifs, notamment cliniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à trois type d'interventions différentes : une procédure d'alcoolisation et d'évaluation de la consommation incontrôlée d'alcool (durée : deux mois), une procédure d'injection sous-cutanée du stabilisateur dopaminergique (durée :2 fois une semaine, soit deux semaines au total) et mise à mort par dose létale d’anesthésique pour prélèvement de tissus cérébraux afin d'étudier les mécanismes neuronaux pouvant expliquer les comportements observés. Dose létale d’anesthésique par injection intrapéritonéale de pentobarbital (durée de la procédure : 5 minute pour l'anesthésie profonde).
Impact sur les animaux
L'effet du modèle de consommation d'alcool que nous allons utiliser et l'isolement nécessaire des animaux pour cette experimentation, à un impact d'ordre modéré sur l'animal, augmentant son niveau d'anxiété mais n'induisant pas par exemple de symptômes physiques de manque. Cette forme d'angoisse est prise en charge par une manipulation régulière des animaux (interaction) avec l'expérimentateur. Nous n'attendons pas d'effet indésirable du traitement au vu de la littérature et des doses modérées que nous allons utiliser et tout sera mis en oeuvre (habituation, aiguilles fines) pour limiter les gênes qui pourraient être causées par les injections sous-cutanées). L'utlisation d'une dose létale d'anesthésique permettra d'éviter toute souffrance lors de la dernière procédure.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux afin de mieux comprendre les mécanismes de ces comportements et du traitement.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation de l'effet d'un traitement sur la consommation d'alcool.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin d’avoir une chance d’au moins 80% de détecter une différence significative (risque β standard en statistique déterminant la puissance statistique minimal requise) et un risque d’erreur α étant fixé dans nos conditions à 5% (degré de significativité fixé à 95%), et donc de ne pas compromettre les objectifs du projet.
Raffinement
Afin de réduire les potentielles gênes induites par les injections sous-cutanées, nous utiliserons des aiguilles très fines. D’autre part, le produit très soluble dans le NaCl sera injecté à un volume de 1 ml/kg soit entre 0,4 et 0,6 ml par rat. L’injection sera réalisée sur la partie souple du dos en la regroupant entre les doigts, limitant ainsi la contention du rat. Les animaux seront habitués à ce geste et les aiguilles seront changées entre chaque injection, ainsi que le site d'injection chaque jour. Les animaux seront également stabulés selon la procédure mise en place par l'animalerie, afin de maintenir un milieu socialement riche et d’éviter tout stress supplémentaire, avec notamment une semaine d'acclimitation après la livraison et avant le début de l'expérimentation. Après cette semaine d'acclimatation regroupés par 4, nous serons cependant dans l'obligation de les isolés pendant la procédure de choix à deux bouteilles et pendant l'auto-administration, mais toujours dans des cages enrichies avec des objets.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des structures que nous allons étudier. De plus, ce projet est dans la continuité d'études faites chez le rat, modèle de choix pour étudier en préclinique l’addiction à l'alcool. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes, ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs mois.
Émulsifiants alimentaires synthétiques et infection gastro-intestinale eucaryote: effets sur l’homéostasie intestinale et le bien être de l’hôte
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
5 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, l'une menée sous anesthésie sans réveil. Elles sont infectées par le parasite Blastocystis puis soumises à une distension colorectale, avant d'être tuées pour prélèvement de tissus, afin d'étudier l'hypersensibilité digestive du syndrome de l'intestin irritable. Le porteur indique qu'une souris atteignant 20 % de perte de poids ou présentant une douleur trop forte serait mise à mort de façon anticipée. Il juge "indispensable" de travailler sur des animaux pour établir un lien de causalité avec le parasite.
Objectifs
De nombreuses études épidémiologiques ont rapporté une forte prévalence de Blastocystis chez des patients atteints de différentes pathologies, plus particulièrement au niveau du tractus intestinal (syndrome de l'intestin irritable (SII), maladies inflammatoires...). Il est donc important de mieux comprendre les causes et conséquences de la prévalence de ce parasite chez les patients souffrant de SII. Un modèle reproductible d'infection chronique à Blastocystis chez le rat a déjà été mis en place et a permis de mettre en lumière le lien entre ce parasite et l'hypersensibilité viscérale d'origine colique (HSVC) non inflammatoire, la dysbiose intestinale ou encore le comportement anxio-dépressif. Dans l’optique de la transposition des données à l’espèce humaine, le passage au modèle souris apparait nécessaire afin d'étudier les mécanismes d'actions de Blastocystis et d'envisager des cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes des douleurs associées au SII afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettraient d’envisager une étude clinique grâce à une collaboration avec les services de gastroentérologie d'un CHU. L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au SII et, in fine, à soulager les patients SII douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.
Procédures
Suite à l'infection par Blastocystis, des feces seront prélevés afin de s'assurer de l'implantation du parasite au niveau intestinal de la souris. De plus les procédures 3, 4 et 5 seront effectuées une seule fois après une infection de 4 semaines
Impact sur les animaux
L’infection par Blastocystis induira chez les animaux les symptômes associés au SII-PI à savoir une hypersensibilité colique. Le développement de ce symptôme nous permettra d’étudier les mécanismes mis en jeu dans les douleurs et les atteintes centrales afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les animaux seront cependant surveillés quotidiennement par l'expérimentateur et si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera mis à mort par overdose d’isoflurane suivie d’une dislocation cervicale.
Devenir
Pour l'ensemble des procédures, les animaux seront maintenus en vie. A l’issue de la procédure 5 (Distension colorectale), les animaux seront mis à mort pour effectuer différents prélèvements de tissus.
Remplacement
Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact de Blastocystis sur la sensibilité colique, le comportement et le microbiote intestinal. De plus, une étude comparant des données de métagénomique entre animaux infectés et animaux non infectés permettra d’établir un lien de causalité avec Blastocystis. Ce type d’étude n’est envisageable que chez l’animal. D’autre part, nous voulons également évaluer les conséquences physiologiques sur la sensibilité viscérale et la perméabilité intestinale, pour lesquelles il n’existe pas d’autre alternative.
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques seront réalisés grâce au programme d'analyse statistique GraphPad Prim 9.0 et les principales analyses, notamment de suivi du poids seront effectuées grâce à des test ANOVA one-way ou two-way suivi d'un post test adéquat en fonction du résultat.
Raffinement
Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Ces animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles) et ceci en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements de type petite maisonnette de chez Genobio ainsi que du coton.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce "souris" a été fait pour ce projet pour 2 raisons : (1) il est connu que cet espèce est résistante à une infection par Blastocystis ST4 et (2) qu'un traitement chronique par des émulsifiants déstabilise le microbiote intestinal et la barrière de mucus. Ainsi, ce projet permettra de définir si une perturbation de l'homéostasie intestinale par des émulsifiants (largement utilisés dans les pays industrialisés) favoriserait l'implantation du parasite Blastocystis et entrainant d'autres perturbations du "Bien-être" de l'hôte. De plus, malgré le modèle d'étude déjà publié chez le rat, des études complémentaires sont indispensables afin de transposer chez la souris les données précédemment obtenues chez le rat. Ainsi, les outils génétiques accessibles uniquement chez la souris (principalement les animaux KO pour un gène d'intérêt) pourront nous permettre de mieux comprendre par quel récepteur ou mécanisme physiopathologique le parasite Blastocystis parvient à s'implanter et induire des troubles du comportement chez son hôte. Les souris seront utilisés au stade de jeune adulte. En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.
« Read-out » pharmacologique par hypothermie induite et biodistribution chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Elles reçoivent des injections de vecteurs par plusieurs voies et des prélèvements de sang à la queue, l'effet étant lu à travers une baisse provoquée de leur température corporelle, pour évaluer des molécules censées franchir la barrière du cerveau. Le porteur reconnaît un risque de choc immunitaire, de réaction allergique ou de détresse cardio-respiratoire, tout en pariant sur l'absence d'effet à court terme. Les animaux sont tués par exsanguination sous dose létale d'anesthésique pour prélever sang et tissus.
Objectifs
Les neuropathies, myopathies, et maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde et, à l'heure actuelle, les besoins médicaux actuels restent très insatisfaits, sans aucuns traitements curatifs, ou palliatifs. Les maladies neurodégénratives telles qu’Alzheimer ou démences associées, les maladies lysosomales, les myopathies (Duchenne) sont des exemples d'enjeux de santé publique. Ces dernières années, les recherches privées et publiques ont augmenté leurs efforts de recherches, suscitant de grands espoirs pour les patients malades et leurs familles. Cette demande de projet s’inscrit dans cette dynamique, avec pour objectif d’améliorer et de proposer à terme des perspectives thérapeutiques. Le savoir-faire de la société consiste en la conjugaison de peptides vecteurs à des pro-drogues ou molécules en cours de développement, voire déjà utilisées sur le marché, mais dont l'efficacité reste insuffisante ou encore à démontrer. En effet, la plupart des médicaments restent inefficaces par manque de passage et d'accès au région ou organes à traiter. La maladie d’Alzheimer est un de ces exemples de neuropathies majeures, pour laquelle aucun traitement efficace n’existe, tout comme bon nombre de pathologies périphériques ou cancers. L’objectif principal de notre société sera donc de proposer de nouvelles formulations capables de reconnaitre des partenaires endogènes spécifiques (récepteurs cellulaires) et d'utiliser leurs mécanismes naturels de trancytoses pour traverser les barrières cellulaires, protectrices des régions et organes sensibles de l'organisme. Dans notre cas, il s'agira en priorité du passage de la Barrière HématoEncéphalique (BHE) vers le système nerveux central (SNC). Par ce principe, nous pouvons passer naturellement ces barrières et amener in situ le médicament par la technique du cheval de Troie. Un avantage considérable qui permet de concentrer les médicaments au niveau des tissus à traiter et ainsi, de potentialiser les chances de traitements. Cette demande de projet s'inscrit dans ce contexte, en développant et optimisant nos molécules-vecteurs (VHH : Domaine variable chaine lourde Anticorps) pour améliorer la délivrance d’agents thérapeutiques. Par des approches systémiques, en administration intra-veineuses ou dermiques, en sous-cutanées, nous tenterons d’améliorer le potentiel d’actions de nos vecteur-médicaments, sur lignée murine consanguine (C57BL/6J) et génétiquement modifiée pour un récepteur cible.
Bénéfices attendus
En ce qui concerne la partie expérimentale, notre procédure met en avant la sensibilité d’action de nos VHH et les faibles quantités administrées (3R : raffinement), ce qui réduit également les risques de toxicités pour les animaux. Le faible nombre d'individus et l'optimisation des tests mettent en avant l'importance et la nécessité de bien caractériser la procédure. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos Vecteurs médicaments (VHH) constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.
Procédures
Au cours de notre procédure, nous allons manipuler les animaux en vigile, ce pour toutes les administrations (administration i.v. 5.5ml/kg ; i.p. ou s.c.10ml/kg) ou prélèvements de sang intermédiaires (Prélèvement caudal ≤50 μl). Les administrations, rapides (quelques secondes) et précises, se feront sous forme de bolus ou injections répétées. L’expertise des expérimentateurs garantit la rapidité du geste et de la manipulation sans stress. De même, le prélèvement intermédiaire, en caudal (PI) (≤ 50 microlitres) sera réalisé en 1 seule fois. L'animal sera alors placé et immobilisé en contention spécialisée, puis, par une légère et micro-incision cutanée de l’extrémité de la queue (idem biopsie génotypage), le sang sera collecté sur tube hépariné (10UI/ml) ou EDTA, à raison de 2-3 gouttes de 50 µl de sang. En point final de la procédure, les animaux seront euthanasiés pour l’exsanguination et les prélèvements de tissus/organes. Les prélèvements finaux en post-mortem (exsanguination, prélèvements tissulaires) se feront sur animal euthanasié : anesthésié/analgésié à dose létale (Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg), aiguille 25G (‘’5/8’’ ; 0.5*16mm), environ 10 minutes avant la fin de la cinétique. Donc ici, pas de procédures chirurgicales avec réveil, seulement une euthanasie et prélèvements sur du post-mortem.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous proposons d’étudier nos VHH sur des temps d’incubation relativement courts. D’une part, sur un read-out de la thermorégulation corporelle, pour valider le passage spécifique à travers la barrière hémato-Encéphalique du cerveau. D’autre part et sur les mêmes animaux, une biodistribution plus précise et quantifiable de nos VHH sélectionnés, et/ou une mesure d’efficacité, par dosage des quantités d’ANRm rémanentes dans les organes ou tissus d’intérêts. Les cinétiques d'incubations (maximum quelques jours) ne suffisent pas à générer d'effets indésirables ou de conséquences physiologiques, notamment, car les conjugués administrés présentent une demi-vie relativement courte, de quelques minutes à quelques heures. Le principal risque se trouve être la réaction immunitaire aigüe et spontanée. Dans le cadre de nos recherches, ces problématiques sont étudiées en amonts et en post-expérimentales (immunogénicité) couplée par de la littérature, ainsi que de notre expertise chimie et in vivo. Les composés VHH administrés aux souris ne doivent pas présenter de toxicité. Le savoir-faire de la société et les données issues de la littérature nous permettent d'anticiper les principaux risques de toxicité, couramment observés post-administration (choc immunitaire (anaphylactique) ; réaction allergique ; détresse cardio-respiratoire ; modification et troubles comportementaux). Dans le cadre de nos études, les conjugués VHH pourront être couplés à des peptides, drogues, ou autres, tel que de petits ARN interférents (siRNA). Ces derniers nous intéressent particulièrement, car leur rôle sera de bloquer en amont les ARN messagers responsables de l’expression de protéines impliquées dans l’apparition symptomatique de certaines pathologies. Notre étude, sur fond standard C57BL/6J et lignée hTfr (même fond ; cf. Annexe 2), permettra de mieux comprendre et appréhender les disfonctionnements physiologiques, sans que pour autant nos conjugués VHH n'aient, à court termes, d’effets sur la santé et le bien-être animal (3R : raffinement). Malgré ces précautions, une observation comportementale des animaux sera faite de manière quotidienne, à la recherche du moindre signe de souffrance (cf. Procédure, annexe1 MGS), le tout accompagné d'un suivit du poids des animaux entre le début et la fin des cinétiques, afin de s'assurer que les animaux ne perdent pas plus de 10% de poids initial.
Devenir
A l'issue de la procédure (biodistribution) les animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements de sang et tissus (Dose létale d'anesthésique en intrapéritonéal ; Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg). Si des problèmes ou souffrances anormales sont rencontrées en cours de procédure, alors les animaux seront immédiatement sédatés par la même solution d’anesthésique à dose létale, suivit d’un sacrifice par une dislocation des cervicales.
Remplacement
Pour mener à bien nos modèles précliniques après validation in vitro, nous envisageons de réaliser des expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, modèle indispensable pour l’étude des mécanismes in situ (3R : remplacement). Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres physiologiques, mécanistiques et homéostasiques, indispensables pour étudier une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit pour cela de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. Les faibles cohortes d'animaux permettront, malgré tout, d’obtenir un maximum de résultats, suffisant pour l’obtention de données statistiques significatives (3R : remplacement et réduction).
Réduction
L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux se répartit sur de petits groupes de n=4, à raison de 240 souris/an, réparties sur 3 études de 80 individus (10 groupes sur fond C57BL/6J et 10 groupes sur fond mutant hTfr), suffisant pour appréhender un effet de la sélection de conjugués sur les souris des 2 lignées. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus) nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes, un test de Kolmogorov-Smirnov ou encore une analyse de variance (N.S one-way ANOVA). En cas d’analyse dite qualitative, on parlera de succès ou d’échec. Pour la partie échantillonnage et prélèvements de tissus en fin de procédure, une liste précise et déclinée sur plusieurs types de post-expérimentations, permettra d'optimiser chacune des souris, de manière qu'il n'y ait pas d'utilisation abusives et inutiles de souris. La réalisation de prélèvements intermédiaires (Prélèvement caudal ≤50 μl) en cours de cinétique permettra d'obtenir des données plasmatiques supplémentaires, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et/ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal (voir points limites Annexe 1 MGS), appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien et vétérinaire pour exercer dans le respect des 3R. Comme cité dans cette même partie de la procédure, nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Au minimum la veille des tests, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 4 individus par cage, litières (copeaux de bois) et raffinements (maison en carton et Sizzle-Nest). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires. De plus, travaillant sur animal sain (C57BL/6J et C57BL/6J hTfr), la simplicité des administrations uniques ou répétées (administration i.v. 5.5ml/kg (Aiguilles 27G (3/4 ; 0.4/19mm)) ; s.c. 10ml/kg (Aiguilles 26G (‘’3/8’’ ; 0.45*10mm)) et i.p. 10ml/kg (Aiguilles 25G (‘5/8’’ ; 0.5*16 mm))) sur animal vigile et le court laps de temps d’exposition des molécules (cinétique de quelques heures à maximum 1 semaine), nous permettent d’éviter toute apparition potentielle de phénotypes dommageables chez les animaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs de chez deux fournisseurs différents.
Choix des espèces
Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières études pré-cliniques. Le développement préclinique nécessite tôt ou tard une première approche in vivo, sur un modèle animal tel que le rongeur, dans notre cas, la souris. C’est le modèle le plus standardisé et utilisé dans la racherche en expérimentation animale, notamment par sa physiologie connue (mammifère) et relativement proche de l’homme. Le modèle rongeur facilite les manipulations, les injections et observations comportementales. Il est aussi plus adapté et intéressant pour la partie pharmacologie (diminution des posologies). En pratique, on l’utilise principalement pour la facilité de mise en place des expérimentations, l’obtention de groupes jusqu’à 6-8 individus sans trop de contraintes de stabulation. Le modèle souris est surtout préférentiel lorsqu’il s’agit de mette en place l'élevage d’une lignée génétiquement modifiée avec une (des) mutation(s) donnée(s), ou encore d'étudier de nombreux modèles de pathologies, plus facilement accessibles. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, organes ou liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter individus, qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 25-27g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).
Inhibition de l’accumulation thalamique de fer dans la prévention de la dégénérescence secondaire après infarctus cérébral
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Après un infarctus cérébral, elles subissent des IRM répétées, des injections dans le nez trois fois par semaine et des tests comportementaux d'apprentissage étalés sur trois jours, pour tester des médicaments réduisant l'accumulation de fer dans le cerveau. Le porteur classe l'ensemble en gravité légère hors la mise à mort finale, alors qu'un infarctus cérébral est induit chez ces animaux. Toutes les souris sont tuées pour prélever leur cerveau et confirmer par histologie ce que l'IRM ne montre pas seule.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est d'apporter des solutions au suivi post-AVC, afin d'éviter des symptomes secondaires suite à l'infarctus cérébral. Pour cela, bous allons tester plusieurs médicaments, pour certains, déjà utilisés dans la pratique médicale courante, dans le but de réduire l'accumulation de fer dans des régions déconnectées par l'AVC.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d'améliorer la prise en charge des patients après un accident vasculaire cérébral, de les suivre de manière adéquate grâce à de nouveaux biomarqueurs et d'apporter de nouvelles solutions thérapeutiques pour diminuer les symptômes secondaires à l'infarctus cérébral. Les bénéfices attendus sont donc ceux-ci, avec une translation à l'Homme rapide (étude clinique déjà en cours de recrutement en parallèle à ce projet, avec un des médicaments testés).
Procédures
Les animaux ne sont soumis a aucune intervention faisant l'objet de procédures dans cette saisine. Seule la procédure 2 implique une manipulation des souris pour des injections en intra-nasal ou per os de médicaments, pouvant être considérée comme une intervention. Toutes les souris de ce projet sont soumises à cette manipulation (252 souris).
Impact sur les animaux
Les animaux ne subiront que des procédures de classe légère durant le projet, en-dehors de la dernière, qui nécessite leur euthanasie afin de récupérer les cerveaux et d'effectuer des analyses post-mortem. Les animaux seront donc suivis et pris en charge sans nuisances, ni effets indésirables attendus, jusqu'à leur euthanasie. La procédure 1 (IRM) dure 1h30 par souris et par IRM, répété toutes les deux semaines. La procédure 2 (injection intra-nasale) dure environ 1 minute par souris et par injection, répété 3 fois par semaine. Enfin, la procédure 3 (analyse comportementale) dure environ 4h par souris, étalées sur trois jours (apprentissage...) et ne sera pas répétée. Pour la dernière procédure (euthanasie et prélèvements), les souris ne sont plus conscientes, la procédure dure environ 20 minutes depuis l'injection d'anesthésiant jusqu'au prélèvement des cerveaux.
Devenir
Les modifications de signal observées en IRM ne sont pas parfaitement spécifiques et seule une étude histologique (immunofluorescence), génomique (qPCR) et analytique (dosage du fer in situ) combinée permettra de confirmer cette hypothèse et de connaitre la forme sous laquelle l’excès de fer est présente (fer libre ou ferritine notamment) et si elle peut être traitée. Cette analyse histologique nécessite le prélèvement des cerveaux des souris de ce projet, impliquant une euthanasie pour toutes les souris.
Remplacement
Chez l’Homme les modifications thalamiques post-AVC sont compatibles avec une augmentation du fer. Néanmoins, les modifications de signal observées en IRM ne sont pas parfaitement spécifiques et seule une étude histologique combinée permettra de confirmer cette hypothèse et de connaitre la forme sous laquelle l’excès de fer est présente (fer libre ou ferritine notamment). Des analyses histologiques et comportementales permettront également d'éclaircir les mécanismes sous-jacents à la neurodégénérescence observée chez l'Homme. Enfin un premier niveau de preuve d’efficacité des traitements luttant contre l'accumulation de fer et son impact sur la mort cellulaire est nécessaire chez l’animal. La démonstration de leur effet bénéfique thérapeutique avant transposition chez l'homme ne peut se faire que dans un modèle animal proche de la physiopathologie humaine car la culture cellulaire ne peut reproduire la complexité des réseaux qui relient le cortex au thalamus et dont l’interruption est à l’origine des phénomènes de neurodégénérescence à distance.
Réduction
Notre projet a été designé dans le but de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, afin d'obtenir des statistiques correctes, extrapolables à des cohortes plus nombreuses. Nous avons pris à coeur d'inclure des femelles et des mâles dans nos analyses également afin d'obtenir des résultats fiables pour une translation à l'Homme efficace.
Raffinement
Tous les animaux seront soigneusement suivis au cours de ce projet. Une grille d'évaluation de la douleur a été établie pour permettre un suivi adéquat. Aucune des procédures de cette saisine, en dehors de la dernière qui nécessite la mise à mort des animaux, ne sont de classe moyenne ou sévère, réduisant ainsi au maximum la douleur. En cas de propblème, des protocoles ont été mis en place pour pallier à une éventuelle douleur (détaillés dans cette saisine).
Choix des espèces
Le modèle envisagé a déjà été induit chez la souris et il a été démontré que les AVC étaient de petite taille mais s’accompagnaient de modifications thalamiques via des phénomènes de déconnexion. Une éventuelle accumulation de fer ainsi que sa temporalité n’a néanmoins pas été étudiée. Nous utiliserons des souris adultes mâles et femelles âgées de 6 à 8 semaines au moment de la chirurgie. Les animaux subiront la chirurgie à l'âge adulte, équivalent à un infarctus humain.
Délivrance intracérébrale d’un médicament par ultrasons chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
300 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Elles reçoivent une injection intraveineuse de particules, une séquence d'ultrasons puis un traceur, avant une perfusion intracardiaque terminale, pour établir une preuve de concept d'une délivrance de médicaments dans le cerveau par ultrasons. Le porteur décrit le stress lié à la contention et à l'anesthésie et une hypothermie limitée par une couverture chauffante. Il indique avoir mené des essais in silico et in vitro et conclut que le modèle animal ne peut être remplacé à cette étape.
Objectifs
Etablir la preuve de concept de l’efficacité d’une nouvelle stratégie de délivrance intracérébrale de médicaments par ultrasons.
Bénéfices attendus
Validation de notre nouvelle stratégie ultrasonore de délivrance intracérébrale de médicaments
Procédures
Procédure 1 : Evaluation de la capacité de la séquence ultrasonore US1 et des particules P1 à accumuler un traceur vasculaire, le bleu d’Evans, dans le cerveau : 1- Injection intraveineuse de particules P1 – anesthésie gazeuse – 80 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 30 s 2- Application de la séquence ultrasonore US1 – anesthésie gazeuse – 80 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 5 min 3- Injection intraveineuse d’une solution de bleu d’Evans – 80 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 30 s 4- Perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde – 160 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 20 min Procédure 2 Evaluation de la capacité des séquences ultrasonores US1 et US2, et des particules P1 et P2 à accumuler un fluorophore, DiD, dans le cerveau 1- Injection intraveineuse de particules P2 – anesthésie gazeuse – 40 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 30 s 2- Co-injection intraveineuse de particules P1 et P2 – anesthésie gazeuse – 80 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 30 s 3- Application de la séquence ultrasonore US2 – anesthésie gazeuse – 40 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 5 min 4- Application de la séquence ultrasonore US1 – anesthésie gazeuse – 40 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 5 min 5- Application des séquences ultrasonores US1 et US2 – anesthésie gazeuse – 20 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 5 min 6- Perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde – 140 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 20 min
Impact sur les animaux
Le stress est minimisé par l'implication d'un personnel qualifié à l'expérimentation animale (niveau concepteur). Les souris sont facilement stressées, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Les animaux, après la phase d’acclimatation, seront habitués à être sortis de leur cage. Les nuisances ou effets indésirables des procédures 1 et 2 seront évalués par le personnel de zootechnie et par les responsables de l’étude. La respiration, la température et le poids seront mesurés.
Devenir
Procédures 1 et 2 : A la fin de l’étude, une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde et un prélèvement du cerveau sera réalisé.
Remplacement
Dans une première approche expérimentale, nous avons réalisé des expériences in-silico et in-vitro dont les résultats sont particulièrement encourageants et nécessitent d'être validés in-vivo. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in silico.
Réduction
Grâce à un plan d’expérience, les groupes contrôles et expérimentaux seront constitués de 20 souris (10 mâles et 10 femelles). Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer si notre nouvelle stratégie ultrasonore permet une accumulation efficace du bleu d’Evans et du DiD dans le cerveau (Puissance de test : Two-way ANOVA, 80%, Seuil de risque : 0.05).
Raffinement
Les souris seront hébergées en présence d'un objet d'enrichissement (morceaux de carton et/ou tube plastique) en groupe. Les souris sont facilement stressées, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Les animaux, après la phase d’acclimatation, seront habitués à être sortis de leur cage. Afin de limiter l’hypothermie induite par l’anesthésie générale, principale nuisance des procédures 1 et 2, les souris seront placées sur une couverture chauffante pendant ces procédures.
Choix des espèces
Dans la littérature, les stratégies de délivrance intracérébrale de médicaments par ultrasons sont réalisées chez la souris Balb/c de 6 semaines environ pour un poids de 20 g.
Un modèle murin d’étude de la réparation de l’ADN dans le développement du cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
522 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes subissent sous anesthésie une chirurgie de 30 à 45 minutes pour introduire un marqueur fluorescent dans les embryons par électroporation, afin d'étudier des lésions programmées de l'ADN dans le cerveau en développement. Le porteur indique des injections d'analgésiques avant et après l'opération et une surveillance quotidienne, avec euthanasie en cas d'atteinte de points limites. Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes, et le porteur affirme que ces questions ne peuvent s'étudier que sur le mammifère "in toto".
Objectifs
Les cassures de l’ADN sont des lésions génomiques très toxiques qui interviennent lors du développement du système nerveux central. Des mécanismes puissants de réparation de ces lésions évitent l’instabilité génétique qu’elles pourraient engendrer. La mauvaise réparation de ces lésions est à la base de nombreuses pathologies chez l’homme comme certaines maladies neurodégénératives, des déficits immunitaires sévères et le développement de cancers. Chez l’animal, les formes les plus sévères de déficit de réparation des lésions de l'ADN se traduisent par une létalité embryonnaire tardive consécutive à la mort des neurones. Plusieurs facteurs impliqués dans diverses voies de réparation des dommages à l'ADN ont été identifiés à partir de l’analyse de situations pathologiques chez l’homme et analysés dans des modèles animaux d’invalidation génique afin d’en mieux comprendre la fonction. L'objectif du présent projet est d'identifier les raisons de la létalité embryonnaire de certaines lignées de souris déficientes en voie de réparation de l'ADN. Nous émettons l'hypothèse que certains dommages programmés de l'ADN dans le cerveau en développement sont à la base du phénotype. Nous projetons de générer une lignée de souris mutantes incapables de générer ces lésions et d'évaluer si ce fonds génétique peut sauver la létalité embryonnaire des animaux déficients en réparation de l'ADN. De plus nous produirons une souris reportrice pour suivre les cellules dans lesquelles interviennent ces lésions programmées.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est la détermination de la fonction des lésions programmées de l’ADN dans les phases précoces du développement du cerveau. Cette fonction est jusqu'à présent inconnue. Cette étude nous permettra alors de mieux comprendre la mort cellulaire neuronale et la létalité embryonnaire qui en découle chez les animaux porteurs d'anomalies de la réparation de l'ADN. In fine, cette étude participera à la compréhension de maladies génétiques de l'enfant caractérisées par des anomalie du développement, l'existence de microcéphalies ainsi que le développement de tumeurs cérébrales et les mécanismes de vieillissement accéléré.
Procédures
Pour l'analyse in vivo des lésions programmées de l’ADN, des embryons à E12.5 ou 14.5 recevront par électroporation in utero (en une seule intervention et sous anesthésie générale) des souris femelles gestantes un marqueurs fluorescent de ces dommages . La chirurgie dure entre 30 et 45 min selon le nombre d’embryons avec 45 min comme durée maximum.
Impact sur les animaux
Les souris avec un défaut de réparation de l'ADN ont un phénotype dommageable connu ; une létalité embryonnaire. Nous n’envisageons pas de phénotype dommageable des deux lignées mutantes faisant l’objet de ce dossier. L’analyse des lésions de l’ADN dans le cerveau par l'introduction intra-embryonnaire d'un marqueur fluorescent peut présenter quelques nuisances liées à l'expérimentation. Afin de minimiser ces nuisances, les souris placées sur une plaque chauffante reçoivent une anesthésie générale ainsi que des injections sous-cutanées d'analgésiques en pré- et post-opératoire. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place. Une injection d'analgésique ou l'euthanasie de l'animal sont envisagées en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques
Remplacement
Les questions scientifiques que nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo ou ex vivo, sur des cerveaux prélevés sur des embryons. Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère in toto. En effet, le développement du cortex des mammifères et son fonctionnement ultérieur sont de mieux en mieux caractérisés chez la souris et aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de ces processus dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Notre expérience préalable sur ce type de modèles animaux avec défaut de réparation de l'ADN nous montre que les phénotypes, lorsqu’ils sont dommageables (létalité́ embryonnaire, baisse de viabilité́ avant sevrage ou déficit immunitaire), sont en général suffisamment importants et homogènes pour être statistiquement significatifs sur de faibles cohortes. Selon le calcul de puissance effectué sous G*Power (puissance de 0.8 et une p-value de ≤0.05), l'évaluation du caractère dommageable nécessite 65 animaux pour la lignée Pgbd5 KO, 289 animaux pour les croisements de Pgbd5 sur fonds génétiques XRCC4 ou PAXX/Xlf KO et 65 animaux pour la lignée reportrice. L’analyse statistique sera réalisée par un test non-paramétrique Mann-Whitney de comparaison de fréquences.
Raffinement
Un des phénotypes dommageables possible des animaux par ailleurs viables étant un déficit immunitaire plus ou moins sévère, ils seront obtenus et maintenus en portoirs ventilés, en zone EOPS afin de minimiser leur exposition à des agents pathogènes. Un suivi quotidien permettra de s’assurer que les animaux ne développent pas de signes cliniques d’infection. Devant un état moribond du pelage, une voussure ou prostration sévère ou un amaigrissement important laissant supposer une telle infection ou un mal-être général, les animaux seront systématiquement euthanasiés. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social avant et après la procédure. Lors de la procédure #2 la litière utilisée dans la cage est spécifique pour les animaux opérés et permet de diminuer le risque d'infection de la cicatrice. La nourriture ainsi qu’un gel hydrique sont placés directement dans la litière pour une meilleure accessibilité. Lors des actes chirurgicaux, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées (Isoflurane, induction : 3%, maintien : 2%) et reçoivent des injections sous-cutanées (seringues 27G, volume injecté de 5µl/g) d'analgésiques en pré́- (Buprenorphine 0,05μg/g) et post-opératoire (Kétoprofène 5μg/g). La couverture antalgique du kétofene dure 36h post opération. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place. Une injection d'analgésique ou l'euthanasie de l'animal sont envisagées en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle pour mener les études sur le développement du cerveau, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. En effet, seuls les Mammifères présentent un néocortex organisé en couches inversées. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation du projet tels que des anticorps pour les immuno-marquages. L'analyse des phénotypes dommageables éventuels se fait sur des femelles gestantes pour la létalité embryonnaire et sur des animaux nouveau-nés de la naissance jusqu'au sevrage pour la baisse de viabilité. L'analyse in vivo des lésions programmées de l’ADN est effectuée sur des embryons à E12.5 et E14.5. Les embryons sont ensuite analysés à E16.5 et E18.5 après activation du marqueur fluorescent.
Etude de la fonction de la protéine CKIP1 dans les microglies de souris EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections d'un composé (tamoxifène) cinq jours de suite, avant prélèvement du cerveau, pour étudier le rôle d'une protéine dans les cellules immunitaires du cerveau. Le porteur décrit l'inconfort comme lié aux injections répétées, sans détailler d'autre suivi que le poids et un scorage de posture et de toilettage. Il s'agit d'une recherche fondamentale dont les bénéfices annoncés restent la connaissance générale et une cible pharmacologique "potentielle".
Objectifs
Les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central façonnent les réseaux de neurones au cours du développement. Chez l’adulte elles participent à la surveillance et l’entretien du cerveaux en éliminant les cellules mortes ou inutiles. Dans le cerveau sain, les cellules immunitaires ont une morphologie complexe caractérisée par des prolongements ramifiés en perpétuelles mouvements. Ces mouvements sont importants car grâce à eux les cellules peuvent explorer le cerveau à la recherche de dysfonctionnements. Il se trouve que dans la plupart des pathologies du cerveau le mouvement de ces prolongements s’arrêtent et il est difficile de savoir si l’arrêt de ces mouvements est une cause ou une conséquence de la pathologie. De plus les mécanismes cellulaires contrôlant ces mouvements sont pour la plupart inconnus. Il est donc important de comprendre le fonctionnement de ces mouvements et leur rôle exact pour mieux comprendre leurs impacts sur les pathologies du cerveau. Nous avons identifié une molécule exprimée par ces cellules immunitaires qui pourrait être impliquées dans ces mouvements, nous proposons de la supprimer pour étudier les effets sur le fonctionnement des cellules et la réponse cellulaire lors d’une inflammation mimant une pathologie. Ce projet a deux objectifs principaux. 1) Caractériser le rôle de cette protéine dans la physiologie des cellules immunitaires du cerveau. 2) Etudier les répercussions de l’invalidation de la protéine sur la neuro-inflammation, et le fonctionnement du cerveau. Ces expériences nous permettront de mieux comprendre la fonction de cette protéine mais également de d’appréhender le rôle que jouent les cellules immunitaires aux cours des pathologies du système nerveux central.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’un projet de recherche fondamentale dont les résultats bénéficieront à la connaissance générale du système nerveux central tant chez l’homme que l’animal, et permettront de mieux comprendre les interactions entre le système nerveux central et le système immunitaire. Les résultats attendus de cette recherche permettront de mieux comprendre les processus cellulaires conduisant aux pathologies neurodégénératives du système nerveux central et aux troubles engendrés par l’auto-immunité. Il permettra surtout de mieux comprendre les voies de signalisations associées à notre protéine d’intérêt et d’en faire une potentielle cible pharmacologique.
Procédures
Une Injections IP de tamoxifene sur 5 jours consécutifs/ animal. Chaque injection se fait en 30 secondes max/animal. Prélèvement de tissus sur des animaux morts (432).
Impact sur les animaux
Inconfort lié à l’injection répétée de tamoxifène
Devenir
Mise à mort pour récolter les tissus et faire des analyses morphologique et transcriptomiques
Remplacement
Il s’agit d’un projet de recherche fondamental visant à étudier le rôle d’une protéine jusqu’alors inconnue. Les expériences réalisées dans ce projet ne peuvent donc pas être modélisées. Nous travaillons sur des cultures de cellules primaires provenant d’animaux nouveaux nés ou réaliserons des études histologiques sur des cerveaux de souris pour obtenir nos données.
Réduction
Les lots et procédures ont été élaborés de manière à optimiser les groupes contrôles et à éviter la redondance. Les effectifs ont été déterminés à l’aide d’un test statistique de puissance. La significativité sera déterminée à l’aide de test ANOVA ou non paramétrique si la normalité des échantillons n’est pas obtenue. Il s’agit de travaux originaux jamais réalisés à notre connaissance dans la littérature.
Raffinement
Afin de limiter le nombre d’expériences et l’inconfort lié aux expériences in vivo, nous avons développé un modèle de culture dans lequel la morphologie de nos cellules d’intérêt est préservée. Ceci nous permettra de limiter l’utilisation de souris entière pour réaliser nos expériences. De façon générale le bien-être des animaux sera évalué de façon quotidienne. Les souris seront observées dans leurs cages pendant plusieurs minutes puis pesées. L’évaluation se fera selon un scorage établi (posture, poids, toilettage) de sorte à identifier les points limites.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle car couramment utilisée au laboratoire. Les souris permettent d’avoir recours à des animaux transgéniques. Il existe une abondante littérature sur le fonctionnement synaptique chez la souris ce qui évitera de reproduire certaines expériences pour valider notre modèle. Pour la culture cellulaire les animaux seront âgés de 2 à 5 jours lors des injections stomacales de tamoxifène et de 10 jours lors de la mise en culture. Cet âge permet d’obtenir une résistance suffisante aux conditions d’hypoxie et d’ischémie des cellules rencontrées lors de la mise en culture et une maturation suffisamment avancée pour obtenir des cellules ramifiées. Les expérimentations in vivo seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 6-10 semaines.
Activité des circuits corticaux dans un modèle murin d’autisme
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie pour injecter un virus et implanter une fibre optique, puis un test de reconnaissance d'objet avec enregistrement de l'activité neuronale, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur décrit des souris invalidées pour un gène lié à l'autisme et à la déficience intellectuelle, et indique que la chirurgie peut causer œdème et douleur post-opératoire. Il affirme que ces procédures sont "essentielles" et qu'aucun modèle informatique des comportements complexes n'existe encore.
Objectifs
Le but de notre projet est d'étudier la contribution d'un gène muté dans le trouble du spectre autistique. Nous explorerons son rôle dans l'apprentissage et la mémoire. Nous analyserons l'activité des circuits neuronaux du cortex préfrontal par photométrie par fibre lors d'un test de reconnaissance d'objet chez des souris invalidées pour le gène d'intérêt comparées aux souris sauvages. Nous étudierons l'activité de différentes sous-populations neuronales impliquées dans la neurotransmission excitatrice et inhibitrice.
Bénéfices attendus
Ces expériences devraient permettre de déterminer le rôle du gène d'intérêt dans l'activité des circuits corticaux préfrontaux lors de la mémoire de reconnaissance, contribuant ainsi à mieux comprendre son implication dans l'autisme et la déficience intellectuelle. L'étude dans des modèles murins des conséquences neurobiologiques de l'absence des gènes mutés dans l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux est une étape clé dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la pathogénèse de ces maladies, afin de permettre à terme de développer des approches thérapeutiques adaptés.
Procédures
Une procédure chirurgicale est effectuée sous anesthésie générale pour injecter dans le cerveau un virus exprimant un marqueur calcique fluorescent et implanter la fibre optique pour la photométrie par fibre. La durée de la chirurgie est de 30-40 min. Aucun phénotype dommageable n’est prévu suite à la procédure. Après une période de récupération de 3 semaines, les souris sont habituées pendant 3 jours (10 min, 2 fois par jour) à un champ ouvert où sera effectué le test de reconnaissance d'objet. Le jour du test, l'activité neuronale est enregistrée par photométrie par fibre pendant 15-20 min en état basal, puis pendant 10 min lorsque l'animal explore 2 objets identiques. L'animal est ensuite replacé dans sa cage et au but de 10 min, il est réintroduit dans le champ et l'activité neuronale est enregistrée pendant 10 min lorsqu'il explore un objet familier et un objet nouveau. Au total, la procédure dure 45-50 min. Après 2 jours de repos, les souris sont enregistrées à nouveau lors d'un deuxième test de reconnaissance d'objet (45-50 min). A la fin des expériences, les animaux subiront une perfusion intracardiaque avec un agent fixateur pendant 3 min, sous anesthésie profonde, afin de prélever le cerveau pour des analyses histologiques. Au total, la procédure de perfusion dure 10-15 min.
Impact sur les animaux
La chirurgie pour injecter le virus dans le cerveau et implanter la fibre optique peut causer un œdème localisé associé à une douleur post-opératoire passagère. Il existe un risque faible d'infection suite à la chirurgie et l'implantation de la fibre optique. La manipulation par l'expérimentateur et l'exposition à un environnement nouveau lors du test comportemental peuvent engendrer un léger stress chez les souris. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées.
Devenir
Tous les animaux injectés avec le virus et utilisés dans les expériences de photométrie par fibre (n=105) seront perfusés avec un agent fixateur à la fin des expériences, afin de prélever le cerveau pour des analyses histologiques.
Remplacement
Nos travaux nécessitent l’utilisation de rongeurs puisque nous étudions des mécanismes pathologiques complexes associés à l’autisme et la déficience intellectuelle tels que des déficits cognitifs et l'activité des circuits neuronaux intacts. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre les conséquences de l'inactivation du gène d'intérêt dans le cerveau. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. De plus, il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 105 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux au strict nécessaire afin d’obtenir des résultats robustes statistiquement dans ce type d'expériences. Pour cela, le nombre d’animaux doit se situer entre 12-15 par condition étudiée. En effet, la variabilité interindividuelle élevée observée lors des tests comportementaux, y compris le test de reconnaissance d'objet, nécessite de groupes de taille relativement élevée. La taille des groupes est déterminée sur la base de la littérature scientifique et notre propre expérience dans ce type d'analyses. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Dans le cadre du raffinement de l’expérimentation animale, les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur possible. L’injection stéréotaxique de virus et la pose de fibres optiques sont réalisées sous anesthésie totale et locale pendant la chirurgie et un analgésique est administré en péri-opératoire. Les animaux sont observés quotidiennement par une personne compétente. Toute souris qui montre des signes de mauvaise santé engendrant une souffrance selon des points limites préétablis, est exclue du protocole et euthanasiée. Les souris sont hébergées à raison de 4 animaux par cage dans une animalerie de stabulation (température 19–21°C, cycle jour–nuit 12h–12h), avec accès libre à l’eau et aux croquettes. La stratégie d’enrichissement consiste à ajouter un nid des lanières de papier Kraft. La litière est changée tous les 7 jours pour éviter le stress. Une semaine avant le test de reconnaissance d'objet, les souris sont manipulés quotidiennement par l'expérimentateur pendant 5 min afin de les habituer et réduire le stress. De plus, les souris sont exposées au champ ouvert plusieurs fois avant le test de reconnaissance d'objet, d'abord en groupe et ensuite individuellement, afin de réduire le stress engendré par l'environnement nouveau. 48 h de repos sont réservées entre les procédures comportementales.
Choix des espèces
Le système nerveux de la souris présente des analogies avec celui de l’être humain. De plus, ce rongeur constitue un modèle de choix bien caractérisé pour les études neurobiologiques et comportementales en rapport avec l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux. Enfin, on a accès à des souris transgéniques afin d’étudier le rôle des gènes d’intérêt, ce qui permet d’aborder leur fonction dans le cerveau de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (2-6 mois). L'autisme étant un trouble qui persiste toute la vie, nous avons choisi d'étudier les conséquences de la perte du gène chez l'adulte, une fois que l'ensemble du système nerveux est développé.
Etude d’un type de mémoire en utilisant le modèle du poisson zèbre au stade larvaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
35 840 poissons zèbres au stade larvaire vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Âgés de 7 à 14 jours, ils sont soumis à des flashs lumineux et des sons pendant sept heures, ou immobilisés dans l'agarose pendant trois heures, pour étudier un type de mémoire appelé habituation. Le porteur affirme que l'étude d'un cerveau entier chez un animal vivant est "essentielle" et qu'aucune approche in vitro ne convient. Le nombre déclaré, très élevé, tient au recours à de nombreuses conditions et à une imagerie à haut débit portant jusqu'à 300 poissons simultanément.
Objectifs
Comprendre comment les animaux apprennent et forment des souvenirs est une question fondamentale en neurosciences. S'il est clair que les souvenirs se forment grâce à la plasticité des réseaux neuronaux, de nombreuses questions restent ouvertes. Par exemple, dans un circuit neuronal complexe de vertébrés, lesquels et combien de neurones sont soumis à la plasticité ? Quels sont les mécanismes moléculaires impliqués dans cette plasticité ? Pour répondre à cette question des poissons zèbres sont utilisées car leur cerveau est relativement simple (~100 000 neurones), petit (0,25 mm3) et l'activité de tous les neurones peut être mesurée de façon indépendante. Lorsqu'il est stimulé par un flash de lumière ou un stimulus acoustique, le poisson zèbre réagit par un sursaut. En cas d'éclairs répétés, cette réponse diminue, formant un type de mémoire à long terme connu sous le nom d’habituation. Afin de comprendre cette habituation et les composants qui pourraient avoir une influence sur cette habituation, dans un premier temps, des tests ont été réalisés sur des embryons âgés de moins de 5 jours issues de différentes lignées existantes sans phénotypes dommageables. Suite à des résultats prometteurs obtenus sur des embryons âgés de moins de 5 jours, des études complémentaires sont nécessaires sur des sujets plus âgés (de 7 et 14 jours). Les deux études décrites ci-dessous sont envisagées. - habituation sur des poissons âgés de plus de 7 et 14 jours en absence ou présence drogues psychoactives (sans effet sur le développement du poissons) pendant 7h - observation de l'activité neuronale des poissons in vivo (live imaging) lors de l'habituation. Ce projet sera réalisé sur des poissons issus de lignées existantes sans phénotype dommageable. L'étude de l'activité neuronale dans son ensemble n'est pas envisageable in vitro puisque nous avons besoin de la fonctionnalité du cerveau dans son intégralité. Des études d'habituation avec d'autres objectifs ont déjà été réalisées dans différents laboratoires à travers le monde avec des tests statistiques robustes et connus ce qui nous permet de limiter au maximum le nombre de poissons utilisés. A partir de 5 jours les poissons seront maintenus dans des aquariums, à faible densité, dans un courant d'eau continu et ils seront nourris 3 fois par jours avec de la poudre adéquate.
Bénéfices attendus
L'étude de l'habituation chez le poissons zèbre nous permettra de mieux comprendre les effets positifs de certaines drogues sur l''habituation et les mécanismes cellulaires mis en place dans cet apprentissage.
Procédures
Dans la procédure 1, les poissons âgés de 7 et 14 jours, seront soumis à des stimuli visuels ou acoustique en présence ou absence de drogues pendant 7h. Dans la procédure 2, les poissons âgés de 7 et 14 jours, seront immobilisés dans de l'agarose pendant 3 heures et seront soumis à des stimuli visuels en présence ou absence de drogues. Aucune intervention physique n'est prévue.
Impact sur les animaux
Pour la procédure 1, les poissons seront soumis à des flashs de lumière et à des bruits pendant 7h. Ces stimuli ont un effet mineur sur les poissons. Les drogues utilisées dans la procédure 1 ont été validées au préalable et n'ont eu aucun effet sur la survie et le bien-être du poisson de moins de 5 jours. Pour la procédure 2, les poissons seront immobilisés dans de l'agarose à 2 % préalablement refroidis à 29°C afin qu'ils ne soient pas brulés. Pendant toute la durée de l'expérience qui durera 3h, les poissons seront suivis visuellement. Tout état anormal (battement anormal de la queue ou entrée massive de calcium dans les neurones) entrainera l'arrêt immédiat de l'expérience et la mise à mort des poissons par balnéation dans de l'eau à 0/4°C puis transfert dans de l'eau de javel.
Devenir
tous les animaux seront mis à mort à la fin de chacune des deux procédures
Remplacement
L'étude de l'activité neuronale dans son ensemble n'est pas envisageable in vitro puisque nous avons besoin de la fonctionnalité du cerveau dans son intégralité. L'étude de la mémoire et du comportement ne peut se faire que sur un cerveau entier, dans des animaux vivants. Le poisson zèbre présente le modèle vertébré ayant un cerveau le plus simple nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre la plasticité neuronale dans le cerveau des vertébrés. En tant que vertébrés, le cerveau et le génome du poisson zèbre partagent des homologies majeures avec les mammifères et les humains. Travailler sur un modèle vertébré est essentiel pour nos projets visant à découvrir les mécanismes conservés de plasticité et leur pertinence potentielle pour la fonction psychiatrique humaine et le dysfonctionnement du cerveau dans les maladies neurologiques
Réduction
Ce projet sera réalisé sur des poissons issus de lignées existantes sans phénotype dommageable. Les poissons mutants (-/-) et les contrôles seront issus de la même ponte en croisant des poissons hétérozygotes, génotype sous lequel toutes les lignées sont maintenues. Des études d'habituation sur le poisson zèbre avec d'autres objectifs, ont déjà été réalisées dans différents laboratoires à travers le monde avec des tests statistiques robustes et connus ce qui nous permet de limiter au maximum le nombre de poissons utilisés. La méthode statistique utilisée sera la comparaison avec les poissons contrôles à l'aide de la méthode d'analyse comportementale multi-composants. Dans ces analyses, les différences cumulatives entre les conditions traitées et les conditions témoins sont comparées par rapport à la présentation de stimulus pour définir des intervalles de confiance à 95 %. Dans ce cas 60 poissons seront utilisés par condition par test comportemental. Toutes les études ont été préalablement réalisées sur des poissons âgés de moins de 5 jours non soumis à l'expérimentation animale afin de tester 1) que les lignées de poissons ayant présenté un comportement intéressant 2) que les drogues ayant montré un effet. La procédure 2 consistant en l'immobilisation du poisson dans de l'agarose pour observation de l'influx de calcium au microscope nécessitera 10 poissons par condition qui est le nombre minimum nécessaire pour pouvoir calculer une différence statistique interprétable entre deux groupes de poissons. La procédure 2 ne sera réalisée que si des résultats intéressants auront été obtenus à la procédure 1.
Raffinement
A partir de 5 jours les poissons seront maintenus dans des aquariums, à faible densité (40 poissons dans 80 cm2) , dans un courant d'eau continu et ils seront nourris 3 fois par jours avec de la poudre adéquate. A ce moment-là, les poissons seront observés attentivement et tout poisson présentant un comportement ou développement anormal ou un des points limites tels que problème de flottabilité, immobilité mouvements anormaux sera mis à mort immédiatement par balnéation dans de l'eau à 4°C pendant 10 min puis transfert dans de l'eau de javel
Choix des espèces
Les études comportementales associées à des approches d’imagerie sur l’organisme entier, à une résolution pouvant atteindre l’échelle cellulaire (poisson optiquement transparent jusqu'à 4 semaines) fait du poisson zèbre un modèle pertinent. Ces approches d'étude de comportement à haut débit (300 poissons imagés simultanément) et d'imagerie sur animal entier, ne sont absolument pas applicables en routine sur d'autres modèles vertébrés ce qui fait du poisson zèbre un modèle vertébré idéal. Les études préalables ont été réalisées sur les larves âgées de moins de 5 jours. Les études seront poursuivies sur des individus plus âgés de 7 et 14 jours pour mieux comprendre l'habituation à un stade de développement ultérieur du cerveau, plus proche d'un cerveau adulte.
Elevage de souris transgéniques SOD1G93A
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 467 souris transgéniques vont être élevées comme modèle de sclérose latérale amyotrophique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles ne subissent aucune intervention dans l'élevage lui-même mais sont produites pour alimenter d'autres projets, transférées vers l'établissement expérimentateur ou euthanasiées à 100 jours si elles ne le sont pas. Le porteur affirme que la culture cellulaire ne permet pas d'appréhender la complexité du système moteur et que ce modèle est le plus utilisé pour cette maladie. Les animaux gardés jusqu'à 100 jours restent asymptomatiques, une surveillance quotidienne devant repérer d'éventuels tremblements ou faiblesses musculaires.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une pathologie humaine létale et rare, dans laquelle on observe une dégénérescence et donc une disparition progressive des neurones du cortex moteur , du bulbe et de la corne antérieure de la moelle épinière. Ceci induit des paralysies pouvant toucher les muscles des membres ou de la sphère ORL (et conduire à un handicap sévère) et/ou une atteinte respiratoire (par paralysie du muscle diaphragmatique) qui est le plus souvent responsable de complication mortelle. Si la majorité des malades n'a aucune anomalie génétique, environ 5% des patients sont atteints d'une forme familiale notamment liée à des mutations sur le gène d'une protéine appelée la Super Oxyde Dismutase1 (SOD1). Dans l'objectif d'étudier les mécanismes de la maladie et de développer de nouveaux traitements, un modèle murin de cette maladie à été développé . Ces animaux contiennent une mutation dans le gène SOD1 et développe une pathologie dégénérative motrice pure qui possède beaucoup d'analogie avec la pathologie humaine. Cette lignée transgénique animale est, à ce jour, le modèle animal le plus utilisé pour la recherche sur la SLA. Notre objectif est de constituer un élevage de ces animaux qui seront utilisés pour différents projets de recherche. Un total de 4467 animaux est prévu pour l'ensemble des projets issus de cet élevage. Pour toutes ces recherches la règle des 3R sera strictement respectée. Ainsi le nombre d'animaux produit par cet élevage correspond très exactement à tous les projets de recherche qui ont été déclarés par les établissement expérimentateurs. Par ailleurs, les souris produites par l’élevage seront transmises à l’établissement expérimentateur avant l’apparition des symptômes de la maladie. Aucune douleur, souffrance ou angoisse n’est donc infligée aux animaux.
Bénéfices attendus
L'utilisation de modèles murins SOD1 G93A est nécessaire pour la recherche des mécanismes physiopathologiques de la SLA, ainsi que pour l'étude de molécules et de stratégies thérapeutiques nouvelles.
Procédures
Les animaux ne sont soumis a aucune intervention au seins de l’etablissement d’élévage. Ils seront transférés à l’etablissement expérimentateur à des âges dépendant des procédures expérimentales.
Impact sur les animaux
Tous les animaux sont euthanasiés à l'age de 100 jours s'ils ne sont pas transmis à l'établissement expérimentateur. Avant cet age, ils sont asympotmatique, toutefois les animaux sont surveillés quotidiennement dans le cas ou un symtpome précoce venait a apparaitre (tremblements ou faiblesses musculaires). Si un seul de ces symptomes se manifestait, le responsable du projet sera immediatement contacté pour décider s'il convient de transférer l'animal à l'etablissement expérimentateur ou s'il convient de l'euthanasier par inhalation de C02.
Devenir
Les animaux sont soit transférés vers l’établissement expérimentateur soit sacrifiés.
Remplacement
Aucune autre méthode comme la culture de lignées cellulaires ne permettent d'appréhender la complexité du système moteur et d'évaluer la pertinence thérapeutique de nouvelles molécules et son intérêt dans la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA).
Réduction
Le nombre d’animaux produit par cet élevage correspond au nombre d’animaux nécessaire pour entretenir l’élevage et pour réaliser les projets ayant fait l’objet d’une validation par le comité d’éthique. Le nombre d’animaux produit par l’élevage sera revue à la baisse en fonction de l’évolution de ces projets .
Raffinement
Les animaux seront placés dans des cages enrichies (carré de cellulose lab'nest ). Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle lumière inversé. L'accès à la nourriture et à l'eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine.
Choix des espèces
La souris SOD1 G93A est un modèle de choix afin de réaliser des études précliniques car c’est le modèle le plus couramment utilisé pour étudier la SLA et par conséquent c’est le modèle le plus caractérisé. Pour la reproduction les animaux seront utilisés entre 7 et 12,5 semaines pour les mâles et 7 et 24 semaines pour les femelles afin d'assurer une reproduction efficace.