Système nerveux

2 700 souris, soit 1 200 adultes et 1 500 souriceaux, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes reçoivent une vingtaine d'injections, sont maintenus tête fixée jusqu'à une heure et équipés d'électrodes cérébrales, avant une perfusion cardiaque terminale, pour étudier le rôle de l'ocytocine dans les comportements maternels. Le porteur indique que les souriceaux sont brièvement séparés de leur mère, parfois sédatés, puis tués car ils ne peuvent être gardés sans elle. Il affirme que l'étude d'animaux vigiles en comportement rend l'in vitro et l'in silico impossibles.

Objectifs

L’ocytocine (OXT) est un neuropeptide synthétisé par les neurones du noyau paraventriculaire de l’hypothalamus (PVN), principalement connu pour son rôle dans la lactation et l’accouchement suite à sa libération dans la circulation sanguine. Cependant, des études récentes mettent en évidence les effets de l’OXT sur le système nerveux central, notamment sur les comportements sociaux et maternels. Chez les rongeurs, l’olfaction joue un rôle central pour les interactions entre individus et en particulier entre adultes et leurs progénitures. Dans le système olfactif, le cortex piriforme (PIR) est un des premiers et principal relais en aval du bulbe olfactif. Il présente chez la souris une densité exceptionnelle de récepteurs à l’OXT par rapport à d’autres régions cérébrales, notamment chez les femelles, avec une densité accrue chez les mères par rapport à des femelles vierges. Aux vues de cette forte expression chez les mères, nous avons fait l’hypothèse que l’OXT dans le PIR est nécessaire à la mise en place de comportements maternels chez des souris femelles. Afin de tester cette hypothèse, nous souhaitons réaliser des expériences en présence de souriceaux âgés de 1 à 10 jours, et manipuler la transmission oxytocinergique dans le PIR pour tester le rôle de l’OXT au niveau comportemental ainsi qu’au niveau des réponses neuronales.

Bénéfices attendus

Chez les Mammifères, la mise en place des comportements maternels est essentielle pour la survie des petits et de l’espèce en général. Chez l’Homme, il est notamment connu que le lien entre mère et enfant est facilité par la neurohormone nommée oxytocine, libérée dans la circulation sanguine de la mère lors de l’accouchement. Nous savons également que les odeurs jouent un rôle important et bénéfique dans le lien entre mère et enfant, un lien qui peut être affecté dans certaines situations, notamment lors de certains accouchements par césarienne (les taux d’oxytocine libérés sont alors plus limités). Ce projet permettra de mieux comprendre comment le cerveau s’adapte lorsqu’il s’agit de mettre en place des comportements maternels et le rôle des odeurs dans ce processus. A terme, il pourrait permettre de mettre en place des stratégies pour faciliter l’établissement de ces comportements chez l’Homme dans des situations problématiques liées à la maternité. Cette perspective est d’autant plus réaliste que l’administration d’ocytocine par voie intranasale est déjà réalisée chez des enfants autistes pour améliorer leurs relations sociales.

Procédures

Les souris seront utilisées lors de tâches comportementales en présence de souriceaux. Elles seront soumises à des injections et à des phases de contentions pendant les périodes d'habituation et d'expérimentation (environ 20 injections par souris, moins de 3min par injection/jour). Afin de pouvoir présenter les odeurs aux souris de manière précise et juste devant leur nez, nous devrons maintenir certaines souris au sein du dispositif comportemental qui permet de délivrer les odeurs. Ce maintien sera réalisé à l'aide d'une petite fixation métallique attachée à leur crâne au préalable. La durée de contentention par maintien de la tête en position fixe n'excédera pas 1h et sera réalisée après une habituation progressive. A la fin de l'expérimentation, les souris seront soumises à une perfusion afin de préserver les tissus cérébraux et d'effectuer des contrôles histologiques (durée de la procédure inférieure à 20min, réalisée sous traitement anesthésique et analgésique).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet seront mises en présence de souriceaux (ou d’odeurs de souriceaux) et nous observerons leur comportement pour quantifier leur capacité à en prendre soin. Les souriceaux pourront être brièvement séparés de leur mère le temps de réaliser ces tests, ce qui correspond à un stress modéré car réduit dans la durée. Pour limiter ce stress, nous prévoyons aussi de sédater ou anesthésier les souriceaux, ce qui nécessite d’injecter des substances médicamenteuses via des injections sous-cutanées réalisées à l’aide d’aiguilles très fines. Afin de pouvoir tester le rôle de l’ocytocine dans ces comportements, nous utiliserons des méthodes qui permettent de cibler les neurones capables de libérer de l’ocytocine ou bien les neurones qui répondent à l’ocytocine lorsqu’elle a été libérée. Pour cela, nous devrons faire exprimer des molécules spécifiques dans le cerveau des souris adultes grâce à l’expression d’adénovirus injectés au préalable (injections réalisées dans un autre établissement) et des injections d’agents pharmacologiques seront nécessaires. Ces injections représentent potentiellement une légère nuisance pour les animaux car elles nécessitent de les maintenir immobiles pendant la durée de l’injection (contention). Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. Les souris pourront être connectées via un câble fin au système d’enregistrement ce qui peut générer une légère gêne. De plus, les odeurs étant très volatiles, il nous faudra maintenir la tête des souris proches de la source d’odeurs dans certaines expériences, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée.

Devenir

Les 1200 souris adultes pourront être mises à mort par perfusion intracardiaque réalisée sous anesthésie générale avec traitement antidouleur adapté. La préservation du tissu nécessite que cette procédure de perfusion soit réalisée et permet ainsi de réaliser des contrôles histologiques en fin d’expérimentation. Cette procédure, en utilisant la voie circulatoire sanguine, favorise la pénétration du fixateur dans les tissus de manière homogène et suffisamment rapide pour empêcher la détérioration du tissu cérébral en condition d'anoxie (normalement engendrée par l'arrêt cardiaque). Les 1500 souriceaux seront aussi euthanasiés à la fin des procédures car ils ne peuvent être gardés en absence de leur mère.

Remplacement

La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront des comportements maternels : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est de 2700 (1200 souris adultes et 1500 souriceaux) sur 5 ans. Nous prévoyons de minimiser ce nombre en utilisant les mêmes souris dans des tests comportementaux différents, avec ou sans intervention sur le système ocytocinergique. Pour chaque condition testée, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions valables sur le plan statistique et tenant compte des aléas liés à ces approches expérimentales complexes. Ce nombre sera réduit davantage grâce à nos études pilotes qui permettront une optimisation des paramètres de nos expériences et raffiner notre approche statistique.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début des tests comportementaux, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux procédures qu’ils vont rencontrer (notamment aux contentions et injections). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris.

Choix des espèces

Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans une fonction cognitive complexe, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. L’effet positif de l’oxytocine sur les comportements sociaux a notamment été montré aussi bien chez la souris que chez l’Homme. Les odeurs jouent un rôle important dans le lien mère-progéniture, aussi bien chez l'Homme que chez la Souris. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. Des souriceaux entre P1 et P10 seront utilisés comme stimuli au cours des expérimentations car elles visent à comprendre les bases neurobiologiques des comportements maternels.

4 790 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés dans leur cerveau par stéréotaxie, sur des embryons via une laparotomie de la mère, sur des nouveau-nés ou sur des adultes, avant des tests comportementaux non précisés puis la mise à mort par exsanguination. Le porteur indique que les chirurgies peuvent provoquer une douleur modérée et que les nouveau-nés atteignant un point limite sont mis à mort par décapitation avant quinze jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité du tissu et que l'étude ne peut être menée qu'in vivo.

Objectifs

Depuis la découverte de la barrière hémato-encéphalique par Paul Erhlich à la fin du XIXe siècle, le cerveau a été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, tels que le microbiote intestinal, les cellules et signaux immunitaires systémiques ou encore le cycle jour/nuit. Parallèlement, les zones barrières du cerveau, comme les méninges et les plexus choroïdes, ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes. Les plexus choroïdes constituent la barrière sang-fluide céphalorachidien, l'une des frontières séparant le cerveau de la périphérie. Ils sont situés dans chacun des quatre ventricules du cerveau et sont adjacents à des zones impliquées dans la neurogenèse. D'un point de vue structurel, les plexus choroïdes sont composés d'un réseau de capillaires sanguins fenêtrés entourés d'une monocouche de cellules épithéliales et peuplés entre les deux par une grande variété de cellules immunitaires. Les principaux rôles physiologiques des plexus choroïdes sont la production de liquide céphalorachidien, qui débarrasse le cerveau des déchets métaboliques et des agrégats de protéines, ainsi que la production et le passage contrôlé du sang au cerveau de diverses molécules de signalisation, notamment des hormones et des facteurs neurotrophiques. Les molécules sécrétées par les plexus choroïdes façonnent l'activité du cerveau, par exemple en modulant la neurogenèse et la fonction des cellules immunitaires microgliales localisées dans le cerveau, ce qui rend les plexus choroïdes cruciaux pour l'homéostasie du cerveau. Des travaux antérieurs et d’autres travaux préliminaires ont montré que le niveau d’expression de certains gènes exprimés par l’épithélium des plexus choroïdes varient en fonction de l’âge et notamment au cours du vieillissement, et en réponse aux variations environnementales telles que celles du microbiote et du cycle circadien. Notre but est de mieux comprendre comment ces facteurs influent sur la biologie des plexus choroïdes et la fonction du cerveau.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra l’identification des facteurs produits par les plexus choroïdes et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité neuronale en fonction de l’âge, depuis la naissance et au cours du vieillissement, en fonction des facteurs environnementaux que représentent les variations de la composition du microbiote et celles du cycle circadien. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que constitue les plexus choroïdes et qui reste encore très peu étudiée et d’identifier de nouveaux mécanismes via lesquels les plexus choroïdes modulent la fonction du cerveau. A terme, ce projet pourrait permettre la mise au point d’immunothérapie afin de mieux lutter notamment contre les maladies dégénératives associées au vieillissement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : - soit une laparotomie sur femelle gestante (durée de la procédure : 45 min à 1h), - soit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau par stéréotaxie (durée de la procédure : incluse dans la durée de la laparotomie quand réalisée sur embryons, 5 à 10 min sur nouveau-nés, 30 min à 1h sur adulte). 12 jours (dans le cas des nouveau-nés injectés à la période embryonnaire) à 12 semaines (adultes) après chirurgie, les animaux seront mis à mort par exsanguination sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux adultes auront été avant mise à mort (4 à 8 semaines après chirurgie) impliqués dans des tests de comportement non invasifs.

Impact sur les animaux

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par une injection de buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. De la lidocaïne sera appliquée sur les zones à inciser. De l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie. Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Devenir

Les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les géniteurs qui n’auront pas subi de chirurgie (procédures 1 et 2) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 après 6 mois de reproduction. Les femelles gestantes qui auront subi une laparotomie (procédure 1) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 au moment de la séparation avec les nouveau-nés P6 ou P21. La mise à mort des souris auxquelles auront été injectés les vecteurs viraux (procédure 2) aura lieu par perfusion de PBS (exsanguination) sous anesthésie générale profonde et analgésie afin de prélever les tissus nettoyés du sang et à analyser post-mortem. Si un animal atteint les points limites définis, il sera mis à mort par exposition croissante en CO2 (jeunes de plus de 15 jours et adultes) ou par décapitation (nouveau-nés de moins de 15 jours).

Remplacement

Notre but est d’étudier comment les cellules situées au niveau des plexus choroïdes, agissent sur le cerveau, en condition physiologique, au cours du développement, du vieillissement et en réponse aux variations de composition du microbiote et du cycle circadien. Les plexus choroïdes sont un tissu composé d’un endothélium fenêtré, de cellules épithéliales, de cellules de type neuronal, de cellules mésenchymateuses et de cellules immunitaires. Les cellules immunitaires du système périphérique pourraient induire l’expression de facteurs produits par les cellules des plexus choroïdes qui pourraient eux-mêmes moduler l’activité neuronale du cerveau. Il n’existe aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité́ d’un organisme ou d’un tissu avec ses composantes endothéliale, épithéliale, neuronale, mésenchymateuse et immunitaire. De plus, nous étudions la physiologie des plexus choroïdes en fonction de l’âge et des variations des facteurs environnementaux tels que le microbiote et le cycle circadien, ce qui ne peut être étudié qu’in vivo.

Réduction

Nous souhaitons étudier les gènes des plexus choroïdes et du cerveau qui auront montré par une précédente approche transcriptomique des différences d’expression considérables en fonction des paramètres comparés. Les quantités d’animaux utilisées pour mener à bien notre projet sont établies en tenant compte de notre précédente expérience et de tests statistiques (test ANOVA, source SHADE). Les 4 plexus choroïdes d’un animal doivent être groupés pour pouvoir réaliser une analyse moléculaire ou transcriptomique sur ces petits tissus. Seuls 10 microlitres de liquide céphalo-rachidien peuvent être prélevés à partir du cerveau d’une souris, ce qui ne permet qu’un seul type d’analyse. Les analyses moléculaires du liquide céphalo-rachidien, des plexus choroïdes et des zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les mêmes animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (adultes). Nous prévoyons pour chaque groupe, 4 animaux par analyse. Le sexe des animaux pouvant influer sur les phénotypes observés, des mâles et femelles seront inclus (ratio 1/1). Des triplicatas d’expérience seront réalisés pour permettre l’obtention de résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 3 groupes comparés (P6, P21 et adultes) : les effectifs proposés (36 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.07 (effets considérables à extrêmes). - 2 groupes comparés (adultes jeunes et âgés) : les effectifs proposés (24 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.65 (effets très forts à considérables). - 6 groupes comparés (4h cycle fixe et 2h cycle perturbé) : les effectifs proposés (72 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.85 (effets très forts à considérables). - 4 groupes comparés (P21 et adultes, conventionnels et axéniques) : les effectifs proposés (48 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.97 (effets considérables à extrêmes). Ces résultats nous permettront d’identifier les différences majeures dans la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau en fonction de l’âge, du microbiote et du cycle circadien, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant et quelques heures après leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par des administrations d’analgésiques (buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur ; lidocaïne appliquée sur les zones à inciser ; de l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie). Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives et notamment des maladies dégénératives car de nombreuses lignées sont disponibles, invalidées pour de nombreux gènes d'intérêt et/ou génétiquement manipulable après injection de vecteurs viraux. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproductions facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. Il est aisé d’en manipuler le microbiote. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le phénotype induit par les vecteurs viraux n’est analysable qu’au minimum 10 jours après injection. Afin d’étudier comment la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau évoluent avec l’âge, nous injecterons les vecteurs viraux à des souris embryonnaires afin d’en étudier les effets chez les souris : (i) âgées de 6 jours, stade important avec la mise en place du système immunitaire et de nombreuses variations métaboliques en réponse à l’allaitement maternel, (ii) âgées de 21 jours qui correspond à la période du sevrage avec d’importantes variations métaboliques et du microbiote qui devient mature, (iii) adultes, âgées de 7 à 12 semaines, qui seront notre point de référence physiologique. De la même manière, nous étudierons les effets du microbiote en injectant les vecteurs viraux à des souris âgées de 3-4 jours afin d’en étudier les effets lorsqu’elles auront 21 jours ou qu’elles seront adultes et les effets du vieillissement en injectant les vecteurs viraux à des souris adultes jeunes de 7 à 12 semaines et âgées de 10 à 20 mois.

2 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une stimulation magnétique du cerveau après une hypoxie. Selon les procédures, elles subissent une privation d'oxygène de quarante minutes à six semaines, quatorze jours de stimulation magnétique et des tests comportementaux, sous sédation profonde. Le porteur décrit des inconforts transitoires liés à l'hypoxie, à la stimulation et aux injections, et affirme que le cervelet ne peut être étudié hors d'un système nerveux entier. La plupart des souris sont mises à mort pour prélever le cerveau, tandis que 180 femelles ayant servi de mères sont renvoyées à l'élevage pour être réutilisées.

Objectifs

Notre projet testera les effets neurologiques de la stimulation cérébrale non invasive pour améliorer les déficits fonctionnels. Ces connaissances permettront d'optimiser des protocoles de stimulation et trouver des traitements potentiels. Nous analyserons les effets de différents patrons de stimulation magnétique répétée à faible intensité (LIrTMS), qui modifient la plasticité neuronale et améliorent le comportement chez les animaux pathologiques. Les fonctions cérébrales seront évaluées avec des tests de comportement, et les modifications structurales et fonctionnelles chez les mêmes animaux pour minimiser le nombre d’animaux utilisé. Ce traitement peut changer la signalisation cellulaire, modifier des réseaux neuronaux, et provoquer une réparation post-lésionnelle dans le cerveau.

Bénéfices attendus

Nous cherchons des protocoles pour traiter une pathologie commune chez l’Homme, l’hypoxie cérébrale. Nous étudierons le cervelet parce qu’il est particulièrement sensible à l’hypoxie; sa structure, sa fonction et son développement sont très bien décrits; son dommage lors du développement est associé avec les maladies neurodéveloppementales; et il est touché par le vieillissement.

Procédures

4 interventions au maximum. Procédure 1 : 40 minutes d’hypoxie ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 30 minutes/jour, un maximum de 12 jours ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes Procédure 2 : hypoxie 6h/jour x 10 jours ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 30 minutes/jour, un maximum de 14 jours ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes Procédure 3 : hébergement en cages hypoxie pendant 6 semaines, hypoxie intermittente 6h/jour ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 60 minutes dans 1 journée ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes

Impact sur les animaux

Les interventions individuellement induisent une douleur en deca de la douleur engendrée par une simple injection faite selon le bon pratique vétérinaire. La succession de ces interventions nous emmène à demander l’autorisation du projet avec degré de gravité modérée. Les effets indésirables possible sont : inconfort transitoire en début d’hypoxie ; inconfort lors de la stimulation; inconfort lors des tests de comportement ; inconfort lors de l’injection d’anesthésiants et analgésiants. La surveillance quotidienne permet de s’assurer du bien être des animaux et lorsqu’un point limite (comme décrit) est atteint, les responsables du projet sont avertis et prennent une décision sur le devenir de l’animal, en lien avec la structure du bien être animal, et le vétérinaire référent.

Devenir

Nos études sont designés pour obtenir un maximum d'information biologique et comportemental d'un nombre minimum de souris. La plupart des souris sujet à l'hypoxie et la stimulation non invasive est testé en comportement puis perfusé, et les cerveaux des autres sont prélévé pour les études moléculaires. 180 souris femelles, les mères des portées des nouveaux-nés impliqués, seront remis dans l’animalerie, pour qu’elles soient re-utilisées pour l’élevage et diminuer donc le nombre total d’animaux.

Remplacement

Comme toute structure du système nerveux central, les connexions complexes entre les neurones ne peuvent pas être entièrement remplacé par des méthodes de culture ni des modèles mathématiques. Les déficits de comportement dus à une mutation associée avec les troubles autistique, ou à la suite d'une hypoxie perinatale, et l'amélioration de ces déficits ne peuvent être étudiés hors contexte de l'ensemble du système nerveux et donc avec des animaux vivants.

Réduction

2700 animaux total seront impliqués dans cette étude de 4 années. Nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaire pour les trois procédures, pour diminuer le nombre d'animaux utilisé. Les tests de comportement nécessitent normalement 10 animaux par groupe, et les études d'expression génique nécessitent 5 animaux par groupe.Un calcul de puissance a été fait pour déterminer ces nombres d'animaux.

Raffinement

Avant le début des interventions, nous habituons les animaux au contact humain en pratiquant du « handling » quotidien pendant une semaine ; ceci diminue leur peur et leur angoisse. Pendant la stimulation non invasive (LIrTMS) les animaux ne montrent aucun signe d’angoisse. Les animaux sont hébergés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Les points limites sont définis pour chaque procédure, en cas de dérèglement physiologique ou souffrance de l’animal. Tout acte invasive est fait uniquement après administration des médicaments analgésique ou anésthetiques adaptés.

Choix des espèces

La souris est très utilisée pour des expériences sur le système nerveux car cette espèce partage un nombre de propriétés biologiques avec l'Homme. Sa petite taille et l'existence des lignées de souris transgénique facilitent les aspects pratiques de l'expérimentation. Il existe de protocoles standardisés du comportement, ce qui permet de mieux comparer les résultats obtenus par différentes équipes de recherche. La majorité des animaux seront utilisés pendant les premier mois de développement postnatal, les âges clés pendant le développement du cerveau. Les ages ont été choisi pour être équivalentes au 1) le 3ème trimestre de gestation chez l’Homme ; 2) jeune adulte ; ou 3) adulte agé.

3 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour enregistrer l'activité de leur cortex pendant des tâches visuomotrices. Chaque animal subit deux chirurgies d'implantation d'électrodes d'environ douze heures, une IRM sous anesthésie, une restriction hydrique partielle entraînant une perte de poids, et une contention quotidienne en chaise d'une à trois heures, cinq jours par semaine, pendant quatorze à quarante-huit mois. Le porteur décrit un stress lié à la capture à la canne, au masque de contention et à l'isolement post-opératoire, ainsi qu'un risque de douleur et d'infection autour des électrodes. Le champ structuré du devenir est vide, et le texte indique que les animaux sont mis à mort pour vérifier la position des électrodes, sauf ceux réutilisés dans un autre projet ou, pour les femelles, renvoyés à l'élevage.

Objectifs

Les comportements sensorimoteurs résultent de traitements parallèles dans de multiples aires cérébrales. Le cortex pariétal « associatif » joue un rôle central dans les transformations sensorimotrices, mais les aires longtemps considérées comme purement visuelles peuvent être modulées par un mouvement de la main, et les aires considérées purement motrices peuvent être activées par des stimuli visuels. Cela suggère l’intervention de nombreuses boucles proactives et rétroactives entre les aires pendant ces comportements. Ce projet a pour but d’explorer les dynamiques intra- et inter-aires des réseaux corticaux fronto-pariétaux impliqués dans la planification de l’action et les processus attentionnels nécessaires à la mise en place et l’exécution des comportements sensorimoteurs. Ces dynamiques sont largement influencées par l'état du cerveau et ce projet les comparera au cours de différents états cérébraux allant de l'anesthésie et de l'état de repos à l'attention sélective et aux différents niveaux de prévisibilité. Pour cela, nous utiliserons des techniques d’enregistrements électrophysiologiques intracorticaux (potentiels d’actions des neurones individuels et potentiels de champs locaux). Les données seront recueillies chez des macaques rhésus en utilisant des matrices d’électrodes laminaires chroniques. Deux aires motrices et deux aires pariétales ayant une complémentarité fonctionnelle somatosensorielle et visuelle seront enregistrées simultanément. Ce modèle animal sera utilisé pour l’analogie qu’il partage avec l’homme au niveau de la structuration du réseau fronto-pariétal, de l’organisation laminaire des couches corticales, et de la coordination sensorimotrice et visuelle lors de l’exécution motrice. Les données recueillies seront partagées avec la communauté scientifique, pour permettre de compléter et étendre les connaissances existantes sur l'organisation corticale, au-delà de nos objectifs scientifiques dans ce projet spécifique. Elles pourront notamment permettre d’étendre et d’affiner les modèles computationnels récents pour décrire les réseaux corticaux qui sous-tendent l’attention et la planification du mouvement.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu, à court et moyen terme, est l’élargissement des connaissances sur les réseaux fronto-pariétaux impliqués dans les comportements sensorimoteurs. Le jeu de données récolté sera d’une précision spatiale et temporelle inédite et couvrira différents états cérébraux. Les objectifs sont de : (i) Caractériser les réseaux fronto-pariétaux fonctionnels. Cela comprend la dynamique des réseaux intra-couches corticales, inter-couches corticales et inter-aires, et cela au travers de différents états cognitifs allant de l’anesthésie à l’attention sélective au cours de la réalisation d’une tâche visuomotrice. (ii) Quantifier la contribution des réseaux fronto-pariétaux à la communication neuronale ascendante et descendante. (iii) Caractériser la dynamique des activités neuronales unitaires dans et à travers différentes aires fronto-pariétales et couches corticales. Cela comprend les fréquences et la variabilité d’occurrence des potentiels d’action des neurones supposés excitateurs et inhibiteurs. Ces informations pourront être comparées à celles rapportées pour les aires sensorielles des primates et d'autres espèces de mammifères. (iv) Fournir ces jeux de données à la communauté scientifique pour contraindre/valider/étendre les modèles computationnels existants.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Déplacement au centre IRM pour acquisition d'images, sous anesthésie, 1 fois pour une durée d'environ 4h. - Chirurgies d'implantation de matrices d'électrodes, sous anesthésie, 2 chirurgies pour une durée d'environ 12h chacune. - La prise quotidienne de l'animal en chaise pour entrainement et enregistrements électrophysiologiques, environ 1h30 (jusqu'à 3h), 5 jours par semaine, durant 14 à 48 mois. - La prise de l'animal en chaise pour microstimulations, 20 sessions d'environ 1h30 (jusqu'à 3h). - La prise de l'animal en chaise pour enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie gazeuse, 20 sessions (habituation + enregistrement) d'environ 2h (jusqu'à 3h).

Impact sur les animaux

Ce projet utilisera des macaques rhésus qui entreront dans une procédure avec une sévérité classée modérée. La plupart des étapes de la procédure utilisée sera susceptible de créer une nuisance aux animaux. i) Les premières fois où les animaux seront mis en chaise pour leur venu dans le laboratoire pourront causer du stress lié à la prise de l’animal à l’aide d’une canne et à son déplacement depuis sa cage d’hébergement jusqu’à la chaise primate. Cela durera d’une à deux semaines bien qu’une habituation des animaux à la canne soit préalablement réalisée. ii) La restriction des mouvements de la tête des animaux à l’aide d’une masque de contention, nécessaire pour l’enregistrement des mouvements oculaires et électrophysiologiques, sera également source de stress lors des premières mises en place du masque. Pour cela, le masque est constitué de pièces détachables permettant de procéder à une habituation progressive. Nous pouvons tout de même prévoir plusieurs semaines de stress liées à la mise en contention dans le masque. iii) La restriction hydrique partielle liée au besoin expérimental pourra engendrer une perte de poids durant toute la durée de l’expérience. Les animaux seront donc pesés au minimum deux fois par semaine et surveillés quotidiennement afin de prévenir toute perte anormale de poids. iv) Malgré le traitement antidouleur, l’anesthésie et l’intubation de l’animal nécessaires aux procédures d’IRM et de chirurgie d’implantation des matrices d’électrodes pourront créer de la douleur post-opératoire à l’animal durant plusieurs jours. v) Malgré la médication post-chirurgicale et l’inspection/nettoyage quotidien de la zone opérée, l’animal pourrait ressentir de la douleur et développer une infection liée à l’implantation des matrices d’électrodes. vi) Afin de laisser l’animal cicatriser, il devra être isolé durant une semaine du contact physique de ses congénères après l’opération d’implantation des matrices d’électrodes et cela pourrait créer du stress. vii) Durant les enregistrements sous anesthésie partielle mais pendant lesquels l’état d’éveil sera maintenu, un masque délivrant le gaz anesthésique sera fixé à la tête de l’animal et cela pourrait augmenter le niveau de stress de l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort. L'objectif de la mis a mort est de prélever le cerveau de l'animal en fin de projet afin de préciser par une analyse post-mortem la localisation et l'état de préservation des zones corticales ayant fait l'objet des enregistrements électrophysiologiques. En particulier, deux scenarios peuvent nécessiter une analyse post-mortem de la localisation et l'état de préservation des zones enregistrées. 1) Les données obtenues chez différents animaux sont très dissimilaire, mettent en question la bonne implantation dans les zones ciblées, ou le bon positionnement des matrices sur une zone corticale permettent une implantation perpendiculaire aux couches corticales. 2) Une mauvaise qualité des signaux électrophysiologiques, ou une forte détérioration des signaux à travers le période d’enregistrement peut suggérer un dommage important du tissue cortical autour des matrices. Cela sera important à considérer pour l’analyse des données, et pour une future utilisation du même dispositif chez d'autres animaux. Si chez certains animaux, après la fin de l'enregistrement des données, on estime qu'il n'est pas nécessaire de procéder à une vérification post-mortem, les animaux seront gardés en vie. Dans ce cas, le connecteur et les câbles pour les matrices seront coupés, laissant les matrices en place. La base de connecteur, sera explantée du crâne et la peau sera fermée et suturée. Apres une récupération complete de leur état de santé et de bien-être général, les animaux gardés en vie peuvent 1) si possible, être inclus dans un autre projet basé sur un dispositif expérimental similaire, permettant d’éviter l’utilisation des autres animaux naïfs. Les animaux réutilisés seront déjà habitués au contexte expérimental (interactions quotidiennes avec l’homme, mise en chaise, travail dans le dispositif expérimental). Sinon, 2) en particulier les femelles peuvent retourner dans un établissement éleveur pour être inclues dans une programme d’élevage.

Remplacement

Le projet implique l'utilisation d'animaux car à ce jour, il n'existe pas d'alternatives expérimentales permettant de répondre aux objectifs. Aucune simulation informatique ou culture cellulaire ne peut remplacer le modèle animal vivant pour l'étude des substrats neuronaux de comportements visuomoteurs complexes. Les techniques électrophysiologiques utilisées dans le projet, permettant une mesure de l'activité de neurones unitaires, bien qu'utilisées en milieu clinique, restent trop invasives pour être utilisées chez l'homme pour des approches expérimentales.

Réduction

Les procédures chirurgicales prévues comportent un certain risque. En outre, la qualité des enregistrements à long terme est difficile à évaluer, car l'implant que nous utiliserons est récent. Nous prévoyons d'inclure un maximum de trois animaux dans cette étude. Si nous obtenons suffisamment de données (neurophysiologiques et séances comportementales) pour une analyse statistique satisfaisante chez deux animaux, nous n'utiliserons pas de troisième animal. Pour chaque animal, l’enregistrement avec plusieurs matrices multi-électrodes permettra de mesurer l’activité de populations neuronales dans plusieurs structures corticales. Le nombre de neurones enregistrés peut varier d’une matrice à l’autre en fonction du succès de la procédure d’implantation. La richesse des enregistrements multi-électrodes offre la possibilité de réaliser de très nombreux types d’analyses portant sur les potentiels d’actions de neurones isolés (modulation de fréquence de décharges ou de synchronisation entre neurones dans différentes périodes de la tâche ou dans différentes structures), sur les populations de neurones (distribution spatiale de l’activité, moyennes de populations), sur les potentiels de champs locaux (LFP) et sur la synchronisation entre LFP et potentiels d’actions. La répétition des séances d’enregistrement sur une durée de 2 à 12 mois a pour objectif d’augmenter le nombre de neurones différents enregistrés dans chaque structure. Cette augmentation permet d’augmenter la puissance statistique de nos analyses, et d'évaluer la stabilité des modulations neuronales et comportementales détectées à travers plusieurs mois. La durée totale des enregistrements pour un animal est étroitement dépendante de la qualité du signal lors des premiers enregistrements et de sa stabilité sur long terme. De fait, elle ne peut être définie à priori.

Raffinement

La cage et volière de l’animal est enrichi de perchoirs, de cordes et de jeux suspendus, pour favoriser les comportements exploratoires de l'animal et aussi le retour à une activité normale en période post-chirurgicale. Après un délai minimal d'une semaine et selon l'état de récupération, l'animal sera sorti en chaise afin de reprendre une routine qui lui est familière. Les méthodes de renforcement positif (training et habituation) seront utilisées afin de réduire le stress des sujets. Le IRM anatomique pre-chirurgicale permet de mieux planifier l’implantation des matrices chroniques, pour bien atteindre les aires corticales ciblées. L'utilisation du masque de contention au lieu d’un plot de tête fixée sur l’os est moins invasive. Les matrices multi-électrodes de nouvelle génération permettent des enregistrements simultanés de neurones dans différentes aires et couches corticales, ce qui implique une réduction d'études et de sujets utilisés, comparé aux recherches effectuées avec des électrodes simples. Le connecteur pour l’implant dans le deuxième hémisphère sera connecté sur la même base de connecteur, déjà fixée sur l’os.

Choix des espèces

L’espèce macaque rhésus est l’espèce de primate non humain utilisée préférentiellement par des laboratoires de recherche étudiant les processus visuomoteurs. Ce choix s’appuie sur la proximité des systèmes visuel (vision diurne binoculaire et trichromatique) et moteur (utilisation du bras pour saisir et manipuler les objets) ainsi que celle de l’anatomie fonctionnelle du cerveau entre les macaques et l’homme. L’utilisation répandue des singes rhésus a permis l’optimisation des procédures d’entraînement ainsi que celle de la gestion de leur alimentation, de leur hébergement et des soins vétérinaires. Les macaques rhésus s’adaptent rapidement aux protocoles de conditionnement comportemental et présentent des performances comportementales très similaires à celles observées chez l’homme. Les animaux seront utilisés au stade de jeune adulte/adulte. A ce stade du développement, les animaux ne sont plus en croissance et leurs besoins physiologiques sont stabilisés. Cela permet un contrôle plus précis des protocoles expérimentaux, que ce soit en termes de volume des récompenses utilisées pour l'apprentissage par renforcement, de contrôle du régime alimentaire dans la cage ou de localisation des structures cérébrales cibles pour les implants chirurgicaux. Par ailleurs, les animaux étant encore jeunes, ils présentent une meilleure tolérance aux procédures expérimentales et une meilleure récupération suite aux procédures nécessitant une anesthésie.

1 402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées à des additifs alimentaires de la vie in utero à l'âge adulte, elles subissent deux tests comportementaux au sevrage et huit à l'âge adulte, dont le porteur ne précise pas la nature. Il affirme que ces tests ne durent que quelques minutes et n'induisent pas de stress majeur, et que l'exposition alimentaire ne peut être étudiée que sur des animaux vivants. Toutes les souris sont mises à mort pour des analyses biochimiques et cellulaires.

Objectifs

Le projet porte sur l’étude de l’impact d’une exposition chronique à des additifs alimentaires sur la mise en place du cerveau et de ses fonctions depuis la vie in utero jusqu’à l’âge adulte, en observant la régulation et les fonctions microgliales ainsi que le développement cérébral et le comportement

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats permettra de mettre en avant l’importance de la période périnatale ou non dans l’exposition aux additifs alimentaires, d'explorer le devenir périnatal des additifs alimentaires, et d’en évaluer les effets sur les fonctions cérébrales des descendants, jusque dans leurs intéractions directes. Ceci permettra de d’accroitre les connaissances scientifiques sur les additifs alimentaires qui sont largement critiqués voir prohibés dans l’alimentation et de valider ou non leur lien avec des altérations comportementales, neurologiques et moléculaires.

Procédures

Tests comportementaux au sevrage (2 tests) et à l’age adulte (8 tests) – quelques minutes par test

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux.

Devenir

tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de réaliser des analyses biochimiques et cellulaires lors des différents temps d'exposition proposés dans le projet.

Remplacement

L’étude de l’exposition à des additifs alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au mieux grâce à l’utilisation de tests statistiques montrant la différence entre plusieurs groupes.

Raffinement

Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux l'inconfort (manipulation régulière et hébergement en cage collective avec enrichissement, utilisation d'antalgiques) des animaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent et reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier notamment le cerveau et son fonctionnement (test comportementaux et électrophysiologie). Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6. Les souris mâles et femelles reproducteurs seront utilisées à l’âge adulte (8 semaines) afin qu’ils soient capables de procréer et leurs descendants seront utilisés au sevrage ou à l’âge de 3 mois selon les procédures. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition périnatale suivie d’une exposition post-sevrage sur le développement des fonctions cérébrale, ainsi que son maintien chez l’adulte.