Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Imagerie de l’activité neuronale chez des souris en mouvement libre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit trois chirurgies puis une dizaine de séances où il porte un microscope miniature fixé sur la tête pendant qu'il se déplace, avant d'être tué par perfusion intracardiaque pour analyse du cerveau. Le porteur indique que les chirurgies provoquent des lésions osseuses et tissulaires pouvant s'accompagner de douleur, de perte de poids et d'immobilité, et que le port du dispositif peut d'abord induire un stress. Il affirme que le remplacement "n'est pas possible" car il s'agit d'un système intégré "non modélisable".
Objectifs
Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles cérébrales qui permettent à l'animal de s'orienter dans l'environnement et d'effectuer des tâches motrices complexes. À cette fin, nous utiliserons des microscopes miniatures pour visualiser l'activité neuronale d'animaux au comportement libre. (1) Notre objectif est de comprendre la structure dynamique du réseau de neurones d'orientation spatiale et comment il est influencé par les stimuli visuels. L'activité des populations de cellules sera enregistrée pendant que les animaux marchent librement dans une arène ronde avec des repères visuels proéminents. Pour examiner comment l'entrée visuelle régit le circuit neuronal de direction de la tête, nous allons faire varier l'entrée sensorielle de l'animal en enregistrant en présence de repères visuels proéminents, puis en éteignant la lumière et en la rallumant. (2) Notre deuxième objectif est d'étudier le rôle des neurones du cervelet lors de la locomotion libre. Le cervelet est l'une des régions clés du cerveau impliquées dans la coordination motrice. On sait que le microcircuit cérébelleux traite les informations sensori-motrices et réalise des modifications immédiates des pattes correspondant au mouvement en cours. Les bases cellulaires d'une telle intégration demeurent largement inconnues. Le but de ce projet est d'examiner le rôle des neurones du cervelet dans la coordination des mouvements. Nous proposons d'étudier le rôle du réseau chez la souris éveillée en mouvement libre en utilisant l'imagerie calcique nous informant sur l'activité neuronale sous-jacente. La tâche pour cette étude consiste pour les animaux à traverser librement une échelle horizontale - avec des barreaux - reliant deux plateformes. Une telle tâche nécessite une intégration sensorimotrice qui implique le cervelet.
Bénéfices attendus
Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles cérébrales qui permettent à l'animal de s'orienter dans l'environnement et d'effectuer des tâches motrices complexes. Nous serons ainsi en mesure, à terme, de démontrer comment le cerveau est capable d’orienter et d’orchestrer le mouvement dans des conditions physiologiques. Une meilleure compréhension du fonctionnement des neurones dans les structures concernées est nécessaire pour permettre un diagnostic précoce et un traitement de des pathologies neurologiques liées.
Procédures
Les souris de cette étude subiront 2 procédures : Procédure n°1: Rôle des neurones du cervelet lors de la locomotion libre (6-8 semaines au total) et Procédure n°2: Dynamique du réseau neuronal d'orientation spatiale dans le présubiculum (6-8 semaines au total). Les animaux de la procédure n°1 (100 souris en total) subiront 3 chirurgies dont 1 peu invasive et environ 10 séances de comportement couplé à des enregistrements de mouvement et d'imagerie calcique. Les animaux de la procédure n°2 (230 souris en total) subiront 3 chirurgies dont 1 peu invasive et environ 10 séances de comportement couplé à des enregistrements de mouvement et d'imagerie calcique. Les deux procédures se terminent par la mise à mort des animaux par perfusion intra-cardiaque.
Impact sur les animaux
Les chirurgies invasives prévues par le protocole impliquent des dommages osseux et tissulaires. En conséquence, les animaux peuvent être potentiellement exposés à la douleur combinée à une perte de poids, à l'immobilité ou à un comportement anormal. Avant, pendant et après la chirurgie, nous traitons ces problèmes potentiels par l'administration de médicaments analgésiques et anti-inflammatoires. La durée typique de récupération après une opération est de 1 à 2 jours, période pendant laquelle les animaux sont traités avec ces médicaments. Le fait de porter le microscope miniature sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement anormal indésirable. Avant d'imager l'activité neuronale à l'aide du miniscope, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer à porter l'appareil d'imagerie.
Devenir
Tous les animaux suivant les procédures 1 et 2 sont sacrifiés comme indiqué à l'étape E. Ils sont mise à mort par perfusion intra-cardique avec dosage des anesthésiques pour prélèvement d'organes et analyses histologiques. L'étude histologique post-mortem nous permet d'identifier la localisation et l'identité des neurones enregistrés.
Remplacement
L'intégration des informations sensorimotrices pendant la navigation spatiale libre implique de multiples régions et réseaux cérébraux. Afin de comprendre le rôle des neurones dans le comportement moteur et l'orientation, il est donc primordial de réaliser des expériences sur animal vivant en libre movement afin de conserver la structure et l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents. Le remplacement n'est pas possible car il s'agit d'une étude d'un système intégré, non modélisable
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, cette étude d'imagerie in vivo est réalisée avec des implants permanents. Une fois implantés, les animaux sont maintenus en vie et utilisés pour de plusieurs sessions d'enregistrement. L'optimisation des soins aux animaux contribue en outre à l'utilisation d'animaux pour plusieurs sessions d'enregistrement et à réduire le nombre d’animaux. Enfin, nous utiliserons les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des résultats exploitables à partir du plus petit nombre d’animaux possible
Raffinement
Tout signe de douleur, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques et anti-inflammatoires. Une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. La surveillance quotidienne de l'animal permettra d'arrêter toute procédure expérimentale en cas de signes d’anxiété ou de souffrance définis dans l’échelle d’évaluation.
Choix des espèces
La souris a été choisie car en combinant souris transgénique et injections virale de GCaMP nous serons en mesure de mesurer l’activité calcique dans des populations neurales spécifiques pendant le mouvement libre. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge où leur activité motrice est arrivée à son niveau mature (P30) et pendant les deux mois qui suivent. À cet âge, la locomotion est entièrement développée et les structures cérébrales impliquées dans la locomotion et l'orientation sont matures..
Etudes histologiques chez les rongeurs
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Rats : 100
200 souris et 100 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil par exsanguination puis dissection. Ils ne servent pas à produire des connaissances mais à mettre au point des protocoles d'histologie et à former étudiants et collaborateurs à ces techniques. Le porteur justifie le recours aux animaux par la baisse du nombre de pièces anatomiques disponibles et par le souci de ne pas "gaspiller" des tissus issus de projets scientifiques. Il affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer l'utilisation des animaux" puisque l'histologie porte sur des pièces anatomiques.
Objectifs
L’objectif du projet est de développer et valider des protocoles d’histologie (2D et 3D), pour la plateforme. En effet, l’histologie reste la méthode de référence pour visualiser post mortem les biomarqueurs ou les différents types cellulaires présents dans un tissu biologique. La réduction du nombre d’animaux dans les études fait qu’il n’y plus de reliquat de pièces anatomiques non utilisées dans les projets. Il n’est pas pertinent de compter uniquement sur les animaux dédiés à une étude pour à la fois mettre en place un protocole d’histologie et réaliser une étude complète, les zones d’intérêt étant parfois très petites (structures cérébrales) ou le protocole d’histologie difficile à mettre au point (multi-marquage et histologie 3D). Ce projet vise donc à utiliser des animaux afin à mettre au point de nouveaux protocoles d’histologie avant de les utiliser pour les projets scientifiques, tels que les études de vieillissement ou les études sur le cancer. Les développements méthodologiques que sont les multiples marquages, l’histologie 3D, ou révélation de la vascularisation d’un organe entier nécessitent de nombreuses mises au point. Les multiples marquages permettent de visualiser sur une même coupe de tissus plusieurs marqueurs, permettant la visualisation de colocalisations de marqueurs ou le dénombrement de différentes cellules dans une même région. Les nouvelles techniques d’histologie en 3D nécessitent également beaucoup de mises au point, pour obtenir un immunomarquage visible en profondeur, en rendant transparent la pièce anatomique. La visualisation de la vascularisation d’un organe entier, en rendant transparent la pièce anatomique, est particulièrement intéressante pour corréler avec l’imagerie IRM mais également très difficile à mettre en place, nécessitant de nombreux ajustements. Ce projet vise aussi à obtenir assez de pièces anatomiques pour pouvoir vérifier un protocole déjà validé sur une espèce sur une autre espèce ou une autre souche. Enfin, et de façon non négligeable, il est nécessaire de disposer de pièces anatomiques pour former les étudiants et les collaborateurs, aux techniques d’histologie, sans gaspiller une pièce « précieuse » car issue d’un projet scientifique. La prise en main des techniques (découpes, immunomarquages et microscopie) nécessitant un apprentissage important, notamment sur la découpe au cryostat.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la mise au point de nouveaux protocoles complexes d’immunomarquages en 2D et 3D pour pouvoir réaliser ensuite des études complètes en histologie sur les projets scientifiques de la plateforme. Le bénéfice est également de pouvoir réaliser la formation des étudiants sans gâcher des pièces anatomiques « précieuses » car issu d’un projet et de pouvoir contrôler les résultats sur un animal sain en cas de résultat inattendu (ex : perte neuronale dans une souche de rat).
Procédures
Une procédure chirurgicale sans réveil, comportant une exsanguination perfusion puis une dissection afin de recueillir des organes d’intérêt. La procédure est déclinée en plusieurs possibilités : 1 : procédure standard d’exsanguination perfusion, puis recueil des organes, durée totale estimée à environ 15 à 20 minutes en fonction du nombre d’organes à prélever. 2 : Injection intracardiaque, intra-artérielle ou intraveineuse préalable d’un marqueur coloré (colorant vasculaire), avant exsanguination perfusion et recueil des organes. Le produit est laissé agir 5 min avant de commencer la procédure d’exsanguination perfusion, durée totale estimée à environ 30-40 minutes, en fonction du site d’injection et du nombre d’organes prélevés. 3 : Injection d’un marqueur coloré (colorant vasculaire) pendant la procédure d’exsanguination perfusion et recueil des organes, durée totale estimée à environ 15 à 20 minutes en fonction du nombre d’organes à prélever. 4 : Injection d’un marqueur coloré (remplissage vasculaire) à la fin de la procédure d’exsanguination perfusion et recueil des organes, durée totale estimée à environ 15 à 20 minutes en fonction du nombre d’organes à prélever.
Impact sur les animaux
Procédures sans réveil.
Devenir
Une procédure sans réveil pour histologie
Remplacement
L’histologie concerne les pièces anatomiques, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation des animaux.
Réduction
Les études rats étant moins nombreuses que les études sur souris, le nombre de 20 rats/an a été déterminé par le nombre de projets nécessitant ce type de mise au point. Les études souris sont beaucoup plus nombreuses mais nous avons déjà accumulé également plus de données histologique, nous pensons donc que 40 souris /an seront suffisantes, en tenant compte des besoins de formation. Soit un total maximal de 100 rats et 200 souris en 5 ans. Il est estimé qu’environ 10 à 15 % de ces animaux seront utilisés pour les action de formation et 85 à 90% pour des actions de mise au point en histologie. Une partie des animaux peuvent être des animaux de réforme issus de projets antérieurs, ou des élevages du CEA, n’ayant subi soit aucune procédure, soit des procédures légères ou modérées n’ayant pas entrainés de signes cliniques persistants. Les actions de formations seront réalisées sur ces animaux. Les mises au point peuvent également être réalisés sur ces animaux à l’exclusion des animaux suivants : - Animaux ayant des signes cliniques, pathologiques ou non. - Animaux d’un âge trop avancé pour l’expression des biomarqueurs d’intérêt (en fonction des marqueurs) - Animaux qui ont reçu un traitement (y compris produits de contraste) - Animaux qui ont subi des procédures chirurgicales lourdes (craniotomies …) - Animaux qui ont subi des procédures pouvant entrainer une inflammation (ouverture de la barrière hémato-encéphalique) - Animaux issus de souche atypique, de souche immunodéficiente ou encore ayant un métabolisme pathologique (sans forcément présenter des signes cliniques - Animaux de l’élevage ayant déjà montré une déficience cellulaire/moléculaire (sans signes cliniques) Les animaux jeunes et sains sont privilégiés pour ces mises au point, limitant les facteurs pouvant troubler l’analyse de l’expression des marqueurs et permettant d’avoir des points de comparaisons avec des animaux ayant une pathologie ou un traitement. Des animaux d’élevage n’ayant absolument subi aucune procédure, peuvent cependant servir pour les mises au point en histologie quand cela concerne l’expression des biomarqueurs liés à l’âge, à condition que la souche soit identique à celle prévue dans le projet lié à l’âge et que les animaux n’ont pas déjà été identifié comme déficients/anormaux pour les marqueurs d’intérêts. Les animaux provenant d’autres animalerie que celle de notre plateforme, seront gardés en quarantaine à réception jusqu’à utilisation.
Raffinement
Procédure sans réveil Une antalgie sera réalisée par injection sous-cutanée de Buprénorphine (0,06 mg/kg pour les souris et 0,03 mg/kg pour les rats), 30 minutes avant anesthésie.. Les animaux seront anesthésiés par une injection intrapéritonéale d’un mélange Kétamine/Xylazine (100/10 mg/kg, dose de 10 ml/kg).
Choix des espèces
La plupart des projets scientifiques sont réalisés sur le rongeur, les mises au point techniques se sont donc en priorité sur ces espèces. Des souris de 6-8 semaines environ, pour un poids de 20-25 g, et des rats de 8 semaines environ, pour un poids de 300 g, seront utilisés de préférence, sauf pour mettre au point des études histologiques sur des animaux plus âgés, où des animaux de plus de 6 mois seront utilisés. En effet, les tissus et en particulier le cerveau montre des différences importantes au cours du temps, avec par exemple la diminution de certains types cellulaires et l’augmentation de dépôts protéiques susceptibles d’interagir avec les anticorps et de donner de faux positifs.
Préparation de débris de myéline à partir de cerveaux de souris ayant subi un traumatisme crânien
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie provoquant un traumatisme crânien, puis sont tuées pour que leurs cerveaux servent à préparer des débris de myéline destinés à des cultures cellulaires. Le porteur indique que le traumatisme peut réduire la prise de nourriture et d'eau, et prévoit une analgésie et des points limites. Il affirme que ce projet, visant à produire ces débris à partir de cerveaux de souris, ne peut être remplacé par des modèles in vitro.
Objectifs
Le traumatisme crânien est un problème majeur de santé publique lourd de conséquences neurologiques et lésionnelles à court comme à long terme pour lequel il n’existe aujourd’hui aucun traitement. Ces conséquences tardives sont en grande partie reliées à des lésions jusqu’ici largement sous-estimées et méconnues : les lésions de la substance blanche. Cette dernière contient essentiellement des cellules nerveuses entourées d'une gaine particulière, la myéline, permettant la transmission des informations dans le cerveau. L'espoir d'améliorer le pronostic du traumatisme crânien repose sur la découverte des mécanismes impliqués dans les lésions de la substance blanche et les désordres neurocomportementaux conséquents. Parmi ces mécanismes, des études suggèrent le rôle de la neuro-inflammation dans les lésions de la substance blanche après un traumatisme crânien. La microglie est une cellule immunitaire du cerveau qui joue un rôle majeur dans la neuro-inflammation. Des études suggèrent que les débris de myéline induits par le traumatisme crânien pourraient activer à leur tour la microglie. Une fois activée, la microglie peut adopter 2 phénotypes distincts, c'est-à-dire qu'elle peut exercer des effets délétères, mais elle peut aussi exercer des effets bénéfiques, et ceci, selon son environnement. Ainsi, des études ont rapporté aussi bien des effets pro- ou anti-inflammatoires des débris de myéline, mais à ce jour, aucun lien entre débris de myéline et activation microgliale n’a pu être mis en évidence dans le traumatisme crânien. L'objectif de ce projet est donc de préparer des débris de myéline à partir de cerveaux de souris mâles Swiss ayant subi un traumatisme crânien, afin (1) d'étudier leurs effets (bénéfiques ou délétères) sur le phénotype microglial, et (2) d'identifier les mécanismes mis en jeu, et ceci sur des cultures de microglies de souris.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche permettra d'identifier des cibles moléculaires permettant de moduler la neuro-inflammation d'origine microgliale induite par les débris de myéline suite à un traumatisme crânien.
Procédures
Une procédure chirurgicale permettant d'induire un traumatisme crânien sera réalisé chez les souris. L’ensemble de cette procédure dure 10 minutes.
Impact sur les animaux
L'induction du traumatisme crânien peut entraîner une diminution de la prise alimentaire et d'eau.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux seront prélevés pour préparer les débris de myéline.
Remplacement
L'objectif de ce projet étant de préparer des débris de myéline à partir de cerveaux de souris mâles Swiss ayant subi un traumatisme crânien pour en étudier les effets sur des cultures de microglies, il ne peut donc être remplacé par des modèles in vitro ou autres.
Réduction
Le faible taux d'échec (10%) des gestes pour réaliser le traumatisme crânien, ainsi que la bonne connaissance de la temporalité des mécanismes induits par le traumatisme crânien (activation microgliale, démyélinisation, détection des débris de myéline, déficits comportementaux, lésions de la substance blanche) permettront de réduire le nombre d'animaux au minimum
Raffinement
L'eau et la nourriture seront fournies à volonté et le milieu sera enrichi par des cotons compactés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables, afin de limiter tout stress et modification de hiérarchie. Afin de s'assurer du bien-être animal, l'intervention chirurgicale permettant de réaliser le traumatisme crânien sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera donné en pré- et post-opératoire, afin de limiter la souffrance des animaux. La mise en place de points limites et l'observation du comportement des animaux permettront d'identifier toute souffrance et douleur, et d'entraîner une mise à mort anticipée, si nécessaire.
Choix des espèces
Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour la réalisation des modèles de traumatisme crânien. Le traumatisme crânien sera réalisé chez des souris jeunes adultes (6-8 semaines), puisque c'est un évènement fréquent dans cette tranche d'âge chez l'Homme.
Etablissement d’un modèle de glioblastomes (GBM) chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
808 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des souriceaux d'un jour sont anesthésiés, reçoivent une injection d'ADN dans un ventricule cérébral puis des chocs électriques d'électroporation, pour induire et étudier les premières étapes d'un glioblastome. Le porteur indique que l'électroporation peut provoquer stress de séparation, refroidissement et douleur modérée, et prévoit d'arrêter l'expérience quand les tumeurs atteignent 15 % du volume du cerveau. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle cellulaire capable de récapituler ces niches de cellules souches.
Objectifs
Les glioblastomes (GBM) représentent la forme la plus fréquente et aussi la plus agressive des tumeurs primaires du cerveau avec un pronostic de survie post-diagnostique très bas. L’objectif du projet est d’établir dans notre laboratoire un modèle murin de GBM qui permettra d’étudier les étapes précoces de progression de ces tumeurs. Récemment les cellules souches neurales localisées autour des ventricules latéraux du cerveau ont été identifiées comme les cellules qui sont à l’origine des GBM. En effet lorsque certains gènes sont mutés dans ces cellules souches, celles-ci sont en capacité de se transformer en cellules tumorales. Sur la base d’études publiées dans d’autres laboratoires, nous souhaitons effectuer des expériences pilotes pour mettre au point un modèle d’induction de GBM basé sur l’introduction de mutations dans ces cellules souches neurales. Grâce à une méthode d’électroporation mise au point au laboratoire, nous pouvons cibler spécifiquement ces cellules souches et y introduire des modifications génétiques. L’analyse de ces cellules ainsi modifiées sera effectuée à différents temps après l’induction des mutations et permettra de caractériser les évènements cellulaires et moléculaires qui interviennent pendant la période d’induction et de développement précoce des GBM.
Bénéfices attendus
Grâce à l'électroporation nous avons le moyen unique de pouvoir cibler les cellules qui sont à l’origine de la formation de GBM. La mise au point d’un nouveau modèle de glioblastome basé uniquement sur l’électroporation ouvre la possibilité d’étudier les étapes précoces du développement des GBM dans un contexte physiologique avec un niveau de résolution cellulaire et moléculaire qui n’existe pas à l’heure actuelle. Ainsi de nouveaux processus cellulaires et moléculaires intervenant au commencement de la tumorigenèse pourront être découverts.
Procédures
Nombre total d'animaux= 808. Tous les animaux de ce projet seront traités avec le même protocole. Pour l'étape d'électroporation, les souriceaux âgés de 1 jour seront anesthésiés, des solutions d'ADN seront injectés dans un ventricule latéral du cerveau grâce un capillaire très fin, puis des électrodes placées de part et d'autre de la tête de l'animal délivreront des chocs électriques. L’ensemble de ces actes ne dure que 30 secondes. Ils seront réveillés progressivement en les ramenant à une température de 37°C et replacés auprès de leur mère. Avant leur mise à mort, les animaux recevront une injection intrapéritonéale d’EdU ou de BrdU, composés qui permettent de suivre la prolifération des cellules, qui ne provoquent aucune douleur et qui ne sont pas délétères à l’animal. Les animaux seront euthanasiés à différents temps après l'électroporation. La mise à mort se fera après injection d'une surdose d'anesthésique.
Impact sur les animaux
Dans la procédure d'électroporation, certaines étapes peuvent potentiellement générer du stress lié à la séparation d’avec leur mère, au refroidissement utilisé pour l’anesthésie et à la douleur modéré de l’électroporation. Cependant avec le recul de plusieurs années d’utilisation et de maitrise des procédures d’électroporation, nous avons pu constater que les souriceaux ne présentent pas de signes de douleur ni d’anxiété au réveil et sont allaités par la mère très rapidement après leur retour dans la cage. Les autres effets indésirables attendus sont le développement de tumeurs qui sera évalué au cours du temps. Comme le but de notre étude est concentré sur les étapes précoces de l’établissement des tumeurs, nous ne souhaitons pas atteindre le stade où les tumeurs deviennent délétères pour l’animal. C’est pourquoi, nous suivrons un lot d’animaux pour déterminer le temps nécessaire à la survenue de tumeurs en analysant par histologie les cerveaux prélevés toutes les deux semaines jusqu'à un maximum de 16 semaines après l'électroporation. L’expérimentation sera arrêtée lorsque les tumeurs atteindront 15% du volume du cerveau. Ce stade de développement des tumeurs est suffisant pour notre étude et n’entraine pas de perte de poids chez l’animal ni de comportement anormal.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin d’analyser le devenir des cellules souches modifiées génétiquement et afin d’ évaluer si et comment des tumeurs se développent.
Remplacement
Le but de notre projet est d’étudier les mécanismes celluaires et moléculaires intervenant dans les phases précoces de développement des GBM dans le contexte écologique de l’avènement des tumeurs en ciblant les cellules souches neurales situées dans le cerveau antérieur et qui sont à l’origine de ces GBM. Malheureusement il n’existe pas de modèles cellulaires capables de récapituler ces niches cellulaires.
Réduction
Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. - Les animaux test et témoin seront issus d’une même portée - des méthodes statistiques adaptées aux petits échantillons seront utilisés pour pouvoir obtenir des données statistiques fiables tout en utilisant un nombre restreint d’animaux par expérience. - Le contrôle des paramètres environnementaux et du statut sanitaire et génétique des animaux limitera la variabilité des résultats expérimentaux. - Des expériences pilotes seront effectuées en début de protocole sur un nombre très réduit d’animaux pour établir la chronologie des évènements conduisant à des GBM et permettront ainsi de réduire ainsi la fenêtre d’étude aux étapes précoces de développement des tumeurs avant que celles-ci ne deviennent délétères.
Raffinement
- L’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé quotidiennement. - Les cages sont enrichies avec des carrés de coton, des cylindres de carton et des dômes de nidification. - Les animaux sont hébergés en groupes sociaux. - Pour limiter l’anxiété lors des procédures expérimentales d’électroporation, les souriceaux sont maintenus au maximum en portée avec leur mère. - Une prémédication d’anti-douleur sera administrée en sous cutanée 30 minutes avant la mise à mort pour éviter toute souffrance ; les animaux seront euthanasiés après avoir reçu une surdose d’anesthésique. Pour limiter les effets trop délétères liés au développement de tumeurs cérébrales, une analyse histologique des cerveaux au cours du temps permettra de déterminer le stade de progression des tumeurs qui soit suffisant pour l'étude mais qui ne provoque pas de perte de poids ni de comportement anormal.
Choix des espèces
De façon générale, la souris est le modèle Mammifère le plus utilisé par la communauté scientifique pour établir des modèles de cancers in vivo permettant l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires des phases précoces de développement de cancer. Un modèle d'induction de GBM similaire au nôtre a déjà été décrit chez la souris et mime différentes caractéristiques cellulaires et moléculaires de la genèse et du développement des glioblastomes. Ce modèle est donc réalisable et pertinent. De plus, grâce à l'adaptation de notre protocole basée uniquement sur l’électroporation, nous pourrons, dans le futur, étudier les étapes d’induction et de développement précoce des GBM dans des contextes génétiques mutants existant uniquement chez la souris. Tous les animaux seront électroporés au stade nouveau-nés car c’est le stade où les cellules souches neurales qui bordent les ventricules latéraux, peuvent être modifiées génétiquement grâce à l’électroporation de plasmides. Des animaux seront euthanasiés à différents temps, à partir d’une semaine jusqu’à un maximum de 16 semaines après l’électroporation pour suivre l’évolution des cellules électroporées.
L’inflammation pour stimuler la régénération rétinienne dans un modèle de dégénérescence spontanée lente chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une dégénérescence rétinienne, elles reçoivent sous anesthésie des injections dans l'œil de molécules inflammatoires et des injections dans l'abdomen, pour tester si l'inflammation réveille les capacités de régénération de la rétine. Le porteur qualifie les atteintes de légères et limitées à la rétine, et compare l'injection intraoculaire à une pratique clinique courante chez l'humain. Il indique valider d'abord ses hypothèses sur des explants de rétine puis affirme le recours à l'animal "nécessaire", l'œil étant un organe complexe.
Objectifs
La rétine est soumise à des pathologies dégénératives dont la plupart restent non traitables jusqu'à ce jour. La stimulation de la capacité de régénération des cellules souches de la rétine des mammifères, qui est naturellement limitée, pourrait constituer une stratégie thérapeutique innovante. Les cellules souches de la rétine, les cellules gliales de Müller, possèdent un potentiel de régénération extraordinaire chez les amphibiens et les téléostéens, mais celui-ci est très limité chez les mammifères. Cependant, elles ne sont pas dépourvues de propriétés régénératives puisque l’on peut les forcer à se reprogrammer et à générer de nouveaux neurones. L'une des différences entre les deux espèces est la réponse inflammatoire aux dommages. Dans le système nerveux central des mammifères (cerveau et rétine), il est considéré que l'inflammation empêche la régénération du tissu. Dans la rétine du poisson, les médiateurs de l’inflammation favorisent la reprogrammation et la prolifération des cellules gliales de Müller après une blessure. En ce sens, il a été montré que les cellules immunes de la rétine (les microglies) favorisent la régénération chez le poisson, bien qu'elles deviennent préjudiciables si l’inflammation se prolonge. Chez les mammifères, l'inflammation favorise la gliose, la fibrose et la cicatrisation, mais pas la régénération. Ceci suggère une interaction microglie-Müller différente selon l’espèce. L’ensemble de ces résultats indiquent que chez la souris, des propriétés régénératives existent mais sont restreintes soit par des mécanismes intrinsèques aux cellules de Müller, soit par leur environnement (par exemple environnement pro- ou anti-inflammatoire défavorable). Dans ce contexte, nous souhaitons chez la souris moduler l’inflammation via l’injection intraoculaire de molécules pro- ou anti-inflammatoires, et étudier les conséquences sur le réveil régénératif des cellules de Müller.
Bénéfices attendus
A ce jour, les différences d'efficacité de régénération observées entre espèces restent inexpliquées. La régénération rétinienne très efficace des espèces telle que les poissons nécessite une régulation fine de l'inflammation. Notre projet vise à reproduire des conditions inflammatoires favorisant la régénération chez la souris. Notre ambition est de réussir à débloquer les propriétés régénératives latentes des cellules souches de la rétine en modulant l'inflammation. Si le projet abouti, cela ouvrirait la voie vers le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour soigner les patients atteints de dégénérescence rétinienne.
Procédures
Les animaux du présent projet seront soumis à quatre actes expérimentaux : (i) Anesthésie : une fois pendant la procédure juste avant l'injection intraoculaire afin d'éviter la douleur qui aurait été générée par l'injection. La durée de l'anesthésie est d'environ 20 minutes. (ii) Injection intraoculaire : une fois pendant la procédure. L'injection s'effectue rapidement en cinq minutes maximum en comptant le temps nécessaire à placer correctement l'animal anesthésié pour réaliser l'injection. (iii) Injection intrapéritonéale : selon l'expérience, chaque animal recevra selon la procédure entre une et quatre injections intrapéritonéales d’un analogue de nucléotide permettant de révéler la prolifération cellulaire. (iv) Alimentation formulée : de 15 à 18 jours.
Impact sur les animaux
Les conséquences sur les animaux des procédures utilisées dans nos expériences sont restreintes à la rétine. Le modèle de souris que nous utilisons présente une dégénérescence rétinienne lente non préjudiciable pour l’animal (Annexe I). Les différentes procédures ont un niveau de sévérité de classe légère (i.e. « entraînant une douleur, une souffrance ou une angoisse légère de courte durée sans incidence significative sur le bien-être ou l'état général des animaux »), et sont couramment utilisées dans le domaine de la recherche ophtalmologique. La technique d’injection intraoculaire est utilisée couramment en clinique chez l’homme dans le cadre du traitement de la dégénérescence maculaire liée à l’âge et n’a pas de conséquence néfaste.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront gardés en vie (4h, 24h, 48h, 72h) selon l'expérience puis euthanasiés pour réaliser des expériences d'analyses phénotypiques.
Remplacement
Préalablement aux expériences in vivo nous validerons nos hypothèses grâce à la technique de culture d’explants rétiniens issus de souris euthanasiées n’ayant subi aucune procédure préalable. Les explants rétiniens cultivés ex vivo dégénèrent progressivement. Ils sont un excellent modèle pour tester l’effet de molécules anti- ou pro-inflammatoires, ou à potentiel régénératif. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que l’œil est un organe complexe composés de différents tissus en communication permanente les uns avec les autres ainsi qu’avec la circulation sanguine systémique et le cerveau via le nerf optique. Ces interactions sont cruciales pour l’obtention d’un signal visuel correct et participent à tous les processus cellulaires y compris la réparation et la régénération. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales sans utilisation d'animaux vivants n’apportent pas la même pertinence d'information.
Réduction
Nous avons estimé à 12 souris le nombre minimum d’animaux par groupe. Ce nombre correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des effets biologiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides et prenant en compte les aléas techniques. A noter également que dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses en même temps, de sorte que les deux rétines de chaque individu seront utilisées.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Nous aurons recours aux procédures anesthésiques appropriées. Les points limites de nos expériences sont déterminés grâce au suivi de l’état des yeux suite à l’injection, et en fonction de la santé générale des animaux ayant subi des manipulations de leur vivant. Les doses d’agents inflammatoires injectés seront réajustées à la suite de la survenue de manifestations extérieures de mal-être. Nous nous baserons sur les doses définies précédemment dans la littérature. Chacune des injections intraoculaires sera effectuée sous anesthésie afin de limiter la douleur et le stress des animaux.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines y compris dans le domaine de l'ophtalmologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins présentant de manière spontanée une dégénérescence rétinienne mimant les pathologies humaines. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Le modèle de souris que nous avons choisi développe spontanément et progressivement une dégénérescence des photorécepteurs. Nos expériences visent à tester la capacité de l’inflammation à réveiller les propriétés régénératives des cellules gliales de Müller dans différents contextes dégénératifs. Pour déterminer le stade auquel nos expériences seront réalisées, il nous faut prendre en compte les contraintes liées au développement de la rétine et du système immunitaire chez la souris, ainsi que les contraintes techniques. Des souris de six semaines ayant une rétine totalement mature seront utilisées pour les expériences nécessitant l'utilisation d'une alimentation contenant une molécule qui inhibe les cellules immunitaires rétiniennes. Il faut un minimum d'une dizaine de jours d’alimentation pour obtenir une inhibition suffisante. Les injections intraoculaires d'agents pro- inflammatoires seront donc réalisées à 8 semaines.
Effet d’un traitement en période pré/périnatale ciblant les anomalies cérébrales dans un modèle murin de la trisomie 21
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quarante femelles gestantes reçoivent des injections sous-cutanées d'une molécule pendant la gestation et après la naissance, et leurs 420 souriceaux subissent des tests respiratoires, un enregistrement de vocalisations après séparation maternelle et un test de préférence pour l'odeur maternelle, avant que tous soient tués pour prélever les cerveaux. Le porteur décrit ces tests sur les nouveau-nés comme non invasifs et peu stressants. Il affirme qu'un "organisme entier et vivant" est nécessaire, la complexité d'un organisme ne pouvant être créée artificiellement.
Objectifs
La trisomie 21 est le syndrome génétique le plus fréquent dans la population générale. En raison des différentes politiques de dépistage et d’interruption médicale de grossesse, cette maladie concerne 1 naissance sur 700 à 1 naissance sur 2000 dans les pays industrialisés. Le projet s’inscrit dans une étude visant à développer une nouvelle approche thérapeutique visant à corriger les désordres neurologiques impliqués dans la trisomie 21. Agir sur le nombre de neurones pourrait permettre de diminuer le risque de déficience intellectuelle dans cette pathologie et de changer son pronostic. Pour cela, le but est de trouver un traitement pour protéger le cerveau lorsque les parents décident de poursuivre la grossesse. Notre étude s’intéresse à une molécule d’origine embryonnaire qui possède des propriétés neuroprotectrices et qui diminue la mort des neurones. Il pourrait donc protéger contre de tels désordres neuro-développementaux. Nous proposons de tester cette molécule par injection sous-cutanée à la mère durant la gestation et après la naissance (période prénatale et périnatale) et d’étudier ses effets sur le cerveau des souris. L’objectif de ce travail est donc de tester l’effet de cette molécule sur le nombre de neurones et les capacités comportementales des souris présentant des caractéristiques de la trisomie 21. Des tests comportementaux seront réalisés dans les 8 premiers jours de vie des souriceaux et des analyses seront réalisées sur les cerveaux afin de déterminer si le traitement est protecteur vis-à-vis des désordres neurodéveloppementaux de la trisomie 21. De plus, dans un but de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous souhaitons utiliser les souriceaux de ce projet pour réaliser des tests respiratoires car une forte comorbidité avec le syndrome d’apnée obstructive du sommeil est observée dans la pathologie. 40 femelles seront nécessaires pour le traitement qui sera administré durant la gestation et jusqu’à 11 jours après la naissance. Quatre groupes de souriceaux seront constitués : des témoins traités et non traités et des trisomiques traités et non traités, pour un total de 420 souriceaux. Les différentes expérimentations pourront être effectuées sur les mêmes groupes de souriceaux dans la mesure où celles-ci se révèlent non invasives, non douloureuses et avec un stress minimal pour l’animal.
Bénéfices attendus
Cette pathologie, associée à une déficience intellectuelle, à des troubles de comportement et du langage, impacte l’autonomie des personnes porteuses de ce syndrome. Ce projet permettrait de continuer à explorer les mécanismes conduisant à des anomalies cérébrales dans la trisomie 21 et d’ainsi pouvoir proposer des traitements plus spécifiques. Il permettrait également d’identifier si la molécule a un effet protecteur sur le développement du cerveau dans le but de diminuer la déficience intellectuelle lorsque les parents décident de poursuivre la grossesse suite à un diagnostic prénatal de trisomie 21. Les tests respiratoires permettront d’investiguer sur les capacités respiratoires des souriceaux et de déterminer s’ils présentent un risque précoce d’obstruction comme cela a déjà été montré dans ce modèle chez des souris adultes.
Procédures
40 femelles recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ou de la molécule. Ce geste sera réalisé sur l’animal vigile, à partir du 14ème jour de gestation, jusqu’à 11 jours après la naissance des souriceaux. Les 420 souriceaux issus des femelles gestantes seront utilisés pour : - Un test respiratoire dans les 12 heures suivant la naissance. Les souriceaux sont placés dans une boite étanche thermostatée pendant 15 minutes afin de mesurer des paramètres respiratoires. - L’enregistrement des vocalisations ultrasoniques le 7ème jour après la naissance pour étudier la communication vocale et les interactions sociales. Les souriceaux sont placés seuls dans une enceinte thermostatée et les ultrasons émis en réponse à la séparation maternelle sont enregistrés pendant 3 minutes. - Un test de préférence maternelle le 8ème jour pour étudier les capacités des souriceaux à identifier l’odeur maternelle, la mémoire et la préférence de cette odeur. Les souriceaux sont placés seuls dans une arène proposant 3 zones avec des odeurs différentes dont l’odeur maternelle. Le temps passé dans ces 3 zones est mesuré pendant 3 minutes.
Impact sur les animaux
Les administrations aux femelles gestantes de la molécule seront effectuées sur l'animal vigile et effectuée selon les bonnes pratiques vétérinaires et n'induisent pas de douleur à l'animal autre que la piqûre de l'aiguille. Les tests qui seront réalisés chez les souriceaux sont faits de façon non-invasive. Ils durent au maximum 15 minutes et induisent peu de stress et aucune douleur à l’animal.
Devenir
Tous les animaux utilisés seront euthanasiés afin de prélever les cerveaux pour effectuer des analyses sur le nombre de neurones et la mort neuronale. Parallèlement à cette étude au niveau neurologique qui nous permettra de montrer l’efficacité du traitement, nous analyserons des marqueurs de la fonction hépatique et de la fonction rénale sur de biopsies de tous les animaux, y compris les femelles traitées, afin de confirmer la sécurité du traitement.
Remplacement
Pour atteindre les objectifs du projet basé sur un traitement, un organisme entier et vivant est nécessaire, n’ayant pas la possibilité de créer artificiellement la complexité d’un organisme avec tous les différents types cellulaires. De plus, la réalisation de tests comportementaux et l’étude des fonctions respiratoires n’est possible que sur un animal vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé après avoir établi l’ensemble des procédures expérimentales à l’aide d’un test de puissance statistique en se basant sur la variabilité entre animaux et le résultat des valeurs. De plus, l’exploration des fonctions respiratoires réalisée en même temps que ce projet permet de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Afin de garantir le bien-être des animaux, le milieu sera amélioré par l’ajout d’un nid végétal et d’un rouleau en carton. Pour les femelles gestantes et avec leurs petits, de l’enrichissement supplémentaire sera apporté : une cabane ainsi que du gel enrichi en nutriments. Les approches expérimentales seront accompagnées d’une surveillance journalière afin de vérifier tout comportement anormal traduisant une souffrance, comme des signes de prostration, d’agressivité, d’apparence physique. Le poids des femelles gestantes sera relevé tous les jours lors de l’administration du traitement. Une absence de prise de poids sera particulièrement surveillée afin de déterminer s’il s’agit d’une dégradation de l’état de santé de l’animal et/ou d’une interruption de la gestation afin de retirer l’animal de l’étude. Les injections seront stoppées en cas d'interruption de la gestation ou l'animal sera euthanasié si son état de santé est dégradé. Les injections journalières seront réalisées par administration sous-cutanée selon les bonnes pratiques vétérinaires. Lors de la manipulation des souriceaux, les mains de l’expérimentateur seront systématiquement frottées avec de la litière de la cage afin de favoriser des odeurs familières moins stressantes pour les petits et la mère. Un changement de gants aura lieu entre chaque cage de femelles gestantes. La technologie utilisée pour réaliser les tests des fonctions respiratoires et comportementaux chez les souriceaux est conçue de façon non invasive, dans des enceintes thermostatées, d’une durée n’excédant pas 15 minutes afin de réduire au maximum le stress des animaux tout en permettant les mesures.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris dans ce projet nous permet de pouvoir réaliser des tests comportementaux et respiratoires sur un modèle de souris établi comme modèle de la trisomie 21. Les injections du traitement seront réalisées sur des femelles adultes à partir du 14ème jour de gestation jusqu’à 11 jours après la naissance des souriceaux afin de réaliser le traitement durant la gestation et après la naissance. Les tests comportementaux et des fonctions respiratoires seront réalisés sur des souriceaux jusqu’à 11 jours après la naissance afin d’étudier précocement l’effet du traitement sur les désordres neurodéveloppementaux. Ceci permettrait également à l’étude d’évaluer le potentiel thérapeutique transposable à l’Homme dans le cas d’une administration chez la femme pendant la grossesse pour corriger très précocement la déficience intellectuelle associée à la trisomie 21.
Étude des effets anxiolytique/sédatif et anticonvulsivant d’un dérivé de la coronaridine : la catharanthine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
110 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Chaque animal reçoit par injection un dérivé végétal, la catharanthine, seul ou associé à un agent convulsivant, le pentylènetétrazole, puis passe des tests comportementaux de locomotion et de labyrinthe, pour évaluer des effets anxiolytiques et anticonvulsivants. Les souris ayant subi les convulsions chimiques sont tuées aussitôt le test terminé, les autres après une réutilisation dans un second test. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternatives" non animales et que le système nerveux central ne s'étudie que in vivo.
Objectifs
Nous cherchons à évaluer les effets anxiolytique et anticonvulsivant de la catharanthine chez la souris. Les benzodiazépines qui sont communément utilisées dans le traitement de l'anxiété peuvent être responsables de nombreux effets indésirables aux conséquences parfois graves. En effet, le rapport en termes d’efficacité/tolérance reste peu satisfaisant. De plus, ils exposent à long terme à un risque de tolérance pharmacologique et un risque de dépendance psychique et physique et de syndrome de sevrage. Ils peuvent induire des troubles de la vigilance et l’altération des fonctions cognitives. Pour tenter de nous s’affranchir de l’ensemble de ces inconvénients associés aux thérapeutiques dont nous disposons actuellement, nous souhaitons étudier les effets de la catharanthine sur l’anxiété chez la souris. Plusieurs travaux suggèrent l'implication des transmissions cholinergiques nicotiniques dans la modulation de l’anxiété. La catharanthine agit justement sur des récepteurs de l’acétylcholine (α3ß4). Le deuxième volet de nos travaux concerne les troubles convulsifs épileptiques. L'épilepsie est un trouble neurologique chronique caractérisé par des crises récurrentes spontanées délétères pour les patients atteints. Elle touche environ 1 % des personnes. La pratique clinique de l'épilepsie reste largement empirique. Bien que la dernière génération des agents pharmacologiques se soit révélée efficace, au moins un tiers des personnes épileptiques restent réfractaires à la thérapie médicale, pour lesquelles l'arsenal thérapeutique est actuellement sévèrement lacunaire. Il a été montré que la diminution des niveaux de GABA était associée à l’apparition des troubles épileptiques. La catharanthine possède également une activité sur les récepteurs GABA A. Les récepteurs GABA A possèdent plusieurs sous-unités qui représentent des cibles moléculaires potentiellement utiles pour une activité anticonvulsivant. Nous cherchons à évaluer si une ou plusieurs de ces sous-unités pourraient être impliquées dans la modulation des troubles épileptiques sous l’effet de la catharanthine. Une attention particulière sera portée au bien-être animal qui passe par des conditions d'hébergement adéquates, un suivi quotidien des animaux, des méthodes utilisées visant à réduire le plus possible toute forme de douleur, souffrance ou stress de l’animal ainsi que l'instauration de points limites pertinents et précoces.
Bénéfices attendus
Les moyens thérapeutiques dans le traitement de l'anxiété dont on dispose présentent des effets indésirables notables, comme l'addiction qui peut s'installer même à des doses thérapeutiques. De plus, ils peuvent induire des altérations des fonctions cognitives comme la mémoire, les performances psychomotrices ainsi que des troubles de la vigilance ce qui limite leur utilisation pour les patients utilisant des engins dangereux et lors de la conduite. L'exploration de nouvelles approches thérapeutiques, comme celles impliquant les récepteurs de l'acétylcholine ou du GABA, pourrait nous permettre une meilleure compréhension de la physiopathologie des états anxieux et épileptiques. Par ailleurs, l’épilepsie est la troisième maladie neurologique la plus fréquente, derrière la migraine et les démences. Elle touche environ 60 000 000 de personnes dans le monde, et environ 600 000 personnes en France, dont près de la moitié sont âgées de moins de 20 ans. Le fonctionnement physiologique du cerveau est basé sur l'interaction réciproque entre différents neurones. Dans les états épileptiques, des réseaux neuronaux distribués à travers le cerveau perturbent l’ensemble de l’activité jusqu’à interrompre, de façon transitoire, le comportement. De nouvelles approches basées sur des investigations détaillées et exhaustives des mécanismes à l'origine des troubles convulsifs sont indispensables pour développer de meilleures options thérapeutiques, qui restent à l’heure actuelle insatisfaisantes pour près d'un tiers des patients. Ces travaux ne font pas l’objet d’un dépôt de brevet, s’ils sont acceptés pour publication dans un journal à comité de lecture, ils seront accessibles à l’ensemble des chercheurs dans ce domaine.
Procédures
Les animaux recevront soit le solvant (une seule injection) , utilisé pour mettre en solution la catharanthine: (DMSO 1% + tween 1% et d’une solution salée à 0,9%)], soit la catharanthine (une seule injection) soit la catharanthine associée au Pentylènetétrazole (2 injections, d'abord la catharanthine suivie du Pentylènetétrazole, 10 minutes après) soit le diazépam seul soit associé au Pentylènetétrazole (2 injections: d'abord le diazépam suivi du Pentylènetétrazole, 10 minutes après). Les animaux seront soumis à des observations pour analyser leurs réponses comportementales. Les injections se feront par voie intrapéritonéale à l'aide de seringue type TERUMO de 1 ml en utilisant des aiguilles fines (aiguille 26G - 0,45 x 13 mm ). Compte tenu du poids moyen (30 grammes) des souris qui seront étudiées, le volume injecté sera de 0,3 ml. Deux tests comportementaux seront réalisés, l'un durera 60 minutes (mesure de l'activité locomotrice) et l'autre durera 5 minutes (le labyrinthe en "O" ). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les animaux, on peut citer celui des injections. On va utiliser des aiguilles les plus fines possibles pour réduire le stress causé par l'introduction d'une aiguille. L’isolement des souris juste avant l'expérimentation pourrait induire du stress, qui au fil du temps s’atténue lorsque l’animal aura exploré le milieu environnant. Cet isolement juste avant l'expérimentation a pour but d'atténuer le stress engendré par la rupture "sociale" des animaux. Cette étape est nécessaire avant la réalisation des tests de comportement, car ce stress, qui apparaît dès les premières secondes et minutes, pourrait interférer avec les effets anxiolytiques recherchés. L'administration du PTZ supprime les fonctions des synapses inhibitrices, ce qui entraîne une augmentation de l'activité neuronale. Cette régulation provoque des crises qui miment une pathologie proche de celle de l'épilepsie chez l’homme. Ce sont bien ces effets que nous cherchons à mettre en évidence et à quantifier afin d'évaluer l'efficacité de l'application de la catharanthine à prévenir ces effets. Les animaux seront placés dans un récipient transparent en plexiglas (diamètre du cylindre = 30 cm), ouverts sur le dessus pour une bonne aération. Le comportement des animaux va ensuite être observé pendant 30 minutes. Nous allons noter le début, l'intensité et le type de phase des crises selon le système de notation suivant: score 0: pas de crises comportementales; score 1: secousses myocloniques (de courtes secousses corporelles involontaires) ; score 2: queue rigide (un maintien rigide de la queue verticalement à la surface) ; score 3: clonus (flexion du membre antérieur avec ou sans perte du réflexe de station debout) ; score 4: extension tonique (contraction tonique des membres postérieurs s'étendant vers l'arrière et parallèlement à la surface) ; et score 5: convulsions généralisées. Dans la littérature, ces effets apparaissent de façon épisodique et sont brefs. Au cours de l'expérimentation, les animaux présentant d'emblée des convulsions généralisées qui durent plus de 4 minutes seront immédiatement exclus de l'expérimentation et mis à mort aussitôt par dislocation cervicale après pré-anesthésie par inhalation d’isoflurane (3% débit de gaz frais 0.8L/min) pour abréger leurs douleurs et souffrances. À l'issue des 30 minutes de l'expérimentation utilisant le PTZ, tous les animaux subiront une mise à mort.
Devenir
Les animaux ayant subi le test de mesure de l'activité locomotrice seront réutilisés dans le test de labyrinthe en "O" après une période de « washout » de 48 heures. À l'issue de ces expérimentations, il sera procédé à la mise à mort de ces animaux. Les animaux ayant subi le test de convulsions chimiques, il sera procédé immédiatement à la fin de l'expérimentation à la mise à mort de ces animaux selon les méthodes autorisées par la législation.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternatives non animales disponibles dans le cadre de notre projet. Les données issues des travaux cliniques et des investigations fondamentales dont nous disposons actuellement reposent, pour la plupart, sur l’expérimentation animale. Les études du système nerveux central chez l’homme, mettant en jeu plusieurs interactions neuronales, étant relativement complexes et difficiles, ne peuvent s’étudier que dans les conditions in vivo chez l’animal entier. Les procédures expérimentales prévues dans ce projet, portant sur des tests d’évaluations de l'anxiété et utilisant des molécules potentiellement convulsivantes, ne peuvent être réalisées que sur l’animal vivant et ne sont pas remplaçables par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. De plus, les mécanismes épileptogènes et de la génération de crises chez les patients épileptiques ne peuvent pas être entièrement clarifiés dans les études cliniques. Par conséquent, un modèle animal approprié est nécessaire pour l'étude du comportement d’anxiété et de l'épilepsie.
Réduction
Par nos expériences passées sur des modèles animaux similaires, il est estimé qu’un groupe de 10 animaux est suffisant pour des études statistiques dans le cadre d’une analyse statistique utilisant un test non paramétrique (test de Wilcoxon ). L'analyse des résultats sera effectuée en utilisant l'analyse de la variance (ANOVA) qui utiliser les moyennes observées sur les échantillons pour conclure à des différences significatives sur les moyennes. Par ailleurs, pour réduire au maximum le nombre des animaux, nous allons utiliser les mêmes animaux dans deux tests différents (mesure de l'activité motrice et le Labyrinthe en "O" en laissant, entre les deux tests, une période de « Wash out » de 48 heures afin d’enregistrer des résultats cohérents. Par ailleurs, des travaux montrent que ni le DMSO ni le Tween n’ont d’effets comportementaux aux taux qui seront utilisés dans notre projet. Une solution contenant ces solvants sera utilisée dans le groupe témoin.
Raffinement
Il sera procédé à une observation étroite des animaux: les animaux seront logés dans des cages de taille réglementaire avec un environnement maîtrisé. Ils bénéficieront d’un environnement enrichi au cours de leur hébergement. L'enrichissement du milieu par des objets simples (exemple un cylindre en carton) permet d'augmenter la complexité d'un environnement captif et améliore le bien-être des animaux en stimulant l'activité et en réduisant les comportements stéréotypés ou anormaux. La surveillance des animaux se fera par le suivi de l'état général des animaux (prise de nourriture, boisson, comportement général) et de leur poids. Lors de l'expérimentation des convulsions induites chimiquement, une surveillance particulièrement minutieuse sera observée. Les animaux présentant d’emblée des convulsions généralisées qui persistent pendant plus 4 minutes devront déclencher le retrait de l'animal concerné de l’expérimentation. Si la douleur ou la souffrance subie par cet animal dépasse le seuil fixé par avance (points limites lors de l'observation des animaux), la mise à mort des animaux sera effectuée immédiatement pour arrêter le plus tôt possible la douleur, la souffrance et l’angoisse de l'animal concerné, sachant que l’ensemble des animaux de cette expérimentation subiront une mise à mort à l’issue des 30 minutes que dure l'expérimentation.
Choix des espèces
Le choix des souris albinos SWISS (SN-SWISS-M) s'est fait sur la base des données de la littérature. Ce sont des souris polyvalentes utilisées dans tous les domaines de la recherche biomédicale. Les procédures envisagées dans ce projet ont déjà été validées chez la souris albinos SWISS. Par ailleurs, elles sont moins sujettes au stress et donc plus susceptibles d’avoir des comportements et traits physiologiques normaux. Il existe une vulnérabilité au penthylènetétrazole en fonction de l'âge des animaux. Comparativement aux souris plus jeunes, les souris plus âgées sont moins vulnérables au PTZ. Nous avons opté pour les sujets au stade adulte pesant en moyenne 30 grammes.
Identification de facteurs de vulnérabilité à l’addiction, et de facteurs de variabilité à la rechute et aux traitements substitutifs chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 344 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un cathéter dans la veine jugulaire par chirurgie sous anesthésie, puis s'auto-administre de l'héroïne pendant vingt jours en cage opérante, jusqu'à six heures par jour, pour identifier des facteurs de vulnérabilité à l'addiction et à la rechute. Les rats sont ensuite mis à mort pour prélever le sang et le cerveau. Le porteur affirme que les méthodes alternatives sont "impossibles" et présente le rat comme un "modèle de référence" dans le domaine des addictions.
Objectifs
Notre étude se focalise sur l'identification: 1) Des facteurs biologiques de vulnérabilité à développer une addiction à l’héroïne. Pour cela nous identifierons des marqueurs sanguins reflétant des modifications cérébrales, qui pourraient ultérieurement être utilisés comme outils de diagnostic et de pronostic dans les études cliniques; 2) Des facteurs de vulnérabilité à la rechute et des facteurs de variabilité à la réponse thérapeutique afin de pronostiquer l’efficacité des traitements de substitution aux opioïdes. Pour cela nous identifierons des marqueurs sanguins, reflétant des modifications cérébrales, qui pourront là aussi être utilisés comme outils de diagnostic et de pronostic dans les études cliniques. De plus, parallélement à l’identification de facteurs de variabilité et vulnérabilité, grâce à des études morphologiques et de transcriptomique sur les cerveaux des animaux, nous pourrons identifier de nouvelles voies de signalisation cellulaire jouant un rôle critique dans les différentes étapes du processus d’addiction (mise en place du comportement, et rechutes), offrant la possibilité de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques. L’ensemble de projet permettra donc d’affiner la prise en charge des personnes dépendantes aux opioïdes, d’assurer un meilleur suivi en abordant la problématique des rechutes qui sont malheureusement très fréquentes en clinique humaine, et d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamentale a plusieurs bénéfices attendus sur la base de nos objectifs qui sont : L’identification des facteurs biologiques de vulnérabilité à développer une addiction à l’héroïne; L’identification des facteurs de vulnérabilité à la rechute et des facteurs de variabilité à la réponse thérapeutique afin de pronostiquer l’efficacité des traitements de substitution aux opioïdes; l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Ce rojet nous permettra, grâce à l’identification de marqueurs sanguins reflétant ce qui peut être observé au niveau central, d’affiner la prise en charge des personnes dépendantes aux opioïdes. Ce projet permettra également d’assurer un meilleur suivi de l’efficacité des traitements de substitution, en étudiant la problématique des rechutes, qui sont malheureusement très fréquentes en clinique humaine. Et enfin, l’ensemble des résultats qui seront obtenus au niveau central, permettra d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la prise en charge des patients dépendants aux opioïdes.
Procédures
Tous les animaux du protocole (N= 1344) seront soumis à une anesthésie générale, pour poser un cathéter dans la veine jugulaire. durant cette anesthésie, 0,6 ml de sang seront prélevés via le cathéter pour éviter la souffrance à l'animal. Cette chirurgie dure environ 45 min. Tous les animaux ayant reçu le cathéter (N=1344), seront soumis au protocole d'auto-administration d'héroïne pendant 20 jours. Pour cela, tous les jours, les animaux sont placés en cage opérante pendant 1heure pour la moitié des rats, ou pendant 6 heures, pour l'autre moitié. Le nombre d'injections d'héroïne, directement par le cathéter, est variable en fonction des animaux. En effet l'injection suit l'appui sur un levier qui est une action que le rat exerce librement dans la cage opérante. Immédiatement après les jours d'auto-administration, 1260 rats seront soumis à une nouvelle anesthésie générale pour la pose en sous-cutanée d’une pompe permettant la libération prolongée d’un traitement pharmacologique. Lors de cette nouvelle anesthésie générale, 0,6 ml de sang seront prélevés via le cathéter. Cette chirurgie dure entre 5 et 10 min.
Impact sur les animaux
Les procédures qui seront réalisées le sont déjà dans des projets antérieurs. La pose du cathéter endovasculaire et des pompes osmotiques sera réalisée sous anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur pré-et post-opératoire. Le protocole d’auto-administration d’héroïne pendant 20 jours peut entrainer une prise de poids un peu moins forte des animaux au cours de l’expérience, mais avec des différences qui restent inférieures à 10% par rapport aux contrôles (sauf atteinte d’un point limite). Dès l’arrêt du protocole d’auto-administration, les animaux reprennent une courbe de prise de poids tout à fait identique à celle des rats contrôles. A la fin des 20 jours d’auto-administration, les animaux recevront une pompe osmotique, permettant le mise en place d’un traitement de substitution. Ce traitement permet d’éviter les symptômes de sevrage. Chez les animaux contrôles ces symptômes pourront être observés (mobilité réduite, diminution des toilettages, courbe de reprise de poids un peu plus lente que chez les rats sous substitution). Au bout de 48 - 72 heures ces symptômes disparaissent spontanément.
Devenir
Induction d'une anesthésie profonde, puis mise à mort, pour récupération d'échantillons sanguins et récupération des cerveaux post-mortem. Ces échantillons sont indispensables pour identifier des marqueurs sanguins de vulnérabilité et de variabilité comme décrit dans nos objectifs, et pour les études morphologiques et transcriptomiques des cerveaux qui seront réalisées à la suite.
Remplacement
Ce projet ayant pour but d’étudier des phénomènes psychiatriques associés à des modifications comportementales d’auto-administration de drogue, les méthodes alternatives actuelles (e.g., modélisation, études in vitro) sont impossibles. Ce projet a pour but d’étudier des modifications cérébrales complexes et des modifications comportementales qui s’inscrivent dans le cadre d’une étude intégrée. L'objectif est également de rechercher des biomarqueurs périphériques prédictifs de la réponse aux traitements de substitution, et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourraient être pertinentes dans la prise en charge des patients dépendants aux opioïdes. Il doit donc être réalisé sur des animaux vivants.
Réduction
Pour réduire au miminum le nombre de rats utilisés, nous avons estimé la taille de échantillons permettant une analyse statistique efficace grâce aux données obtenues lors de projets précédents. Chaque groupe sera constitué de 14 animaux pour révéler des différences inter-individuelles comportementales.
Raffinement
L’hébergement s’effectuera dans un environnement enrichi (nids végétaux et un tunnel opaque où ils pourront s’isoler). Les rats seront également logés à deux par cage d’habitation permettant un enrichissement social tout en assurant un espace d’hébergement suffisant. Pour réduire au maximum l’angoisse des animaux ils seront habitués à l’expérimentateur par une manipulation quotidienne de 7 jours avant la chirurgie. La chirurgie endovasculaire et l’implantation des pompes osmotiques seront réalisées par une personne compétente ayant suivie la formation réglementaire de chirurgie. Pour éviter la souffrance, les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale Les études expériences comportementales commenceront après récupération totale des animaux, au moins 7 jours après la chirurgie endovasculaire.
Choix des espèces
L’investigation d’une pathologie telle que l’addiction nécessite d’étudier une espèce animale phylogénétiquement voisine de l’homme pour pouvoir reproduire la maladie. Le rat est un modèle de référence dans le domaine des addictions. Il possède une organisation anatomique et structurelle du cerveau comparable à celle de l’Homme. De plus, il est idéal pour les études comportementales. Le rat est capable d’apprendre des tâches complexes et peut réaliser des comportements élaborés. Enfin, le rat présente un certain nombre de similitudes de séquences génétiques et de régulations géniques avec l’Homme, ce qui en fait un modèle très intéressant lors de l’étude des régulateurs génétiques. Les animaux testés seront de jeunes adultes. Ils arriveront au laboratoire à l’âge de 7 semaines environ et ne sont pas testés avant leur 8ème semaine, ce qui correspond à une phase où ils sont sexuellement mâtures. Il est important que nous réalisions ces expériences chez l’animal adulte pour pouvoir éviter le facteur confondant de l’âge sur les facteurs comportementaux mesurées. En effet, l’âge peut influencer de manière significative l’état émotionnel et le comportement de l’animal, un animal vieux pourra ainsi présenter un déclin cognitif ou une diminution de l’exploration par exemple. De même un rat adolescent pourra présenter un comportement différent de l’adulte (exploration plus importante, une prise de risque et une recherche de la nouveauté plus importantes).
Vieillissement cardio-cérébral chez le marmouset: analyses intégrant la protéomique et l’imagerie non invasive
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
58 ouistitis vont être utilisés, puis réutilisés dans d'autres protocoles, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chaque primate subit une fois par an des séances d'imagerie cérébrale et cardiaque sous anesthésie et un prélèvement sanguin, pour étudier le vieillissement cardio-cérébral. Le porteur présente ces interventions comme non invasives et indique que les animaux peuvent être inclus dans plusieurs protocoles au cours de leur vie. Il justifie le recours au primate par la possibilité d'études longitudinales sur un même individu et par le "besoin" d'un organisme vivant intègre.
Objectifs
Le vieillissement est un processus multifactoriel caractérisé par des modifications physiologiques à l’origine d’un déclin fonctionnel progressif, qui peut être à l’origine de plusieurs maladies chroniques, notamment cardiovasculaires et neurodégénératives. Ces maladies altèrent la qualité de vie et en limitent la durée. L’étude des processus de vieillissement est largement réalisée sur des espèces animales non primates, mais des différences fondamentales dans le processus de vieillissement entre les non-primates et les humains ont entravé la transposition directe des résultats à l'homme. Le marmouset (ouistiti commun, Callithrix jacchus), petit primate non humain (~350 g) à la durée de vie plus courte (~10 ans), a été proposé comme un modèle de vieillissement. Ce singe partage avec l'homme des traits génétiques, physiologiques et comportementaux similaires. Il présente un déclin de la fonction cardiaque, les caractéristiques des maladies neurodégénératives et de la neuroinflammation dans le cerveau, ainsi que des altérations cognitives. Le marmouset constitue un modèle adapté aux études sur le vieillissement: durée de vie compatible avec des analyses longitudinales, accès à un nombre raisonnable d’animaux élevés dans les mêmes conditions environnementales et alimentaires. Notre projet est destiné à intégrer les résultats issus de deux approches chez le marmouset: (1) identifier les signatures protéomiques plasmatiques liées à l'âge et au sexe (2) caractériser les phénotypes cardiaques et cérébraux (phénome cardio-cérébral) liés à l'âge chez les marmousets des deux sexes, afin de déterminer la relation entre le protéome circulant et le phénome cardio-cérébral en fonction de l'âge et du sexe. Etant donné que le concept de différences entre les sexes domine dans les processus de vieillissement chez les humains, il est essential de prendre en considération les mécanismes qui régissent les différences entre le sexe et l'âge pour, à terme, détecter, prévenir, ralentir ou même inverser les phénotypes associés à l'âge. L'IRM multimodale sera utilisée pour évaluer les fonctions ventriculaires cardiaques, mesurer les flux sanguins cérébraux et la perfusion cérébrale. Nous déterminerons la contribution des changements liés à l'âge et au sexe dans les phénotypes cardio-cérébraux, d’une part en comparant différents groupes de singes (vieux vs jeunes; mâles vs femelles), d’autre part en réalisant un suivi longitudinal individuel.
Bénéfices attendus
Des simulations numériques seront développées à partir des données expérimentales anatomiques et physiologiques que nous aurons recueillies chez le marmouset. Les modèles numériques marmouset seront comparés et corrélés au modèle homme que nous avons obtenu dans le cadre d’un autre projet, afin de valider : 1. les hypothèses que nous proposons sur le rôle du système cranio-spinal dans le vieillissement cérébral, 2. la transversalité effective de ce modèle animal à l’homme. Le couplage d’approches in vivo dans le respect de l’éthique animale et d’approches in silico va permettre d’évaluer les compatibilités homme/animal et d’améliorer notre connaissance des mécanismes de maladies neurodégénératives en particulier. De plus les données de l’analyse protéomique du plasma, les images issues des différentes modalités d’imagerie IRM, obtenues à partir d’une large gamme d’âges et pour les deux sexes, chez les marmousets, représentent un vivier considérable d’informations. De plus, les données biochimiques du plasma pourront être utilisées pour différents domaines de la recherche, non limités au système cardio-vasculaire et au cérébral. Les modèles développés seront disponibles en open source pour garantir une diffusion large au sein des communautés scientifiques et médicales. Cette démarche devrait permettre de réduire le nombre d’expérimentations chez l’animal, et potentiellement d’améliorer, voire développer des protocoles cliniques testables in silico en première approche.
Procédures
Les marmousets seront soumis à deux types d’intervention, 1 fois par an: -imagerie IRM sous anesthésie: une imagerie multimodale cérébrale (IRM 3T) d’une durée de 1,5h et une imagerie multimodale cardiaque (IRM7T) d’une durée de 1,5h (procédure 1) -prélèvement sanguin sous anesthésie (veine fémorale) qui nécessite 5 à 10mn (procédure 2) Les prélèvements sanguins seront réalisés autant que faire se peut lors de l’anesthésie des animaux pour une séance d’imagerie.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales mises en oeuvre (imagerie IRM et prélèvement sanguin sous anesthésie), 2 fois/an ne génèrent pas de douleur et ne causent pas de dommage à l’animal. Les marmousets seront imagés dans la mesure où ils seront aptes à entreprendre le voyage prévu et la séance d’imagerie. Leur état de santé est contrôlé : avec courbe de poids, suivi de comportement de base, surveillance des interactions entre les animaux et de leur état physique par le personnel zootechnique Animalliance en charge de l’animalerie. Les animaux vigiles ne sont jamais soumis à l'isolement et la privation hydrique est limitée au jeûne imposé avant l'anesthésie. Pendant les séances d'imagerie, l'animal est maintenu dans des conditions de température adéquates et sa fréquence respiratoire suivie avec alarmes programmées en cas d’hyper ou d’hypo ventilation. La mise à mort sera pratiquée si des animaux âgés sont en état de souffrance liée à une altération de l’état général très prononcée (procédure valable pour toute l’animalerie marmouset, indépendante de l’étude présente).
Devenir
Les deux procédures expérimentales mises en oeuvre ne génèrent pas de douleur et ne causent pas de dommage à l'animal. Elles ne sont pas invasives et les interventions sur l'animal sont peu fréqentes (2 fois/an). Ainsi au cours même de l'étude, les animaux peuvent être impliqués dans des études comportementales, si ces dernières sont réalisées à intervalles préalablement définis. A la fin de l'étude les animaux peuvent être attribués à d'autres projets.
Remplacement
L’objectif du projet scientifique consiste à chercher, au cours du vieillissement, et en fonction du sexe, des relations entre des modifications dans les flux cérébraux, l'anatomie cérébrale, les fonctions cardiaques et des marqueurs sanguins. L’approche requiert l’intégrité de l’organisme vivant qui fournira à la fois des éléments physiologiques (métabolismes cérébral et cardiaque), anatomiques (taille et forme des structures cérébrales) et biochimiques (marqueurs sanguins). De plus cette étude s’inscrit dans le temps, sur une échelle de plusieurs années au cours desquelles les mêmes animaux seront suivis. Le modèle animal est justifié par la problématique du vieillissement des organes, et de leurs interactions, ainsi que par la nécessité de mesurer des phénomènes dynamiques, tels que les flux sanguins. Le modèle marmouset s’inscrit dans la proximité phylogénétique, anatomique et physiologique avec l’humain. C’est pour l’ensemble de ces raisons que ce projet ne pourrait être réalisé in vitro ou avec un modèle animal rongeur.
Réduction
Le nombre nécessaire et suffisant d’animaux a été établi lors de la conception du protocole expérimental par une approche méthodologique/statistique. L'étude vise à pouvoir exploiter la colonie de marmousets présente au CerCo avec une stratification en fonction de l'âge (jeunes adultes vs adultes âgés) et du sexe. Pour un risque de type I de 0,05 et de type II de 0.10, une modification théorique minimale de 20% des différentes variables avec des déviations standards de 15% nécessite 13 animaux par sous-groupe d'âge (4 sous-groupes : jeunes adultes, adultes, adultes vieillissants et sujets âgés). Si l'erreur de type II est fixée à 0.2 (valeur plus couramment acceptée), 10 animaux par sous-groupe doivent être étudiés. Il faut également considérer l 'éventuelle perte d'animaux. Ainsi, ce nombre est compatible avec la colonie présente dans l'animalerie. Les 4 sous-groupes pourront être regroupés en 2 groupes d’âges (jeunes 6ans). Il faut également considérer que ces animaux, impliqués dans une analyse de type transversal, seront intégrés dans une étude longitudinale, avec une exploration annuelle par imagerie et analyse du protéome sanguin. Les procédures n'étant pas ou peu invasives (prélèvement sanguin sous anesthésie) et à la fréquence d’une fois par an, les marmousets de l'étude pourraient être impliqués en parallèle dans d'autres études non invasives, telles que des études comportementales menées au laboratoire par d’autres chercheurs, dans le respect d’un planning partagé adéquat. De plus à la fin du projet, les animaux pourront être attribués à d'autres études. Les mêmes marmousets contribuent à plusieurs approches : imagerie avec plusieurs séquences d'imagerie et des prélèvements biologiques. Les résultats obtenus à partir des différentes procédures seront analysés séparément mais également fusionnés. Des corrélations seront recherchées entre le phénotype cardio-vasculaire et le protéome sanguin au sein des différents groupes d’âge, en fonction du sexe, afin de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques et neurodégénératifs liés à l’âge, et de l’interaction âge/sexe. En complément de l’analyse catégorielle, la méthode sera étendue à un modèle linéaire généralisé, qui permettra une définition plus fine des variations liées l’âge. Il sera ainsi possible de détecter des âges auxquels des modifications liées au vieillissement normal ou pathologique sont attendues, sans nécessiter une approche expérimentale supplémentaire.
Raffinement
Les interventions sur l’animal sont réduites au minimum (anesthésie), toutes les approches d’imagerie étant non invasives. Les animaux vivent en contact (au moins visuel, olfactif et auditif) avec l’ensemble des congénères de la même pièce. Les durées de séparation (contact physique) avec les congénères de la même cage/volière sont limitées. Les procédures ne génèrent pas d’isolement social ni de douleur. Les déplacements des marmousets entre l’animalerie et les machines IRM sont réalisés avec des animaux anesthésiés (Alfaxan, 0.25ml) pour limiter le stress. Les privations alimentaires et hydriques ne sont appliquées qu’en prévision d’une anesthésie. Les anesthésies (isoflurane ~2% dans O2) sont surveillées (monitoring de la respiration et du rythme cardiaque). Lors des séances IRM, le dispositif dans lequel les animaux anesthésiés sont installés est maintenu à la température de 27.5°C. Le suivi sanitaire des animaux est assuré par le personnel zootechnique : courbe de poids, surveillance de comportement de base et des interactions entre les animaux et de leur état physique. Une vétérinaire peut également être amenée à intervenir si un examen clinique est nécessaire, et décider du maintien de l’animal dans l’étude. En cas de blessures, le traitement consistera en des injections d'antibiotique (Clamoxyl 0.1ml/kg)par animal pendat 5 à 7 j) et d’anti-inflammatoire (Dexadreson ou Diurizone, 0,05 ml/kg soit environ 0,015 ml/animal), qui seront complétées par l’application de pommades antibiotiques (Duphader, Predniderm, Fucidine). Des injections d’un antibiotiqueadapté (metronidazole) et d’antispasmodique (Estocélan 0,1ml/kg soit environ 0,03ml/animal) seront faites aux animaux présentant des problèmes gastriques. En cas de diarrhées, du phosphaluvet est donné (1ml/kg soit environ 0,3ml par animal) sur quelques jours. Un dispositif de protection destiné à réduire le dommage auditif lié au fonctionnement de l’IRM (procédure expérimentale 1) est à l’étude (‘mini-casque’ ou bouchon d’oreilles).
Choix des espèces
Dans le cadre de l’analyse des processus de vieillissement, le marmouset Callithrix jacchus offre la possibilité de réaliser des études longitudinales sur un même animal sur une échelle de temps bien plus courte que chez l’homme (en étant de plus inclus dans plusieurs protocoles d’imagerie). Ce modèle présente l’avantage, en regard d’autres modèles (rongeurs « humanisés », microcèbe), d’une proximité phylogénétique avec l'homme. D'autres travaux au laboratoire s'intéressent aux aptitudes cognitives de ces singes en fonction de l'âge). Ainsi il est possible sur ce modèle de mener des travaux qui permettront d’analyser l’évolution des interactions entre différents biomarqueurs cérébraux, vasculaires, cardiaques et sanguins en corrélation avec les aptitudes cognitives. Une étude comparable en terme de nombre d’animaux, d’espace et de durée de projet relative à la longévité de l’espèce ne peut être envisagée, en conditions de laboratoire, chez le macaque, modèle PNH classique. L'analyse est destinée à définir in fine des marqueurs précoces du vieillissement du système cardio-cérébral. La gamme d’âges devra être suffisamment étendue. Les marmousets inclus dans les études seront des adultes, à partir du stage jeune adulte jusqu'au stade gériatrique. La cohorte participant aux études sera dichotomisée d’une part en adultes jeunes entre 2,5 et 6 ans, et d’autre part en adultes vieillissants et âgés au-delà de 6 ans, puis stratifiée en 4 sous-groupes d’individus: jeunes adultes (2,5-4 ans), adultes (4-6 ans), adultes vieillissants (6-9 ans) et sujets âgés (>9 ans) si la composition de la colonie (âge, sexe, effectif/classe d’âge) de marmousets le permet.
Mesure du couplage neuro-vasculaire par co-acquisition TEP/UltraSons chez le rat : application à la neuropharmacologie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
158 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie crânienne de quatre heures pour poser une prothèse, puis un isolement pouvant durer soixante jours et plusieurs séances d'imagerie sous anesthésie, pour mesurer le couplage neurovasculaire par TEP et ultrasons en neuropharmacologie. Le porteur indique que la fenêtre crânienne empêche de regrouper ou d'adopter les rats, qui sont donc euthanasiés dès la dernière acquisition. Il juge "indispensable" le recours à des animaux vivants, la modélisation et l'in vitro ne restituant pas ces interactions.
Objectifs
La tomographie par émission de positons (TEP) est une modalité d’imagerie qui permet d’étudier la fixation d’un médicament sur sa cible cérébrale. L’imagerie ultrasonore (US) permet quant à elle d’étudier les variations du débit sanguin cérébral qui sont la conséquence de l’effet des médicaments sur le cerveau (réponse hémodynamique). L’objectif de ce projet est d’associer ces deux modalités de neuro-imagerie innovantes de manière simultanée pour mieux comprendre l’effet des médicaments sur le cerveau. Le phénomène de pharmacorésistance ou la tolérance à certains médicaments pourrait s’expliquer par une réponse hémodynamique atténuée lors de l’interaction du médicament avec sa cible. Cela pourrait s’expliquer par un déficit des mécanismes de couplage entre les cibles neuronales et la réponse hémodynamique, c’est-à-dire le couplage neuro-vasculaire. On pense que la qualité du couplage neuro-vasculaire peut être appréciée in vivo en mesurant les paramètres TEP et US de manière simultanée. L’imagerie hybride TEP/US sera réalisée chez le rats témoins. Certains animaux recevront un médicament testé à dose unique et/ou après un traitement prolongé. L’os du crâne atténue les US. Une « fenêtre » chirurgicale devra donc être mise en place sur chaque animal. Cela consiste à ôter et remplacer une partie de l’os du crâne par une résine dans des conditions d’asepsie et sans générer de douleur. La chirurgie et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale. Au total, 158 rats seront utilisés sur 5 ans. Cela permettra d’optimiser les conditions expérimentales et de suivre les effets de 4 protocoles de traitements médicamenteux différents. Compte tenu des contraintes techniques liées aux traitements et aux modalités d’imagerie, la taille des groupes a été fixée à 8 rats par groupe. Les traitements étudiés sont des médicaments parfaitement connus, déjà utilisés chez l’animal voire chez l’Homme: ils n’induisent pas de toxicité. Les animaux seront surveillés quotidiennement et pesés 3 fois par semaine. Ils feront aussi l’objet de mesures de comportement simples et peu génératrices de stress comme la mesure de l’activité locomotrice. Ce protocole ne peut pas être remplacé par des études de pharmacologie in vitro qui permettent seulement de mettre en évidence l’interaction d’une molécule isolée avec une cible ou un système biologique isolé. Seules les expériences in vivo récapitulent la complexité et l’ensemble des effets des médicaments sur le cerveau.
Bénéfices attendus
Actuellement, chacune de ces techniques est utilisée séparément en routine en recherche préclinique. Réalisées en même temps, elles permettront de diviser au moins par 2 le nombre d’animaux nécessaires par rapport à l’utilisation de l’imagerie TEP puis US isolées. Surtout l’approche simultanée TEP-US ne nécessite pas le sacrifice de l’animal, il sera donc possible de réaliser plusieurs sessions d’imagerie chez un même animal pour mesurer l’évolution de l’effet des médicaments au cours du temps. Cela permettra de diminuer encore plus le nombre d’animaux grâce à la puissance des tests statistiques appariés. A terme, ce protocole devrait permettre d’offrir une méthode d’imagerie optimisée pour mieux comprendre l’effet des médicaments sur le cerveau et de mettre en évidence des mécanismes de tolérance ou de résistance.
Procédures
1. Procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie. Temps=4h 2. Isolement à 1 animal par cage afin de préserver l’intégrité de la prothèse, pendant 60 jours maximum avant euthanasie (le temps de réaliser les traitements et les sessions d’imagerie, en prenant en compte un risque d’échec de radiosynthèse du traceur et la reprogrammation des examens). 3. Les animaux utilisés pour la mise au point de l’acquisition US pourront participer à 5 acquisitions US de 90 min maximum, sous anesthésie générale, espacées de 48h au minimum. 4. Maximum 2 acquisitions espacées de 7 jours au minimum en TEP-US sous anesthésie générale incluant injections i.v par cathéter caudal Temps 90 min 5. 1 traitement chronique, quelques minutes quotidiennement, sur animal vigile pendant 15 jours maximum 6. Etude du comportement pendant 15 min, au maximum 2 fois par jour pendant la durée du traitement (15 jours maximum).
Impact sur les animaux
La procédure chirurgicale est conduite sous anesthésie générale et des analgésiques sont également utilisés. La récupération post-opératoire inclut un traitement antalgique. Aucune douleur n’est attendue. Les injections nécessaires à l’enregistrement TEP-US se font également sous anesthésie générale à l’isoflurane. Pas de douleur attendue. Les animaux ne peuvent pas s’arracher la prothèse crânienne qui est parfaitement solidaire de l’os et qu’ils ne peuvent pas voir ou sentir. Cependant, afin de les protéger des conflits avec leurs congénères, les animaux opérés sont hébergés individuellement par cage, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’hébergement individuel en cage transparente et ouverte, à côté d’autres cage, permet ainsi un partage de l’odorat et du visuel avec les autres animaux présents dans le cages voisines afin de minimiser l’effet négatif sur le bien-être animal. De plus, un enrichissement supplémentaire tel qu’un deuxième matériel de nidification sera ajouté. Les médicaments testés auront vraisemblablement un effet sur le comportement (apathie, diminution ou augmentation de l’activité locomotrice) mais ne sont aucunement toxiques pour l’animal aux doses testées. Le stress induit par l’administration des médicaments sur animal non anesthésié est limité par une habituation à la manipulation préalable. Pour les injections répétées, les sites d’injection parentérale seront alternés afin de ne pas induite de lésion au point d’injection.
Devenir
La présence d’un volet chirurgical au niveau du crâne empêche le rassemblement avec d’autres rats et une adoption ultérieure : les animaux opérés seront donc euthanasiés dès que possible, soit immédiatement après la dernière acquisition TEP-US.
Remplacement
Ni la modélisation informatique ni l’expérimentation sur cellules in vitro ne permettent encore d’appréhender les processus complexes relevant de mécanismes impliquant des interactions entre neurones, cellules gliales et réseau vasculaire, dans un contexte de régulation circulatoire sanguine. Il est donc indispensable d’utiliser des animaux vivants capables d’exprimer les troubles neurologiques et de valider les biomarqueurs d’imagerie étudiés. Au maximum, toutes les adaptations possibles de l’imagerie US (sensibilité, résolution spatiale, résolution temporelle…) seront mises au point au préalable sur des objets en plastique remplis d’eau ou de gel qui miment les propriétés physiques de la tête et du cerveau. Néanmoins, 30 rats seront tout de même nécessaires pour finaliser la mise au point de cette nouvelle technique d’imagerie : les données collectées sur ces animaux serviront à l’élaboration d’un référentiel (animaux non traités), ce qui permettra au final de réduire le nombre de sujets nécessaires. La réalisation d’une imagerie US sur tout la profondeur du cerveau directement chez l’Homme n’est pas possible à ce jour du fait de l’épaisseur de la boite crânienne.
Réduction
L’utilisation conjointe des deux techniques (imagerie TEP et ultrasonore (US)) permet de diviser par deux le nombre d’animaux actuellement nécessaire à la collecte séparée de données TEP et US indépendamment l’une de l’autre. De plus, ces techniques d’imagerie permettent d’étudier plusieurs régions cérébrales en même temps, dans l’ensemble du cerveau. Pour la mise au point de la méthode : 30 rats serviront à l’apprentissage de la technique chirurgicale et à la mise au point des paramètres physiques de la méthode TEP-US. Ce nombre pourra être revu à la baisse si les objectifs sont atteints avec un nombre inférieur d’animaux. Pour l’étude de l’effet de 4 traitements dont la tolérance chez l’animal voire chez l’Homme est parfaitement connue, le nombre d’animaux nécessaires à cette étude a été calculé grâce à une planification précise afin d’en réduire au maximum le nombre. Il a été estimé à 128 pour les 5 ans à venir. Ce nombre est un minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Avant chirurgie : Les animaux seront acclimatés pendant les 5 jours suivant leur arrivée aux conditions de température et d’humidité de l’animalerie. Ils seront deux par cage (enrichie en tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et papier Kraft). Il y aura une période d’habituation des animaux aux manipulations par les personnes intervenantes sur ce projet avant toute expérimentation. Après chirurgie : Les chirurgies se feront sous anesthésie générale et en étant vigilant sur les conditions d’asepsie. Une surveillance continue de l’état de l’animal aura lieu de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal. Pendant toute la durée de l’expérimentation, les animaux seront observés individuellement tous les jours et pesés 3 fois par semaine. Le traitement sera administré en fonction du poids des animaux.
Choix des espèces
Nous utiliserons des rats adultes jeunes et matures sexuellement (180-250g au début de l’étude). Ils pourront être étudiés pendant un maximum de 3 mois après la réalisation de la chirurgie. Cet âge a été choisi car les animaux sont suffisamment matures dans leur développement mais leur taille reste compatible avec les outils d’acquisition qui sont réalisés dans un espace restreint.
Etude des effets cellulaires, moléculaires et épigénétiques d’un stress dans un modèle murin de stress périnatal
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
398 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Chaque animal reçoit des injections répétées d'alcool ou d'interleukine, jusqu'à neuf fois, pour reproduire un stress périnatal et en étudier les effets épigénétiques sur le cerveau. Le porteur attend des effets comportementaux comme la prostration et l'agressivité, et les souris sont tuées à l'issue de chaque procédure pour prélever les tissus. Il juge le modèle souris "essentiel" pour tenir compte de l'architecture cellulaire complexe du système nerveux.
Objectifs
Plusieurs études suggèrent qu’un stress périnatal augmente la susceptibilité d’apparition de pathologies mentales à l’âge adulte. Ces stress périnataux pourraient induire des modifications épigénétiques à l’origine de l’augmentation de cette susceptibilité. Ces modifications épigénétiques se répercuteraient au niveau architectural puis fonctionnel dans le cerveau et conduiraient à des comportements pathologiques. L’amélioration du pronostic des pathologies mentales liées au stress repose donc sur la découverte de nouvelles stratégies neuroprotectrices. L’objectif de cette étude est de comprendre les mécanismes biologiques, moléculaires, épigénétiques et cellulaires, responsables d’anomalies du développement cérébral décrites chez l’homme suite à des stress périnataux: l’ingestion d’alcool chez la femme enceinte (syndrome d’alcoolisation fœtale SAF) et l’inflammation périnatale. Ces anomalies ont été associées à la présence de lésions cérébrales et de pathologies mentales. Les voies du stress, notamment celles impliquant le gène HSF2 sont particulièrement présentes au cours du développement neural et y jouent un rôle critique. Disséquer les mécanismes génétiques et épigénétiques possiblement causals dans ces troubles psychiatriques est une des voies vers le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans ce but, l’induction de stress répétés chez le souriceau (embryonnaire ou nouveau-né), déjà bien caractérisés et connus pour mimer les effets d’une intoxication alcoolique aigue ou l’inflammation périnatale chez la femme enceinte, sera réalisée afin d’étudier les effets cellulaires, et moléculaires au niveau de l’épigénome dans le cerveau de ces souriceaux, soit peu de temps après le stress, soit après plusieurs semaines. Une partie des travaux de ce projet sera réalisée en parallèle sur des modèles organoïdes, afin de limiter à terme, l'utilisation des animaux dans ce type d'étude. Cependant, une partie du travail repose sur le suivi à long terme des conséquences du stress périnatal, il est donc encore indispensable d'y associer des études chez l'animal.
Bénéfices attendus
Ces travaux s'inscrivent dans la compréhension des mécanismes moléculaires qui sont ciblés par un stress développemental, que ce soit lors de la vie foetale ou l'enfance, et qui ont des répercussions sur la vie adulte. Ce projet à trois visée à long terme, (1) l'anticipation des effets du stress et de leur répercutions par la prévention, notamment en identifiant les périodes de susceptibilité, (2) le développement d'approches diagnostiques basées sur les défauts identifiés et qui viseront à la prise en charge la plus précoce possible pour limiter les conséquences du stress et enfin, (3) le développement d'approches thérapeutiques qui cibleront les voies moléculaires identifiées.
Procédures
Injections intrapéritonéales répétées d'alcool (3 injections séparées de 12h), ou Injections intrapéritonélaes répétées d'interleukine (jusqu'à 9 injections espacées de 12h, soit sur 5 jours), et/ou injections intrapéritonéales de BrdU/EdU (jusqu'à 3 injections espacées de 3h).
Impact sur les animaux
Les animaux subissent des stress contrôlés et modérés, mais sufisants pour reproduire des effets du stress observés chez l'humain. Des effets comportementaux sont principalement attendus, tels la prostration et l'agressivité, dont nous essaieront de limiter l'impact par les enrichissement environnementaux.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour prélevement des tissus à analyser.
Remplacement
Il est important de travailler sur ce modèle souris car ces études doivent tenir compte de l'architecture cellulaire et tissulaire complexe qui impacte sur la protéostasie, le métabolisme et les réponses cellulaires, surtout concernant les réponses neurales. Le système nerveux est par essence un système intriqué dédié à la réponse environnemental, vouloir préserver son intégrité dans nos études est donc essentiel, et pour le moment, seul le modèle animal répond à ce défi. Par ailleurs, nous disposons d'animaux transgéniques qui permettent de disséquer des voies complexes de le réponse cellulaire. C’est également la seule possibilité de coupler des phénotypes cellulaires, histologiques à des défauts comportementaux. Nous développons en parallèle des modèles de culture cellulaire complexe qui permettront à terme de limiter le nombre d'animaux utilisés mais pour le moment, ces modèles sont encore imparfaits et ne permettent pas encore de reproduire les phénotypes comportementaux.
Réduction
Les modèles de lésions cérébrales induits par l'alcool sont extrêmement reprocductibles et n'entrainent qu'une faible mortalité, de l'ordrede 5%. Il en est de même pour le modèle d'inflammation que nous utilisons. Ces deux aspects permettent de limiter le nombre d'animaux par groupe. Par ailleurs, l'utilisation de tests statistiques appropriés à l'étude des petits echantillons permet également l'utilisation d'un nombre limité d'animaux. En parallèle à nos travaux nous développons des modèles de culture d'organoides cérébraux, qui pourront être utilisés pour les validations d'effets, et développés à terme pour ce type d'étude.
Raffinement
Le bien être des animaux est au coeur de nos travaux puisque en étudiant le stress, nous sommes particulièrement attentif à leur environnement qui influerait sur nos résultats. Nous veillons à maintenir l'enrichissement approprié, à limiter la manipulation des animaux, et les changements d'environnement qui sont stressants pour les animaux.
Choix des espèces
Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour la réalisation des modèles neuropathologiques. Par ailleurs, nos études sont axées sur des conséquences à relativement long terme sur la physiologie tissulaire, ce qu'il n'est pas encore possible de modéliser complètement dans les modèles complexes 3D. De plus, il nous est indispensable d’avoir accès aux animaux génétiquement modifiés pour nos analyses mécanistiques. Nous travaillerons sur : E15.5, E16.5, P7, P30 pour suivre la mise en place et la persistance ou l'aggravation des effets de l'alccol, à des etapes clés du développement neural. Le stade auquel le stress alcoolique est appliqué correspond au deuxieme trimestre de la grossesse chez l'humain. A ce stade l'alcool n'induit pas d'altérations majeures identifiables au niveau clinique, poutant les consequences comportementales sont bien caractérisées chez le jeune enfant. Il s'agit donc d'identifier une signature precoce du défauts induits par l'alcool. Les stades d'analyse choisis couvrent des periodes clés du developpement neural (pic de neurogenese cortical, etablissement de la myelination corticale, architecture cerebrale mature). P1, P3, P5, P45 pour les études de l’inflammation puisque cette période correspond au au 3eme semestre de gestation chez la femme durant lequel le développement du fœtus est particulièrement sensible à l’inflammation et cause de prématurité infantile avec des consequences connues chez le jeune enfant. Notre expérience a déjà montré que l’inflammation pendant le développement cérébral est un processus complexe qui doit être étudié dans le temps (notamment la mise en place de la myelination corticale et d'une architecture mature du cortex cérébral). Stades embryonnaires entre E11.5, E14.5 et E16.5 pour les études du rôle de HSF2, car ce sont les stades auxquels les protéines HSF sont exprimées et des étapes clés de la corticogenèse: début de neurogenèse, modification de l'expression de HSF2 dans le cortex cérébral, pic de la neurogenèse corticale et génération des neurones des couches supérieures.
Utilisation de faibles doses d’IL2 dans un modèle murin d’autisme médié par une MIA
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
275 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit jusqu'à cinq injections sous-cutanées, un prélèvement sanguin et des tests comportementaux nommés, mesure des vocalisations, test d'enfouissement et test des trois chambres, dans un modèle d'autisme induit par activation immunitaire de la mère pendant la gestation. Les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale pour prélever le sang et les organes. Le porteur juge "nécessaire" d'étudier le comportement sur l'animal, les modèles cellulaires ne venant selon lui qu'après la caractérisation comportementale.
Objectifs
Les troubles du spectre autistique (TSA) touchent une personne sur 100. Il s’agit d’un trouble neuro-développemental caractérisé par des anomalies de la communication sociale ainsi que des comportements stéréotypés et des intérêts restreints. Cependant, derrière cette définition générale se trouve un spectre clinique large et hétérogène. Récemment, la piste d’une activation du système immunitaire de la mère durant la grossesse (MIA) a été suspectée par des études épidémiologiques puis confirmée par des modèles animaux. Grâce à une collaboration étroite entre psychiatres et immunologistes, des données cliniques combinées avec des modèles animaux, nous permettrons de mieux comprendre les toubles autistiques des patients. En effet, dans notre projet, nous allons développer des modèles murins d’autisme liés à une MIA afin de mieux comprendre et de caractériser expérimentalement les conséquences de ces modifications neuro-immunologiques in vitro et in vivo. Nous examinerons également le comportement de ces modèles animaux. Nous explorerons donc, sous des angles très divers, les relations entre immunologie et susceptibilité aux troubles du spectre autistique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont multiples: 1- Permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques en lien avec l'immunité dans le champ de l'autisme 2- Identifier des sous-groupes homogènes de patients à l'aide de biomarqueurs diagnostiques 3- Développer une prise en charge thérapeutique spécifique pour ces patients
Procédures
Les animaux seront soumis à: 1- des analyses comportementales (vocalisation (5 minutes), test d'enfouissement (20 minutes), test des 3 chambres (20 minutes). Chaque animal ne sera soumis à chaque test qu'une seule fois. 2- une injection sous-cutanée de produits pharmaceutiques non iatrogènes, répétée au maximum 5 fois et un prélèvement sanguin qui ne sera réalisé qu'une seule fois.
Impact sur les animaux
Dans notre projet, les animaux subissent soit des injections sous-cutanées et un prélévement sanguin, soit des tests comportementaux. Dans le cas des injections sous-cutanées et du prélévement sanguin, une attention particulière sera portée à la surveillance des potentielles infections et/ou signes d'inflammation au niveau des sites d'injection. Par expérience, nous savons que les produits utilisés dans notre projet sur les groupes d'animaux ne présentent aucun effet dommageable sur les souris. Pour réduire au maximum les effets indésirables de nos procédures sur les animaux, les manipulations seront réalisées par du personnel expérimenté et compétent. Cela permettra de diminuer la douleur mais aussi le stress généré aux animaux. Enfin un suivi quotidien des animaux sera réalisé afin de veiller au bon état de santé de ces derniers. L'application de la surveillance des points limites décrits dans chaque procédure sera utilisée pour détecter au plus vite le moindre problème chez les animaux.
Devenir
Euthanasie par dislocation cervicale afin de récuperer le sang et les organes et de réaliser des analyses immunologiques.
Remplacement
Les marqueurs de l’autisme sont comportementaux (anomalies de la communication sociale et comportements stéréotypés). Il est donc nécessaire d’étudier le comportement des modèles afin d’identifier clairement les mécanismes liés aux MIA (activation du système immunitaire de la mère durant la grossesse). Les modèles cellulaires ne pourront être utilisés qu’une fois que les anomalies comportementales auront été caractérisées chez les modèles murins. Par ailleurs, aucun modèle alternatif et aucune approche in vitro satisfaisante n’existe et ne peut être utilisé pour répondre aux questions posées. Seul le modèle animal permet d’évaluer l’efficacité́ des approches thérapeutiques. Nous avons choisi d’utiliser un modèle murin, qui permet de répondre aux questions scientifiques posées et pour lequel nous avons toute l’expertise et les outils nécessaires.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous avons calculé le nombre nécessaire en fonction de la puissance nécessaire. Afin de palier à la variabilité inhérente aux tests comportementaux (vocalisation, test d'enfouissement, 3 chambres), il est nécessaire de tester 15 souris par groupe pour obtenir des résulats robustes, dans le respect de la règle des 3R. Pour comparer les différents groupes et utilisant 15 souris par groupes, nous utiliserons donc des tests statistiques adaptés limitant le nombre d'individus.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et accès illimté à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie seront controlées et stables. Le cycle d'éclairage sera de 12h/jour. Les animaux seront hebergés ensemble et l'isolement sera limité aux conditions expérimentales décrites. Dans le cas d'isolement, un enrichissement avec du coton et un maison en carton sera apporté et le temps d'isolement sera limité au maximum. Les animaux seront surveillés quotidiennement et un soin particulier sera apporté à la surveillance des points limites des souris isolées (comportements répétitifs, automutilation, perturbation de l'activité motrice).
Choix des espèces
La souris est un modèle important en immunologie et particulièrement dans les modèles de pathologies psychiatriques tels que l'autisme. En effet, la souris est un animal spontannément social et ses comportements normaux commencent à être de mieux en mieux connus, La souris a donc été choisie car elle permet d'analyser les symptômes cores de l'autisme c'est-à-dire (i) les anomalies précoces de la communication par l’évaluation des vocalisations ultrasoniques dès 7 jours de vie, (ii) les comportements répétitifs par le test d'enfouissement et (iii) la perte d'appétence sociale par le tests des 3 chambres. Ces deux dernières évaluations seront réalisées sur des souris adultes entre 7 et 9 semaines de vie.