Système nerveux

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie avec implantation d'une pompe de diffusion, puis huit jours d'isolement, et présente une perte de neurones et un déficit de mémoire évalué par un test de labyrinthe en Y. Le porteur utilise une lignée 5xFAD, qu'il décrit à la fois comme modèle d'Alzheimer et de la maladie de Lafora, pour tester une molécule enzymatique. Les souris sont expédiées vers une société privée qui les tue à réception, et le bénéfice annoncé se limite à une "meilleure compréhension" de la maladie.

Objectifs

La maladie de Lafora (ML) représente une forme fréquente et particulièrement grave d’épilepsie myoclonique progressive. Ses premières manifestations surviennent à l’adolescence : la personne perd soudainement conscience et tombe avant de présenter des contractions musculaires généralisées. Cette première phase est suivie d’une seconde période durant laquelle le patient présente des spasmes rapides des quatre membres suivie d’une décontraction généralisée des muscles. Après un délai variable d’inconscience, la personne se réveille. L’évolution est dominée par une détérioration cognitive majeure et rapide, dont les premiers symptômes peuvent précéder les troubles moteurs. Le décès survient généralement 4 à 10 ans après les premiers symptômes dans les formes typiques. L’utilisation d’un modèle rongeur, vertébré présentant des structures cérébrales comparables à l’Humain, permet l’étude de ces dernières et des circuits neuromusculaires associés afin de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour la maladie de Lafora. L’objectif de ce projet est de tester une molécule enzymatique thérapeutique (VAL) sur ce modèle murin. Pour le modèle murin utilisé (souris 5xFAD : MMRRC Strain #034840-JAX) : Ces souris transgéniques 5xFAD surexpriment la protéine mutante humaine précurseur bêta-amyloïde (A4) 695 (APP) avec les mutations suédoises (K670N, M671L), de Floride (I716V) et de Londres (V717I) de la maladie d'Alzheimer familiale (FAD) avec la préséniline humaine 1 (PS1) hébergeant deux mutations FAD, M146L et L286V. Les deux transgènes sont régulés par le promoteur Thy1 de la souris pour entraîner une surexpression dans le cerveau. Les souris 5XFAD récapitulent les principales caractéristiques de la pathologie amyloïde de la maladie d'Alzheimer et peuvent constituer un modèle utile de neurodégénérescence intraneuronale induite par Abeta-42 et de formation de plaque amyloïde. De plus ces animaux présentent des formes d’épilepsie similaires à la maladie de Lafora, ce pourquoi nous les utilisons.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension de la maladie de Lafora.

Procédures

Tous les animaux subiront une opération chirurgicale sous anesthésie de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Pour l’étude de la maladie de Lafora, le modèle murin utilisé est le modèle 5xFAD. Ces souris lorsque reproduites en hémizygotes (un organisme est dit hémizygote pour un gène particulier si ce dernier n'est présent qu'à une seule copie) sont viables et fertiles et présentent des déficits cognitifs et de mémoire ainsi que des épisodes d’épilepsie. Ces animaux subissent une chirurgie avec implantation d’une pompe de diffusion et sont isolés pendant 8 jours à la suite de cette chirurgie. Ces animaux présentent une perte de neurones et une déficience de la mémoire dans le test du Y-maze (test du labyrinthe en Y). Les souris transgéniques 5xFAD possèdent les principales caractéristiques de la pathologie amyloïde de la maladie d'Alzheimer et peuvent être des modèles utiles de la neurodégénérescence intraneuronale induite par l'Abeta-42 et de la formation de plaques amyloïdes. Pour limiter la souffrance, un analgésique [Meloxicam (Metacam™), 0.03 ml, 5mg/kg] est administré par voie intrapéritonéale avant la chirurgie et pendant les 3 jours (si nécessaire) suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisés sous anesthésie gazeuse. Concernant le stress et l’anxiété, les animaux voient et sentent leurs congénères même s’ils sont isolés. La cage est enrichie avec un nid végétal. Les animaux sont manipulés avant et après la chirurgie pour minimiser le stress et l’anxiété.

Devenir

A la suite des opérations de chirurgie, les animaux seront envoyés à la société Neuroservices Alliance localisé à Aix en Provence. Les animaux seront envoyés à cette société avant l’apparition du phénotype dommageable. Cette société s’occupera de l’euthanasie des animaux dès leur réception ainsi que des prélèvements.

Remplacement

Ce protocole nécessite l’utilisation d’animaux. En effet, l’identification des structures cérébrales et des circuits neuromusculaires impliqués dans la maladie de Lafora nécessite l’utilisation d’un cerveau intact chez l’animal vigile. Des méthodes in vitro telles que la culture cellulaire ou bien les coupes de cerveau ne contiennent pas les connections neurones qui sont le sujet de nos travaux. Il n’existe donc pas de méthodes alternatives.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé par l’estimation de la variance observée avec ce type de données permettant d’atteindre une signification statistique. Ce nombre est de 15 souris par groupe mais par expérience 10 animaux par groupe sont suffisant et seront utilisés, soit un total de 60 animaux pour la réalisation de ce protocole.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la souffrance des animaux, nous appliquons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisés sous anesthésie gazeuse. L’évaluation du poids de l’animal est effectuée de façon journalière à partir du moment où il est isolé en cage individuelle et rentre dans la phase expérimentale. Ces mesures ont lieu lors de la manipulation journalière des animaux en même temps que la vérification de l’état général de l’animal. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans diverses maladies myocérébrales. De plus, nous utilisons ici un modèle transgénique présentant un fort intérêt scientifique. Les animaux seront utilisés entre 4 et 9 mois post natal fin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.

672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à une restriction alimentaire chronique à la moitié de leur ration pendant deux à six semaines, parfois avec une roue d'activité, ainsi qu'à des prélèvements de sang et des injections répétées, pour modéliser l'anorexie mentale. Le porteur présente la perte de poids comme le principal effet indésirable et indique la corriger en 24 heures si elle dépasse le seuil prévu. Il affirme qu'une approche intégrée chez l'animal est "indispensable" et ne peut être remplacée par des méthodes in vitro ou in silico.

Objectifs

L’anorexie mentale (AM) est un trouble des conduites alimentaires qui se caractérise par une restriction alimentaire et une activité physique compulsives aboutissant à une dénutrition chronique et des complications somatiques et psychiatriques sévères. Parmi les troubles psychiatriques, l’AM a le taux de mortalité le plus élevé et un taux de rechute important. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’AM et son évolution est donc essentielle et représente un enjeu de santé publique. L’objectif de ce projet, mené chez des souris, est de montrer l’impact d’une restriction alimentaire chronique associée ou non à de l’activité physique volontaire sur l’évolution de biomarqueurs du métabolisme. En clinique, les patients qui souffrent d’AM de type restrictif présentent de manière surprenante une adaptation efficace de la glycémie qui reste relativement stable sur la durée. Nous nous intéressons à une hormone produite en réponse à l'état de dénutrition et dont les concentrations plasmatiques sont élevées chez les patientes souffrant d'AM. Nous nous intéressons notamment à deux isoformes de cette hormone et leur implication dans la modulation de la prise alimentaire, la glycémie et de la motivation à l’activité physique. Nous évaluerons donc comment un modèle murin conçu pour s'approcher au mieux du contexte de survenue et de chronicisation des symptômes de l'AM peut permettre la mise en évidence de biomarqueurs pertinents qui seront utilisés en clinique comme potentiels facteurs de diagnostic et surtout de pronostic de l’évolution de la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet, en parallèle des études menées en clinique, nous permettra de préciser les adaptations métaboliques observées en situation de restriction alimentaire et/ou de renutrition et de valider des biomarqueurs prédictifs de l’évolution de la maladie.

Procédures

Restriction alimentaire chronique (50% de la quantité délivrée en ad libitum) entre deux et six semaines. Prélévements sur animaux vigiles : prélévements d'une goutte de sang à la queue pour vérifier l'état glycémique de l'animal au cours de la restriction alimentaire, tous les 2-3 jours. Injection unique en intrapéritonéal : glucose, glycérol, pyruvate, glutamine, insuline (évaluation de la régulation glucidique). Injection en sous-cutané (sub-scapulaire) en aigu (injection unique) : isoformes de la ghréline (implication dans la régulation de la prise alimentaire et de la glycémie)

Impact sur les animaux

Nous utilisons ce modèle de restriction alimentaire depuis plusieurs années. La perte de poids induite par la restriction alimentaire est le principal effet indésirable. Toutefois, le protocole permet une perte de poids progressive et contrôlée, et l'état général des animaux est surveillé de manière quotidienne. Aussi, une perte de poids plus importante que celle habituellement observée sera régularisée dans les 24h en ajoutant une quantité de nourriture plus importante, permettant une reprise rapide de poids. Afin d'obtenir l'activité physique individuelle, certaines souris seront temporairement maintenues en cage individuelle équipée d'une roue d'activité, et ce pendant 4 jours.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à chaque fin de procédure.

Remplacement

Ce projet ayant pour objectif d’étudier des altérations cérébrales et comportementales (émotions, cognition et physiologie glucidique) complexes mimant la pathologie humaine, une approche intégrée chez l’animal est indispensable qui ne peut absolument pas être substituée par des approches in vitro ou in silico

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés (réduction) lors des explorations in vivo, nous répéterons différentes procédures sur le même animal lorsque cela se justifie sur le plan expérimental. Les animaux seront ensuite mis à mort pour les analyses biochimiques et/ou moléculaires.

Raffinement

Pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, l’état général des animaux seront suivis quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie (apparence physique, changement de comportement). Tout état anormal, évalué à l’aide de points limites bien définis, sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en œuvre en cas de points limites atteints (utilisation d’un analgésique, arrêt du protocole ou mise à mort). Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.

Choix des espèces

Le modèle murin est ici un modèle de choix pour l'exploration du comportement alimentaire dans des conditions particulières de restriction chronique, des processus addictifs et du métabolisme énergétique. Les régulations métaboliques, hormonales et neurobiologiques mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant de très nombreuses similitudes avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet une investigation anatomique et fonctionnelle plus élaborée que ce que peuvent nous procurer les approches par imagerie chez l’humain. De plus, ces modèles bien décrits par les expériences ultérieures menées dans notre laboratoire permettent de réaliser des études phénotypiques comparatives pour caractériser les voies moléculaires ou mimer certains aspects de pathologies humaines. Les troubles alimentaires et en particulier l’AM font partie des pathologies neuropsychiatriques qui touchent principalement des sujets jeunes adultes et des adolescents. Dans notre projet, la majorité des procédures sera réalisée chez de jeunes souris adolescentes, sexuellement matures, à partir de l’âge de 5-7 semaines. Comme l’AM est une maladie chronique, les paradigmes expérimentaux que nous avons choisis nécessitent un suivi longitudinal de plusieurs semaines, ainsi certaines souris pourront être utilisées jusqu’à l’âge de 15-20 semaines.

400 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, environ trois quarts conservés comme reproducteurs et le reste tué faute de porter la mutation recherchée. Le porteur crée six lignées transgéniques et mutantes pour étudier la formation du système olfactif à partir des embryons, prélevés avant cinq jours de développement. Il indique que les formes homozygotes peuvent provoquer stérilité, stress et agressivité, et prévoit de ne maintenir que des adultes hétérozygotes pour éviter ces atteintes. Sur le remplacement, il décrit des modèles mathématiques en développement mais conclut qu'une approche in vivo sur un vertébré reste "nécessaire".

Objectifs

Notre projet vise à caractériser les mécanismes génétiques et morphométriques gouvernant la mise en place du système olfactif en utilisant le poisson zèbre Danio Rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours du développement de cette structure, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent sur la mise en place précoce du système olfactif dont les évènements interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 6 Lignées pour ce projet : A. 2 lignées transgéniques : Tg(fa2h::eGFP) et Tg(8.4neurog1::nls-EOS) pour visualiser les étapes précoces de la formation de notre structure d'intérêt et B. 4 lignées mutantes : pitx3 , f11r.1, fa2h et oclna pour analyser le rôle de ces gènes candidats dans la mise en place précoce du système olfactif.

Bénéfices attendus

Le projet nous permettra d’établir des lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons pour mieux comprendre la mise en place de l’organe sensoriel olfactif. Ces outils seront alors largement accessibles à la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle des molécules d’adhésion jonctionnelle, des enzymes et pour établir un modèle poisson zèbre de développement des neurones dopaminergiques (maladie de Parkinson et développement du cristallin).

Procédures

Les animaux générés par ce projet seront utilisés à des fins reproductives, seuls leurs embryons dans les phases de développement autonomes (avant 5 jours de développement) seront utilisés pour les expérimentations.

Impact sur les animaux

Nous ne prévoyons pas d'effets indésirables pour les lignées transgéniques et mutantes à l'état hétérozygote. Cependant, nous pouvons anticiper que pour les lignées mutantes le développement des placodes craniales antérieures (cristallin, adénohypophyse et olfaction) soit perturbé. Les données bibliographiques de mutants qui perturbent le développement de l'adénohypophyse, du cristallin et de l'olfaction peuvent indiquer des effets indésirables chez les adultes homozygotes : risques de stérilité, de stress et d’agressivité. Il est important de noter que chez le poisson zèbre, ces pathologies se développent lorsque la mutation est présente à l'état homozygote et que nous maintiendrons les lignées avec des adultes hétérozygotes dans ce projet.

Devenir

Idéalement, nous aimerions conserver la totalité des animaux mais tous les adultes ne seront pas porteurs de la mutation et nous choisirons les allèles mutants les plus facilement identifiables et les lignées transgéniques les plus robustes pour ne conserver en moyenne les 3/4 des animaux reproducteurs. Les autres qui ne portent pas l'évébement génétique requis seront mis à mort.

Remplacement

Nous développons actuellement des modèles théoriques mathématiques pour simuler numériquement les expérimentations et ne tester biologiquement que les expériences ayant un intérêt pré-validé.

Réduction

L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse grâce au développement de protocoles utilisant le système CRIPR/Cas9, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées.

Raffinement

Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement dans notre projet des méthodes d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour comprendte la formation de l'organe sensoriel olfactif à l'aide de lignées transgéniques fluorescentes qui marquent le territoire olfactif et les différentes populations cellulaires qui le composent.

Choix des espèces

Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes génétiques et morphomètriques régissant la mise en place du système olfactif. La perturbation de ces processus peut conduire chez l’homme à de nombreuses pathologies allant de la stérilité à l’anosmie. L’utilisation d’une approche in vivo sur un animal vertébré, comme le poisson zèbre est donc nécessaire à la compréhension de ces processus dynamiques et complexes. Dans ce projet, nous générerons des poissons zèbres transgéniques ou mutants qui seront utilisés adultes à des fins reproductives.

1 490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Selon les lots, elles subissent une à trois chirurgies, chirurgie stéréotaxique, injection virale et vagotomie, puis portent des fibres optiques ou un cathéter gastrique pour des tests de comportement et de métabolisme. Le porteur indique des douleurs et infections postopératoires possibles et un stress lié aux dispositifs, et précise que tous les animaux sont mis à mort pour prélever des tissus. Il affirme que les expériences ne peuvent se faire in vitro car il a "besoin" d'observer une physiologie intégrée, et que les invertébrés n'ont pas les structures équivalentes aux mammifères.

Objectifs

La régulation de la prise alimentaire repose sur la balance entre besoins énergétiques et la valeur renforçatrice de la nourriture. Cette régulation résulte de l'intégration dynamique de plusieurs signaux qui façonnent collectivement les stratégies adaptatives pour le maintien de l'apport calorique et du poids corporel. Cependant, notre environnement alimentaire moderne fait évoluer les ajustements physiologiques vers des dysfonctionnements de la récompense et du métabolisme qui peuvent conduire au syndrome métabolique (obésité). Les composantes de la prise alimentaire (énergie et récompense) ont été souvent décrites et étudiées en termes de régulation par le cerveau. Cependant, dans les dernières années l’axe vagal (intestin-cerveau) a émergé comme un régulateur clé de la prise alimentaire en modulant à la fois le métabolisme énergétique et les processus de récompense. Le nerf vague représente un relai neuronal capable d’assurer le transfer de l’information intéroceptive entre les organes périphériques et le cerveau. Malgré ce rôle critique, les mécanismes sous-jacents à cette régulation en conditions physiologiques et/ou pathologiques (obésité) restent largement inconnus. Ce projet de recherche vise donc à étudier le rôle de l’axe vagal dans les processus de récompense et de métabolisme énergétique. Le projet est construit autour de 4 objectifs principaux. 1. Étudier la plasticité structurale et neuronale des neurones du système de la récompense suite à vagotomie. 2. Établir le rôle des afférences vagales intestin-cerveau dans les réponses adaptatives du circuit de récompense dans l'obésité : de l'alimentation à la détection des nutriments. 3. Interroger l'axe vagal intestin-cerveau pour restaurer les fonctions hédoniques et métaboliques 4. Explorer la signature moléculaire des neurones vagaux pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour l'obésité

Bénéfices attendus

Les dernières estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela représente également un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés et largement étudiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes d'inadaptations physiopathologiques en aval. Malgré les progrès et les efforts récents, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. En fait, à ce jour, les approches thérapeutiques les plus durables de l'obésité et des dysfonctionnements qui lui sont liés sont représentées par les chirurgies bariatriques, très efficaces mais extrêmement invasives et dangereuses, dont les mécanismes d'action restent largement inexplorés. Le développement récent de technologies de pointe et l'émergence de concepts révolutionnaires dans le domaine de la physiologie intégrative, comme le propose le projet, vont certainement élargir notre quête de connaissances et de solutions thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis : -pour 5 lots à une chirurgie d'injection virale (environ 1h), puis après une période de repos de 3 semaines minimum, à des tests de comportements, de métabolisme du glucose et/ou de mesure de calorimétrie indirecte. Des prélèvements sanguin sur animaux vigiles (175ul, 35ul et 35ul sur 3j à interval d'une semaine) seront fait sur deux de ces lots. -pour 4 lots à deux chirurgies (stéréotaxie 30min et injection virale en périphérie 40min, ou stéréotaxie 30min et après 15j de repos une vagotomie 40min), puis après une nouvelle période de repos de 15j, à des tests de comportements. -pour 1 lot à trois chirurgies qui se feront en deux fois pour le bien être de la souris (stéréotaxie 30min et injection virale en périphérie 40min, puis après 15j de repos une vagotomie 40min). Puis après une période de repos de 15 jours à nouveau, il seront soumis à des tests de comportements.

Impact sur les animaux

Pour l'ensemble des procédures il peut y avoir des douleurs ou infections post opératoires qui seront traitées par analgésie et antibiothérapie si nécessaire. Pour les procédures 1-2-3, le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres étant légères, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrement. De même pour les animaux portant un cathéter gastrique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et la régulation de la récompense alimentaire.

Réduction

Oui selon le dessin expérimentale et les nombres de variables (groupes; temps; régimes; comportements) nous utiliserons les tests suivant: Student T Test ; One-Way Anova (Bonferroni post-hoc multiple comparaison) ; Two-Way Anova (Bonferroni post-hoc multiple comparaison) ; régression linéaire. Par rapport aux nombres d'échantillons nous utiliserons principalement des tests paramétriques et si nécessaire des tests non-paramétriques.

Raffinement

Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, batons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale qui sont peu développées ou absentes dans d’autres modèles. Toutes les souris seront utilisées à l’age adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux sont bien en place.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur produit des souriceaux porteurs d'une mutation du gène Nemo reproduisant la maladie Incontinentia pigmenti, puis les euthanasie sept jours après la naissance pour prélever leur cerveau. Il indique que les animaux développent une inflammation cutanée pouvant être sévère et que les plus atteints sont euthanasiés avant la date prévue. Sur les 120 animaux produits, il précise que 60 sont des mâles de type sauvage et qu'environ 20 femelles présenteront les lésions cérébrales étudiées, et affirme qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer l'animal pour cette pathologie.

Objectifs

Incontinentia pigmenti (IP) est une sévère génodermatose liée au chromosome X qui est létale chez le garçon très tôt durant le développement. Chez la fille, la caractéristique majeure de la maladie est une dermatose qui débute habituellement peu de temps après la naissance et évolue selon une séquence d’événements spécifique. En plus de cette dermatose, les patientes IP peuvent aussi présenter des anomalies ophtalmologues, odotonlogiques et cérébrales. Le gène responsable d’IP (NEMO) code pour un régulateur essentiel de la voie de signalisation NF-kB et est localisé sur Xq28. Chez 70-80% des patientes une délétion identique du gène a lieu. L’invalidation conditionnelle de Nemo chez la souris permet d’éliminer NEMO dans tout l’organisme ou dans des tissus spécifiques. Le phénotype des souris invalidées dans tout l’organisme est très similaire à celui des patientes IP. Alors que les souris mâles meurent très tôt durant l’embryogénèse les souris femelles (Nemo+/Nemo-) se développent normalement mais présentent juste après la naissance des lésions cutanées similaires à celles qui sont observées chez les patientes IP. Les souris invalidées pour Nemo représentent donc un modèle fidèle pour étudier la dermatose liée à IP. En contraste avec ce qui a été élucidé au niveau cutané, grâce au système murin décrit ci-dessus, peu de choses sont connues concernant la base des anomalies cérébrales touchant environ 30% de patientes IP. Chez les humains, divers défauts ont été détectés parmi lesquels de l’atrophie/hypoplasie cérébelleuse, des défauts de la matière blanche périventriculaire et subcorticale avec infarctus, de l’ischémie, une hypoplasie du corps calleux et un élargissement ventriculaire qui est la cause de l’épilepsie, du retard mental, de l’hémiparésie, de la spasticité musculaire, de la microcéphalie et de l’ataxie cérébelleuse). Les causes primaires de ces défauts (développementales, vasculaires, etc…?) restent obscures, ne permettant pas un traitement rationnel des patientes. Pour tenter de comprendre les mécanismes entrainant les anomalies cérébrales des animaux atteints de dermatose liée à l’IP nous proposons d’analyser en détail le cerveau de souriceaux femelles (Nemo+/Nemo-), agés de moins de 8 jours, et de détecter s’il existe des défauts et analyser leur origine.

Bénéfices attendus

Acquérir une meilleure connaissance des défauts cérébraux des patientes IP

Procédures

Les animaux sont euthanasiés 7 jours après leur naissance et leur cerveau prélevé et analysé.

Impact sur les animaux

Les animaux développent peu après la naissance une inflammation cutanée qui peut être sévère. Dans ce cas les animaux sont euthanasiés avant la date prévue.

Devenir

Euthanasie pour récupération du cerveau

Remplacement

Modèle murin mimant une pathologie humaine, ce qui permet 1) de comprendre la pathologie et 2) de tester des traitements potentiels. Seul système génétique envisageable correspondant à ce qui a lieu chez l’humain : KO murin correspondant au KO observé chez 70 % des patientes + Transmission du défaut liée à l’X et état mosaïque comme chez l’humain. Aucune méthode alternative ne peut remplacer l’animal dans le cas de cette pathologie

Réduction

Le nombre minimum d’animaux a été défini de façon à produire les données expérimentales requises pour comprendre les mécanismes entrainant les anomalies cérébrales. 120 animaux signifient qu’après avoir utilisé une stratégie de production optimale génétiquement, 60 sont des mâles de type sauvage et 60 des femelles pouvant être atteintes de dermatose IP. Nous avons ensuite considéré la situation humaine dans laquelle, approximativement 30 % des patientes développant une dermatose présentent des lésions cérébrales : ce qui correspond à environ 20 souris.

Raffinement

Après leur naissance, les animaux sont observés quotidiennement par les zootechniciens et les expérimentateurs pour contrôler l’apparition des signes cutanés : - retard de croissance - retard dans la lactation - inflammation cutanée . Un examen quotidien a lieu entre P4 et P7 permettant d’euthanasier si nécessaire des souriceaux trop atteints Elles sont surveillées après leur naissance pour détecter l’apparition des lésions cutanées, qui surviennent à peu près à P4 et sont euthanasiées au plus tard à P7 pour analyser leur cerveau.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle mimant la pathologie humaine incontinentia pigmenti. Les souriceaux seront utilisés au maximum 7 jours après leur naissance (P7). En effet, des femelles affectées par la dermatose peuvent mourir entre 8 et 10 jours après leur naissance si celle-ci est sévère.

1 496 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une injection intracérébroventriculaire d'agrégats de peptide bêta-amyloïde par chirurgie stéréotaxique, puis reçoivent un candidat-médicament chaque jour pendant dix-sept jours, avant un prélèvement terminal de sang et de cerveau. Le porteur mesure l'activité locomotrice pour évaluer les rythmes circadiens et indique que des effets indésirables comme une sédation peuvent apparaître. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun test in vitro ni modèle informatique ne rend compte du comportement d'un "organisme vivant entier" et conclut à l'impossibilité de remplacer l'animal.

Objectifs

Au cours du vieillissement normal, le sommeil se modifie et il peut être profondément altéré par certaines maladies neurodégénératives, tel que la maladie d’Alzheimer (MA). Les personnes souffrant de démences présentent à la fois des modifications de l’architecture de leur sommeil et des perturbations de leurs rythmes circadiens. Des études ont montré que le manque de sommeil peut augmenter de manière significative les taux de bêta-amyloïde dans certaines régions du cerveau. L’objectif de cette étude est 1) d'examiner si une injection intracérébroventriculaire (ICV) d'agrégats du peptide bêta-amyloïde Aβ (1-42) perturbe le rythme circadien chez le rat et 2) dans le cas où l'injection ICV d'agrégats Aβ (1-42) perturbe le rythme circadien, d’examiner l’effet d’une administration quotidienne de candidats médicaments sur ces perturbations préalablement observées.

Bénéfices attendus

Au cours du vieillissement normal, le sommeil se modifie et il peut être profondément altéré par certaines maladies neurodégénératives, tel que la maladie d’Alzheimer (MA). Les personnes souffrant de démences présentent à la fois des modifications de l’architecture de leur sommeil et des perturbations de leurs rythmes circadiens. 40 à 70 % des personnes ayant la MA éprouvent des problèmes de sommeil qui au fil du temps vont être amplifiés ; ce qui est épuisant pour la personne atteinte mais également pour son aidant. La prise en charge de ces troubles repose sur des traitements médicamenteux tels que des antipsychotiques ou des benzodiazépines. Mais ces médicaments ont souvent des effets indésirables inquiétants chez les personnes atteintes de la MA ; ils peuvent aggraver le déclin cognitif et accroître les risques de chute. Ainsi, ce modèle peut être utile pour le développement de cibles thérapeutiques pour traiter cette problématique.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux sont soumis à une intervention chirurgicale (injection d'Aβ (1-42) par stéréotaxie) qui dure dans sa totalité environ 45 minutes (de l'anesthésie jusqu'au réveil). Ensuite, au moment du test de comportement (test de l'activité locomotrice), les animaux reçoivent une injection par jour du candidat médicament; et ceci durant 17 jours maximum. A la fin de l’étude, juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang et de cerveau est réalisé sur l'ensemble des animaux. Cette procédure est réalisée sous anesthésie générale et elle dure en moyenne 20 minutes (dans sa totalité). Le prélèvement de cerveau est une demande fréquente dans les études de recherche préclinique. Cela permet de réaliser des mesures de paramètres biochimiques.

Impact sur les animaux

1) Chirurgie : injection ICV - Les rats sont anesthésiés avec de l’isoflurane et placés dans un appareil stéréotaxique. Puis, selon les groupes, une injection intracérébroventriculaire (ICV) d'agrégats du peptide bêta-amyloïde Aβ (1-42) ou de véhicule est réalisée. 2) Administration des candidats médicaments - Les administrations sont réalisées tous les jours et pendant toute la durée de l’enregistrement de l’activité locomotrice. Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple)

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent pas donc être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe aucun modèle permettant d’évaluer le cycle circadien dans la maladie d’Alzheimer.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Il correspond à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux reçoivent trente minutes, avant l’acte chirurgical, une administration en sous-cutanée d’’un analgésique (Opiacés ou AINS). Après la chirurgie, les animaux reçoivent 1 ml de solution de lactate Ringer en sous-cutanée. Une coupelle contenant du « Gel Diet Energy » (Safe) mélangé à de la nourriture mouillée est déposée sur le sol de la cage pour stimuler l’appétit et la mobilité gastro-intestinale de l’animal. 24h post-opératoire, les animaux reçoivent une administration en sous-cutanée ou voie orale (per os) d’analgésique (Opiacés ou AINS). Ils sont pesés et leur état général est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter tous signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rats correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. La lignée de rat utilisée est : Sprague-Dawley 9-10 semaines au moment de la chirurgie. Les molécules développées sont destinées à des patients adultes.