Système nerveux
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Modulation de la tVTA dans les troubles de l’humeur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 40 et sévère pour 560. Après implantation de canules par chirurgie, ils subissent un modèle de dépression fondé sur des chocs électriques inéluctables et imprévisibles, puis des tests d'évitement avec 30 chocs, de nage forcée et de champ ouvert. Le porteur attend l'apparition de symptômes dépressifs chez au moins 30 % des animaux et teste une molécule censée les prévenir. Il affirme qu'aucune méthode alternative in vitro ne répond à cette question.
Objectifs
Ce projet concerne la caractérisation et la manipulation de mécanismes impliqués dans le développement de symptômes dépressifs induits par le stress chronique. Notre but est de déterminer si les symptômes dépressifs observés peuvent découler de la modification de récepteurs neuronaux. Notre premier objectif est de confirmer les résultats obtenus par analyse moléculaire (PCR) et de vérifier si ces modifications se produisent également chez des rats ne présentant pas de symptômes de type dépressifs malgré avoir également subi un stress chronique. Ensuite nous souhaitons bloquer pharmacologiquement ces récepteurs par approche préventive (avant le stress) et curative (après le stress) pour voir si cela suffit à empêcher l’expression de ces symptômes de type dépressifs.
Bénéfices attendus
Grâce à ce projet, nous pourrons mieux comprendre le rôle de la tVTA, une structure du cerveau récemment découverte et impliquée dans le développement de symptômes de type dépressifs induits par le stress. Nous pourrons également vérifier si le blocage des récepteurs des neurones de la tVTA permet de diminuer ou de prévenir l'apparition des troubles dépressifs. Si tel est le cas, ces récepteurs pourraient être la cible de futurs traitements plus spécifiques de la dépression.
Procédures
Implantation des canules : (520 rats maximum). La durée de la chirurgie ne dépassera pas 2h. Les animaux subiront le modèle de stress consistant en 2 séances de stress de 50 min (jour 1 et 2) où les rats seront soumis à des chocs électriques non échappables et non prédictibles (séances de 10 sec avec un intervalle moyen de 5-30 secondes) et le test comportemental d'une durée de 15 min visant à évaluer les conséquences dépressives du modèle et qui consiste en l’application de 30 chocs électriques, que l’animal peut éviter en changeant de compartiment dans la chambre de test. Les animaux subiront également le test comportemental de nage d'une durée de 15 min nous permettant de voir si l’animal montre également des signes de dépression en utilisant un autre test comportemental dans un environnement nouveau pour l’animal et le test comportemental du champ ouvert d'une durée de 15 min consistant à laisser le rat explorer un nouvel environnement.
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie d'implantation de canules, les rats devront s'habituer au dispositif sur leur tête. Dans le modèle utilisé, les rats sont soumis un stress intense lors de l'établissement du modèle. Ce stress est attendu et nécessaire à l'expérience. Nous nous attendons à l'apparition de symptômes de type dépressifs pour au moins 30% des animaux dans le modèle étudié. Néanmoins, les animaux seront traités avec une molécule permettant d'inhiber une structure cérébrale qui serait en partie responsable du développement de la dépression, notre hypothèse étant que ce traitement permettrait d'empêcher le développement de la dépression chez ces animaux.
Devenir
A la fin de l'étude, les animaux sont mis à mort afin de prélever leur cerveau pour procéder aux analyses biologiques.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chronique chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, est un processus intégré et repose sur l’observation du comportement de l’animal vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum afin d'obtenir un nombre d'échantillons statistiquement significatif, compte tenu du taux de succès de la chirurgie (60-90%), du modèle qui génère seulement 30% d'animaux susceptibles ainsi que de la qualité de prélèvement des structures cérébrales et le succès des analyses moléculaires. Pour optimiser l'expérience et réduire le nombre final d'animaux utilisés, les expériences seront également menées par petits lots d'animaux jusqu'à ce que suffisamment d'échantillons de qualité adéquate aient pu être obtenus.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cage collective afin de respecter leurs besoins sociaux. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale et analgésie (sans que l'animal ne ressente de la douleur) et durant toute la chirurgie, l'animal est maintenu au chaud à l'aide d'un tapis chauffant. En post-chirurgie, les animaux seront quotidiennement surveillés afin de contrôler leur bien-être et de mettre en place une analgésie si besoin. A chaque étape de l'étude, nous avons établi des points limites nous permettant de soustraire l'animal à la souffrance.
Choix des espèces
La tVTA (structure cérébrale étudiée) a été initialement décrite chez le rat, puis chez le singe. Chez la souris, cette structure est présente mais moins bien définie que chez le rat. Le projet utilise donc l'espèce chez laquelle le plus d’informations sont présentes. Pour ce projet, des rats adultes ( poids>200g à la chirurgie) seront utilisés puisque l’étude nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures.
Evaluation des effets d’un nouveau traitement dans un modèle murin de troubles neurodéveloppementaux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers pour 128 et modérés pour 384. Génétiquement modifiées pour reproduire le syndrome de Williams-Beuren, elles reçoivent des injections intrapéritonéales pendant dix jours puis passent une batterie de tests comportementaux, sursaut acoustique, évitement, clair-obscur, interaction sociale et immobilisation de peur. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu car la molécule testée est déjà commercialisée chez l'humain. Il indique que l'évaluation des altérations comportementales impose le recours au modèle murin.
Objectifs
Ce projet a le but d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement pharmacologique dans un modèle murin d’un trouble neuro-développemental, le syndrome de Williams-Beuren (SWB). Cette molécule est un activateur des canaux pour le potassium et n’a pas d’effets nocifs à la dose utilisée dans le projet. De plus, cette molécule est déjà présente sur le marché et présente aucun effet néfaste chez l’homme. L’objectif final du projet est d’identifier une nouvelle approche thérapeutique pour ce syndrome rare qui est aujourd‘hui sans traitement.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra sur le cours terme de vérifier l’efficacité thérapeutique du chlorzoxazone pour le traitement du syndrome de Williams-Beuren et de comprendre le rôle des canaux potassiques dans l’étiologie de cette maladie. Sur le long terme, nos résultats pourront être une base pour développer des essais cliniques sur des patients de cette maladie de développement.
Procédures
Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales pendant une période de courte durée (10 jours) et ensuite leurs comportements seront analysés pour déterminer leurs altérations comportementales. Les animaux sont soumis à différents expérimentation : startle à faible intensité ( 15 minutes), avoidance ( 2 séances de 35 minutes), light/dark ( 20 minutes), interaction sociale ( 6 minutes), startle à forte intensité ( 30 minutes), freezing ( 2 séances de 20 minutes).
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n’est attendu sur nos animaux suite au traitement de 10 jours avec cette molécule. Des travaux précédents, ont montrés aucune perte de poids, ni altération comportementaux suggérant une altération du bien-être animal. Au contraire, les données préliminaires ont montré une récupération de certains troubles de nos souris mutants suite à un traitement aigüe avec la même molécule. En outre, cette molécule est déjà sur le marché chez l’homme et n’entraine aucun danger.
Devenir
Les animaux passés en tests de comportement seront sacrifiés par inhalation de CO2. Les animaux pas testés seront sacrifiés et leur cerveaux prélevés pour des études de tissus. L'expérience dans le test comportement du type utilisé dans notre projet (apprentissage et sursaut acoustique) peut induire des modifications cérébrales et donc interférer avec les paramètres à mesurer.
Remplacement
Notre projet doit impérativement être réalisé chez un modèle murin pour permettre l’évaluation des effets thérapeutiques du traitement proposé. Le but de ce projet est l’évaluation des altérations comportementales des souris génétiquement modifiées étant donné que celles-ci représentent les seuls symptômes mesurables de cette pathologie.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé par des études pilotes précédentes avec les mêmes souris CD. Ces études ont démontré que n=12 est nécessaire pour obtenir une différence significative entre souris CD et leur congénères WT dans la plupart des tests comportementaux et n=8 pour les principales altérations cérébrales. Cette différence significative est la base pour évaluer les effets thérapeutiques de la molécule dans le modèle murin CD et doit donc être utilisé pour ce projet.
Raffinement
Pour limiter au maximum le stress des animaux, ceux-ci sont habitués à l’expérimentateur (le même pendant toute la durée de l’expérience) et aux différents dispositifs utilisés. Les substances injectées n’ont à ce jour pas montré d’effet néfaste sur l’état général des animaux (la molécule a été déjà mise sur le marché et utilisé chez l’homme sans danger connu). Néanmoins, pour chaque expérimentation, les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler d’éventuels comportements pouvant traduire une souffrance de l’animal. Parmi ces critères : perte de poids, agressivité vis-à-vis des congénères, automutilation, diminution de l’activité des animaux en cage d’hébergement, respiration anormale (une description détaillant les points limites est fournie dans la grille de score attachée). Dans la mesure où l’animal présenterait une de ces caractéristiques, il sera isolé de ses congénères, le traitement sera arrêté et l’évolution du poids, du pelage et de la mobilité dans la cage sera surveillée. S’il ne récupère pas des paramètres normaux, le vétérinaire sera contacté afin de s’assurer qu’il ne s’agit pas d’un problème plus grave de nature infectieuse par exemple. Il sera alors exclu de l’étude et des analyses statistiques. Si jugé nécessaire sur la base de l’évaluation des points limites, l’animal en souffrance sera sacrifié par dislocation cervicale et sa mort vérifié par l’absence de respiration et de reflexes principaux. Concernant l’hébergement, les animaux sont maintenus dans des cages collectives de 3 à 10 individus (leur taille varie en fonction du nombre) avec comme enrichissement des carrés de coton (Nestlets) pour permettre la construction du nid. Chaque personne manipulant les animaux possède la formation à l’expérimentation animale (concepteur ou opérateur) et suit régulièrement la formation continue en expérimentation animale. En plus, tout le nouveau personnel reçoit un entrainement supplémentaire dans la manipulation des animaux par la responsable de l’animalerie avant d’être admis à participer au déroulement pratique du projet de recherche.
Choix des espèces
Des souris (CD) et leurs congénères de type sauvage seront utilisés dans ce projet. La mutation est une microdélétion sur le chromosome correspondante à celle trouvé chez les patients du syndrome Williams-Beuren (WBSCR). La souris représente le seul modèl animal disponible actuellement pour étudier ce syndrome. Les animaux vont être utilisés à deux stades (adolescents et adultes). L’adolescence est une phase critique pour le développement du cerveau et est particulièrement sensible à certains traitements pharmacologiques. L’utilisation de l’âge adulte nous permettra de mieux comparer nos résultats comportementaux avec la littérature. En effet la plupart des études réalisées sur les modèles murins utilisés sont effectués à l’âge adulte.
Effet de la spiruline sur la dégradation des processus cognitifs liés à un régime hypercalorique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures classées légères. Soumis à un régime hypercalorique de type "cafétéria" pendant plusieurs mois, ils reçoivent chaque jour de la spiruline par gavage, puis passent des tests de reconnaissance d'objets et de mémoire spatiale. Le porteur teste l'hypothèse que la spiruline limiterait les déficits cognitifs liés à l'obésité et annonce comme bénéfice l'ouverture de pistes cliniques. Il affirme que l'évaluation des capacités cognitives ne peut se faire que sur l'animal entier.
Objectifs
L'obésité est une maladie complexe, multifactorielle, qui affecte plus d'un tiers de la population mondiale. Elle est devenue la première maladie « inflammatoire » non infectieuse et concerne aussi bien l'enfant et l'adolescent que l'adulte dans les pays industrialisés et les pays en voie de développement. L'Organisation Mondiale de la Santé définit l'obésité comme une surcharge pondérale par excès de masse grasse qui a des conséquences néfastes pour la santé, dans ses trois dimensions, somatique, psychique et sociale. Selon les dernières estimations de l'OMS, 1,6 milliards d'adultes de plus de 15 ans seraient en surpoids, et 400 millions seraient obèses. En France, selon la dernière enquête épidémiologique on estime que 31,9% des français de plus de 18 ans sont en surpoids, et 14,5% sont obèses. Outre les conséquences sociales et psychologiques qu'engendre cette pathologie, elle représente un risque majeur de développement des maladies cardiovasculaires et d’altération des fonctions cognitives. Au cours des dernières décennies, de nombreux efforts ont été consacrés à l'étude de différentes espèces végétales en raison de leurs activités pharmacologiques puissantes, de leurs effets secondaires moindres et de leur coût relativement faible. En particulier, la spiruline (Spirulina platensis) une algue microscopique suscite un intérêt important et un certain nombre de travaux indique qu’elle pourrait avoir un effet anti-obésogène. Le projet a pour objectif d’étudier l'impact de la spiruline à la fois sur l'installation de l'obésité induite par un régime hypercalorique et sur les perturbations cognitives de cette obésité. En effet, de nombreuses études montrent que l’obésité affecte les capacités d’apprentissage et de mémoire dépendantes de l’hippocampe chez les animaux et l’homme. Plus spécifiquement nous étudierons les effets de l’obésité induite par un régime « cafétéria » sur la reconnaissance d’objets et la mémoire spatiale dans une tâche d’exploration d’objets, ainsi que les effets de la prise de spiruline pendant le régime cafétéria sur ces mêmes processus mnésiques. L'hypothèse du projet est que la prise de spiruline empêche également l’installation des déficits cognitifs induits par l’obésité.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont d’apporter des connaissances fondamentales sur les effets de la spiruline sur l’obésité, et d’ouvrir des pistes cliniques de traitement préventif de l’obésité. En effet, les hypothèses du projet sont que la spiruline empêche l’installation des mécanismes physiologiques de l’obésité (prise de poids) et contrecarre les effets délétères de l’obésité sur la cognition et la mémoire.
Procédures
Les rats seront soumis à une procédure de gavage pour administrer la spiruline. L'intervention pour le gavage dure de 5 à 7 s. Le gavage aura lieu une fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (2 mois + la durée des tests comportementaux c'est -à-dire au total 3 mois environ).
Impact sur les animaux
L'effet indésirable principal est lié à la réalisation du gavage pour l'administration de la spiruline. L’expérimentateur maitrise la technique de gavage chez les rats car elle la pratique depuis plusieurs années. Si des difficultés surviennent dans la mise en œuvre de cette technique, ce qui peut se manifester par une résistance à l’insertion de la canule d’administration, des traces de sang sur la canule, un comportement anormal (halètement), l’opération de gavage sera suspendue pendant plusieurs jours. Un autre effet indésirable potentiel sur la physiologie est la prise de poids liée au régime hypercalorique. Cependant, il est à noter que bien que le régime cafétéria induise une hyperphagie et aboutit à une prise de poids plus rapide que les animaux contrôles, le poids des animaux en surpoids reste dans une gamme de poids "normale" pour ces animaux. La courbe de poids provenant d'études réalisées par l’expérimentateur et d’autres études (en annexe 3) montre qu'après 3 mois de régime cafétéria, les animaux pèsent aux alentours de 350-400 g. Ainsi cette prise de poids, si elle est rapide ne sera pas, dans l’absolu, d'une ampleur telle qu’elle aurait un effet délétère sur la motricité par exemple. Cependant, l’expérimentateur sera vigilant sur l’état général de l’animal qui sera vérifié quotidiennement selon la grille de score approuvée par la SBEA.
Devenir
A l'issue les animaux seront mis-à-mort afin de prélever le cerveau pour mesurer les marqueurs du stress oxydant et des défenses anti-oxydantes.
Remplacement
Ce projet repose sur un modèle rongeur de l’obésité qui permet une induction rapide de l’obésité et qui permet de tester les effets de traitements potentiellement efficaces contre l’obésité. L’évaluation des capacités cognitives et mnésiques ne peut se faire que chez l’animal entier, et non avec des études in vitro ou de la modélisation.
Réduction
Le régime cafétéria induit une obésité chez tous les animaux. Le nombre d’animaux minimum nécessaires pour les tâches de reconnaissance est de 8 par groupe. Ce nombre permet d’obtenir des données qui peuvent être analysées statistiquement soit par des test paramétriques (dans le cas d’une distribution normale des données) ou non paramétriques.
Raffinement
Les régimes alimentaires seront contrôlés mais la nourriture sera fournie ad libitum. Dès leur arrivée, chaque animal sera quotidiennement manipulé par l’expérimentateur afin de diminuer leur stress pendant toute la durée de l’étude. Les tests comportementaux impliquent une exploration libre de l’environnement et reposent sur l’attrait de la nouveauté et la réaction naturelle et spontanée de l’animal à la détection de la nouveauté. Il n’y a donc pas de contrainte pouvant induire un mal être. L’état général des animaux sera observé. Il est par exemple possible que, dans une cage, les animaux dominants blessent les animaux dominés. Ces critères seront évalués selon une grille de score, adaptée de Morton et Griffiths 1985, approuvée par la SBEA, ce qui permet de s’assurer du bien-être animal pendant et en dehors des temps d’expérience. Cette grille repose sur des critères liés à l’apparence des animaux, à leur prise alimentaire/poids corporel, à certains signes cliniques (fréquence respiratoire) ainsi qu’à leur comportement général (activité, vocalisation) et permet d’évaluer si l’animal est dans un état normal ou en souffrance. Le score obtenu dicte les dispositions éventuelles à considérer pour l’animal : De 0 à 4 : Etat normal ; De 4 à 9 : observation quotidienne, analgésie envisagée (buprénorphine 0,05 mg/kg ; s.c. 0,1 ml/10g) ; ≥ 10 : souffrance sévère avérée, arrêt de l'expérimentation par mise à mort de l'animal. Les animaux seront observés à chaque pesée bi-hebdomadaire. Les méthodes d’arrêt des souffrances se font de concert avec les zootechniciens de l’animalerie et sont reportées pour chaque animale sur une feuille de soins disponibles à l’animalerie.
Choix des espèces
Du fait de l'existence de modèles bien connu d'obésité innée ou acquise par l'exposition à des régimes hypercaloriques, le rat est une espèce particulièrement pertinente pour la réalisation du projet. En particuler le modèle d'obésité induite par un régime cafétéria est un modèle pertinent de l'obésité chez l'homme. Ce seront des rats adultes. L'étude considère l'obésité induite par un régime hypercalorique chez l'adulte.
Banque de tissus primates
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 microcèbes, des primates, vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil pour prélever leur sang et leurs organes. Le projet récupère les tissus d'individus en fin de vie, âgés, blessés ou malades, dont les points limites sont déjà atteints, pour constituer une banque destinée à d'autres équipes. Le porteur présente cette collecte comme une mesure de "réduction" du nombre de primates utilisés par la communauté scientifique. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale pour l'étude du vieillissement et des maladies neurodégénératives.
Objectifs
Le projet consiste à récuperer le sang et les tissus de primates en fin de vie. L'objectif du projet permet une rationalisation et une réduction du nombre d'animaux (primates) utilisés par la communauté scientifique. Les tissus prélevés sont le coeur, les poumons, le foie, la rate, le pancréas, le tube digestif, les reins, l'utérus, les testicules, les muscles des pattes postérieures, le diaphragme, le cerveau, la moelle épinière, les yeux, les bulles tympaniques (en fonction des demandes des équipes). Les tissus disponibles non utilisés par notre équipe sont en général conservés à -80°C ou post-fixés au paraformaldéhyde (sur demande des équipes). Une fiche individuelle des organes prélevés sur l'animal est conservée avec la date , le mode de conservation et le nom des équipes qui ont reçu les échantillons.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la mise à disposition de tissus précieux de primates à la communauté scientifique pour des études translationnelles vers l'humain. Un projet de dons d'organes primates est actuellement en cours par le GDR BIOSIMIA.
Procédures
En fin de vie, anesthésie des animaux par injection intrapéritonéale d'un mélange anesthésique et analgésique, puis injection intrapéritonéale d'héparine pour permettre l'exsanguination par prélèvement intracardiaque puis prélèvement du coeur et des autres organes. Une fois que l'animal est profondément endormi, la durée de l'intervention pour l'exsanguination et prélèvement du coeur est de 3 minutes.
Impact sur les animaux
En fin de vie, les points limites étant atteints, les animaux sont anesthésiés par injection intrapéritonéale d'anesthésique, ce qui peut engendrer un stress.
Devenir
si les soins apportés par le vétérinaire sont inefficaces et que les points limites sont atteints, les animaux seront mis à mort pour prélèvement de sang et des tissus pour banque de tissus fixés ou congelés
Remplacement
Il n'y a pas d'alternative non animale disponible pour l'étude du vieillissement et des maladies neurodégénératives dans la cadre de projet translationnel vers la santé humaine. La variabilité individuelle chez les primates miment la variabilité chez l'homme.
Réduction
ce projet rentre totalement dans le cadre de la réduction puisqu'il s'agit de partager des tissus de primates en fin de vie à la communauté scientifique
Raffinement
Les animaux sont anesthésiés par un mélange d'anesthésique et analgésique avant exsanguination intracardiaque
Choix des espèces
Le primate Microcebus murinus, phylogénétiquement plus proche de l’homme que les rongeurs, présente des caractéristiques physiologiques similaires à l'humain. Les animaux adultes en élevage qui présentent une altération forte de leur bien être (blessure, pathologie, âge avancé) et pour lesquels les points limites sont atteints seront utilisés
Caractérisation et traitement de l’inflammation intestinale dans un modèle murin de Sclérose En Plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
730 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Deux modèles de sclérose en plaques leur sont induits par injections d'un cocktail pro-inflammatoire et de toxine pertussique, avec pose d'un cathéter pour l'imagerie, provoquant une perte de mobilité et des poussées de paralysie sur plusieurs semaines. Le porteur prévoit une mise à mort si la perte de poids dépasse 20 % ou si le score de douleur reste élevé. Il affirme que les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro et parle de "stricte nécessité".
Objectifs
Nous utiliserons l'imagerie ciblée à l'aide de molécules spécifiques pour visualiser l'inflammation intestinale dans deux modèles de sclérose en plaques. Il s'agit d'un modèle progressif et d'un modèle avec une phase de rémission et une autre phase de récurrence. Pour chacun de ces deux modèles deux objectifs sont prévus : mesurer l’évolution de l’inflammation intestinale au cours de la maladie ainsi que de savoir si une inflammation intestinale apparait avant l’apparition des symptômes moteurs et/ou avant une rechute de la pathologie (réapparition des symptômes après une période de rémission), et si, le cas échéant, une telle inflammation est prédictive d’une déclaration, d’une rechute imminente de la pathologie et/ou de sa sévérité.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’approfondir nos connaissances sur le lien entre l’inflammation intestinale et la sclérose en plaques. Ce projet vise également à développer de nouvelles méthodes de diagnostic (imagerie) et de thérapeutique (traitement de l’inflammation intestinale) dans la sclérose en plaques.
Procédures
Injections s.c. à J0 de 50 µl au niveau de chaque hanche et de chaque épaule (soit 200 μl au total pour l’animal) : durée 20 secondes par injection, moins de 2 minutes pour tout + Injection i.p. à J0 et à J2 de toxine pertussique (200ng dans un volume final de 200 µl) 30 secondes en tout à chaque injection. Pose d'un cathéter veineux à la veine caudale pour l'imagerie et injection du contraste (200 µL au total) 5 minutes en tout. Suivi du score neurologique : observation pendant 5 minutes environ et pesées : 30 secondes en tout à chaque pesée après une habituation de quelques minutes une fois la cage déplacée à proximité de la balance.
Impact sur les animaux
Ce projet, sur la sclérose en plaques utilisera deux modèles chez la souris : un modèle progressif et un autre récurrent-intermittant. Des injections seront nécessaires ainsi que la pose d'un cathéter pour l'imagerie. Les animaux auront des injections d'un cocktail pro-inflammatoire qui provoquera une inflammation intestinale suivie en imagerie en plus que les symptomes moteurs. Le temps nécessaire entre le début du projet et l'imagerie est de 12-20 jours pour le modèle progressif et jusqu'à 40 jours pour le modèle récurrent intermittant (le scoring identifiera ce point). Pour le premier modèle, des signes cliniques de la sclérose apparaitront au bout de 8-10 jours et comprendront une perte de la mobilité. Pour le deuxième modèle, les signes cliniques apparaitront au bout de 10-15 jours pour la première poussée, une phase de rémission autour de 15-30 jours avec une deuxième poussée vers 30-40 jours.
Devenir
Procédure 1 : animaux mis à mort et tissus récupérés. Procédure 2 : animaux mis à mort et tissus récupérés. Procédure 3: tous les animaux inclus dans cette procédure seront gardés en vie à la fin afin d’évaluer les effets thérapeutiques des injections des anticorps monoclonaux. La mise à mort sera réalisée aux temps prévus par les procédures 1 et 2.
Remplacement
Ces études seront réalisées en parallèle avec des études in vitro (modèle de barrière hématoencéphalique, modèle de barrière intestinale, culture de cellules immunitaires). La réalisation de ces expériences in vitro est de nature à réduire le nombre d’animaux utilisés dans les procédures d’expérimentation décrites dans ce projet. Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro pour la bonne réussite de ce projet. En effet, des études dans des modèles animaux intégrés sont nécessaires pour la validation des données obtenues in vitro et pour la future translation à la santé humaine. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible. Les tests statistiques utilisés comprendront des tests non-paramétriques (test de Kruskall-Wallis suivi d’un test de Mann-Whitney), des tests paramétriques (ANOVA à mesures répétées suivi d’un test de Bonferroni, et tests de Student appariés et non appariés), des tests de régression linéaire ainsi que des tests de Gehan-Breslow-Wilcoxon. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui puissent suivre ces tests statistiques.
Raffinement
Un score clinique neurologique sera effectué tous les jours (dès le 1er jour jusqu’au jour de la mise à mort) afin d’évaluer la douleur et l’atteinte neurologique des souris. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveillance du poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée par rapport au poids initial et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (grimace scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel utilisé dans cette procédure expérimentale est neuf (pour les consommables, comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyé et désinfecté pour les réutilisables (pinces métalliques). Afin de prévenir toute douleur occasionnée par l’injection sous-cutanée du cocktail de protéines et par l’injection intra-péritonéale de la solution de toxine pertussique, une anesthésie générale gazeuse de courte durée sera réalisée (oxygène/protoxyde d’azote 30%/70% + 2.5 % d’Isoflurane) et un patch de Lidocaïne sera posé sur le dos et sur le ventre de l’animal 1h avant les injections. Une application de Lidocaïne par spray sera également réalisée quotidiennement au niveau de chaque point d’injection, du 1er jour de l’induction jusqu’au 5e jour après celle-ci (soit par l’animalier, soit par l’expérimentateur). Les animaux ne présentant pas de signe d’arrêt (voir plus loin : points limites) seront mis à mort 40 jours après l’induction de la maladie. Afin de faciliter l’accès à la nourriture et à la boisson lors des atteintes cliniques neurologiques sévères, une boite de pétri rempli de croquettes humidifiés est déposée dans la cage même et ceci dès le premier jour de l’induction du modèle. Un anesthésique gazeux sera utilisé qui permet une récupération rapide des animaux (isoflurane) et une analgésie est prévue (lidocaine en application locale et buprénorphine en s.c.).
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus utilisée pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la SEP, grâce à différents modèles bien caractérisés. Elle constitue également une espèce très étudiée dans le domaine de l’inflammation intestinale. L’anatomie de l’intestin et du système nerveux murin ainsi que la physiologie de la souris (notamment en ce qui concerne la barrière intestinale, la barrière hémato-encéphalique et le système immunitaire) sont également bien connues et sont proches de celles de l’homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables de la pathologie humaine de l’inflammation. Enfin, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’homme. Les souris utilisées auront 6-7 semaines. En effet, la SEP est une pathologie qui survient principalement dans une population jeune (entre 25 et 35 ans majoritairement).
Intérêt des facteurs de croissance hépatocytaires à la phase aigüe de l’accident vasculaire cérébral chez le rat (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
92 rats vont être utilisés dans des procédures légères puis modérées, 62 tués à 24 heures pour prélèvement du cerveau et du cœur et 30 réutilisés dans d'autres projets. Une chirurgie occlut une artère cérébrale par un filament pendant 90 minutes avant reperfusion, avec examens IRM sous anesthésie et injection d'une protéine, le facteur de croissance hépatocytaire, censée limiter les dégâts. Le porteur rappelle qu'aucun traitement de neuroprotection n'a démontré d'efficacité chez l'humain et renvoie un éventuel essai clinique au conditionnel. Il indique que le mécanisme d'action testé n'est pas reproductible in vitro.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la troisième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. Dans 85% des cas, l’AVC est d’origine ischémique, c’est-à-dire qu’il provient de l’occlusion d’une artère cérébrale. Le seul traitement disponible en phase aigüe d’un AVC ischémique (dans les premières heures) consiste à déboucher l’artère occluse (recanalisation). La recanalisation artérielle entraîne une restauration du flux sanguin au sein d’un territoire qui en était privé. Cette reperfusion du tissu cérébral est nécessaire, mais elle déclenche des cascades pathologiques qui contribuent aussi aux séquelles de l’AVC. L’un des enjeux du développement de nouvelles approches thérapeutique dans l’AVC, en complément des traitements actuels, serait de combattre les dommages liés à la reperfusion. L’objectif de ce projet est de déterminer si une protéine d’intérêt appelé Hepatocyte Growth Factor (HGF) permet de diminuer la taille et les conséquences de l’AVC. Il s’agit d’un élément majeur en santé publique car la taille de l’AVC est directement reliée au handicap et à la mortalité. Les données de la littérature sont croissantes depuis une dizaine d’année. Notre hypothèse est en faveur d’une diminution de la taille de l’infarctus et une amélioration de la fonction cérébrale lorsque HGF est utilisé dans l’AVC.
Bénéfices attendus
A ce jour, aucun traitement visant à protéger le tissu cérébral (neuroprotection) n’a démontré d’efficacité chez l’Homme. Ce projet de recherche a pour objectif de tester un nouveau traitement de neuroprotection dans les premières heures suivant la survenue d’un AVC liée à l’occlusion d’une artère cérébrale. La molécule testée a déjà montré des bénéfices dans l’attaque cardiaque. Si notre étude apporte des preuves d’efficacité, un essai clinique pourrait être mis en place rapidement pour évaluer cette nouvelle approche thérapeutique chez les patients. L’évaluation de nouveaux traitements dans un modèle d’AVC ischémique chez le rongeur est une étape nécessaire pour pouvoir concevoir correctement de futurs essais cliniques.
Procédures
Ce projet multisite se découpera en 2 procédures : 1) Etude pharmacologique de N Acetyl Heparin sous anesthésie gazeuse profonde à l’isoflurane - classe légère : La veine caudale est cathétérisée puis le produit est injecté par voie intraveineuse à différentes posologies, soit uniquement en bolus, soit par bolus puis perfusion continue pendant une heure (anesthésie de 10 minutes pour les injections en bolus seul, de 1h10 pour les injections en bolus puis anesthésie). Les animaux auront des prises de sang régulières, par voie caudale, de 50 μL : avant injection de NAH, à 10 minutes, à 1h puis à 24h (le prélèvement réalisé à une heure chez les animaux ayant uniquement un bolus intraveineux et celui réalisé à 24h seront réalisés après anesthésie locale caudale). 2) induction chirurgicale de l’AVC et administration des traitements - classe modérée : - (H0) Induction chirurgicale de l’AVC - (H1) Examen IRM basal afin de vérifier la bonne efficacité de la ligature artérielle - (H1,5) : le filament est laissé en place pendant 90 minutes (ischémie), après quoi il est retiré (reperfusion), et l’animal peut être définitivement suturé à l’aide de fils stériles. Le traitement est administré par voie intraveineuse (cathéter caudal) 5 minutes avant la reperfusion (HGF, NAH ou NaCl). Les animaux sont anesthésiés pendant 1h30. La durée de la chirurgie en elle-même est d’environ 30 minutes. - (H23) Examen fonctionnel : Evaluation du Neuroscore - (H24) Examen IRM final : imagerie IRM à 24h sous anesthésie générale. Les animaux sont anesthésiés une quinzaine de minutes pour l’acquisition des différentes séquences.
Impact sur les animaux
L’induction d’un AVC ischémique chez le rat nécessite une procédure de classe modérée avec une chirurgie réalisée sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes. L’AVC ischémique n’induit pas de douleur en soi (de même que chez les patients, le parenchyme cérébral étant dépourvu d’innervation). Une des complications, rare, est l’œdème cérébral malin. Par ailleurs, le modèle animal induit des déficits sensoriels et moteurs reproduisant la physiopathologie humaine. Les cerveaux et les cœurs seront prélevés en fin de procédure afin d’évaluer les mécanismes d’action du traitement sur le cerveau et, à distance, sur le coeur. Un nombre total de 92 rats au maximum seront utilisés au cours de ce projet (phase 1 + phase 2), afin de disposer d’une étude statistique robuste.
Devenir
Les animaux issus de la phase 1, utilisés pour l’étude pharmacologique de N Acetyl Heparin, pourront être réutilisés dans d’autres projets de recherche utilisant des rats. Les animaux issus de la phase 2 seront mis à mort à 24h afin de pouvoir analyser les mécanismes d’action en jeux. Les différentes techniques d’analyse nécessitent d’utiliser le cerveau et le coeur des rats après sacrifice des animaux pour analyses en laboratoire.
Remplacement
Ce projet s’appuie sur des données expérimentales déjà publiées. En effet l’activation des cellules cérébrales par la protéine HGF les protégeraient de la mort cellulaire. L’utilisation d’animaux vivants est justifiée d’une part par le rôle central de l’imagerie « in vivo » dans nos procédures, grâce à l’utilisation d’appareils d’imagerie par résonance magnétique (IRM) dédiés aux petits animaux, afin de reproduire la prise en charge de l’AVC chez l’Homme ; et d’autre part le mécanisme d’action de NAH qui n’est pas reproductible « in vitro ».
Réduction
Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux. L’imagerie « in vivo » permet un suivi longitudinal sans avoir à mettre à mort des animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Tous les animaux utilisés lors de la phase 1 seront réutilisés dans d’autres projets. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé par un biostatisticien. Nous avons utilisé un test satistique spécifique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
La chirurgie et les examens d’imagerie sont entièrement réalisés sous anesthésie profonde avec couverture analgésique adaptée. Les animaux sont surveillés de façon rapprochée avec utilisation de grilles de score pour évaluer le bien-être et prise de poids quotidienne (même en l’absence de chirurgie). Ils ont un accès facilité à la nourriture et à l’eau en période post-opératoire.
Choix des espèces
Le rat (souche Sprague-Dawley) est utilisé en première intention car c’est sur cette espèce qu’ont été décrites les techniques d’occlusion endoluminale (via un filament carotidien), ne nécessitant pas de craniotomie et permettant un excellent contrôle de la recanalisation. De plus nos méthodes d’imagerie et d’évaluation neurocomportementale sont bien validées entre nos mains chez le rat et pour cette souche. Il s'agira de jeunes adultes (poids de 250-300g). L’occlusion de l’artère cérébrale moyenne est réalisée via un filament dont le diamètre est calibré en fonction du poids de l’animal. Il est donc capital pour la réussite du modèle et l’inclusion des animaux que le poids soit strictement contrôlé. Les animaux jeunes sont préférés car la variabilité du modèle est moindre. Cette fourchette de poids est par ailleurs celle utilisée dans les études antérieures et sur lesquelles s’appuient notre retour d’expérience et nos statistiques.
Etude de l’effet neuroréparateur de la stimulation du nerf vague dans un modèle d’AVC chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
277 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue puisque leur cerveau est prélevé, la plupart sous anesthésie sans réveil et 25 en gravité modérée. Une microchirurgie provoque une ischémie du cortex et pose une électrode autour du nerf vague, les animaux étant gardés jusqu'à 28 jours avec des tests sensori-moteurs quotidiens puis un enregistrement électrophysiologique sous anesthésie. Le porteur affirme que la stimulation du nerf vague est indolore et que le seuil des points limites n'a jamais été franchi lors de projets antérieurs. Il décrit les procédures comme d'une "stricte nécessité" ne pouvant être remplacées par des méthodes in vitro ou in silico.
Objectifs
A ce jour, il n’existe pas de solution thérapeutique capable de protéger ou réparer le système nerveux central après un accident vasculaire cérébral (AVC). Plusieurs laboratoires, dont le nôtre, ont démontré que la récupération fonctionnelle est freinée par un excès d’inhibition par le GABA, un neurotransmetteur inhibiteur, au sein des territoires adjacents à la lésion cérébrale et que la réduction de cet excès d’inhibition favorise la plasticité cérébrale, c'est à dire la formation de nouvelles connexions neuronales, ainsi que la récupération sensori-motrice. La stimulation du nerf vague (SNV) favorise cette récupération, mais son mécanisme d’action reste à démontrer. Ce projet s’inscrit dans la thématique du laboratoire.
Bénéfices attendus
L'objectif est de valider l'hypothèse que la SNV permet d'amplifier l'activité du cortex cérébral lors de la phase de réparation après un AVC expérimental, et ainsi d'améliorer la récupération des fonctions sensori-motrices perdues avec l'AVC.
Procédures
Quatre procédures sont prévues dans cette demande. Ces 4 procédures seront réalisées, (avec des modalités différentes, clairement explicitées dans les paragraphes concernés) pour tous les animaux. A savoir : 1. une microchirurgie permettant de réaliser une ischémie du cortex cérébral ainsi que d'équiper l'animal avec une électrode de stimulation du nerf vague. Les animaux seront maintenus en vie 28 jours au maximum. La chirurgie durera environ 1h. Les performances motrices de l’animal seront sensiblement diminuées pendant les 48h suivant l’intervention, après quoi son état s’amméliorera de jour en jour grâce à la récupération sensori-motice. 2. des tests d'évaluation des capacités sensori-motrices. L'animal sera soumis aux tests sensori-moteurs pendant une quinzaine de minutes par jour de tests. 3. La stimulation du nerf vague (SNV) indolore et sans effet inconfortable pour l'animal sera pratiquée pendant la tâche comportementale ou alors sous anesthésie générale (30 min). 4. L'enregistrement électrophysiologique (2 h) sera pratiqué exclusivement sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Nuisances : - La microchirurgie au niveau du crâne et la suture de la peau à ce niveau entraînera une plaie sur 1 cm, qui sera traitée. - L'occlusion d'une branche de l'artère cérébrale induira une déficit partiel de la force musculaire du côté opposé à la lésion, le plus souvent réversible au cours des 3 semaines qui suivent. - La pose de l'électrode autour du nerf vague et la suture de la peau à ce niveau (cou) entraînera une plaie sur 1,5 cm qui sera traitée (résorption en quelques jours). Les muscles et les organes ne seront pas endommagés. Au total, notre expérience de plusieurs années sur ce modèle modéré d'AVC montre que les animaux supportent ces procédures sans complication et sans manifester une douleur ou une détresse que nous ne puissions traiter. - La stimulation du nerf vague, à l'intensité choisie, n'entraîne pas d'inconfort, de douleur ou de perturbation métabolique ou physiologique nuisible. Tout au contraire, il s'agit d'une stimulation employée chez l'animal et chez l'homme pour réduire les symptômes de dépression, pour limiter l'épilepsie ou pour inhiber la douleur. Le retour sur les précédant projets autorisés utilisant ces mêmes procédures ont montré que le seuil des points limites n'a jamais été franchi. Nous sommes donc confiant que le présent projet n'occasionnera pas d'effet inattendus.
Devenir
Le cerveau de tous les animaux utilisés dans ce projet sera prélevé pour des exploitations histologiques (analyses histopathologique et immunohistochimique).
Remplacement
Ce projet permettra d’analyser un mécanisme physiologique hautement intégré qui ne peut pas être reproduit de manière satisfaisante par des expériences in vitro ou in silico. Les paramètres physiologiques concernés n'existent que dans la situation "in vivo''. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales.
Réduction
Ce projet s’efforce de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante (277 souris mâles adultes), en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience. Le nombre d’animaux nécessaire a été évalué selon la sensibilité et la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études et de la littérature en vigueur. L’utilisation d'un modèle d'AVC modéré génère une lésion uniquement corticale de quelques millimètres cube (7 en moyenne) ce qui n’occasionne pas de handicap lourd chez les animaux ni de mortalité, permettant ainsi d’optimiser le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Concernant le critère de raffinement, les souris seront systématiquement anesthésiées lors des procédures invasives. Seul du personnel qualifié se chargera de réaliser les expériences, en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Des points limites sont définis au préalable. Tout au long du projet, du personnel qualifié veillera au bien-être des animaux bi-quotidiennement 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuellement en vigueur (Directive 2010/63/UE). Pour limiter le stress des animaux, les cages seront isolées dans une pièce dédiée, à l'abri du bruit extérieur. Les animaux auront accès à l’eau et la nourriture ad libitum et ils seront sous surveillance constante après le déclenchement de l’AVC expérimental.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est le mammifère non primate le plus proche (phylogénétiquement) de l’Homme : son degré d’homologie avec l’Homme est donc très élevé. De fait, la souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser l’ischémie cérébrale et le niveau de connaissance en physiopathologie est très avancé. L’anatomie du système nerveux central et la physiologie vasculaire assez similaire à celle de l’Homme en font un très bon modèle pour cette pathologie. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammifère (autres groupes de vertébrés ou invertébrés) ne permettrait pas d’obtenir des données aussi pertinentes et exploitables par la communauté scientifique et médicale. Les animaux seront âgés de 8-15 semaines en début du protocole, ce qui correspond à la maturité cérébrale adulte. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes pour comparer les données obtenues avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC. De plus, chez l’Homme, les AVC surviennent très majoritairement chez l’adulte.
Effets de la cécité sur le développement et la plasticité du système olfactif chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la moitié des petits naissant aveugles, un phénotype que le porteur qualifie lui-même de "dommageable". Les animaux testés subissent trois chirurgies du crâne sous anesthésie, avec incision au-dessus des bulbes olfactifs pour de l'imagerie optique, répétées à un mois d'intervalle, puis sont tués à la dernière séance. Quinze reproducteurs voyants n'ayant subi aucune chirurgie sont réutilisés dans un autre projet, les souris aveugles ne pouvant l'être. Le projet vise à comprendre la plasticité de l'odorat après une cécité précoce, le porteur affirmant que cette imagerie ne peut s'envisager sur modèle in vitro.
Objectifs
À l’échelle mondiale, environ 2,2 milliards de personnes présentent une déficience visuelle, touchant aussi bien les nouveau-nés prématurés que les personnes de plus de 50 ans (OMS). La théorie du «darwinisme neuronal» stipule que l'absence d'une modalité sensorielle, comme la vision, induit une plasticité cérébrale permettant la potentialisation des autres sens afin d’aider l’individu à s’adapter à son environnement. Si ce phénomène de potentialisation sensorielle a été largement décrit, son évolution au cours du développement et ses mécanismes font encore l’objet de nombreuses questions. Ainsi, une des questions principales est d’étudier comment se met en place au cours du temps cette plasticité chez un individu privé de la vision, à la fois du point de vue comportemental, mais également au niveau des processus cérébraux sous-jacents. À ce jour, l’impact de la cécité sur la fonction olfactive, qui est un sens invisible mais critique dans notre quotidien, reste peu étudié, en particulier au niveau des mécanismes de réorganisation sensorielle cérébrale. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le développement et la plasticité fonctionnelle du système olfactif induite par l’absence de système visuel périphérique au cours du développement. Nous avons choisi d’aborder cette question chez les rongeurs, des macrosmates qui utilisent principalement leur sens olfactif pour la perception de leur environnement (interactions sociales, recherche de nourriture, détection des prédateurs). Nous allons ainsi utiliser un modèle murin de cécité congénitale afin d’appréhender les mécanismes liés au développement et à la plasticité des systèmes sensoriels. Grace à la combinaison de plusieurs approches expérimentales, nous allons chercher à quel niveau et avec quel décours temporel interviennent les mécanismes de plasticité cérébrale afin d’apporter de nouvelles données pour mieux comprendre comment cette plasticité se met en place chez l’humain privé d’un sens.
Bénéfices attendus
Ce projet innovant répond à l’un des enjeux clés des neurosciences : la compréhension des mécanismes de plasticité cérébrale. Il est bien établi que la cécité précoce entraîne une amélioration des modalités sensorielles résiduelles non visuelles qui est accompagnée d'une plasticité cérébrale fonctionnelle et anatomique. Alors que les fonctions auditives et tactiles ont été largement étudiées, les données concernant les fonctions olfactives sont moins documentées et les résultats moins cohérents. Le but de la présente étude est d’évaluer, sur un modèle de souris présentant une cécité congénitale, les performances olfactives et de corréler les changements observés à l’activité des aires cérébrales impliquées dans la perception des odeurs. Cette étude sera menée à différents stades de développement afin d’évaluer comment ces modifications se mettent en place au cours du temps. Étant donné que les données concernant les fonctions olfactives chez les humains aveugles sont controversées, ce modèle murin nous permettra d’approfondir nos connaissances de la plasticité du système olfactif et de clarifier, avec des approches de pointe, l’effet de la cécité sur les fonctions olfactives. De nombreuses études ont montré qu’il était possible d’éduquer notre fonction olfactive comme l’illustre parfaitement l’exemple des parfumeurs, mais également de la rééduquer après une perte olfactive. Ce projet, en étudiant comment la plasticité se met en place au cours du développement, pourra fournir des données sur les périodes critiques au cours desquelles on pourrait proposer une éducation olfactive chez les enfants aveugles congénitaux visant à améliorer encore leur perception du monde qui les entoure.
Procédures
La procédure 1 concerne la mise en reproduction des souris et il n’y a donc aucune intervention sur ces dernières. La procédure 2 comprend deux session expérimentale. La première vise à enregistrer la respiration des souris dans un pléthysmographe corps entier. Afin de limiter le stress des animaux lié au changement d’environnement par rapport à leur cage d’hébergement, ils seront habitués à l’appareil pendant 10 minutes les deux jours précédant cette session. La durée totale de cette session sera de 30 minutes. La deuxième session expérimentale a lieu de lendemain de la première. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés puis placés dans un cadre stéréotaxique. Suite à un traitement anesthésique local, la peau du crâne sera incisée au niveau des bulbes olfactifs (ouverture de 0,5 cm environ). Une session d’imagerie optique sera alors réalisée pendant 30 minutes et en présentant différentes odeurs. L’anesthésie et l’analgésie seront maintenues tout au long de la procédure. La peau du crâne sera ensuite recousue et l’animal replacé dans sa cage d’hébergement. La durée de cette session n’excédera pas 60 minutes. Cette procédure sera répétée 3 fois pour chaque animal à 9/11 jours post-natal (P9/11) à P30 et à P60. Après chaque session expérimentale, les souris (en particulier les plus jeunes à P9) seront replacés le plus rapidement possible avec leur mère ou leurs congénères. A la suite de la dernière session d’imagerie (P60), les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
La procédure 1, qui concerne la reproduction des animaux, va engendrer la naissance (la moitié de la portée) de souris aveugles qui est un phénotype dommageable. La procédure 2 comprend deux sessions expérimentales sur chaque animal. La première, qui concerne l’enregistrement dans la cage de pléthysmographie peut potentiellement générer un léger stress pour le jeune animal séparé de sa mère. La deuxième nécessite une chirurgie de gravité modérée réalisée sous anesthésie qui consiste en l’incision de peau au-dessus des bulbes olfactifs puis a la suture de celle-ci. Cette intervention peut engendrer une douleur post-opératoire. Cette intervention sera répétée à 30 jours d’intervalle.
Devenir
Procédure 1 : les souris reproducteurs et reproductrices voyantes (soit 15 souris) n’ayant subies aucune chirurgie ni geste invasif pourront, comme leur progéniture excédentaire, être réutilisés dans un autre projet de recherche. Il est difficile d’envisager la réutilisation des souris de phénotype aveugle dans une autre procédure, la plupart de celles-ci nécessitant un animal « voyant ». Si nous avons des pertes des juvéniles lors de la procédures 2, nous pourrons considérer utiliser ces animaux pour nos enregistrements chez l’adulte. Procédures 2: les animaux ayant subis 3 chirurgies au cours de leur développement et ayant été testé avec des odeurs dans le pléthysmographe ne pourront pas être réutilisés. Ils seront donc mis à mort à la fin de la procédure après la 3ème et dernière session d’imagerie.
Remplacement
L’étude de l’activité fonctionnelle du bulbe olfactif et du cerveau ainsi que des fonctions respiratoires et olfactives nécessitent l’utilisation d’animaux vivants et ne peut s’envisager sur modèles strictement in vitro. Les enregistrements optiques, s’ils ne sont pas invasifs au niveau cérébral, nécessitent la réalisation d’une fenêtre dans l’os du crane et rendent donc ces expériences non envisageables chez le sujet humain.
Réduction
Pour mener ce projet, nous aurons besoin d’utiliser 80 souris pendant la durée du projet. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum et choisi en fonction 1) du calcul de la puissance statistique (avec alpha =0.05 et puissance statistique de 0.8) et 2) de nos travaux antérieurs et des données bibliographiques d’autres groupes. Les tests statistiques seront basés sur des ANOVA factorielles (aveugle VS voyant) (comparaison des fréquence respiratoires, surface des aires activées en imagerie optique) et des ANOVA à mesures répétées (test d’habituation/cross habituation). De plus et de façon critique, les approches expérimentales choisies (pléthysmographie et imagerie optique) permettent une approche longitudinale sur les mêmes animaux au cours du développement, réduisant ainsi le nombre total d’animaux utilisés. De plus, nous allons utiliser les mêmes animaux pour les mesures physiologiques (mesure de la respiration) et l’imagerie optique dans la procédure 2. Pour limiter tout effet de portée, seules 2 souris par phénotype seront testées à l'intérieur de la même portée, soit 2 souris aveugles (1 femelle et 1 mâle) et 2 souris voyantes (1 femelle et 1 mâle) pour un total de 4. Les animaux surnuméraires seront proposés pour être réutilisés dans d’autres procédures au sein de l’établissement. Si ce nombre idéal n’est pas possible dans une portée (par exemple une femelle aveugle et 2 mâles, 1 aveugle, 1 voyant), nous inclurons ces animaux dans notre procédure et inclurons 1 animal supplémentaire d’une autre portée pour compléter notre groupe).
Raffinement
Nous avons choisi d’enregistrer la respiration de façon non-invasive en utilisant une cage de pléthysmographie. Cette technique permet d’étudier très finement un ensemble de paramètres respiratoires comme la fréquence et les volumes inspiratoires et expiratoires de manière spontanée ou en présence d’une stimulation odorante. Ces enregistrements ont lieu sans aucune contrainte chez l’animal comme c’est le cas, par exemple, avec l’utilisation d’une ceinture placée autour de la cage thoracique. L’animal est libre de ses mouvements. Pour les expériences d’imagerie optique, l’anesthésie et l’analgésie seront maintenues tout au long de la chirurgie ou de l’enregistrement. La douleur post-opératoire sera quantifiée et une couverture analgésique sera mise en place. Étant donné que la moitié des souris présentera un phénotype dommageable dû à l’absence de perception visuelle, un milieu d’hébergement ultra-enrichi est préconisé. Le matériel utilisé sera le suivant : une grande cage, hébergement en groupe, la nourriture est mélangée avec la litière, un tunnel et une roulette / cage, et du matériel de nidification. Cette souche de souris, en offrant la possibilité d’avoir nos deux phénotypes d’intérêt au sein d’une même portée, permet de ne réaliser qu’un seul élevage.
Choix des espèces
Les rongeurs et en particulier les souris sont un modèle de choix pour l’étude du système olfactif en général et pour cette étude en particulier pour plusieurs raisons : (1) Les souris nouveau-nées naissent sans entrées auditives et visuelles (jusqu'aux jours 9 et 14-15, respectivement); Elles sont donc d'abord guidées par la chimioréception; (2) Le système olfactif de la souris fonctionne avant la naissance, contribuant ainsi très tôt à l'induction expérientielle de phénotypes comportementaux ; (3) Après la naissance et à l’âge adulte, les souris utilisent de façon critique les indices olfactifs pour guider leur comportement ; (4) Des tests comportementaux standardisés sont conçus pour évaluer les fonctions cérébrales et le comportement chez les souris adultes et en développement ; (5) L'accès à de nombreux génotypes obtenus par mutation ou par manipulation génétique permettent de disséquer de nombreuses fonctions cérébrales et notamment la plasticité. Pour répondre à la question des effets de la cécité sur la plasticité cérébrale et les performances sensorielles non visuelles, nous avons choisi d'utiliser une souche de souris mutante (la souche de souris ZRDBA). Lors de la reproduction, cette souche permet d’obtenir, au sein d’une même portée, une moitié de congénères aveugles et l'autre moitié voyants normalement. C’est un critère majeur lorsque l’on étudie le développement puisque l’on peut comparer des animaux de phénotypes différents issus d’une même portée. Ces animaux ont donc reçu les mêmes soins maternels et ont été exposés aux mêmes stimuli lors de leur développement. L’objectif est de tester l’impact de l’absence du système visuel périphérique sur l’activité du système olfactif au cours du développement. Nous utiliserons donc des souris à 3 stades développementaux différents : avant qu’elles n’ouvrent les yeux à un âge post-natal compris entre P9 et P11, quand elles ont ouvert les yeux et sont séparées de leur mère entre P30 et P32 et à l’âge adulte (>P60).
Evaluation de l’impact de la dépletion de la microglie durant le développement sur les fonctions cognitives à l’age adulte
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après déplétion de la microglie par gavage des mères gestantes, elles subissent à l'âge adulte des sons intenses provoquant des sursauts, des chocs électriques plantaires pour un conditionnement pavlovien et un test de sensibilité à l'épilepsie pouvant déclencher des convulsions. Le porteur qualifie ces périodes de stress de courtes et indique faire enchaîner toute la batterie de tests aux mêmes animaux pour en réduire le nombre. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ou in silico n'existe pour étudier ce rôle développemental.
Objectifs
Le développement des cellules de la microglie (une population spécifique du cerveau) durant le développement embryonnaire constitue une étape clé dans la mise en place des réseaux neuronaux mais aussi dans l'équilibre entre les différents types cellulaires qui semble prépondérant dans de nombreuses pathologies neurodégénératives chez l'Homme. Nous souhaitons dans le cadre de cette étude mettre en évidence les troubles comportementaux qui seraient susceptibles d'apparaitre chez des animaux ayant subi une déplétion de cette microglie durant leur développement. On constate en effet que la microglie se régénère lors du développement post-natal, mais que son absence durant le stade embryonnaire entraîne un impact durable au niveau cognitif. Pour cela, des Souris seront exposées durant leur développement (par gavage des souris gestantes), à un agent pharmacologique entrainant une disparition de la microglie durant une période définie du développement. Par la suite, ces Souris poursuivront leur développement et nous analyserons leurs réponses comportementales dans de multiples tests visant à déterminer les capacités cognitives.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mettre en évidence le rôle critique joué par la microglie durant le développement embryonnaire, sur les fonctions cognitives à l'âge adulte. De plus, nous obtiendrons des informations imporantes sur la chronologie des évenénements ayant lieu au cours de la mise en place de cette population durant le développement de l'embryon.
Procédures
Les animaux effectueront plusieurs procédures impliquant des sons d'intensité élevée mais d'une durée inférieure à 40 ms, afin de déterminer leurs réaction face à des stimulus acoustiques, un choc électrique plantaire d'intensité modérée et d'une durée inférieure à 50ms (afin de mettre en place un conditionnement de type pavlovien) ainsi qu'une évaluation de leur sensibilité à l'épilepsie pouvant mener à des convulsions musculaires. Aucun prélevement sanguin ne sera réalisé.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront durant ce projet de courtes périodes de stress (30 minutes environ) liées à l'exposition à des bruits entrainant des sursauts, ainsi qu'à un choc électrique plantaire visant à mettre en place un apprentissage de type pavlovien. En fin de protocole, lors de l'évaluation de la susceptibilité à l'épilepsie, il pourraient subir des contractions musculaires d'intensité modérée à forte durant une période de deux heures, sous surveillance d'un expérimentateur entrainé.
Devenir
Les animaux ayant suvi l'ensemble du protocole ne pourront pas être réutilisés pour d'autres projets.
Remplacement
Etant donné que ce protocole vise à déterminer le rôle d'une population de cellules durant le développement d'une organisme complexe sur le comportement adulte, aucune alternative (in vitro ou in silico) n'est actuellement possible
Réduction
Nos effectifs expérimentaux sont réduits à 10 animaux par groupe, ce nombre est suffisant pour obtenir une puissance statistique acceptable dans les procédures que nous allons utiliser, au regard des données précédemment générées. Par ailleurs, le même lot d'animaux effectuera l'ensemble de la batterie de tests afin de minimiser le nombre d'animaux employés tout en disposant de temps de récupération pour éviter un effet cumulatif du stress et une interaction des procédures entre elles.
Raffinement
Toutes les mesures possibles ont été mises en place pour améliorer les conditions de vie ainsi que réduire le stress occasionné par les procédures expérimentales. Ainsi, les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi avec eau et nourriture à disposition, lors des protocoles expérimentaux, les animaux sont placés 30 minutes avant le test dans la pièce expérimentale pour réduire le stress occasionné par le changement d'environnement de leur cage. Durant les procédures impliquant une anésthésie, un gel oculaire sera utilisé pour éviter le déssechement de la cornée. Les animaux seront maintenus en groupe sociaux durant l'ensemble du projet.
Choix des espèces
Nous disposons de bons modèles de déplétion de la microglie durant le développement embryonnaire dans ce modèle . Les animaux seront agés de 8 semaines lors de l'implantation de la puce et de 10 semaines au premier tests comportemental, cela constitue l'âge idéal pour étudire le comportement des animaux déjà suffisamment développés.
Le rôle du recepteur CB1 dans le processus de de/regeneration de la junction neuromusculaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un écrasement chirurgical du nerf sciatique pour dénerver une patte, puis reçoivent un dérivé de cannabinoïde ou un placebo, avant mise à mort à 2 ou 21 jours pour prélever muscles et nerfs. Le porteur indique un risque faible d'automutilation des extrémités dénervées, entraînant la mise à mort en cas d'atteinte. Il affirme que les connaissances actuelles ne permettent aucune simulation in vitro ou in silico de ces processus.
Objectifs
Avec ce projet, nous voulons comprendre le mécanisme par lequel les cannabinoïdes (molécules dérivées du cannabis) régulent la (ré)génération nerveuse, et leurs implications potentielles dans les maladies neurodégénératives. Pour ce faire, nous procéderons à un écrasement chirurgical du nerf sciatique chez des souris, afin de supprimer transitoirement l’innervation d’une patte, ce qui que nous permetra d’étudier par la suite les effets des cannabinoïdes sur la dé/ré-generation nerveuse.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra amener au développment d’outils thérapeutiques visant les processus de dégénération des nerfs périphériques, qui manquent cruellement pour traiter un certain nombre de maladies neuro-dégénratives (telles que la sclérose latérale amyotrophique).
Procédures
Nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées, dont le récepteur aux cannabinoïdes de type 1, « CB1 », est absent chez la moitié des individus. Ces souris subiront une dénervation complète et transitoire d’un membre inférieur par écrasement du nerf sciatique. Cette procédure chirurgicale se fera sous anesthésie générale, avec un traitement morphinique pour prévenir la douleur. L'intervention aura une durée de 30 minutes. Dans la période postopératoire (intevention de 3 jours), une injection sous-cutanée de Buprénorphine (0,1 mg/kg) sera administrée 6 heures apres la premiere injection et répétée une fois par jour pedant 3 jours. Par la suite, un groupe de souris sera traité avec un analogue des cannabinoïdes tandis que l’autre recevra un traitement placebo, par injection quotidienne dans l’abdomen. Cette intervention aura une durée de 2 jours ou 21 jours comme expliqué apres. En fait la moitié des souris sera mise à mort après seulement 2 jours de traitement, pour l’analyse post-mortem de la dégénération nerveuse. L’autre moitié sera mise à mort après 21 jours de traitement, pour analyser cette fois-ci la régénération nerveuse.
Impact sur les animaux
La procédure de dénervation complète transitoire d’un membre inférieur par écrasement contrôlé du nerf sciatique offre un modèle fiable de dégénération/régénération nerveuse et sourtout sans impacts dramatiques sur l’état générale de l’animal, son comportement moteur et alimentaire ou presence de douleur chronique, car la procédure sera effectué de façon aigüe et unilaterale. Il n’y a pas de risque majeur de saignement lié à l’acte chirurgical et la douleur associée est traité par une anesthésie majeure et des analgesiques (voir procédure). La douleur est normalment associée à l’acte opératoire mais il n’y a pas de signe perceptible des douleur après l'opération et durant la régénération. Neanmoins, il peut y avoir des points limites bien décrit dans la procédure. Le taux d’apparition des signes d’infection de la plaie et autotraumatisme des extremités suite à la dénervation est très faible et la mortalité lié à la procedure de dénervation est reportée aux alentours de 1% dans les publications sur le sujet. Ainsi, un protocole de surveillance et un suivi quotidien et rigoureux seront mis en place par l’experimentateur et le personel zootechnicien. En cas de blessure légère, un protocole de soins et désinfection sera mis en place (antiseptique topique e.g. cicajet et anti-inflammatoire systemique e.g. Metacam 5mg/kg I.P.) jusqu’à la guérison. En cas d’atteinte du point limite terminal (automutilation), l’animal sera mis a mort.
Devenir
Les souris sont mises à mort par dislocation cervicale 2 jours ou 21 jours apres la procedure chirurgical/injections pour prelevement post-mortem des muscles et nerf sciatiques. Ce type de mise a mort est l’unique compatible avec les analyse hystologique at d’expression des proteines que seront effectué sur les echantillons.
Remplacement
À ce jour, l'étendue des connaissances concernant le système nerveux est encore trop limitée pour permettre la conception de simulations numériques ou de modèles in vitro pour modéliser fidèlement les processus de dégénération et régénération nerveuse. De plus, l’usage d’invertébrés, qui ont un système nerveux complètement différent du nôtre, serait ici inapproprié. Dans ce contexte il demeure donc nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale sur des vertébrés.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 12 animaux par groupe expérimental, c'est-à-dire le nombre minimal d’animaux permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine. Cela représente au total 288 souris, sur les 2 années que dure ce projet. Les nombres prévus permettront de garantir une bonne interprétation des résultats. Néanmoins, si l’expérience nous montre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages collectives avant et après manipulation, avec un milieu enrichi (matériel de nidification), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière pour les souris. Les souris seront observées quotidiennement par un personnel qualifié ainsi que par l’expérimentateur, et ce, afin que des soins soient immédiatement prodigués si nécessaire (désinfection, anti-douleurs, etc.). La mise en place de points limites repose sur une évaluation de l'état général et comportemental des animaux et peut conduire à la mise à mort d’un animal afin d’éviter toute souffrance prolongée qui ne saurait être soulagée.
Choix des espèces
La souris représente le modèle idéal pour ces trois raisons : 1) Possibilité d’étudier des mutants pour une protéine donnée (ici le récepteur aux cannabinoïdes de type 1, « CB1 »), 2) Pour une reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Les infrastructures sont parfaitement adaptées à l’étude des rongeurs. Les souris seront âgées de 8-12 semaines (âge adulte). En effet, les protocoles que nous avons établis nécessitent des souris adultes, pour éviter la variabilité associée aux différences de développement. Cela nous permettra également de comparer avec d'autres études sur le terrain. Les protocoles que nous avons établis seront utilisés sur des souris mâles pour éviter la variabilité associée au cycle menstruel des femelles, qui a un impact sur les niveaux d’expression du récepteur CB1. Cela nous permettra également de comparer les résultats obtenus avec ceux d'autres études déjà effectuées dans notre équipe.
Modélisation des ribosomopathies chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
- Système urogénital
1 140 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, environ 855 conservés comme reproducteurs et les autres tués faute de porter la modification génétique recherchée. Les adultes subissent une coupure de nageoire pour vérifier leur génotype, leurs embryons servant à modéliser des maladies génétiques humaines rares. Le porteur décrit l'imagerie sur embryon comme non invasive. Il affirme que la souris ou le xénope ne permettent pas de modéliser ces pathologies alors que le poisson zèbre le permet.
Objectifs
Notre projet vise à caractériser les mécanismes génétiques et physiologiques gouvernant le développement de ribosomopathies (pathologies génétiques humaines) en utilisant le poisson zèbre Danio Rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours de l'établissement de ces pathologies, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt et la synthèse des ribosomes dans des tissus cibles. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent les événements précoces de ces ribosomopathies qui interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 11 Lignées pour ce projet : (A) 5 lignées transgéniques : 4 lignées transgéniques ciblant spécifiquement 4 tissus : Tg(crêtes neurales::CRE) ,Tg(sang::CRE), Tg(lignée germinale::CRE) et Tg(système neural::CRE) pour visualiser les étapes précoces de la mise en place des pathologies dans ces tissus, 1 lignée transgénique permettant de quantifier la synthèse des ribosomes in vivo : Tg(ribo:Tag) et (B) 6 lignées mutantes des génes humains et candidats impliqués dans les ribosomopathies: tsr2, rpsa, rpn1, hspa, et deux nouveaux génes (ribo1, ribo2) pour modéliser et analyser le rôle possible de ces gènes candidats dans le développement des ribosomopathies.
Bénéfices attendus
Le projet nous permettra d’établir des lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons pour modéliser les ribosomopathies qui ne sont pas modélisables chez d'autres modèles vertébrés comme la souris ou le xénope. Ces outils seront alors largement accessibles à la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle de ces gènes dans différents processus physiologiques.
Procédures
Afin de valider leur génotype les animaux subiront un coupure de la nageoire au stade adulte. Les animaux générés par la suite seront utilisés à des fins reproductives, seuls leurs embryons dans les phases de développement autonomes (avant 5 jours de développement) seront utilisés pour les expérimentations.
Impact sur les animaux
A ce jour, nos expériences n'indiquent pas d'effets indésirables pour les lignées transgéniques à l'état hétérozygote et homozygote. Enfin, le génotypage des adultes pourrait induire un stress qui sera surveillé attentivement.
Devenir
Idéalement, nous aimerions conserver la totalité des animaux mais tous les adultes ne seront pas porteurs de la mutation et nous choisirons les allèles mutants les plus facilement identifiables et les lignées transgéniques les plus robustes pour ne conserver en moyenne les 3/4 des animaux reproducteurs (1140 X3)/4 = 855 animaux. Les autres qui ne portent pas l'événement génétique requis seront mis à mort.
Remplacement
Nous développons actuellement des modèles théoriques mathématiques pour simuler numériquement les expérimentations et ne tester biologiquement que les expériences ayant un intérêt pré-validé.
Réduction
L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et à l'observation ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation et observation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse grâce au développement de protocoles utilisant le système CRISPR/Cas9, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées. Nous utilisons les individus hétérozygotes comme "contrôles équivalents" pour avoir dans un même croisement d'individus hétérozygotes tous les génotypes d'intérêt pour nos expérimentations. Enfin, nous pouvons générer des individus adultes porteurs de transgènes et de mutations pour réduire le nombre d'adultes utilisés dans nos expérimentations.
Raffinement
Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement des méthodes non invasives d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour modéliser les ribosomopathies.
Choix des espèces
Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes modélisant les ribosomopathies humaines affectant le développement cranio-facial et l’hématopoïèse. Une approche in vivo sur un animal vertébré est nécessaire pour comprendre ces processus dynamiques. Cependant, les modèles murins ne sont pas adaptés pour modéliser ces pathologies alors que le poisson zèbre le permet. Il présente de nombreux avantages dont la possibilité de procéder à de l'imagerie « in vivo » grâce à la transparence de ses embryons. Ce modèle, permet aisément et de façon non-invasive, le recourt à la transgénèse et la mutagénèse dirigée pour établir les lignées mutantes ou transgéniques stables nécessaires à la dissection des processus moléculaires impliqués. De plus, contrairement, aux autres modèles génétiques vertébrés, les poissons ont un développement embryonnaire externe permettant d'avoir accès à ses embryons facilement pour observer le développement précoce de ces pathologies (impossible chez un mammifère) et surtout sans sacrifier l'animal ni lui infliger de douleur. L'ensemble de nos processus développementaux d'intérêt et donc de nos expérimentations se déroulement entre le stade 1 cellule (oeuf) et 5 jours après la fécondation, stade auquel les larves de poissons zèbre ne sont pas encore autonomes. Les adultes sont utilisés uniquement à des fins reproductives et d'observation.
Etude des circuits neuronaux impliqués dans les comportements autistiques et épileptiques de souris déficientes en canaux sodiques Nav1.2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une mutation liée à l'autisme, elles subissent une chirurgie cérébrale d'environ une heure avec pose de fibres optiques, puis des tests comportementaux courts ou un enregistrement électrique de six heures. Le porteur stimule des zones du cerveau par la lumière pour tenter de corriger le comportement et qualifie cette approche in vivo d'"indispensable". Il déclare des effets indésirables limités à un "léger stress" lié à la chirurgie.
Objectifs
Les Troubles du Spectre Autistique représentent un ensemble de pathologies neurodéveloppementales touchant 1 enfant sur 160 dans le monde. Les symptômes sont répartis en 2 grandes catégories : apparition de déficits dans l'interaction et la communication sociale et des comportements moteurs inappropriés, répétitifs et stéréotypés. Ils apparaissent à partir de 3 ans et se prolongent chez l’adulte. Bien que de nombreuses causes tant génétiques qu’environnementales, aient été mises en évidence grâce aux études actuelles, le mécanisme commun expliquant le développement de la pathologie reste encore à utiliser. Pour cela, l’utilisation de modèle animaux reste donc cruciale. Notre équipe étudie notamment l’influence d’un gène identifié chez les patients comme faisant partie des plus fréquemment muté (SCN2A). Il code pour une protéine impliquée dans l’activité électrique des neurones. Ce projet se base sur l’étude d’un modèle de souris portant une mutation du gène SCN2A entrainant une diminution de l’excitabilité neuronale et dont les troubles comportementaux reproduisent ceux retrouvés chez les patients. Ce projet se déroulera sur 5 ans et propose d’identifier les régions cérébrales impliqués dans différents comportements autistiques chez ces souris (communication sociale et anxiété). Pour cela, nous utiliserons une protéine (activable par la lumière) pour stimuler différentes zones cérébrales d’intérêt à l'aide d'un laser pendant les tests. Cela aura pour but de compenser la présence de la mutation et le manque d'excitabilité des neurones, ce qui rétablira le comportement si les zones cérébrales étudiées sont impliquées.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes menant au développement de l'autisme et/ou de l'épilepsie chez le modèle animal est indispensable pour expliquer l'apparition des symptômes et leur développement au cours du temps chez l'Homme. La mise en évidence de zones cérébrales et de certaines connexions neuronales spécifiquement impliquées dans les différents troubles comportementaux observés permettent à la fois de comprendre le fonctionnement naturel des comportements étudiés (ex: communication dans un contexte social) et d'avoir des cibles précises sur lesquelles avoir une action thérapeutique précoce pour limiter ou empêcher l'apparition des symptômes.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'environ 1 heure (injection de l'outil permettant la production de la protéine activable par la lumière dans les zones cérébrales d'intérêt et pose de fibres optiques permettant de l'activer), puis à un test comportemental (de 3 ou 5 min) ou à un enregistrement de l'activité électrique des neurones = électrocorticogramme (6 heures).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables liés à ce projet sont peu nombreux. En effet, l'étape de chirurgie est la seule susceptible de causer un léger stress à l'animal. En outre, toutes les mesures seront prises pour éviter toute souffrance à l'animal lors de cette étape. Nos tests comportementaux sont peu stressants car ils sont basés sur des comportements naturels d'exploration, sont de courtes durées (3-5min) et se déroule avec une faible luminosité environnante contrôlée pour ne pas ajouter un stress supplémentaire.
Devenir
Tous les animaux utilisés lors des procédures seront mis à mort pour prélever les cerveaux dans le but de vérifier le bon positionnement des injections de l'outil, des fibres optiques et des électrodes.
Remplacement
Nous avons établi notre projet de recherche en tenant compte de la règle des 3R. Ainsi, afin de répondre au principe de remplacement, nous réaliserons, parallèlement aux expérimentations sur animal vivant, quand cela sera possible, des études sur culture de neurones ou tranches de cerveau. Cependant, les études fonctionnelles basées sur la stimulation des neurones et leur impact sur la réponse comportementale ne peuvent être réalisées que sur animal vigile. Cette approche in vivo est donc indispensable pour modéliser et étudier au mieux le phénotype clinique associé aux Troubles du Spectre Autistique.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été réduit au maximum tout en nous permettant d'obtenir des résultats interprétables. Nous comparerons pour chaque test 4 groupes d'animaux : souris sauvages et mutantes, avec ou sans stimulation lumineuse. Nous avons calculé nos besoins en animaux via une méthode statistique adaptée. Un maximum de 20 animaux seront donc utilisés par groupe pour les procédures. Les 2 sexes seront utilisés pour réduire la production nécessaire en termes de nombre d'animaux (mâles pour la communication sociale et femelles pour le test d'anxiété).
Raffinement
Toutes les mesures de raffinement appropriéees seront prises pour éviter toute souffrance ou inconfort à l’animal. Toutes les souris seront élevées dans un environnement enrichi (social et physique) et une manipulation régulière des animaux sera réalisée afin de réduire leur stress. Les procédures chirurgicales seront réalisées par des expérimentateurs habilités à pratiquer la chirurgie dans des conditons optimales pour le bien-être des animaux (prise en charge de la douleur, soins pré/post opératoire, suivi quotidien, etc.). Un autre exemple de mesure de raffinement sera l'administration d'un anti-inflammatoire dans l'eau de boisson pendant la période post-opératoire. Un suivi journalier permettra d’évaluer leur état de santé et ainsi d’intervenir rapidement par rapport aux points limites définis, par application d'une grille de critères. Exemples: Désinfection de plaies, administration d'antalgique, injection de solution saline glucosée pour l'hydratation, manipulation de l'animal, séparation de congénaire agressif ou euthanasie.
Choix des espèces
Nous utilisons une des rares lignées de souris génétiquement modifiées actuellement disponibles pour l'étude de notre mutation in vivo. Nous travaillerons sur des souris ayant une réduction de 50% de la production de notre protéine d'intérêt (espèce très largement utilisée pour les études comportementales) obtenues à partir de croisements de souris mutantes avec des souris sauvages. Les protocoles utilisés ont été choisis par rapport à la littérature basée sur la même espèce. Les animaux seront utilisés à 2 stades de développement : Jeunes et Adultes. Les Troubles du Spectre Autistiques apparaissant chez l'enfant autour de 3 ans et se maintenant à l'âge adulte, ces deux phases sont à étudier pour comprendre les circuits neuronaux impliqués dans l'apparition des comportements autistiques, leur développement ainsi que les possibles adaptations neuronales (changements physiologiques ou pathologiques) se mettant en place au cours du temps.