Système nerveux
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Développement et fonction du système olfactif chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès la naissance, du matériel génétique est injecté dans leur cerveau, puis une fenêtre d'observation est implantée sur le crâne et une narine est obstruée, pour étudier le développement du système olfactif sous microscope. Le porteur indique que l'électroporation sous anesthésie par le froid entraîne une faible mortalité et que l'occlusion nasale gêne la respiration et l'olfaction. Les souris sont tuées par perfusion d'un fixateur dans le cœur pour conserver le cerveau.
Objectifs
L'olfaction joue un rôle majeur dans le comportement des animaux et leur adaptation à environnement. A ce titre, le système olfactif représente un modèle très attractif pour étudier une question centrale en neurosciences : comment le cerveau traite les signaux issus de notre environnement sensoriel et comment ces signaux influencent le développement neuronal. Au cours des dix dernières années, le développement d'approches d'imagerie fonctionnelle in vivo chez le rongeur a permis de commencer à comprendre ces différents mécanismes. Néanmoins, le manque de marqueurs et d'outils a empêché l’étude du développement du système olfactif et la délimitation de rôles précis pour plusieurs des populations neuronales impliquées. Le but de ce projet est de mieux comprendre le développement et le fonctionnement du système olfactif. Nous étudierons dans un premier temps le rôle de l’environnement sensoriel olfactif dans le développement du système bulbe olfactif. Nous nous intéresserons ensuite à la représentation neuronale des odeurs et de leur concentration dans le bulbe olfactif.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le role d'activité sensoriel dans le développement cérébral en condition physiologique. Cela nous permettra également de mieux comprendre comment la concentration des odeurs est codées dans le cerveau.
Procédures
Pour la partie 1 (40 animaux), du matériel génétique est injecté le jour de la naissance dans le cerveau. Quatre semaines plus tard, les animaux sont anesthésiés et une fenêtre d'observation du cerveau est implantée sur le crâne. Une narine est également obstruée à ce moment. Les animaux sont ensuite observés toutes les semaines pendant 4 semaines sous un microscope en condition anesthésiée. Cette observation dure moins d'une heure. Pour la partie 2 (40 animaux), du matériel génétique est injecté le jour de la naissance dans le cerveau. Quatre semaines plus tard, les animaux sont anesthésiés et une fenêtre d'observation du cerveau est implantée sur le crâne. Une narine est également obstruée à ce moment. Les animaux sont ensuite observés toutes les semaines pendant 4 semaines sous un microscope en condition anesthésiée. Cette observation dure moins d'une heure. Au bout de 4 semaines d'observation la narine est débouchée. Les animaux sont alors observés à nouveau toutes les semaines pendant 4 semaines sous un microscope en condition anesthésiée. Pour la partie 3 (50 animaux), dans une période comprise entre 2 et 12 mois, les animaux sont anesthésiés et une fenêtre d'observation du cerveau est implantée sur le crâne. Après une semaine de récupération les animaux commencent à être enregistrés « tête-fixée » anesthésiés (injection combinée de xylazine (10 mg/kg) et de kétamine (100 mg/kg) par voie intrapéritonéale (0.1ml pour 10g) sous le microscope lors de session durant au maximum 1h et où ils sont exposés brièvement à des odeurs pendant 3s (x 6 concentrations, 40 secondes entre les concentrations) et jusqu’à 3 odeurs différentes (total 54 stimulations). Pour mesurer la stabilité des réponses aux odeurs dans le temps, les animaux sont placés à nouveau sous le microscope sous anesthésie 1 jour, 1 semaine et 1 mois plus tard.
Impact sur les animaux
L’électroporation in vivo sur de jeunes animaux postnataux est exécutée sous anesthésie par le froid qui peut malheureusement induire un très faible taux de mortalité. Consécutif à l’implantation d’une fenêtre crânienne la présence d’une barre de contention pourra potentiellement entrainer une gêne dans les mouvements des animaux. L’occlusion nasale unilatérale entrainera une gène au niveau respiratoire et une perturbation de l’olfaction.
Devenir
Les cerveaux des animaux sera conservés pour analyse complémentaire potentiel. La burprenorphine (0.05mg/kg, en SC) est injecté 30 minutes avant une anesthésie profonde à l’aide d’un mélange ketamine (150 mg/kg) et xylazine (15 mg/kg) par IP puis d’une perfusion de para-formaldéhyde par voie intracardiaque » »
Remplacement
L’étude du système olfactif, de par leur complexité d’organisation, de développement et de fonctionnement ne peut pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, seules des approches menées chez un modèle animal peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau dont pourra bénéficier à terme les études menées chez l’homme.
Réduction
Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. -la méthode d’électroporation et les vecteurs d’expression ont été optimisés pour limiter le nombre d’animaux. -Les étapes de validation fonctionnelle générant des résultats quantitatifs utiliseront des outils statistiques (p
Raffinement
-L’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé quotidiennement. -Enrichissement des cages avec des carrés de coton et des bâtons de bois. -Hébergement des animaux en groupes sociaux. -Chaque intervention chirurgicale ( chirugie cranienne, occlusion nasale) est réalisée sous anesthésie générale (ketamine 125 mg/kg + xylazine 12,5 mg/kg par IP) en présence d’analgésique : analgésie locale (Lidocaine) lors de l’injection d’ADN avant électroporation in vivo ou lors de l’occlusion nasale. Analgésie générale : Dès la fin de la chirurgie, les animaux reçoivent par injection sous-cutanée, du carprofène (10mg/kg). Cette injection est renouvelée pendant 3 jours. -Pour la perfusion intracardiaque, pour éviter toute souffrance, la buprénorphine (0.05mg/kg, en SC) est injectée 30 minutes avant la perfusion et les doses de Ketamine/Xylazine (150 mg/kg et 15 mg/kgrespectivement) utilisées pour anesthésier les animaux sont sub-létales (et la procédure n’est enclenchée qu’après s’être assuré que l’animal est sans réaction. -Etablissement des points limites les plus précoces possibles. En cas d'infection de la narine de la pommade antibiotique dermaflon est appliquée pendant plusieurs jours. -en cas d’observation de souffrance les animaux seront injectés avec la buprénorphine (0.05mg/kg, en SC) de façon journalière. Si la souffrance persiste malgré la buprénorphine ou après 3 jours de traitement à la buprénorphine alors l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
L’étude du système olfactif, de par leur complexité d’organisation, de développement et de fonctionnement ne peuvent pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, seules des approches menées chez un modèle animal comme la souris peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau dont pourra bénéficier à terme les études menées chez l’homme. C’est dans ce contexte que se situent nos travaux dont l’objectif est d'étudier le développement et la fonction du système olfactif. Notre projet utilisera des animaux à partir de la naissance et jusqu'à 12 mois. Il semble qu'il y ait une diminution des performances olfactives passé cet age.
Caractérisation des déterminants physiologiques de la circulation intra-parenchymateuse du liquide cérébro-spinal et influence des agents anesthésiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit jusqu'à quatre chirurgies sous anesthésie générale, avec pose d'une prothèse crânienne et d'une canule dans le cerveau, pour mesurer l'effet de différents anesthésiques sur la circulation du liquide cérébro-spinal. Le porteur indique un risque de douleur lié aux chirurgies et de stress lié aux examens sur animal vigile. Il précise que la lourdeur des interventions interdit toute réutilisation, réhabilitation ou adoption, tous les animaux étant euthanasiés pour une étude histologique du cerveau.
Objectifs
L'hypothèse de travail de ce projet est que les agents anesthésiques ont une influence sur le fonctionnement du glymphatique et que cet effet est dépendant de l'agent hypnotique utilisé et/ou de ces conséquences pharmacodynamiques. Dans ce projet, nous avons pour objectif de déterminer et de quantifier l'effet sur la circulation intra-cérébrale du liquide cérébro-spinal (LCS) de différents agents anesthésiques ayant tous un pouvoir hypnotique mais dont le mode d'action et les cibles cérébrales sont différentes.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus sont un effet non univoque de l'anesthésie générale sur la circulation intra-cérébrale du LCS dépendant de l'agent anesthésique utilisé et de ses conséquences physiologiques. Cet effet étant, selon nous, très dépendant de ces mêmes conséquences pharmacodynamiques. Les bénéfices attendus de ce projet sont: - sur le plan pré-clinique: une meilleure connaissance des mécanismes influençants la circulation intra-cérébrale du liquide cérébro-spinale. Cette approche fondamentale est essentielle au développement d'hypothèses physiopathologiques qui permettraient le développement d'éventuelles propositions de prévention ou de thérapeutiques. - sur le plan clinique: cette approche pharmacodynamique des agents anesthésiques est inedite et originale. In fine, nos conclusions pourraient jouer un rôle en pratiques cliniques avec la determination de protocoles d'anesthésies dont les agents anesthésiques choisis seraient les moins à risque d'aggraver le pronostic de patients dont le système dit glymphatique semble déjà compromis, comme dans l'hémorragie méningée ou la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Procédures chirurgicales: maximum 4 procédures par animal, toutes réalisées sous anesthésie générale, durée moyenne d'une procédure: 15min. Les procédures: mise en place d'une prothèse crânienne, mise en place d'une canule intra-cisternale, mise en place d'une voie veineuse périphérique, mise en place d'un catheter de pression artérielle invasive (groupe contrôle). Procédure vigile: imagerie vigile.
Impact sur les animaux
Les animaux sont exposés au risque de douleur en lien avec les procédures chirurgicales, au risque de stress lié aux manipulations et aux examens réalisés en vigile. Ce protocole considère ces risques et prévoit les prises en charge à réaliser en fonction des situations possibles.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à l'issu des procédures en raison d'une étude histologique cérébrale prévue. Tous les animaux de ce projet vont subir des procédures de classe sévère avec notamment la mise en place d'une prothèse crânienne et d'une canule intra-cisternale n'autorisant ni à les réutiliser ni à les replacer ni à les proposer à l'adoption.
Remplacement
Ce projet n'est à l'heure actuelle pas remplaçable par un autre modèle expériemental que l'animal. La complexité des mécanismes sous-tendant la physiologie cérébrale ne peuvent être reproduit par un modèle informatique ni par un modèle in vitro. Le caractère expérimental et invasif rend impossible ce projet sur volontaire humain. La souris est par ailleurs l’animal indiqué pour cette expérimentation. C’est chez cette espèce que l’existence du système glymphatique a été montrée et que son fonctionnement a été le plus étudié. La physiologie cérébrale est également parfaitement connue chez cette espèce et comparable à celle du cerveau humain dans ces grands principes. Enfin, la méthodologie expérimentale requise par ce projet est également parfaitement décrite dans la littérature pour le modèle murin.
Réduction
Ce projet nécessite 160 souris. Nous avons calculé ce nombre de sujet nécessaire qui permettrait l’obtention de résultats significatifs à partir de nos données locales, en y ajoutant des pertes estimées de 10% (échec de la procédure) et en tenant compte du principe de réduction du nombre d'animaux. Il s’agit donc du nombre maximum d’animaux prévus pour ce projet ; en l’absence d’échec le nombre minimum est de 148 animaux.
Raffinement
Ce protocole a été pensé et organisé afin d’optimiser l’expérimentation sans minimiser nos chances d’obtenir des résultats significatifs. Les principes éthiques et les standards de raffinement y sont respectés de la naissance à la mort de l’animal : le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel formé. Ils seront hébergés dans des locaux agréés où température (21°), hygrométrie (55%), luminosité (100 lux) et durée du cycle de lumière inversé (12h/12h) sont maitrisées. La réalisation des procédures sera réalisée durant la phase d'activité physiologique de l'animal. L'alimentation et l'eau seront fournies ad libidum. Le raffinement de nos procédure sera assuré par un souci constant du confort et de l’analgésie des animaux, notamment : l’hébergement de tous les animaux dans des cages standards aux normes européennes. L’habituation à la manipulation sera engagée précocement afin de réduire le stress lié au contact avec l’homme avant le début du protocole. Une analgésie efficace sera garantie avec le recours à un antalgique morphinique de durée d’action longue associé à un antalgique non morphinique, le paracétamol, et à des mesures non pharmacologiques telles qu’un environnement enrichi avec de la ouate en post-opératoire. L’hébergement post-opératoire sera réalisé en cage individuelle après la pose de la prothèse crânienne afin de prévenir tout risque d’arrachement du matériel en lien avec une bagarre entre animaux. Cet hébergement isolé sera enrichi et d’une durée la plus réduite possible avant la procédure (10 jours maximum) afin de prévenir le stress chez un animal isolé. L’accès à l’eau et à la nourriture sera adapté au besoin (croquette dans une coupelle humide). Les souris, préalablement habituées à la manipulation, seront habituées à la contention et au bruit de l’IRM durant 6 jours avec des durées croissantes (de 10 minutes à 60 minutes) afin de diminuer leur stress lié à l’expérimentation. Des bouchons d’oreilles seront placés afin de limiter le bruit de l’appareil. Ajouté à ces précautionsont été défini des points limites adaptés à chaque étape de notre protocole avec une escalade des prises en charge aboutissant à la mise à mort de l’animal en cas de détresse ou souffrance ne pouvant être soulagée dans des délais brefs.
Choix des espèces
La souris Swiss est le meilleur compromis entre remplacement et pertinence. Sans reprendre les agruments avancés plus haut, ses caractéristiques physiologiques et anatomiques parfaitement connues, son poids et sa taille classiquement supérieurs à ceux d'autre souche, la facilité d'un abord vasculaire et trachéal et son hétérogénéité génétique en fond un candidat de choix pour ce projet. Les expériences seront réalisées chez des animaux de 8 semaines, ce qui correspond à un stade jeune adulte, âge auquel le système glymphatique est considéré mature et pleinement efficient. Ils seront commandés à 6 semaines pour anticiper les étapes d'habituation à la manipulation et à la contention.
Caractérisation d’un modèle murin de paraplégie spastique héréditaire liée à SPG4 en vue d’une thérapie.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
224 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tuées à l'issue et une partie conservée pour la reproduction de la lignée. Elles reçoivent une injection intraveineuse d'un vecteur AAV censé rétablir la protéine spastine, avec des prélèvements de muscles et de sang sous anesthésie, pour caractériser un modèle de paraplégie spastique héréditaire. Le porteur indique que l'injection n'est pas censée nuire, mais qu'une bulle d'air pourrait provoquer une mort instantanée et que l'effet des vecteurs reste mal connu. Les animaux sont ensuite tués par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque pour les analyses.
Objectifs
Les paraplégies spastiques héréditaires (PSH) sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par une spasticité et une faiblesse des membres inférieurs. Ce groupe de maladies, a une prévalence dans le monde de 5 pour 100 000 personnes et est lié à des mutations sur plus de 90 gènes qui peuvent avoir de fonctions et localisations différentes au sein de la cellule. La majorité des cas (40%) de PSH à transmission autosomique dominante sont dû à des mutations d’un gène nommé SPG4 qui code pour la protéine spastine dont la fonction principale est de couper les microtubules. Le gène SPG4 grâce à deux codons d’initiation, code pour deux isoformes de la protéine : une forme longue et une forme courte avec différentes localisations subcellulaires. Les défauts d’expression de la spastine, dus à ses mutations, se traduisent par une axonopathie des motoneurones supérieurs au niveau de la moelle épinière qui cause la pathologie. Bien que le mécanisme moléculaire de la spastine soit bien documenté les véritables causes qui amènent à la pathologie ne sont pas connues. A ce jour, aucun traitement curatif n’est disponible. Le but de ce projet est de développer une approche de thérapie génique afin de rétablir l’expression d’une protéine spastine fonctionnelle qui permettrait de corriger les symptômes de la maladie.
Bénéfices attendus
A ce jour, aucun traitement n’existe pour les paraplégies spastiques héréditaires. Les objectifs ainsi que les bénéfices de ce projet sont multiples : tout d’abord éclaircir sur l’implications d’autres protéines partenaires de spastine dans l’évolution de la maladie. En absence d’un traitement efficace pour corriger les symptômes, le deuxième objectif est de développer une stratégie thérapeutique qui rétablirait une expression de la spastine fonctionnelle à l’aide d’un vecteur AAV. Le bénéfice pourrait se traduire par l’amélioration des signes pathologiques chez le modèle murin SPG4-KO ce qui apporterait une preuve de l’efficacité de cette approche pour traiter des patients et améliorer leurs conditions de vie.
Procédures
Dans la PE1: mise à mort par dislocation cervicale. Dans la PE2: une seule injection intraveineuse d’AAV via la veine caudale. Au cours de la PE2 des prélèvements ante-mortem des muscles et du sang seront effectués sous effet anesthésique de la souris. Mise à mort par dislocation cervicale pour les analyses biochimiques et moléculaires et perfusion intracardiaque à l'aide d'une pompe pour les analyses histochimiques.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux lors du projet sont liés à l’acte de l’injection nécessaire pour administrer la thérapie mais cette procédure n’est pas censée induire d’effets négatifs. Néanmoins, dans le cas où l’injection comporte l’introduction imprévue d’un bulle d’air comme effet indésirable, il pourrait y avoir une mort instantanée de l’animal. Un autre effet indésirable pourrait être causée par l’expression de la protéine spastine par le biais des deux vecteurs administrés dont nous n’avons pas des informations.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, les animaux seront gardés pour d’autres accouplements ou mis à mort si les accouplements ne sont plus nécessaires. A la fin de la procédure 2, tous les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque à l'aide d'une pompe afin d’effectuer les prélèvements des organes et faire les analyses post-mortem.
Remplacement
Il n’existe pas de moyen de remplacer l’utilisation d’animaux pour l’étude d’une stratégie thérapeutique dont l’administration ne peut faire que par voie systémique et qui peut avoir des conséquences sur son efficacité à traiter correctement les symptômes. Une étude sur des cultures primaires de neurones issus de souris SPG4-KO ou d’autres modèles cellulaires déficient en spastine, peuvent permettre uniquement une meilleure compréhension de la physiopathologie et la confirmation/identification de certains marqueurs moléculaires pour cette pathologie. Ces marqueurs ont été préalablement identifiés à la fois dans des modèles cellulaires d’origine humaine ou la protéine spastine a été réduite/supprimée par siRNA et ainsi que dans le cerveau et la moelle épinière des modèles murins.
Réduction
Les souris hétérozygotes (SPG4-HE) issues des croisements seront utilisées pour les croisements nécessaires au maintien de l’élevage. Les paraplégies spastiques héréditaires affectent indifféremment les hommes et les femmes : des souris des deux sexes seront donc utilisées. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés par groupe, le nombre de souris nécessaire a été estimé à 224 souris par une étude statistiques prédictive (test paramétrique unilatéral de comparaison des moyennes) suite à la compilation des données en littérature avec des expériences précliniques issues de notre équipe. Des tests in vitro ont été préalablement réalisés afin de tester plusieurs cassettes d’expression et de n’en sélectionner que 2 pour l’application in vivo. A notre connaissance, notre étude serait la première à tester la piste thérapeutique avec AAV pour les PSH-SPG4 et permettrait non seulement de valider la stratégie de thérapie génique mais aussi de vérifier l’absence d’effets secondaires inattendus. Nous avons aussi décider de réduire à deux temps d’analyses notre étude afin de regarder les effets à court terme (3 mois post injection) et à plus long terme (11 mois post injection).
Raffinement
Raffinement pour les animaux injectés avec des vecteurs viraux. Les procédures ne sont pas censées induire d’effets négatifs. Cependant, c’est la première fois qu’une injection de vecteurs pour remplacer l’expression de la protéine Spastine sera faite dans ce modèle. C’est pourquoi l’observation et le suivi de poids sera effectué deux fois par semaine pendant 15 jours post-injection puis une fois par semaine. Concernant les prélèvements de muscles et de sang dans la PE2 , les prélèvements seront anticipés par l’administration d’une anesthésie et la profondeur de l’anesthésie sera contrôlée avec le début de l’acte chirurgical (absence de réflexe palpébral, absence de réflexe de retrait ou pincement de la queue et présence d’une respiration affaiblit (fréquence respiratoire 55-65/min) et essentiellement abdominale). Pour l’infusion cardiaque, elle sera précédée d’une injection par voie sous-cutanée d’un mélange de deux anesthésiques à raison de 100µl/20g de poids: la kétamine (aux propriétés anesthésiques et analgésiques (100 mg/kg,Virbac, Carros)) et la xylazine (aux propriétés anesthésiques, sédatives, myorelaxantes et analgésiques (10 mg/kg, Rompun® 2%, Bayer)). La profondeur de l’anesthésie sera contrôlée avec le début de l’acte chirurgical (absence de réflexe palpébral, absence de réflexe de retrait ou pincement de la queue et présence d’une respiration affaiblit (fréquence respiratoire 55-65/min) et essentiellement abdominale). Nous estimons qu’il faut environ 2 minutes pour l’installation de l’animal sur le plan de travail. Puis le temps passé entre l’ouverture de la cage thoracique et le début de la perfusion est estimé à 1 minute suivi par une perfusion intracardiaque d’une solution au PBS puis du fixateur au PFA, qui sera réalisée dans les 5 minutes selon la taille de la souris. L’opérateur pourra suivre l’efficacité de la procédure via l’observation de l’animal : la correcte fixation de l’aldéhyde aux nerf et aux muscles sera évidente par un tremblement des extrémités. Pour l’ensemble de la PE2: avant toute anesthésie, un examen préopératoire sera effectué pour vérifier l’état de l’animal qui sera ensuite pesé afin de calculer la dose exacte d’anesthésiant/analgésique à injecter. De plus le stress des animaux en attente sera évité car ces procédures seront réalisées dans une pièce à part.
Choix des espèces
Le modèle murin SPG4-KO reproduit des phénotypes pathologiques spécifiques qui ont été aussi observés chez l’homme. Ce modèle ainsi que d’autres, selon les données en littérature disponibles à ce jour, reproduisent des signes tels que l’apparition des dilatations axonales au niveau de la moelle épinière, des défauts de comportement moteurs ainsi qu’une augmentation de nombre de cellules gliales dans le cortex. La correction de l’ensemble ou d’une partie des défauts pathologiques pourra être utile pour estimer l’avantage de ce type d’approche thérapeutique pour le traitement de paraplégies spastiques liées au gène SPG4. Dans la première procédure expérimentale nous allons mettre en accouplement des souris hétérozygotes pour SPG4 (SPG4-HE). Les souris seront mises en accouplement entre l’âge de 6 semaines et de 6 mois. Il n’y a pas de point limite à prendre en compte car les souris SPG4-HE ne présentent pas de phénotype dommageable. Dans la deuxième procédure expérimentale nous allons utiliser des souris SPG4-KO âgées de quatre semaines, avant l’apparition des premières manifestations pathologiques (4 mois) afin d’étudier l’expression de la protéine spastine, leur bio-distribution et le niveau d’expression de la protéine SPG4 dans les tissus d’intérêt mais aussi sélectionner la dose optimale des vecteurs afin d’avoir un niveau d’expression physiologique de la protéine d’intérêt. Le phénotype de ces animaux n’est pas dommageable mais les points limites seront surveillés dans le cadre des injections.
Radiothérapie X d’un modèle d’épilepsie focale chez la souris par irradiation fractionnée spatialement
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
396 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes pour être réutilisées dans d'autres enregistrements. Rendues épileptiques, elles sont irradiées par microfaisceaux de rayons X sous anesthésie, la tête fixée dans un cadre stéréotaxique, pour tester une alternative à la chirurgie du foyer épileptique. Le porteur indique qu'un animal perdant plus de 20 % de son poids ou présentant une akinésie est mis à mort, et qu'un surdosage d'irradiation entraîne aussi l'euthanasie. Les bénéfices annoncés pour les patients épileptiques restent renvoyés à une éventuelle application chez l'humain.
Objectifs
Le traitement pharmacologique des différents types d’épilepsie est complexe et doit répondre au mieux aux différents types de crises présentées par les patients. Il n’est efficace que chez 70 % des patients. L’épilepsie Mésio-Temporale (MesioTemporal Lobe Epilepsy ou MTLE) est la forme d’épilepsie focale la plus fréquente en clinique parmi celles qui ne répondent pas aux traitements pharmacologiques par les anti-épileptiques de référence. La MTLE est le plus souvent caractérisée sur le plan histologique par une sclérose de l’hippocampe (dispersion des cellules granulaires du gyrus denté et mort des neurones pyramidaux au niveau de la corne d’Ammon, CA1 et CA3). La résection chirurgicale du foyer épileptique ou zone épileptogène (ZE) est l’unique possibilité, à l’heure actuelle, de guérir les patients atteints de MTLE. Cette chirurgie nécessite une craniotomie pour enlever le foyer épileptique. C’est une méthode efficace dans 50 à 70 % des cas, mais qui comporte plusieurs risques (infection, effets secondaires, troubles cognitifs) et représente un coût hospitalier important (plus de 10 jours d’hospitalisation et suivi pendant plusieurs mois). L’irradiation par microfaisceaux de Rayons-X ou « Microbeam Radiation Therapy » (MRT) est de plus en plus étudiée chez l’animal dans le but d’une application à l’homme dans le cas de tumeurs cérébrales ou de maladies neurologiques dans lesquelles un circuit nerveux dysfonctionne (Serduc et al, 2010 ; Studer et al, 2015). Il s’agit d’une technique non invasive, focalisée et avec une très faible toxicité pour les tissus adjacents du fait de sa grande précision. Dans des pathologies comme la MTLE, cette méthode permettrait de s’affranchir d’une chirurgie invasive (Pouyatos et al, 2013). L’objectif de ce projet est donc de développer sur un modèle de MTLE chez la souris (Riban et al, 2002 ; Heinrich et al, 2011) un protocole de MRT qui permette de rendre moins invasive la prise en charge des patient atteints d’une épilepsie focale.
Bénéfices attendus
L’irradiation par microfaisceaux de Rayons-X ou « Microbeam Radiation Therapy » (MRT) est de plus en plus étudiée chez l’animal dans le but d’une application à l’homme dans le cas de tumeurs cérébrales ou de maladies neurologiques dans lesquelles un circuit nerveux dysfonctionne (Serduc et al, 2010 ; Studer et al, 2015). Il s’agit d’une technique non invasive, focalisée et avec une très faible toxicité pour les tissus adjacents du fait de sa grande précision. Dans des pathologies comme la MTLE, cette méthode permettrait de s’affranchir d’une chirurgie invasive (Pouyatos et al, 2013).
Procédures
- Pendant l’irradiation les souris seront anesthésiées et, après vérification de l’absence de réflexe du retrait de la patte, elles seront fixées dans un cadre stéréotaxique afin d’éviter tout mouvement de la tête et les précautions suivantes seront prises afin de limiter le stress et la douleur: - Anesthésie générale: Kétamine + Xylazine (voir ci-dessous) d’environ 40 min. - Anesthésie locale: baume à la lidocaïne 2% au niveau des oreilles.
Impact sur les animaux
Comme le développement d’une épilepsie et le traitement par MRT peuvent altérer la prise alimentaire, notre point limite se basera à la fois sur le poids de l’animal et sur son comportement général. Un animal sera immédiatement euthanasié si l’un des signes suivants est observé: perte de poids > 20% du poids mesuré le jour de l’irradiation, akinésie, rotation (voir Annexe 3). La radiothérapie peut être une source de souffrance si la dose délivrée est trop élevée. Les choix concernant les champs d’irradiation et les doses délivrées à la peau ont donc été effectuées en fonction des connaissances actuelles et de notre expertise. En cas d’erreur ou de problème technique au moment de l’irradiation d’un animal et notamment de surdosage, l’animal sera euthanasié immédiatement par surdosage de pentobarbital (150 mg/kg). Après radiothérapie, des effets secondaires invalidants (hyper ou hypo-locomotion, modification de la prise de nourriture, nécrose de la peau, ischémie cérébrale) peuvent apparaitre avec des délais différents selon les animaux
Devenir
L’ensemble des animaux seront gardés en vie à la suite de la manipulation. Ils seront rapatriés dans l’animalerie du GIN afin de réaliser les enregistrements de leurs crises, leur comportement et les contrôles histologiques. Ces procédures font l’objet d’une demande d’autorisation gérée par le comité d’éthique du GIN.
Remplacement
L’utilisation de l’animal dans son intégrité est nécessaire pour répondre à notre question. Il n’existe aucun modèle cellulaire qui permette de mettre en évidence un foyer épileptique dans le cerveau ni de le traiter par irradiation et l’utilisation d’irradiation fractionnée spatialement n’est pas encore possible chez l’homme. Le développement d’une stratégie thérapeutique telle qu’envisagée dans cette étude nécessite d’avoir recours à un modèle animal dans lequel le développement d’un foyer épileptogène a été clairement caractérisé et mis en évidence. Dans cette étude, la souris sera utilisée, malgré sa petite taille, en complément de l’étude effectuée chez le rat en parallèle. En effet, le modèle souris d’épilepsie mésiotemporale présente une plus grande stabilité, une évolution plus rapide de la pathologie, une fréquence de crises plus importante et une plus grande similitude des symptômes avec la clinique humaine. L’utilisation des modèles souris et rat sera ainsi très complémentaire et permettra d’obtenir des résultats plus fiables pour la préparation des essais cliniques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant une exploitation statistique rigoureuse des résultats. Pour cela, en fonction de l’expérience acquise en modélisation animale des épilepsies, nous estimons que 396 animaux au total seront utilisés pendant 5 ans dans les quatre séries d’expériences de ce projet.
Raffinement
Nous veillerons à suivre les animaux quotidiennement de façon à intervenir immédiatement dès qu’un signe évocateur de douleur serait observé. Pour réduire toute douleur, souffrance ou anxiété, ils seront anesthésiés et analgésiés de façon profonde durant toutes les interventions (chirurgie, IRM, irradiation) et les techniques d’imagerie que nous utiliserons dans nos procédures sont sans douleur pour l’animal et permettent de répéter les acquisitions chez le même animal. Les animaux seront maintenus avec de la nourriture et de la boisson à volonté, ainsi que des objets en carton et du coton. Il seront habitués à la manipulation par des expérimentateurs agrémentés. A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés par surdosage de pentobarbital.
Choix des espèces
Le modèle d’épilepsie KA-MTLE chez la souris et chez le rat sont actuellement les modèles de référence les plus proches des conditions observées chez l’homme, aussi bien sur le plan électrophysiologique, histologique que pharmacologique. Malgré sa taille réduite nous souhaitons utiliser l’espèce souris, en complément de l’étude sur le rat, en raison de sa plus grande prédictivité et sa plus grande stabilité dans le temps que le modèle rat. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet. Ils auront 8 semaines en début d’expérience et 12 à 15 semaines lorsqu’ils seront irradiés à l’ESRF. Le modèle de souris KA-MTLE a été développé chez des animaux de cet âge afin de travailler sur un cerveau mature qui restera stable tout au long de la procédure.
Prolifération cellulaire saisonnière hypothalamique chez le hamster syrien : Influence de la mélatonine et des hormones thyroïdiennes (TSH et T3)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
240 hamsters syriens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des injections répétées de mélatonine, une autre subit une chirurgie d'implantation d'un système d'infusion continue d'hormones thyroïdiennes dans le cerveau, pour étudier la prolifération cellulaire saisonnière de l'hypothalamus. Le porteur indique que la chirurgie est douloureuse, que le passage en jours courts provoque une perte de poids d'environ 15 % et que l'isolement en cage individuelle peut générer du stress. Tous les animaux sont ensuite tués pour prélever le cerveau, le sang et les testicules.
Objectifs
L’hypothalamus est une partie du cerveau qui contrôle les fonctions métaboliques et reproductives. Chez les mammifères, il a été montré que les changements saisonniers des hormones thyroïdiennes et de la mélatonine régulent l’activité de l’hypothalamus pour ajuster les fonctions métaboliques et reproductives avec les saisons. Notre projet déterminera quel est le rôle des hormones saisonnières (mélatonine et hormones thyroïdiennes) dans la prolifération cellulaire saisonnière de l’hypothalamus du hamster syrien, un mammifère saisonnier. Des études chez le mouton ont montré que l'exposition à des jours courts d’hiver (avec un pic long de mélatonine), qui induit une activation de leur reproduction, est associée à une augmentation de la prolifération cellulaire dans l’hypothalamus. Nos données préliminaires chez le hamster syrien montrent que l'exposition à des jours courts (qui, à l’inverse du mouton, inhibent sa reproduction) induit également une prolifération cellulaire dans l’hypothalamus. Ces observations suggèrent que la prolifération saisonnière des cellules hypothalamiques se produit en réponse au signal saisonnier, indépendamment de la stratégie de reproduction de l'animal. Notre projet testera quelles hormones saisonnières (mélatonine et/ou hormones thyroïdiennes) induit la prolifération cellulaire hypothalamique en jours courts chez le hamster syrien mâle.
Bénéfices attendus
Ce projet nous aidera à mieux comprendre la nature du signal saisonnier endocrine (mélatonine et/ou hormones thyroïdiennes) qui contrôle la prolifération cellulaire saisonnière dans l'hypothalamus du cerveau adulte d’un mammifère. Les résultats obtenus nous permettront ensuite d’envisager de futures expériences pour 1) établir la nature des cellules hypothalamiques nouvellement formées suite au changement des saisons, 2) analyser le rôle physiologique de la prolifération cellulaire adulte saisonnière et 3) d’étudier l’effet de perturbateurs saisonniers (réchauffement climatique, pollution lumineuse nocturne) sur la prolifération cellulaire saisonnière. Ces travaux ont des implications cliniques potentielles car des études récentes montrent que la physiologie humaine présente aussi des variations saisonnières d’hormones liées au métabolisme, à la reproduction et à la croissance.
Procédures
Dans la première expérience où nous testons l’effet d’un allongement du pic nocturne de mélatonine en jours longs, chaque hamster recevra une injection de solvant ou de la mélatonine (durée de la préhension plus injection : 2 min) chaque jour pendant 2 ou 4 semaines. Un jour avant la fin de l’expérience, une injection intrapéritonéale d’une substance qui permet la visualisation des cellules nouvellement formées (durée de la préhension plus injection : 2 min) sera donnée sur chaque hamster vigile. Toutes les injections se feront sur animal vigile. Les hamsters seront stabulés à raison de de 3 individus par cage enrichie (tunnel, nid, bâton en bois). Dans la deuxième expérience où nous testons l’effet d’une augmentation des concentrations des hormones thyroïdiennes en jours courts, chaque hamster aura une chirurgie pour implanter un système permettant l’infusion continue de solvant ou d’hormones thyroïdiennes dans le cerveau (durée de la chirurgie sous anesthésie profonde : 30 min) pendant 2 ou 4 semaines. Un jour avant la fin de l’expérience, une injection intrapéritonéale d’une substance qui permet la visualisation des cellules nouvellement formées (durée de la préhension plus injection : 2 min) sera donnée sur chaque hamster vigile. Les hamsters seront stabulés en cages individuelles enrichies (tunnel, nid, bâton de bois) car la situation de jours courts les rend naturellement agressifs et les animaux pourraient s’attaquer les uns aux autres, notamment au niveau des plaies des implantations. A la fin de l'étude, tous les animaux seront mis à mort après anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Le hamster syrien peut être stressé par les manipulations/préhensions qu’il devra subir régulièrement. Les injections intrapéritonéales peuvent engendrer une douleur locale mais de courte durée. L’intervention chirurgicale est jugée douloureuse per se (douleur modérée) et peut également entrainer des inflammations. Le transfert en jours courts entraine naturellement une perte de poids d’environ 15%, mais il est possible que la perte de poids soit supérieure. Les hamsters opérés et leurs contrôles sont suite à l'impantation transférés en jours courts et sont placés en cage individuelle (car étant naturellement plus agressifs en jours courts, ils pourraient s’attaquer, notamment au niveau des plaies) ce qui peut conduire à un stress de l’isolement.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux pour prélèvements 1) du cerveau post-mortem dans le but d’analyser la prolifération cellulaire grâce à la visualisation par une technique de coloration de cellules nouvelles nées par immunohistochimie ; 2) du sang pour doser les hormones de la reproduction, 3) des testicules dont la masse indique le statut reproducteur de l’animal.
Remplacement
Le projet vise à étudier l’effet de plusieurs hormones de la saisonnalité sur les processus de prolifération cellulaire dans l’hypothalamus. Ce sont des fonctions intégrées typiques des mammifères qui par conséquent ne peuvent pas être étudiées chez des organismes non-mammifères, des lignées cellulaires ou des modèles biomathématiques, et qui nécessitent des organismes entiers. Dans ce contexte il n'est encore pas possible de proposer d’alternatives pour des études préliminaires dans des modèles hors-champs.
Réduction
Le nombre de animaux a été calculé sur des connaissances du modèle et une méthode mathématique en intégrant la variabilité inhérente au modèle et aux gestes réalisés. Ce nombre permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les tests statistiques utilisés pour comparer les groupes ont été choisis pour permettre d’évaluer l’effet de plusieurs hormones de la saisonnalité sur les processus de prolifération cellulaire dans l’hypothalamus.
Raffinement
Tous les hamsters seront dans des cages enrichies avec du matériel de nidation, un bâton à ronger, et tunnel de refuge. Avant et pendant les traitements, les hamsters, qui sont des animaux sociaux, seront placés en cage collective (3 individus par cage). Il y aura une exception pour les hamsters stabulés en jours et ayant eu une intervention chirurgicale qui seront isolés car il y a des risques qu’ils soient agressifs entre eux. Les hamsters soumis à des traitements seront traités avec des analgésiques et anesthésiques adaptés pour réduire leur souffrance induite par les procédures à un niveau minimum. Les animaux seront habitués à la manipulation avant le début des injections pour limiter le stress généré par celles-ci. Ils seront observés quotidiennement pour détecter tout signe de souffrance. Des points-imites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance durant la durée de l’étude.
Choix des espèces
Le hamster syrien est un modèle de rongeur dont la physiologie saisonnière est bien caractérisée. Des résultats récents chez le hamster syrien ont montré l’existence d’une prolifération cellulaire hypothalamique augmentée lors du transfert en jours courts type hiver. De plus les procédures expérimentales proposées chez cette espèce sont bien maitrisées, ce qui contribuera à en limiter les effets dommageables pour l’animal. Pour ce projet seuls les mâles seront utilisés car la bonne intégration de l’information photopériodique est facilement observable par la modification de la taille des testicules. Nous utiliserons des hamsters mâles post-pubères âgés entre 3 et 8 mois, car notre expérience nécessite que les hamsters aient un âge où la maturation sexuelle est optimale.
Réalisation de biopsies de papilles gustatives chez des chevaux sains – Etude préliminaire au diagnostic ante-mortem de la Maladie de l’Herbe
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
6 chevaux sains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés vivants comme animaux d'enseignement. Chaque cheval subit une biopsie de la langue réalisée à travers la joue sous sédation et anesthésie locale, ainsi que des examens cliniques et des administrations orales de médicaments sur trois jours. Le porteur reconnaît que des complications modérées à sévères comme une hémorragie ou une anorexie peuvent survenir. Il présente cette étude comme une étape préliminaire "indispensable" avant des prélèvements sur des chevaux malades, pour améliorer le diagnostic de la maladie de l'herbe.
Objectifs
Démontrer la tolérance et la faisabilité de la technique de biopsie de langue réalisée à travers la joue, chez des chevaux vivants sains. Ce travail est une étape préliminaire indispensable à la réalisation des prélèvements chez des chevaux symptomatiques, dans un contexte clinique.
Bénéfices attendus
Permettre de valider la faisabilité et la tolérance d'une technique de biopsie linguale sur des chevaux debouts, afin d'améliorer le diagnostic et la prise en charge des chevaux atteints de la maladie de l'herbe. Le diagnostic précoce et fiable de cette maladie présente un réél enjeu éthique et financier.
Procédures
3 interventions : 3 examens cliniques par jour pendant 3 jours, soit 9 examens cliniques, 10 minutes par examen ; 2 administrations per os de médicaments par jour pendant 3 jours, soit 6 per os, 1 minute par administration ; la réalisation de la biopsie linguale transbuccale (à travers la jour) sous anesthésie locale et sédation.
Impact sur les animaux
Des complications modérées à sévères pourraient éventuellement survenir, telles qu'une hémorragie ou une anorexie (perte totale d'appétit). Des complications plus modérées pourraient éventuellement survenir, telles qu'une dysorexie (difficultée à manger, perte d'appétit partielle) les premiers jours après l'intervention, une inflammation douloureuse ou une infection du site d'incision de la joue, des symptômes de fièvre et d'infection généralisée.
Devenir
A l'issue de la première procédure, les 3 chevaux seront replacés pour l'enseignement de l'anatomie. A l'issue de la 2e procédure, les 3 chevaux seront conservés au sein de l'EU, en tant que chevaux d'enseignement clinique.
Remplacement
Une étude préliminaire a été effectuée sur des cadavres afin de garantir la faisabilité de la technique. Notre projet cherche maintenant à démontrer la faisabilité de cette procédure sur des chevaux vivants debouts, avec les difficultées que cela représente : comportement d'acceptation de la procédure, déglutition, mastication et mouvements de langue. La procédure vise également à recenser les complications éventuelles qui pourraient survenir. Aucun modèle inerte ne peut être utilisé pour cette étape du projet.
Réduction
Aucun projet ne s'est intéressé à la réalisation de biopsie linguale chez des chevaux vivants. La faisabilité de la procédure par approche transbuccale a été au préalable évaluée sur des cadavres et la technique a été améliorée au fur et à mesure des essais. Les analyses histologiques effectuées ont démontré la bonne qualité des prélèvements. La procédure a été optimisée avant d'être employée sur des chevaux vivants, permettant de réduire leur nombre. Aucun test statistique n'a été utilisé pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Nous optimisons la technique pour améliorer le bien-être des animaux. Les chevaux seront logés au box sur une litière paillée, avec une nourriture standard (foin et granulés), avec des congénères en visuel et sortis 2 fois par jour. Un enrichissement du milieu à l'aide de jeux, de pierres à sel et de pipolino sera effectué selon les individus et leur niveau d’habituation, afin de ne pas générer une source de stress supplémentaire. Pour la réalisation des biopsies, les chevaux seront tranquillisés, après l’administration d’antalgiques et des anesthésies locales seront réalisées pour tous les actes pouvant être inconfortables. Enfin, les chevaux seront remis au box et re-nourris dès que les effets de la sédation auront disparu. La procédure sera réalisée si le cheval supporte une sédation adéquate, sans agitation avec un arrêt de la mobilité de la langue, afin de prélever la biopsie dans des conditions optimales. Si tel n’est pas le cas, la procédure sera arrêtée et le cheval sorti du protocole.
Choix des espèces
Espèce cible pour la pathologie concernée Chevaux adultes. La maladie de l'herbe se déclare le plus souvent chez de jeunes adultes entre 2 et 7 ans. Notre projet vise à tester la faisabilité des biopsies chez des chevaux de taille adulte.
Etude de la comorbidité entre la douleur chronique et la dépression : analyse anatomo-fonctionnelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1090 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie provoque une douleur neuropathique à la patte, une seconde implante une fibre optique dans le cerveau, et les animaux développent des troubles de type anxieux et dépressif, objets mêmes de l'étude. Le porteur indique que la douleur ne peut pas être soulagée puisqu'elle constitue le sujet de recherche, et que les souris subissent jusqu'à vingt-huit tests de douleur puis des tests comportementaux. Les cibles thérapeutiques évoquées pour l'humain restent renvoyées au conditionnel.
Objectifs
La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux responsable des sensations somatiques. Généralement chronique, avec une prévalence de 5 à 7% dans la population, elle s’accompagne d’un fort risque de développement de troubles de l’humeur (anxiété, dépression). En effet, environ 50% des patients présentent ces deux symptômes associés : douleur chronique et troubles de l’humeur. Ceci constitue un enjeu important de santé publique. Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents de ce lien entre ces 2 pathologies (douleur et troubles de l’humeur) restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Chez la souris mâle des données de la littérature suggèrent que plusieurs structures cérébrales clés seraient impliquées dans les conséquences affectives à long terme d’une douleur neuropathique. Les données clinique chez l’homme mais également préclinique chez l’animal montrent que non seulement la dépression majeure mais aussi les situations douloureuses s’accompagnent de changements dans des structures cérébrales bien précises. Mais de nombreuses données de la littérature montrent également d’importantes différences dans la sensibilité à la douleur entre les hommes et les femmes ; données également observées chez les rongeurs. De plus, la prévalence des troubles anxieux et dépressifs, dans la population ainsi que chez les patients douloureux chronique, présente également des différences intersexuelles. De telles différences suggèrent très probablement des mécanismes spécifiques à chaque sexe. Ainsi, bien que les régions cérébrales impliquées dans les troubles de l’humeur provoqués par la douleur chronique soient sans doute les mêmes, les altérations des réseaux que ces structures forment sont sans doute différentes chez des individus mâles et femelles. Le but de ce projet est donc de comparer les changements anatomo-physiologiques éventuels entre mâles et femelles.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d'étudier les modifications d’activité et d’interaction entre ces 5 régions pouvant être à l’origine du lien entre la douleur chronique et les troubles de l’humeur grâce à des techniques de mesure d’activité neuronale in vivo. A l’issue de ce projet, nous serons en mesure de détailler pour la première fois les adaptations d’activité cérébrale liées au développement des comportements de type anxieux et dépressif chez les deux sexes. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques (structures cérébrales d'intérets mais aussi systèmes de neurotranmissions) spécifiques au sexe et donc potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.
Procédures
Les animaux seront soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Ils subiront une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 5 min environ et une chirurgie stéréotaxique avec injection de virus puis implantation de fibre optique ou plateforme multimode d’une durée de 45 min environ, soit au total 2 chirurgies. Ces deux chirurgies se dérouleront sous anesthésie, soit 2 anesthésies générales. Les animaux subiront 3x le test de douleur avant la chirurgie neuropathique puis deux fois par semaine (délai de 4 jours minimum après la chirurgie avant la reprise des tests) jusqu’à la fin du protocole expérimental soit un total de 28 tests maximum. Ils subiront également 4 semaines après la chirurgie stéréotaxique, 1 test pour évaluer la douleur spontanée et 4 tests anxio-dépressifs (avec 24h minium entre chaque test).
Impact sur les animaux
Il y a présence de douleur qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie neuropathique (présente dans toutes les procédures de ce projet), une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les animaux vont développer des troubles anxio-dépressifs, objectifs de l'étude.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse anatomo-fonctionnelle du développement des troubles anxio-dépressifs dans un modèle de douleur neuropathique nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats fiables et robustes à l’issue de l’étude tout en tenant compte des variabilités entre individus, le nombre d’animaux utilisé a été déterminé statistiquement. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Pour cette raison une même cohorte d’animaux sera étudiée et caractérisée au niveau comportemental et émotionnel, puis fera l’objet d’investigations anatomiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des enrichissements sont placés dans la cage pour favoriser le bien-être animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Des points limites ont été établis pour l’ensemble des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le modèle de douleur neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. De plus, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles ce qui nous permettra de répondre de façon précise aux questions scientifique posées. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g). Afin d’éviter tout risque de variabilité liée au vieillissement, notre étude portera sur des animaux adultes de 8 semaines à leur arrivée au laboratoire. Le décours temporel de nos expériences fait que ces animaux seront testés jusqu’à leur ~18-19eme semaine à la fin des expériences.
Est-ce que les neurones en contact avec le liquide céphalo-rachidien au niveau thoracique appartiennent au système nerveux sympathique ?
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie pour l'implantation d'un capteur sous-cutané porté dix-sept jours, toutes courent ou marchent sur un tapis, puis sont endormies profondément pour des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien. Le porteur indique que l'étude vise à savoir si certains neurones de la moelle épinière thoracique participent à la régulation cardiovasculaire, un objectif de connaissance fondamentale sans application annoncée. Les animaux sont mis à mort pour collecter un maximum de tissus.
Objectifs
Cette demande d’autorisation de protocole s’inscrit dans un projet plus large qui vise à déterminer si les neurones présents autour du canal central dans la moelle thoracique et qui sont en contact avec le liquide céphalorachidien (cellules appelées LCR-cNs) font partie du système nerveux autonome sympathique (SNAS) en charge, entre autres, de la régulation cardiovasculaire. L’objectif de ce projet sera donc de regarder la pression artérielle de base et sa modulation lors d’un exercice moteur chez des souris dont les LCR-cNs seront spécifiquement invalidés pour le gène codant pour une protéine appelée PKD2L1 qui leur confère une sensibilité aux déformations mécaniques et aux variations de pH. En parallèle de ces expériences, nous regarderons l’effet d’un exercice physique sur la composition du plasma sanguin et du LCR chez la souris. Les molécules identifiées seront alors testées sur l’activité des LCR-cNs en tranches par des approches électrophysiologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de savoir si l'activité de certains neurones de la moelle épinière thoracique sont capables de moduler la commande nerveuse du système nerveux autonome et de participer à la régulation du tonus cardiovasculaire. Ces neurones constitueraient ainsi un système sensoriel intrinsèque à la moelle épinière qui pourrait informer directement les réseaux neuronaux des changements métaboliques de l’organisme sans obligatoirement passer par les structures présentes dans l’encéphale. Les informations recueillies fourniront de nouvelles données sur l’organisation de la moelle épinière et son implication dans la régulation des fonctions vitales.
Procédures
Certains animaux subiront une chirurgie peu invasive d’une heure environ pour suivre leurs paramètres cardio-vasculaires dans le temps et courront sur un tapis, 15 minutes pendant 4 jours d’affilé (n=28) Ces animaux porteront un capteur en sous-cutané pendant 17 jours. D'autres marcheront (n=24) ou courront (n=48) à 2 vitesses différentes (24 animaux par vitesse), pendant 15 minutes. Enfin les 24 marcheurs, 48 coureurs et 24 sédentaires seront profondément endormis avant des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirurgie peu invasive mais seront suivis avec une analgésie adaptée. Les animaux marcheront ou courreront pendant 15 minutes sur un tapis roulant après une phase d'entrainement où aucun système aversif ne sera utilisé
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures car nous travaillons à mieux comprendre des systèmes biologiques aujourd'hui mal connu et il est important de collecter un maximum d'information via les prélèvements de tissus.
Remplacement
Cette étude in-vivo fait suite à plusieurs années de recherche ex-vivo sur des moelles épinières extraites. Malgrès les nombreuses connaissances accumulées, il est impossible de mettre en évidence les interactions entre les populations de cellules de la moelle épinière étudiées ici et le reste de l'organisme sans réaliser des expérimentations in vivo.
Réduction
Afin de cibler très précisément des questions soulevées par le projet, des études préliminaires sur moelles extraites ont été faites et ont permis de grandement limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus le nombre d'animaux a été reduit au minimum afin d'avoir des résultats statistiquement viables à exploiter . Enfin pour réduire le nombre d'animaux utilisés, nous allons utiliser un système de mesure de la pression artérielle qui sera implanté (télémétrie ). Ainsi, chacun des animaux sera son propre contrôle (avant et après exercise physique). Le nombre d’animaux a été établi sur la base des minimums nécessaires pour effectuer des tests statistiques robustes et des données bibliographiques dont nous disposons.
Raffinement
La technique de télémétrie permet à l'animal d'être libre de ses mouvements dans la cage. Sauf en cas d'avis vétérinaire pour un soin, aucun animal ne sera isolé afin de préserver le caractère grégaire de la souris. Lors de la chirurgie d'implantation, des soins post-opératoires seront faits (anesthésie et analgésie), les conditions d'asepsies seront respectées (stérilisation du matériel) et le personnel dédié à la chirurgie sera parfaitement formé . Les animaux seront vus quotidiennement et seront évalués suivant une méthode d'évaluation validée avec des points limites gradés et précis. Toutes les cages seront enrichies avec du matériel de nidification et un tunnel en carton.
Choix des espèces
La souris est une espèce dont le génome est parfaitement connu et que l'on peut très facilement manipuler. Ainsi dans le cadre de notre étude, la lignée cellulaire à étudier a été ciblée en supprimant un gène cible. De plus, la souris est une espèce dont la gestation et la phase juvénile est courte, permettant ainsi d'avoir régulièrement des animaux au génotype voulu. Les animaux seront utilisés adultes (autour de 7 semaines). Nous devons attendre que les animaux fassent 22gr pour leur implantation en télémétrie (recommandation du fabriquant) mais nous ne voulons pas avoir des animaux trop âgés par soucis technique (implantation facilitée chez les individus jeunes).
Utilisation de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) pour la caracterisation des glioblastomes
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, puis des séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements sanguins hebdomadaires, avant l'euthanasie pour prélever le cerveau. Le porteur indique que l'imagerie n'ajoute pas de douleur mais qu'elle sera réalisée malgré l'observation préalable de signes de souffrance liés à la tumeur, les souris perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. L'objectif reste de valider l'IRM comme outil de suivi tumoral, les retombées pour les patients étant renvoyées à un stade ultérieur.
Objectifs
Le glioblastome multiforme (GBM) est le type de tumeur cérébrale le plus fréquent et le plus mortel. En principe, les médicaments peuvent atteindre les tumeurs via les vaisseaux, mais l’environnement cellulaire au sein duquel évoluent les cellules cancéreuses joue le rôle d'un antagoniste à toute délivrance efficace de médicaments. Les traitements récents associent la chimiothérapie à des médicaments, qui visent à renormaliser les vaisseaux de la tumeur en réduisant l'angiogenèse, c'est-à-dire la ramification de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux existants. Cependant, il n'existe pas encore de facon de distinguer les différents effets du traitement sur les cellules cancéreuses. Le but de ce projet est d’utiliser l'imagerie par résonance magnétique (IRM) afin d'évaluer chez la souris 1) la taille de la lésion tumorale suite à l’implantation de cellules tumorales dans le cerveau 2) les modifications des propriétés visqueuses et élastiques du cerveau qui permettent d'évaluer l'intégrité des tissus et l'organisation vasculaire, 3) la circulation du sang dans les vaisseaux et leur organisation.
Bénéfices attendus
Disposer d’un marqueur biologique identifiable par imagerie robustes et non-invasifs pour évaluer les composants individuels de la t umeur, c'est-à-dire la composition des tissus et l'organisation du réseau des vaisseaux. Ces approches d'imagerie sont donc le moyen idéal pour évaluer les effets de la thérapie sur les tumeurs et l’environnement cellulaire au sein duquel évoluent les cellules cancéreuses.
Procédures
Tous les animaux seront soumis a: 1) Imagerie par résonance magnétique au temps J7, J14, J28, J40 après implantation des cellules tumorales dans le cerveau (J0) pour une duree de 2h par souris (réalisé sous anesthésie gazeuse ) 2) prélèvement sanguin (qui dure environ 5 sec) afin d’évaluer la lésion tumorale 1 fois par semaine sans anesthesie pendant toute la duree du protocole 3) euthanasie pour prélever le cerveau.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables ne sont pas spécifiques à la procédure car l’IRM n’induit pas de douleur supplémentaire. Néanmoins, en cas d’observation de la douleur des mesures seront prises telles que l’administration d’ analgésiants. La procédure IRM, qui n'induit pas de douleur, sera réalisée malgré l'observation préalable de signes de souffrance liee à l’implantation des cellules tumorales ou a la croissance de la tumeur. Pendant la procédure d'IRM, l'animal est endormi avec un gaz anesthésiant pendant l’intégralité de la procédure, la fréquence respiratoire est surveillée et l'animal est placé sur un lit chauffé.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure a fin de recuperer les cerveaux pour les analyses biologiques.
Remplacement
Dans ce projet, l'expérimentation animale sera mise en place pour étudier une modification locale de l’environnement cellulaire au sein duquel évoluent les cellules cancéreuses, qui serait difficile à étudier par des moyens alternatifs (par culture cellulaires ou en modélisation par logiciel).
Réduction
Les groupes ont été conçus de manière à minimiser le nombre d'animaux utilisés. Un calcul statistique du nombre de sujets nécessaires a été effectué afin d'évaluer le nombre d'animaux à inclure pour obtenir des résultats significatifs tout en minimisant le nombre d'animaux. Ces calculs ont été rendus possibles par les résultats antérieurs obtenus avec ces modèles animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur seront limités pour garantir le bien-être de l'animal et des résultats fiables. Le stress a un impact important sur le comportement biologique de la réponse immunitaire. Par conséquent, la manipulation des animaux sera réduite au minimum. Toutes les manipulations seront effectuées sous anesthésie. Les soins et le suivi des animaux seront effectués par des personnes compétentes et expérimentées. De facon systematique, du coton est ajoute dans les cages pour que les souris fassent leurs nids. Les critères d'évaluation de la douleur ne sont pas spécifiques à la procédure car l’IRM n’induit pas de douleur supplémentaire. La douleur observée peut être due à l’implantation des cellules tumorales. Neanmoins, en cas d’observation de la douleur des mesures seront prises. Les points les plus précoces sont les troubles du comportement (repli dans un coin, poil hérissé, etc.), l'altération de l'apparence physique (grattage, poil terne, etc.) puis l'anorexie, perte de poids > 20%. Si les points limites sont atteints, l'animal sera euthanasié et ne sera donc pas soumis à la procédure IRM. La procédure IRM, qui n'induit pas de douleur, sera réalisée malgré l'observation préalable de signes de souffrance liee à l’implantation des cellules tumorales ou a la croissance de la tumeur. En effet, si le score comme indiqué ci-dessous indique des signes de douleur et donc la nécessité d'utiliser un analgésiant, celui-ci sera administrée avant de se rendre sur le site de l'IRM. Pendant la procédure d'IRM, l'animal est endormi avec un gaz anesthésiant pendant l’intégralité de la procédure, la fréquence respiratoire est surveillee et l'animal est placé sur un lit chauffé.
Choix des espèces
L'utilisation des animaux pour etudier le cancer présente de nombreux avantages par rapport à l'utilisation des cellules in vitro (n’utilisant pas de modèle animal). Plus de 80 % des gènes de la souris sont similaires à ceux de l'homme, ce qui a conduit à l'adoption de la souris comme organisme pour etudier la biologie et la thérapie du cancer du cerveau. Beaucoup d'etudes scientifiques ont démontré que les tumeurs dans les animaux, reproduisent mieux les caractéristiques des vaisseaux et des cellules des tumeurs cérébrales humaines. Dans ce contexte, les souris (âge adulte, agées 9-11 semaines) sont soumises à une transplantation dans le cerveau des cellules tumorales, et puis les souris sont soumises au protocole d’IRM pour étudier les propriétés des tissus et développer de nouvelles stratégies diagnostiques.
Étude des défauts hypothalamiques dans des modèles murins de sclérose latérale amyotrophique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations mimant la sclérose latérale amyotrophique et subissent des chirurgies cérébrales, implantation de pompes, pose d'électrodes sous-durales et injection intracérébrale, puis des tests glycémiques, métaboliques et des tests comportementaux non détaillés sur trente-cinq jours. Le porteur indique que les chirurgies provoquent des douleurs atténuées par des analgésiques et prévoit de retirer un animal dont l'état ne s'améliore pas sous 48 heures. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur un modèle animal dont l'hypothalamus est bien caractérisé et conclut que la souris ne "saurait être remplacée".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA), la plus fréquente des maladies du système moteur adulte (2 à 3 nouveaux cas pour 100 000 habitants), reste une pathologie incurable et présente un pronostic extrêmement sévère, conduisant au décès, 2 à 5 ans après l’apparition des premiers symptômes. La SLA présente des formes sporadiques (90%) et familiales (10%). Diverses lignées de souris transgéniques ont été mises au point, récapitulant les symptômes de la maladie : une dégénérescence des neurones moteurs cortico-spinaux et des motoneurones spinaux, une dénervation des muscles striés squelettiques accompagnée d’une atrophie musculaire et d’une paralysie progressive se finissant par la mort. Ces lignées transgéniques sont à la base des recherches expérimentales dans le domaine de la SLA. Outre les symptômes moteurs, la SLA est aussi accompagné par une perte de poids très importante (chez l’homme et modèles murins) due à une diminution de la prise alimentaire, associée à un changement de la dépense énergétique. Il a été observé récemment que les modèles transgéniques ont aussi des dysfonctionnements du sommeil et du métabolisme. Ces altérations à l’origine de ces symptômes n'ont pas encore été demontrees. Chez la souris, l’hypothèse expliquant les bases cellulaires de ces dysfonctionnements sont un défaut fonctionnel des neurones hypothalamiques impliquées dans la régulation de la balance énergétique, la prise alimentaire et le sommeil. Ceci suggère l’existence d’un défaut hypothalamique touchant le contrôle de la prise alimentaire et la qualité/quantité de sommeil aussi chez le patient SLA. De plus d'un point de vue moléculaire, il a été montré que l'une des molécules impliquées dans la maladie, est un élément central de l’horloge interne. Ce dernier gène particulièrement contrôle de façon remarquable le rythme de prise alimentaire et le sommeil. Ceci faisant le lien entre la pathologie étudiée et les problèmes de l'horloge interne. Nous investiguerons donc, dans cette etude, le sommeil et le metabolisme de ces lignees transgeniques mimant la SLA.
Bénéfices attendus
Ces expériences nous permettront de déterminer si les défauts fonctionnels de l’hypothalamus peuvent être reversés et ainsi ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour la SLA. Au-delà de la SLA, ce projet est destiné à contribuer à l’effort commun de recherche sur l’étiologie des maladies neurodégénératives du système moteur.
Procédures
Les animaux subiront des procédures chirurgicales (implantation de pompes iPRECIO durée 2h, implantation d’électrodes subdurales durée 3h, injection intracérébrale durée 2h) en plus de test glycémique (durée 2h), comportementaux et métaboliques. Ces expériences dureront maximum 35 jours et prennent en compte le développement de la pathologie dans les 2 lignées transgéniques. Les prélèvements ne seront fait qu’en phase terminale d’une procédure.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à des douleurs causées par les procédures chirurgicales qui seront atténuées par des antalgiques et analgésiques avant, pendant et après la chirurgie ainsi qu’une surveillance quotidienne pendant la période de récupération des souris. Nous préviendrons toutes infections par l’apport d’antibiotique a la fin des procédures chirurgicales. Enfin, nous ne laisserons aucune souris dans la souffrance en nous référant à la feuille en Annexe 1. Il sera pris la décision de sortir une souris de l’étude si les conditions de la souris ne montrent pas d'amélioration sous 48 heures.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort pour des analyses biochimiques et immunologiques, après avoir collecté sang, tissus et organes.
Remplacement
La SLA est une maladie d’origine multifactorielle et multicellulaire. Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l’aspect intégré de cette pathologie. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent, en outre, une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme pour réaliser ce projet de recherche.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux dans ce projet, les animaux destinés aux analyses biochimiques ou histologiques seront au préalable inclus dans les études fonctionnelles. Le nombre de souris incluses dans ce projet a été précisément calculé à partir des observations faites dans le laboratoire lors d’études préliminaires ce qui a permis de calculer la puissance statistique et d’éviter les biais de taille d’effet (nombre suffisant permettant l’exploitation statistique). Le logiciel GPower nous a permis de calculer le nombre minimum nécessaire par groupe à 24. Secondairement lorsque les données seront récoltées nous utiliserons une analyse statistique ANOVA à un facteur avec une analyse post-hoc pour analyser les résultats.
Raffinement
Les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, bénéficieront de conditions d’hébergement conformes à la réglementation en vigueur. L’enrichissement de l’environnement des animaux (coton compressé pour faire des nids, maisons en plastique rouge), le maintien des interactions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront de s’assurer de leurs bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Des points limites (perte de poids, difficultés métaboliques, etc.) permettant de soustraire l’animal à la souffrance ont été établi. De plus, nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes de pré-anesthésie, d’anesthésie et de prise en charge analgésique en cas de procédure.
Choix des espèces
La souris est un modèle important et pertinent dans l’étude de la SLA. Pour intégrer la complexité de la pathologie, et notamment des implications du dysfonctionnement de hypothalamus, il est indispensable de travailler avec un modèle animal possédant une structure hypothalamique bien caractérisée. De plus, les modèles transgéniques de souris sont des modèles expérimentaux très puissants (génétique connue, commercialisation d’outils moléculaires, etc.). En conséquence, dans le cadre de la question biologique posée, le modèle animal choisi ne saurait être remplacé par un autre. Les animaux seront utilisés à partir de 30 jours, au moment du sevrage, car l’injection de DREADDS nécessite d’être faite sur des souris âgées de 30 jours car le DREADDS est laissé 15 jours avant de pouvoir conduire un quelconque effet. Pour les pompes iPRECIO et l’EEG des animaux de 65 jours seront utilisés pour pouvoir observer les effets au stade présymptomatique.
Approche régénérative pour restaurer les fonctions après une lésion traumatique du système nerveux : de l’étude fondamentale à l’étude translationnelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 1170
1 104 souris et 1 170 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, en majorité dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit de une à quatre chirurgies, dont des sections ou contusions de la moelle épinière entraînant une paralysie des pattes postérieures, ou des lésions du nerf sciatique, avant d'être euthanasié pour analyses post-mortem. Le porteur souligne que cette paralysie est chez le rongeur partiellement réversible, à la différence de l'humain. Il affirme que les études sans animaux ne permettent pas d'étudier le contrôle moteur et conclut que trouver une solution thérapeutique est "indispensable".
Objectifs
Les lésions traumatiques (médullaires et crâniennes) et neurodégénératives du cerveau et de la moelle épinière chez l’homme induisent en général un handicap sévère et qui peut être permanent. Par leur importante prévalence, ces pathologies ont un fort impact sociétal et économique. Analyser l’évolution de la lésion du système nerveux central et, en parallèle, élucider comment le neurone répond à ces changements constitue un grand défi pour concevoir des stratégies thérapeutiques visant à stimuler la régénération et la réparation du réseau neuronal affecté. Cela s’applique également aux lésions sévères des nerfs périphériques où la régénération axonale est limitée pour atteindre les cibles périphériques appropriées. Le projet vise à comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la dégénérescence versus la régénération des fibres nerveuses, avec l'objectif de contribuer à l'élaboration de stratégies de réparation, basée sur l’ingénierie tissulaire. L’utilisation des rongeurs, rat et souris, constitue le modèle animal adapté pour ce projet. Ces modèles inclus les lésions médulaires : la transection bilatérale dorsale ou la contusion, au niveau thoracique qui entraine une paralysie des pattes postérieures, mais qui est suivie d’une récupération partielle. De même, la lésion du nerf sciatique est le modèle de lésion périphérique couramment utilisé. Enfin pour obtenir une preuve de concept de notre stratégie d’ingénierie tissulaire du trauma au niveau du cerveau, le modèle de contusion corticale contrôlée sera adapté. La règle des 3R a été́ considérée tout au long de l'élaboration de ce projet et sera appliquée au quotidien.
Bénéfices attendus
Notre objectif ultime est de déterminer quand et comment, après la lésion de la moelle épinière, la combinaison de l'implantation du biomatériau avec les traitements cités montrerait une efficacité. Par ailleurs, nous poursuivrons notre processus de valorisation et d’interaction avec des cliniciens vers une perspective clinique, pour aboutir à des solutions transposables, réalisables et convaincantes pour leur application en clinique. Grâce aux preuves de concept obtenues au préalable, notre projet de recherche préclinique démontre qu’il est possible de réactiver et de soutenir la plasticité du système nerveux central (ici la moelle épinière), même dans les conditions les plus toxiques et néfastes de la lésion traumatique de la moelle épinière. Notre motivation dans cette thématique et qu’aujourd’hui aucune solution thérapeutique curative n’est disponible en routine clinique pour favoriser significativement la récupération médullaire chez les patients paralysés. Trouver une solution est indispensable.
Procédures
Les animaux sont soumis à 1 à 4 procédures chirurgicales, de durées inférieures à 30 min chacune pour les souris et inférieures à 45 min pour les rats. La durée entre 2 chirurgies soumises à un animal s’étale entre 24h et 8 semaines. Toute procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie et analgésie. Aucun prélèvement n’est effectué sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Nos procédures sont, pour la plupart, classées sévères. Cependant chez le rongeur, les modèles expérimentaux utilisés, entrainent une paralysie (paraplégie) qui, à la différence de l’homme, est réversible partiellement. Les traitements utilisés ne sont pas nocifs, au contraire, ils améliorent la récupération fonctionnelle. Ils sont biocompatibles et résorbables. Ils pourront aussi être envisager dans le cas de trauma ou dommages du système nerveux des animaux domestiques comme le chien ou le chat. Enfin, la réglementation est strictement respectée et appliquée.
Devenir
Chaque animal sera euthanasié à l’issue de leur procédure, afin de réaliser des études histologiques et biochimiques sur les prélèvements post-mortem. Ces analyses constituent une part importante des projets sur lesquels nous travaillons, auxquelles les méthodes alternatives ne répondent pas.
Remplacement
Les études in vitro et sur les invertébrés ne permettent pas l'étude de comportements tel que le contrôle moteur latéralisé. D’autre part, le système nerveux traumatique est complexe et évolutif ; l’utilisation de lignées cellulaires ne permet pas d’appréhender ces études ni de développer des stratégies à visées thérapeutiques pour obtenir des preuves de concepts pour une application translationnelle. Néanmoins, dans notre projet, des études in vitro sont menées en parallèle pour des questions fondamentales de mécanistiques à l’échelle moléculaire ainsi que des tests de criblage sont développés en amont de l’expérimentation animale.
Réduction
Les expériences antérieures nous ont permis de définir le nombre minimal d'animaux permettant de générer des données statistiquement solides. Ainsi, les analyses comportementales et biochimiques ou anatomiques sont réalisées sur les mêmes animaux, pour des raisons de rigueur d’analyse et pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. A cette fin, les groupes d’animaux sont créés au fur et à mesure, avec les contrôles à l’intérieur de chaque groupe. 2274 animaux seront utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec un cycle jour/nuit adapté et avec la boisson et la nourriture ad libitum. outes les chirurgies sont effectuées sous anesthésie (isofluorane au masque) et analgésique. Les animaux sont regroupés dès le lendemain après chirurgie pour limiter la période d’isolement et un enrichissement adapté pour chaque espèce de rongeur (briques en bois pour les rats et nid végétal pour les souris) est placé dans la cage. Ils feront l’objet d’un contrôle quotidien par une personne formée et compétente. Ces contrôles, enregistrés et validés par le SBEA local, permettent de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. Les points limites sont définis et les méthodes seront mises en place pour supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux comme l’injection d’antalgiques ou l’euthanasie par injection d’une surdose d’euthanasiant. (ces injections sont réalisées après une brève anesthésie ; induction à l’isoflurane). Par ailleurs, nous continuons à poursuivre des formations de mise à jour pour appliquer au mieux la réglementation et d’avoir l’opportunité d’introduire des améliorations pout le meilleur raffinement possible en le validant en amont par notre SBEA et en interagissant avec le vétérinaire référant.
Choix des espèces
Rat et souris sont les animaux d’expérimentation les plus utilisés dans la recherche sur le traumatisme du système nerveux, afin d’améliorer la connaissance de la physiopathologie et développer des stratégies thérapeutiques adaptés. Malgré des différences entre l’homme et les rongeurs, les changements pathologiques, la réponse inflammatoire et l’expression des gènes précoces post-traumatiques sont les mêmes. L’induction du trauma est très reproductible et standardisée chez le rat et de nombreux tests sensori-moteurs ont été très bien établis. Les outils disponibles sont multiples et permettent de caractériser l’évolution d’une lésion. Malgré l’absence de formation de cavités chez la souris (présente chez l’homme et le rat), elle permet de démontrer la fonction d’un gène spécifique grâce à la transgénèse et les caractéristiques moléculaires, cellulaires et fonctionnelles post-traumatiques y sont comparables. Chez le mammifère l’incapacité d’un neurone à régénérer son axone après une lésion mécanique est essentiellement notée à l’âge adulte. Ainsi la majorité de nos expériences seront réalisées chez la souris et le rat adultes âgés de 6 à 7 semaines, soit 30g et 250g respectivement. A noter que les lésions arrivent en grande majorité sur des jeunes adultes. Par ailleurs, dans le cadre du développement d’une stratégie thérapeutique après traumatisme, nous projetons de combiner l’implantation de biomatériaux biocompatibles et biodégradable avec une greffe de cellules : des neurones issus d’embryons à E12-14 de rongeurs et des cellules de Schwann issues de rat adulte. Cette greffe homotypique sera réalisée uniquement chez le rat.
Elevage de lignée transgénique pour la protéine Tau à phénotype dommageable
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
600 souris vont être utilisées dans un projet d'élevage impliquant un niveau de souffrance modéré, 450 étant transférées vers un autre établissement et 150 reproducteurs tués pour prélèvement du cerveau. La lignée porte un phénotype décrit comme "dommageable", une paralysie progressive des membres postérieurs que les animaux développent à partir de cinq mois et demi. Le porteur précise qu'il faut maintenir ces souris en vie jusqu'à un stade avancé de paralysie, en les aidant alors à s'alimenter et à s'hydrater, car c'est à ce stade que la pathologie visée s'étend dans le cerveau. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" et que l'étude in vivo est "indispensable".
Objectifs
Il s’agit d’un projet d’élevage de souris transgénique avec phénotypage dommageable dans le but de générer des animaux nécessaires pour répondre à des questions scientifiques avec des enjeux de santé public majeurs. Pour mener à bien notre projet de recherche, nous aurons recours à des souris transgéniques pour la protéine Tau humaine qui présentent l’avantage d’être un modèle robuste d’induction et de propagation de la tauopathie. Les avancées de notre projet scientifiques, de par l'utilisation de ces animaux à phénotype dommageable, permettront de répondre à des questions majeures sur les mécanismes de mise en place de la maladie d'Alzheimer aboutissant sur des innovations thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Cet élevage a pour but de générer le nombre d'animaux nécessaires à nos deux projets de recherche tout en surveillant l'apparition du phénotype dommageable et en assurant le bien être animal. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet, les tauopathies sont des maladies neurodégénératives complexes pour lesquelles des spécificités semblent être impliquées et l'étude de certains de ces aspects est indispensable in vivo afin de pouvoir analyser les différences d'induction et de propagation au sein de l'organisme vivant.
Procédures
Il s'agit d'un élevage de souris à phénotype dommageable. 450 animaux produits au sein de ce projet sont destinés à être transférés dans un autre établissement utilisateur dans le cadre de projets préalablement autorisés. 150 animaux reproducteurs seront euthanasiés par CO2, leur cerveau sera prélevé, congelé dans de l’azote liquide et stocké à -80°C afin d'être analysés pour les besoins des projets de recherche.
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable attendu sera une paralysie des membres inférieurs qui sera détectable cliniquement à partir de 22 semaines d’âge (5,5 mois) chez les souris homozygotes et entre 9 et 12 mois d’âge (36-48 semaines) pour les souris hétérozygotes. Les premiers signes de développement de la paralysie observables seront une perte d’équilibre lors de la marche et un affinement progressif du bas du corps. Les animaux à ce stade peuvent encore se déplacer et se dresser sur les pattes arrières pour accéder aux croquettes et à l’eau de boisson. Il faut bien suivre le développement de la paralysie à partir de ce stade. Il va progresser vers un stade avancé en un mois pour les souris homozygotes et en 2-3 mois pour les hétérozygotes. A ce moment-là il faudra aider ces animaux à s’alimenter et à s’hydrater en leur mettant à disposition des croquettes en poudre mouillées et en ajoutant de l’eau gélifiée. Pour les besoins des différents projets nous devons garder les animaux en vie jusqu’à un stade avancé de paralysie car c’est à ce moment que la pathologie de Tau s’étend dans l’hippocampe, région de grand intérêt pour notre recherche.
Devenir
450 animaux produits au sein de ce projet sont destinés à être transférés dans un autre établissement utilisateur dans le cadre de projets préalablement autorisés. 150 animaux reproducteurs seront euthanasiés par une méthode réglementaire, leur cerveau sera prélevé, congelé dans de l’azote liquide et stocké à -80°C. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique l'euthanasie de ces animaux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre projet les objectifs du projet. En effet, les tauopathies sont des maladies neurodégénératives complexes pour lesquelles des spécificités semblent être impliquées et l'étude de certains de ces aspects est indispensable in vivo afin de pouvoir analyser les différences d'induction et de propagation au sein de l'organisme vivant.
Réduction
Nous utiliserons 600 animaux, nombre minimal nous permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif afin de pouvoir aboutir à des conclusions scientifiquement solides pour l’ensemble des travaux. Le nombre d'animaux a été établi grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Toutes les précautions seront prises afin de n’imposer aucune souffrance ou une contrainte minimale aux souris utilisées. Nous avons défini un ensemble de points limites pour la procédure d’élevage. De plus, un programme d’enrichissement sera appliqué en ajoutant dans la cage, une petite maison en carton et de matériel pour la nidification (coton compacté).
Choix des espèces
Nous aurons recours à une lignée de souris transgénique pour la protéine Tau qui représente un modèle de tauopathie robuste et fiable car la cinétique de développement de la tauopathie est prédictible. Les animaux seront utilisés à des stades adultes (à partir de 6 semaines) leur permettant de pouvoir être mis en accouplement.