Système nerveux

135 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué, puis leur mémoire spatiale est évaluée par le test du labyrinthe de Barnes, répété plusieurs fois par jour sur plusieurs jours, pour étudier le rôle des plaquettes dans la réparation cérébrale. Le porteur décrit un déficit moteur et sensoriel faible et transitoire, qui disparaîtrait en trois jours. Les retombées pour les patients victimes d'AVC sont renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat restant de comprendre la contribution des plaquettes.

Objectifs

En France, l'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, c’est à dire l’occlusion d’un vaisseau cérébral par un caillot sanguin, touche une personne toutes les 4 minutes. Les conséquences d’un AVC sont sévères : 25% des patients décèdent de leur AVC, 40% garderont un handicap et 25% développeront une démence. Les seuls traitements disponibles sont soit l’administration d’un médicament permettant de dissoudre le caillot de sang soit un dispositif médical permettant de le retirer mécaniquement. Malheureusement, ces traitements ne sont possibles que lors des 6 premières heures après la survenue de l’AVC ce qui limite considérablement leur utilisation. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements pour étendre la fenêtre thérapeutique à la phase aiguë de l'AVC, mais aussi pour améliorer la réparation et /ou la récupération des dommages neurologiques post AVC. Des études récentes ont montré que des thérapies ciblant l’inflammation cérébrale pouvaient stimuler la modification structurale ou fonctionnelle du réseau neuronal (remodelage cérébral) et favoriser la récupération post-AVC à long terme, sur le plan de la motricité mais aussi en limitant/empêchant la démence. Un caillot sanguin est formé essentiellement de plaquettes. Ces dernières jouent un rôle essentiellement dans la coagulation du sang mais sont de plus en plus reconnues comme des modulateurs pertinents d'autres processus physiopathologiques, tels l'inflammation et la régénération tissulaire. A ce jour, leur contribution à la réparation neurovasculaire n’a été que très peu étudiée et uniquement à la phase aiguë. Étant donné que les plaquettes peuvent produire des facteurs favorisant le remodelage cérébral et/ou neuroprotecteurs, elles pourraient être impliquées dans les processus de remodelage cérébral après un AVC. L’objectif de ce projet vise à étudier le rôle des plaquettes dans la réparation cérébrale à long terme, et en particulier les conséquences d’un déficit en plaquettes sur la mémoire et l’apprentissage à long terme dans un modèle murin d’AVC.

Bénéfices attendus

L’AVC ischémique est aujourd’hui la 2nde cause de démence dans le monde, faisant d’elle une maladie chronique. Les plaquettes étant des réservoirs de facteurs neurotrophiques (protéines responsable de la croissance et de la survie des neurones) et de réparation cérébrale, facteurs connus pour être impliqués dans les processus de remodelage cérébral à long terme, il est nécessaire de comprendre leur contribution dans le développement de ces troubles de la mémoire. L’étude des mécanismes de mémoire et d’apprentissage dans des modèles d’AVC à long-terme nous permettrait ainsi d’obtenir une première réponse quant au rôle des plaquettes dans les processus de réparation post-AVC à long terme et dans le développement de ces troubles de la mémoire.

Procédures

Le Barnes maze consiste à explorer la mémoire spatiale, c’est-à-dire le temps mis par la souris pour se souvenir de l’endroit où a été placée une boite noire sous un labyrinthe circulaire de 20 trous. C’est une procédure observationnelle sans geste technique. La souris est placée dans un labyrinthe de Barnes permettant d’évaluer le temps nécessaire à une souris pour se souvenir de l'emplacement d'une zone cible. La souris sera simplement observée pendant 4 minutes. Cette phase d’observation sera réalisée 3 fois par jour pendant 4 jours, puis renouvelée 1 fois sur une journée après 2 jours de repos (même zone cible) et enfin pendant 3 jours en changeant l’emplacement de la zone cible. Entre chaque essai sur une journée, les souris seront laissées 1h au repos.

Impact sur les animaux

Ce modèle d’AVC conduit à un faible déficit et transitoire de la fonction motrice et sensorielle. Ces troubles disparaissent en quelques jours (3 jours en général)

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de projet dans un autre établissement pour lequel une autorisation a déjà été obtenue.

Remplacement

Aucun modèle in vitro ne permet de rendre compte de la complexité des évènements qui se mettent en place de manière intégrée au cours du temps après l’accident vasculaire cérébral, en particulier le comportement de la souris tels l’apprentissage et la mémoire.

Réduction

Les modèles d’AVC développés chez la souris sont parfaitement connus et maitrisés par les membres de l’équipe impliqués dans ce projet, ce qui permet l’évaluation précise du nombre d’animaux nécessaire afin de réaliser des statistiques ayant une puissance suffisante pour interpréter les résultats.

Raffinement

Le soin et le suivi des animaux seront faits par des personnes compétentes et expérimentées, journalière par l’animalier et bi-hebdomadaire par l’expérimentateur. Le bien-être de l’animal est également assuré par un enrichissement de son milieu environnemental (coton pour nidification). La douleur sera évaluée par la mise en place de points limites bien définis à l’aide d’une grille de score. En cas de douleurs, l’administration d’antalgique et d’analgésie sera réalisée. Si la douleur persiste, l’animal sera euthanasié. L’évaluation du comportement neurologique n’est pas douloureuse ; il s’agit de données d’observation. Toutes les précautions environnementales sont prises pour éviter le stress de l’animal. Les souris seront isolées dans une pièce calme adaptée à l’évaluation cognitive réservée exclusivement aux animaux de ce projet.

Choix des espèces

En se basant sur les nombreuses publications au sein de notre laboratoire, Les souris mâles seront évaluées sur le plan cognitif à l'âge adulte (fin des tests à 6 semaines après l'induction de l'accident vasculaire cérébral réalisée chez des souris adultes de 12 semaines). Nous utilserons que des souris mâles pour eviter des interférences avec le cycle hormonal des femelles.

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une microchirurgie du cerveau sous anesthésie puis des enregistrements EEG sous contention répétés sur vingt-trois jours, avant d'être tués pour prélever sang et cerveau, afin de tester une molécule anti-épileptique. Le porteur indique des douleurs liées au cadre stéréotaxique et un stress lié à la contention. Il présente ce modèle génétique d'épilepsie absence comme "incontournable" pour évaluer un nouveau médicament.

Objectifs

L'épilepsie est le syndrome neurologique le plus répandu, avec environ 70 millions de patients dans le monde. Elle se caractérise par des crises pouvant se manifester sous des formes diverses, comme une absence de manifestation visible caractérisant les épilepsies absences, ou des convulsions généralisées très spectaculaires dans beaucoup de formes d’épilepsies. Il existe de nombreux médicaments anti-épileptiques (MAEs) sur le marché, dont l’objectif est de contrôler (supprimer) les crises d’épilepsie. Néanmoins, 30 % des patients ne peuvent pas être libérés des crises malgré le large panel de MAEs disponibles. Le développement de nouvelles molécules, est donc nécessaire. C’est le sens de ce projet, visant à évaluer une nouvelle molécule dont les bénéfices ont déjà été démontrés in vivo. Il envisage de tester l’effet de la molécule sur un modèle rat d’épilepsie absences reconnu comme un modèle classique d’épilepsie généralisée d’origine génétique.

Bénéfices attendus

Les épilepsies absences affectent majoritairement les jeunes enfants. Le nombre journalier de crises peut être très élevé. Au-delà de l’impact immédiat que ces crises peuvent avoir au moment où elles se produisent (le jeune patient apparaît pour l’extérieur comme « dans la lune »), les crises peuvent altérer profondément les performances scolaires, via des mécanismes de défaut de consolidation mnésique durant le sommeil, induisant de ce fait des retards importants dans les différents apprentissages. Le développement de MAEs pertinents dans ce syndrome pourrait permettre de maintenir à un bon niveau les capacités d’apprentissage et de mémoire. De surcroît, au-delà de l’intérêt direct pour cette forme d’épilepsie, l’épilepsie absences est un modèle d’épilepsie généralisée d’ordre génétique incontournable pour l’évaluation d’un nouveau MAE.

Procédures

Micro Chirurgie cérébrale sous anesthésie général et analgésie, 30 min par rat sur 48 rats. Limitation de mobilité légère (monitoring EEG), 10 X 3h étalé sur 23J sur 48 rats.

Impact sur les animaux

Des douleurs (prise en charge par l’anesthésie et l’analgésie) liées au placement de l’animal dans le cadre stéréotaxique et à l'incision de la peau au dessus du crâne. Stress momentané (quelques minutes) dû à la contention de l’animal nécessaire pour connecter le système électroencéphalographique au rat.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour le prélèvement du sang et du cerveau

Remplacement

Les processus physiopathologiques conduisant à la récurrence des crises épileptiques sont différents d’un syndrome à un autre. Il n’est pas donc pas envisageable d’utiliser une approche in-vitro, encore moins in-silico, en remplacement de l’approche in-vivo puisque le trait évalué (fréquence des crises épileptiques) correspond à la réponse mettant en jeu tout un processus physiologique intégré chez un sujet respirant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été réduit autant que possible tout en garantissant l’atteinte de l’objectif scientifique visé. Ainsi, la taille des échantillons a été calculée de sorte à mettre en évidence de façon statistique une réduction de 30% de la fréquence des crises épileptiques.

Raffinement

Le protocole suit des procédures standardisées soucieuses de minimiser le stress et toute souffrance des animaux avec une détermination précise des points limites. Ceci se traduit par une visite quotidienne à l’animalerie pour contrôler le bien-être des animaux, l’enrichissement des cages autant que faire se peut, le respect des normes liées aux surfaces/volumes des cages pour éviter la surpopulation ainsi que celles liées aux plages acceptables pour la température et l’hygrométrie. En outre, avant les procédures chirurgicales et les enregistrements EEG, les rats seront emmenés aux salles d’expérimentation, pour habituation et diminution du stress induit par la nouveauté.

Choix des espèces

Ce modèle génétique d’épilepsie absences établi chez le rat a été validé aussi bien pour la période d’installation de l’épilepsie (épileptogénèse) que pendant la période où l’animal est considéré comme présentant une épilepsie stabilisé. Dans ce modèle d’épilepsie absences, les crises apparaissent spontanément et progressivement à partir de l’âge de 2-3 mois chez tous les rats et se stabilisent à l’âge de 6 mois, atteignant alors un plateau. Nous réaliserons donc les chirurgies et les enregistrements EEG à partir de l’âge de 6 mois.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'injection dans le cerveau puis l'implantation d'une micro-LED sur le crâne, avant des tests moteurs et des injections de L-dopa destinées à reproduire les mouvements anormaux des patients parkinsoniens. Le porteur indique que le modèle provoque hypoactivité, perte de poids et mouvements involontaires, qu'il décrit comme non douloureux. Il affirme qu'aucune simulation informatique ne reproduit la physiopathologie cérébrale et sa traduction comportementale.

Objectifs

Ce projet a pour but de tester le potentiel thérapeutique d'une méthode peu invasive de stimulation du cerveau dans la maladie de Parkinson. Le traitement symptomatique de la maladie de Parkinson repose sur la substitution de la dopamine manquante par la L-Dopa. Cependant, après plusieurs années sous L-Dopa, les patients développent des complications motrices : les dyskinésies (mouvements anormaux involontaires). Une alternative thérapeutique non médicamenteuse peut alors être proposée à certains patients: la stimulation cérébrale profonde à haute fréquence du noyau subthalamique (HFS-STN), un des noyaux des ganglions de la base. Il s’agit d’un traitement neurochirurgical symptomatique très efficace, mais qui présente l’inconvénient majeur d’être invasif et de ne profiter qu’à une minorité des patients du fait de critères d’éligibilité stricts (environ 10%). Certains types de neurones dans le cortex moteur sont activés par la HFS-STN, et la stimulation directe de ces neurones par la lumière (grâce à une fibre optique implantée dans le cerveau) dans des souris transgéniques parkinsoniennes permet de reproduire partiellement les effets bénéfiques de la HFS-STN sur les symptômes moteurs dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Ces résultats ouvrent une nouvelle voie thérapeutique moins invasive que la stimulation cérébrale profonde, donc pouvant potentiellement bénéficier à plus de patients. Dans cette étude, nous optimiserons cette voie thérapeutique chez des souris modèle de la maladie de Parkinson sur deux axes : 1) en mettant au point une méthode d'activation neurones moins invasive : illuminer à travers le crâne à la place d'insérer une fibre optique dans le cerveau 2) en comparant les effets de la stimulation sur de nouvelles localisations pour sélectionner celle qui induit les meilleurs effets bénéfiques sur les symptômes parkinsoniens.

Bénéfices attendus

Cette étude s'insère dans un projet plus large de mise au point de techniques alternatives à la stimulation cérébrale profonde dans la maladie de Parkinson. En effet cette technique est très invasive et ne peut donc bénéficier qu'à environ 10% des patients. Certains types de neurones du cortex moteur, activés par la stimulation cérébrale profonde, constituent des cibles thérapeutiques plus superficielles donc moins invasives. La stimulation par la lumière de ces neurones améliore les symptômes moteurs dans un modèle de la maladie de Parkinson chez la souris, mais nécessite l'insertion d'une fibre optique dans le cerveau. Cette étude permettra de tester et mettre au point une méthode moins invasive de stimulation par la lumière des neurones du cortex : à travers le crâne intact.

Procédures

Les souris du lot de mise au point subiront 1 chirurgies d'injection cérébrale sous anesthésie générale de courte durée (

Impact sur les animaux

Les souris utilisées pour la mise au point technique et dans le groupe contrôle non parkinsonien n'auront que peu d'effets indésirables : en effet, les lignées transgéniques utilisées n'ont pas de phénotype dommageable, et toutes les mesures sont prises pour prendre en charge la douleur péri-opératoire. Pour les souris modèles de la maladie de Parkinson, nous nous attendons à diminution de l'activité et une perte de poids durant les deux premières semaines, pendant lesquelles elles bénéficieront d'un suivi renforcé pour minimiser au maximum les nuisances. Après stabilisation, ces souris présenteront également des modifications à long terme du comportement moteur (légère hypoactivité, asymétrie de l'usage des membres). Ces modifications sont inhérentes au modèle parkinsonien, et nécessaires pour tester les effets bénéfiques de la stimulation, et ne causent pas de douleur. Après induction des dyskinésies (mouvements anormaux involontaires), les souris présenteront temporairement après chaque injection des mouvements involontaires (rotations, posture tournée d'un côté, tics des pattes et tics faciaux). Là aussi ces nuisances sont non douloureuses et nécessaires pour pouvoir tester les effets bénéfiques de la stimulation dans les conditions les plus proches de celles vécues par les patients parkinsoniens.

Devenir

Il est nécessaire de mettre à mort les animaux dans toutes les procédures pour pouvoir effectuer une vérification histologique des aires corticales ciblées et du modèle parkinsonien.

Remplacement

Pour étudier le bénéfice des stimulations proposées sur les symptômes moteurs de la maladie de parkinson, il est nécessaire d'utiliser des animaux produisant un comportement moteur (et modèles de cette maladie). Aucune méthode de simulation informatique ne permet de récapituler la complexité de la physio-pathologie cérébrale, et encore moins sa traduction comportementale. Les structures cérébrales étudiées ne sont pas présentes chez les invertébrés.

Réduction

Trois conditions sont testées sur les mêmes animaux (Parkinson, et 2 états dyskinétiques) pour réduire le nombre total d'animaux utilisés.

Raffinement

Toutes les mesures sont prises pour minimiser les nuisances subies par les souris: une anesthésie et analgésie appropriée lors des chirurgies, un suivi post-opératoire quotidien et adapté tout au long de l'utilisation des animaux, et renforcé dans le cas des modèles de la maladie de Parkinson (maintien au chaud, nourriture appétante et hypercalorique, surveillance et maintien de l'hydratation, analgésique selon nécessité), pendant tout le temps nécessaire à la stabilisation (en général 2 semaines). Les souris sont hébergées dans une animalerie agréée et disposent de matériel d'enrichissement (coton pour faire des nids, petites maisons ou tubes pour se cacher).

Choix des espèces

Il est nécéssaire d'utiliser un modèle animal mammifère pour obtenir des résultats potentiellement transposables à l'Homme, car les structures étudiées ne sont pas présentes, ou sont organisées différement chez les autres vertébrés (et absentes chez les invertébrés). Parmi les modèles animaux mammifères, nous utilisons le modèle souris qui permet l'utilisation de lignées transgéniques nécessaires à cette étude. adulte : il est nécessaire d'étudier l'effet de la stimulation cérébrale sur un animal dont le cerveau est complètement développé

605 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de la tête leur injecte de la collagénase pour provoquer une hémorragie cérébrale, suivie d'IRM, de tests de score neurologique et de force d'agrippement, puis d'une perfusion intracardiaque létale pour prélever le cerveau. Le porteur indique que le modèle peut entraîner des pertes d'équilibre, une faiblesse musculaire, une désorientation et une perte de poids. Il précise que le projet fait l'objet de financements industriels et affirme qu'aucune méthode alternative n'apporterait le même niveau d'information.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester cinq stratégies thérapeutiques dont leurs mécanismes d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’hémorragie : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. L’effet de nos cinq stratégies thérapeutiques seront évalués en utilisant un modèle d’AVC hémorragique chez le rat par gavage (per-os), par administration intrapéritonéale (i.p) ou bien par injection directe sur le site hémorragique pour chaque traitement. Nous chercherons également à comparer l’effet de ces stratégies thérapeutiques à 2 doses différentes afin de déterminer laquelle permet d’obtenir une réduction du déficit sensorimoteur ainsi que du volume hémorragique.

Bénéfices attendus

Ce projet fait l’objet de plusieurs financements industriels afin d'étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant la réduction du déficit sensorimoteur, limiter la lésion ainsi que l’inflammation causé par un saignement cérébral. Chez l’homme, les hémorragies intracérébrales spontanées (HICS), non traumatique, résulte d’une irruption importante de sang dans le parenchyme cérébral, suite à une rupture de micro-vaisseaux. Cette étude pourra mettre en évidence de nouvelles stratégies thérapeutiques pharmacologiques dans la lutte contre ce type d’AVC hémorragiques, n’ayant aujourd’hui aucun traitement de référence permettant de réduire les effets délétères d’un hématome sur le parenchyme cérébral.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la collagénase, provoquant ainsi une hémorragie dans le cerveau. Cet act chirugical durera 15 minutes. Pour les groupes traités par injection directement sur le site hemorragique, une seconde pipette sera insérée au même endroit ou la collagénase a été injectée, 20 minutes post-AVC. Cet acte durera 6 minutes. A J+1 et J+14, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 8 minutes et suiveront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+22 post hémorragie. La mesure du score neurologique durera 10 minutes. En prenant compte des temps de récupération, la mesure de la force d’agrippement durera entre 25 et 30 minutes. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC hémorragique à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire. L'hémorragie cérébrale provoque une désorientation au moment du réveil post-chirurgical. Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après l'hémorragie. Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Lors de l'administration des traitements par voie intrapéritonéale, la contention et l'injection peuvent engendrer un stress et une douleur. Un acte rapide réalisé avec du matériel adéquat par du personnel compétent limite drastiquement cette douleur et le traumatisme provoqué.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que le rat est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, le rat est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 10 rats par groupe (+ 10%), ce qui nous permettra de déceler des différences significatives. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les rats seront en groupes sociaux avec un ou plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et buchette en bois), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi biquotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. L'expérimentateur ou l'animalier pèsera chaque animal et veillera à ce que les points limites ne soient pas dépassés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue à 37.5°C grâce à un système de couverture chauffante, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Chaque site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, puis à une désinfection à la Chlorexidine et enfin l’application d’une analgésie locale. Lors de la phase de réveil, les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 2 heures avant d’être remis en cage par 2. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le rat (Rattus norvegicus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’hémorragie intracérébrale. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines soit un poids de 300g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’hémorragie.

496 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une nuit de mise en reproduction et un frottis vaginal, la moitié des femelles gestantes reçoit un régime pauvre en protéines pendant toute la gestation pour provoquer un retard de croissance chez les fœtus, et toutes subissent au seizième jour une ouverture de l'abdomen pour une électroporation in utero, qui marque les neurones des fœtus. Leurs petits sont tués à trois, huit ou trente jours de vie pour étudier leur cerveau, et une portée sur trois seulement donne un marquage exploitable, selon l'expérience du laboratoire. Les mères et les petits en surnombre sont proposés en interne à un autre projet avant d'être mis à mort.

Objectifs

Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est la deuxième cause la plus fréquente de mortalité périnatale. C’est une pathologie caractérisée par un retard de croissance général du fœtus en développement qui représente la deuxième cause la plus fréquente de mortalité périnatale. Touchant près de 3 à 9% des naissances dans les pays développés, c’est une insuffisance placentaire qui est le plus fréquemment mise en cause mais il peut également résulter d’une carence alimentaire de la mère dans les pays moins développés. Un tel retard dans le développement du fœtus entraine des déficits cognitifs à long terme caractérisés par des troubles de la concentration, de l’attention, une hyperactivité, un quotient intellectuel plus faible ainsi que des désordres moteurs. Le cortex ainsi que son réseau neuronal est le siège des fonctions cognitives de haut niveau. Ce projet consistera à utiliser le modèle de rat de RCIU pour appliquer une technique innovante qui permet de marquer de manière très claire des neurones isolés pour nous permettre d’apprécier d’une part les morphologies neuronales et d’autre part les interactions des neurones avec les vaisseaux sanguins environnants que l'on pourra mettre en évidence par des techniques classiques d'histologie.

Bénéfices attendus

Etudier les conséquences d’un RCIU sur l’intégrité du système nerveux central et plus précisément sur l’intégrité de ces réseaux neuronaux est indispensable pour mieux comprendre la mise en place de ces déficits cognitifs observés à long terme, afin d’envisager des stratégies thérapeutiques applicables dès la naissance pour limiter ces troubles cognitifs.

Procédures

Deux prélèvements sont effectués dans le cadre de ce projet. Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et deux femelles par cage maximum) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation (22jours). Une chirurgie expérimentale appelée électroporation in utero est appliquée sur chacune de ces femelles au 16e de gestation. La chirurgie ne dure pas plus de 40 minute à partir de l’anesthésie jusqu’au réveil.

Impact sur les animaux

Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une perte de poids associé à ce régime pourra être observé durant la période de gestation. Le régime n’induit pas de perturbation du système digestif, si ce n’est des fèces d’une couleur plus claire. Ces effets indésirables n’ont pas de conséquences sur la mise bas des femelles d’après les projets déjà évalués. La taille des portées issues d’un RCIU peut être plus petite mais aucune mortalité supplémentaire n’est observée. La laparotomie appliquée à ces mêmes femelles au 16e jour de gestation peut également entrainer des changements dans le comportement de la femelle. Le réveil suite à la chirurgie peut être source de stress et suivie d’une inactivité et de douleurs. Ces observations ne durent pas plus de 2 à 3 jours selon les projets déjà évalués.

Devenir

Tous les animaux subissent la chirurgie d’électroporation in utero. En revanche, la moitié des femelles gestantes de ce projet ne sont pas soumis à un régime hypo-protéinée durant la période de gestation pour constituer un groupe contrôle. Après la mise à bas, les nouveau-nés seront maintenus en vie jusqu’au prélèvement des tissus à différents temps (P3, P8 ou P30). Parce que des différences métaboliques et une réaction inflammatoire influençant le développement du système nerveux central peuvent être observées entre les portées d’une femelle ayant déjà subi une intervention chirurgicale et notamment une laparotomie, nous ne réutiliserons pas ces mêmes animaux pour produire d’autres portées. En revanche, les femelles ainsi que les petits surnuméraires seront proposées en interne pour une réutilisation dans un autre projet avant de les mettre à mort.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de barrières hémoencéphaliques (cellules endothéliales cérébrales) existent, ils ne permettent pas d’étudier de façon concomitante la mise en place des réseaux neuronaux et vasculaires. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro, et la maturation des neurones ainsi que leur connectivité (entre eux mais aussi avec le réseau vasculaire environnant) ne peuvent être étudiés qu’in situ, dans un animal vivant. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal pour étudier la pathologie. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.

Réduction

Toutes les expériences sont planifiées avec un nombre minimal d’animaux, mais nous devons garantir une pertinence statistique significative (Annexe 2). Des recherches bibliographiques, des calculs statistiques de puissance, ainsi que les expériences passées du laboratoire démontrent que 10 animaux par groupe permettent d'obtenir des résultats significatifs à la suite de tests statistiques bilatéraux non paramétriques sur des échantillons indépendants. En revanche, les expériences passées dans le laboratoire ainsi que des recherches bibliographiques démontrent un taux d’efficacité d’électroporation moins important chez le rat que dans les modèles murins sur lesquelles le projet s’est inspiré (43% de réussite). Cela signifie qu’un nombre plus important de femelles est nécessaire pour obtenir suffisamment d’embryons pour lesquels l’électroporation a été efficace, positive. Selon les expériences passées du laboratoire, 1 portée sur 3 obtient des résultats positifs au marquage in utero. Ce nombre est néanmoins réduit car il nous sera possible d’utiliser les résultats des animaux du groupe contrôle d’un projet déjà existant utilisant la même procédure pour P8 et P30. Notre approche expérimentale nous permet d’analyser plusieurs dizaines de neurones ainsi que leur réseau vasculaire sur un même animal. Par ailleurs, les mêmes cerveaux pourront être utilisés pour d’autres marquages immunohistochimiques, permettant ainsi de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Il existe dans le laboratoire un système de préservation jusqu’à plusieurs années de toutes les séries de coupes non utilisées. Cette banque de tissus permet d’optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisé. Les mères ayant subi cette procédure, ainsi que les petits surnuméraires, sont proposés en interne pour être réutiliser dans le cadre d’un autre projet.

Raffinement

De nombreuses actions de raffinement seront mises en place lors de ce projet. La mise en reproduction s’effectue en respectant les normes d’hébergement. Nous réunissons au maximum deux femelles et un mâle par cage pour une nuit seulement. Nous surveillons leur comportement et si la moindre violence est observée alors les animaux sont immédiatement séparés. Les femelles gestantes sont pesées tous les trois jours afin de prévenir d’une perte de poids trop importante associée au régime alimentaire. Nous mettons fin au protocole si la femelle perd plus de 10% de son poids initial (pesée le jour de la mise en reproduction). Toute procédure de chirurgie sera accompagnée d’utilisation d’anesthésiques et/ou d’analgésiques, et d’un suivi journalier des animaux afin de détecter et traiter immédiatement tout signe d’inconfort.

Choix des espèces

Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats Sprague Dawley (SD) puisqu’il s’agit de l’espèce utilisée dans l’équipe pour plusieurs projets. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requiert une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits et récupèrent très vite après une chirurgie. Les électroporations in utero seront effectuées à 16.5 jours embryonnaires (E16.5) pour nous permettre le ciblage des progéniteurs donnant naissance aux neurones corticaux superficiels. Les animaux seront mis à mort à 3 jours postnatal (P3), P8 et P30. Ces différents temps nous permettront d’analyser l’organisation des réseaux neurovasculaires au cours du développement postnatal et ainsi apprécier des modifications qui persisteraient à long terme.