Système nerveux

Une pompe glissée sous la peau sous anesthésie générale, sept jours d'injections quotidiennes dans l'abdomen, puis des tests de mémoire : 636 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comparer deux modes d'administration de la FENM, un dérivé de la mémantine. Certaines appartiennent à une lignée transgénique qui développe des lésions de type Alzheimer, d'autres reçoivent un peptide amyloïde pour en provoquer une forme aiguë, une injection absente de la description des procédures. Le porteur évoque des labyrinthes sans les nommer et un test d'évitement passif qui impose des "stimulus désagréables", et ne laisse dans les cages que des copeaux de carton, parce qu'un enrichissement trop important "interagit avec l'étude de la mémoire". Après les tests, toutes sont tuées par une dose létale d'Exagon et leur cerveau est prélevé.

Objectifs

Les traitements disponibles aujourd’hui pour traiter la maladie d’Alzheimer (MA) sont essentiellement symptomatiques. C’est le cas de la mémantine, un antagoniste non-compétitif du récepteur au NMDA malheureusement aujourd'hui déremboursé en France, comme tous les médicaments disponibles contre la MA. La recherche pharmacologique explore donc activement d'autres pistes, la première d'entre elles étant de mettre au point des molécules similaires(antagonistes du RNMDA) mais plus actives et sans effets secondaires. La piste suivie par le laboratoire s'articule autour des dérivés directs de la Mémantine et notamment la Fluoroéthylnormémantine (FENM) qui s'est avéré être un neuroprotecteur plus efficace à dose égale que la Mémantine. Une question essentielle pour envisager le développement clinique de ce composé est de bien comprendre les spécificités et les conséquences pharmacologiques d'un traitement au long cours, notamment selon la voie d'administration et le mode d'injection. Dans la MA en effet, certains médicaments existent selon deux modes d'administrations, comme la rivastigmine (Exelon® gélule ou solution buvable vs Exelon® dispositif transdermique), mais ce n'est pas le cas de la Mémantine (Ebixa® comprimé ou solution buvable). Ce projet a donc pour but de comparer deux modes d'administrations de la FENM, par injection direct (Bolus) ou diffusion passive (Pompe). Pour cela, trois types de modèles seront étudiés dans ce projet, un modèle contrôle non pathologique afin de confirmer que les modes d'injections n'impactent pas la santé de l'animal, un modèle aigu de la maladie d'Alzheimer et un modèle transgénique de la maladie d'Alzheimer

Bénéfices attendus

Les données préliminaires obtenue au laboratoire suggèrent en effet que la FENM serait un neuroprotecteur puissant, validé pour l’instant dans un modèle pharmacologique aigue de la MA chez la souris. La molécule présenterait une efficacité supérieure à celle de sa molécule parente, la mémantine notamment sur les aspects anti-inflammatoires et une absence d’effet amnésiant direct aux doses élevées. Le but de ce projet est de consolider ces résultats dans un modèle transgénique murin de la MA, un modèle qui se rapproche des caractéristiques histopathologiques et cliniques de la MA avec une évolution progressive de la pathologie, dans le but in fine de passr à un développement clinique de la FENM.

Procédures

Les animaux auront une procédure chirurgicale permettant la pose de Pompe Alzet sous cutanée qui permet de faire diffuser le médicament dans le système sanguin. Cette procédure rapide (15 min) se fera sous anesthésie générale. Les animaux auront également des injections intrapéritonéale quotidienne pendant 7 jours afin d'administer le médicament sous forme de "bollus". Afin d'évaluer le statut mnésique des animaux, des tests comportementaux type "labyrinthe" seront effectués.

Impact sur les animaux

Les animaux auront une chirurgie permettant l'innoculation par diffusionn de la FENM à l'aide d'une pompe Alzet. Les animaux auront également une injection intra-péritonéale durant 7 jours. Certains tests comportementaux comme le tetst d'évitement passif engendreront des stimulus désagréables pour l'animal.

Devenir

Après la serie de tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés et le materiel biologique (cerveau) sera récuperé pour procéder à des analyses port-mortem.

Remplacement

Les modèles précliniques d’étude des mécanismes complexes de neurodégénération dans la maladie d’Alzheimer les plus performants sont des modèles murins et plus particulièrement des modèles murins transgéniques développant la pathologie progressivement après plusieurs mois de vie. Les propriétés neuroprotectrices de la FENM seront analysées en administration chronique sur un modèle transgénique de la maladie d’Alzheimer, les souris APPSwe/PS1dE9 ainsi qu'un modèle pharmacologique d'injection de peptide amyloïde‐ß[25‐35] oligomérisé.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux les doses administrées aux animaux se baseront sur les doses efficaces observées sur un modèle aigu de la MA précédemment obtenus au laboratoire. Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Une veille bibliographique sera également prise en compte durant les 5 années du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.

Raffinement

Nous procéderons à l’enrichissement minimal du milieu, car un enrichissement trop important interagit avec l’étude de la mémoire. Les animaux auront donc seulement accès à des copeaux de cartons afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. De la naissance jusqu’à la fin de vie des animaux les procédures d’injections seront peu douloureuses avec une administration par voie intra péritonéale et par diffusion sous cutanée. Pour éviter toute souffrance aux animaux, après analyses des tâches comportementales, ils recevront une dose léthale d’Exagon au moment du sacrifice. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu et si nécessaire la mise à mort de l’animal serait anticipée. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci sera isolé du reste du groupe ou présentera des lésions cutanées signe d’un stress. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur

Choix des espèces

Les souris C57BL/6 mâles seront utilisées pour différencier l'effet des deux modes d'administrations (bolus VS infusion). Les composés seront testés dans une large gamme de dose de 0,03 à 1 mg/kg/jour. Ces souris témoins sont le fond génétique des souris transgéniques APPPS1 utilisées pour la suite de l'étude, il est donc important de travailler avec le même fond génétique pour ce projet. Les souris APPPS1 seront par la suite utilisées pour tester l'efficacité des composés aux doses efficaces en bolus VS infusion. Cette lignée développe la pathologie progressivement avec des altérations comportementales dès 9 mois et qui sont très marquées à 12 mois d'âge. Les dépôts amyloïdes, la neuroinflammation, la gliose et le stress oxydant apparaissent même plus tôt, dès 6 mois, c'est donc un très bon modèle expérimental pour refléter les symptômes de la maladie d'Alzheimer. Les souris C57/BL6 seront utilisées à l'âge de 3 mois qui correspond à l'âge adulte les souris APPS1 à l'âge de 3 mois afin de visualiser si la FENM a un effet neuroprotecteur avant l'apparition des premiers signes de la pathologie et 6 mois afin de visualiser un effet neuroprotecteur sur le comportement de ces souris.

Huit heures par jour pendant seize semaines, 160 souris sont placées en hypoxie intermittente, une privation d'oxygène répétée censée reproduire l'apnée du sommeil. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec trois séries d'injections d'insuline, de glucagon, d'adrénaline ou de dexaméthasone, des gouttes de sang prélevées à la queue et trois ECG et échographies cardiaques sous anesthésie générale. Le porteur décrit des effets "sans conséquence majeure", une ventilation et un hématocrite en hausse, alors que le projet doit établir si ce stress hypoxique dérègle le système sympathique et le métabolisme du foie. Toutes sont tuées au bout des seize semaines pour prélever leurs organes, que d'autres chercheurs du laboratoire pourront se partager.

Objectifs

Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -L’hypoxie intermittente (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système sympathique ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ?

Bénéfices attendus

L'activation du système sympathique dans la pathologie de l'AOS commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'HI avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au SAOS.

Procédures

Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Le modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagon devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose à 10% (2mg/kg). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augementer légèrement la fréquence cardiaque.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.

Remplacement

Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système sympathique .

Réduction

Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal graçe a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice teminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.

550 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de fixation d'une pièce métallique sur le crâne, une restriction hydrique et, pour une partie, une perfusion intracardiaque terminale, afin d'enregistrer l'activité de neurones pendant des tâches olfactives. Les souris sont maintenues assoiffées, la totalité de leur eau quotidienne servant de récompense pour les faire travailler dans le dispositif, où elles doivent aussi éviter des bouffées d'air ou d'eau salée. Le porteur affirme que la souris est le seul mammifère au système olfactif proche de l'humain et qu'aucune approche in vitro ou in silico ne peut répondre à ses questions.

Objectifs

Les odeurs ont une capacité unique à nous transporter dans des moments reculés de notre passé, notamment ceux associés à des émotions fortes. Elles jouent également un rôle très important dans les choix que nous faisons au jour le jour, notamment lorsqu’il s’agit de notre alimentation. Mais qu'est-ce qui, dans le système olfactif, confère aux odeurs ces propriétés particulières ? Dans cette étude, nous étudierons les voies anatomiques et les mécanismes physiologiques par lesquels les odeurs laissent une empreinte émotionnelle si forte dans nos mémoires.

Bénéfices attendus

Cette recherche peut fournir des indications importantes sur les mécanismes neuronaux qui attachent une valence hédonique à un objet. Dans de nombreux troubles neurodégénératifs, à mesure que la maladie progresse (en particulier dans le cas de la dégénérescence du lobe frontal), les patients souffrent car ils sont moins connectés au monde qui les entoure. La valeur qu'ils attribuent à différents éléments peut être déformée, ce qui peut entraîner des changements radicaux dans leur personnalité, inquiétants pour eux et leurs proches. Si cette recherche permet de découvrir l'ensemble des connexions qui attribuent une valeur émotionnelle aux odeurs, elle peut donner un aperçu de la physiopathologie de ces troubles. Outre les maladies neurodégénératives, des études récentes ont également montré que les enfants atteints de troubles du spectre autistique (TSA) n'adaptent pas leur comportement de reniflage lorsqu'on leur présente des substances odorantes aversives ou appétissantes, alors que les enfants au développement normal le font. Cela suggère une déconnexion entre l'intégration des informations sensorielles et les processus de mémoire émotionnelle dans les TSA, et ce travail pourrait permettre de comprendre comment les odeurs se voient attribuer une signification émotionnelle qui conduit à un comportement adaptatif.

Procédures

Dans cette étude, toutes les souris (550) subiront une intervention chirurgicale. Certaines souris (490) seront fixées à la tête et soumises à une restriction hydrique, et d'autres seront perfusées par voie intracardiaque à la fin de l'étude (460).

Impact sur les animaux

Dans cette étude, les souris seront placées dans un appareil comportemental dans lequel elles devront utiliser leur odorat pour trouver une récompense hydrique et éviter les petites bouffées d'air ou d'eau salée. Afin de pouvoir présenter les odeurs aux souris de manière précise et juste devant leur nez, nous devrons maintenir les souris au sein du dispositif comportemental qui permet de délivrer les odeurs. Ce maintien sera réalisé à l'aide d'une petite fixation métallique attachée à leur crâne au préalable. Pour les motiver à effectuer des tâches dans l'appareil, la totalité de l'apport en eau quotidien nécessaire aux souris sera fournie pendant les tests comportementaux.

Devenir

Sur les 490 souris soumises à une restriction hydrique, 90 seront mis à mort et 400 seront gardé en vie. Sur les 550 (y compris les 490 de la restriction hydrique) animaux qui subissent une intervention chirurgicale, 90 (le même 90 que la restriction hydrique) seront mis à mort et 460 seront gardés en vie. Ces 460 pourront être mises à mort et utilisé pour contrôles histologiques en fin d’expérimentation.

Remplacement

La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront une tâche comportementale : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est de 550 souris sur 5 ans. Les techniques d’enregistrement (électrodes très fines et lentilles à gradients d'indices) que nous prévoyons d’utiliser permettent de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés car un grand volume de données pourra être collecté sur plusieurs jours au sein d’un même animal. Ce nombre sera réduit davantage grâce à nos études pilotes qui permettront une optimisation des paramètres de nos expériences.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début de leur entraînement, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L'accoutumance à l'expérimentateur et aux conditions expérimentales permettra également aux animaux d'accomplir les tâches comportementales avec un minimum de stress.

Choix des espèces

Ce projet vise à comprendre les mécanismes neuronaux qui explique comment la valence hédonique d'une odeur affecte son encodage dans le cortex olfactif, et comment cette information est acheminée pour guider les comportements adaptatifs. Le cerveau doit donc être intact pour que les connections entre les différentes aires cérébrales soient maintenues et que nous puissions étudier leur interactions réciproques. De plus, nous étudions le fonctionnement des circuits neuronaux alors même que la souris est en train d’apprendre et d'exprimer leur préférences olfactifs : il nous faut donc travailler avec des animaux vivants et vigiles. La souris est la seule espèce de mammifère qui possède un système olfactif très similaire à celui des humains dans lequel nous pouvons entraîner les animaux à s'approcher et à éviter différentes odeurs tout en enregistrant et en manipulant l'activité dans des groupes de neurones génétiquement et anatomiquement circonscrits. La boîte à outils pour ces manipulations chez la souris est bien plus développée que pour tout autre organisme modèle. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. Par précaution par rapport à ce dernier point, nous utiliserons uniquement des animaux dont le poids est compris entre 20 et 45g.

1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Chaque animal reçoit des injections induisant une encéphalomyélite, modèle de sclérose en plaques, dont le porteur décrit les signes attendus, une faiblesse pouvant aller jusqu'à la paralysie des membres. Les souris sont suivies par un score clinique pendant 28 jours puis tuées pour prélever cerveau, moelle épinière et organes. Le porteur affirme que ce modèle est la seule alternative adaptée à l'étude des mécanismes immunitaires de la maladie.

Objectifs

Notre projet a pour objectif général de caractériser la composante immunitaire de l’inflammation chronique. Celle-ci est liée à des pathologies aussi diverses que les cancers, les maladies cardio-vasculaires et les maladies autoimmunes, notamment la sclérose en plaques (SEP), maladie autoimmune du système nerveux central (SNC), touchant plus de 100.000 personnes en France et 3 millions dans le monde. Il a en effet été montré que chez des patients atteints de SEP, les lymphocytes T régulateurs (Treg) perdent leur fonction suppressive. De plus, dans un environnement inflammatoire, l’identité même des Tregs est modifiée, menant à des modifications épigénétiques et phénotypiques, et aboutissant à une perte de leur capacité régulatrice. La compréhension de ces phénomènes pourrait pourtant permettre de mieux comprendre le déficit fonctionnel des Treg au cours de la SEP, et de définir des cibles thérapeutiques et donc de nouveaux traitements de cette pathologie. Les modèles animaux de SEP permettent, contrairement à ce qui est possible chez les patients, d’étudier l’inflammation locale. L’objectif de ce projet est d’étudier les modifications d’identité des Tregs au cours de l’inflammation chronique dans un modèle de SEP, l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE) chez la souris.

Bénéfices attendus

La SEP est une maladie extrêmement invalidante, réduisant l’espérance de vie, induisant un coût social important et touchant plus de 3 millions de patients dans le monde. Les traitements actuels permettent dans certains cas de ralentir la progression de cette pathologie, mais l’arsenal thérapeutique n’est encore pas assez développé, et bon nombre de patents ne répondent pas, ou plus, aux traitements. Cette pathologie a pour origine un dysfonctionnement du système immunitaire dont les mécanismes ne sont pas encore bien identifiés. Les recherches portant sur la compréhension de ces mécanismes immunologiques sont indispensables à l’élaboration de nouveaux traitements de la SEP. Le système immunitaire formant un système complexe dont la globalité n’est pas pleinement reproductible in vitro, les modèles animaux de cette maladie permettent de mieux comprendre les étapes cellulaires et moléculaires à l’origine de l’initiation, du développement et de l’entretien des atteints du SNC caractérisant la SEP et menant au handicap qui en résulte. Les bénéfices attendus de notre projet sont, à court terme, de comprendre les mécanismes immunitaires de l’inflammation chronique du SNC dans le modèle d‘EAE pour, à plus long terme, définir des cibles thérapeutiques qui constitueront la base de nouveau traitements de la SEP chez les patients.

Procédures

2 injections sous cutanées et 2 injections intra-péritonéales en 2 jours, sur animaux vigiles, d'une durée de moins d'une minute par injection. Un prélèvement de sang rétro-orbitaire sous anesthésie générale (1 à 2 minutes pour le prélèvement, environ 1h d'anesthésie) une semaine avant le début des injections et un prélèvement de sang intra-cardiaque (1 à 2 minutes de prélèvement) sous anesthésie générale terminale également en fin d'expérimentation. Les traitements seront réalisés quotidiennement par voie orale (moins de 2 minutes) ou intra-péritonéale (moins de 1 minute) dans un volume maximum de 0.2 ml et dilués dans de l’eau ou du PBS, au maximum pendant toute la durée de l’expérience, soit 28 jours. Le scoring (environ 2 minutes par souris) sera effectué par examen clinique des animaux : simple observation de la queue (flaccidité ou non), des pattes postérieures et antérieures (mobiles ou non). L’état général des animaux sera évalué à chaque scoring. Le scoring sera réalisé trois fois par semaine pendant 28 jours.

Impact sur les animaux

Les effets attendus sont les signes cliniques de l’EAE : perte de mobilité (faiblesse à paralysie des membres postérieurs et antérieurs) réversibles après 2 semaines en absence de traitement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Ceci permettra d'effectuer de nombreux prélèvements d'organes (cerveau, rate, moelle épinière, ganglions, moelle osseuse et sang) et de réaliser de nombreuses analyses in vitro complémentaires aux résultats cliniques obtenus.

Remplacement

Notre projet porte sur la compréhension de la physiopathologie d’une maladie autoimmune inflammatoire, la SEP. Aucun système in vitro ou in silico ne peut à l’heure actuelle reproduire la complexité des mécanismes cellulaires et moléculaires initiant et entretenant cette pathologie. Les modèles animaux de SEP, dont le principal est l’EAE, miment le développement de l’autoimmunité et le declenchement de l’inflammation chronique du SNC. Ils sont ainsi la seule alternative adaptée à l’étude des mécanismes immunitaires de la SEP.

Réduction

Cette étude utilisera un total de 1200 animaux. Le nombre de souris nécessaires dans chaque procédure est défini sur la base d'un calcul de puissance et des études réalisées historiquement dans le laboratoire. Le nombre de souris défini pour chaque groupe devrait être suffisant pour obtenir des données statistiquement exploitables. Nous avons tenu également compte d'une possible perte d'animaux liée à la procédure expérimentale. Des analyses statistiques seront réalisées pour obtenir une interprétation fiable des résultats. Sur les animaux seront prélevés sur chaque animal le sang, le cerveau, la moelle épinière la rate, les ganglions et la moelle osseuse afin d’obtenir un maximum d’information sur l’homéostasie immunologique dans les différents tissus et limiter ainsi la répétition d'expériences.

Raffinement

Les souris sont maintenues en groupe de plusieurs individus afin de respecter leurs besoins sociaux. Elles sont hébergées dans des cages enrichies avec du coton et des igloos pour améliorer leur bien-être. Une période d’adaptation est respectée avant le début de la procédure pour réduire le stress des animaux lié à leur transport. Toutes les conditions sont réunies pour prendre en compte la douleur des animaux, notamment avec la mise en place d'une anesthésie. Des points limites ont été définis pour limiter la souffrance des animaux sans remettre en cause les objectifs du projet et les données obtenues. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers et les expérimentateurs, Le score clinique précis des souris et évalué 3 fois par semaine par les expérimentateurs. L’euthanasie se fera sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le modèle de l’EAE existe chez la souris, le rat et le primate non humain. Il reproduit les signes cliniques, histologiques et immunologiques de la maladie humaine, la SEP. Le choix de la souris est de plus justifié par l’existence d’outils biotechnologiques (anticorps, dosage de molécules..) adapté à cette espèce. L’induction de l’EAE se fera sur des animaux de 5-10 semaines. Les scores cliniques de l’EAE seront évalués pendant 2 à 8 semaines après l'induction. L'âge des souris au moment de leur utilisation est déterminé par la maturation du système immunitaire

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes sont exposées au bisphénol A par l'eau de boisson, leurs petits reçoivent des injections sous la peau dès la naissance, subissent des tests comportementaux, puis une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélever le cerveau. Le porteur indique que les injections chez les nouveau-nés peuvent provoquer une douleur locale et que la séparation d'avec la mère génère un stress. Il affirme que l'étude de la myéline ne peut se concevoir qu'in vivo et qu'un modèle exposé par voie orale est le seul moyen de mimer l'exposition humaine.

Objectifs

Les troubles du développement cérébral, incluant des déficits d'apprentissage, de l'attention ou encore les troubles du spectre autistique, constituent un problème de santé publique majeur. Les perturbateurs endocriniens sont aujourd'hui mis en cause dans l'augmentation de la fréquence de ces pathologies. En mimant ou en bloquant les effets de certaines hormones, les perturbateurs endocriniens peuvent avoir des conséquences néfastes sur le développement cérébral. Parmi les composés préoccupants, le bisphénol A (BPA) est un agent plastifiant omniprésent dans notre environnement. Ainsi, dès la conception puis pendant la grossesse et la lactation, les fœtus et les nourrissons sont exposés au BPA provenant de l’organisme de leur mère à travers le placenta puis le lait maternel. L’une des étapes cruciales du développement cérébral correspond à la mise en place de gaines de myéline autour des prolongements de certains neurones. Ces gaines de myéline, très riches en lipides, permettent d’accélérer la transmission des messages nerveux et d’assurer un fonctionnement optimal du cerveau. Nous émettons l’hypothèse que le BPA pourrait perturber la mise en place des gaines de myéline dans le cerveau au cours du développement. En administrant du BPA à des souris au cours de la grossesse et de l’allaitement, nous avons pour objectif d’étudier l’impact de ce perturbateur endocrinien sur la mise en place de la myéline chez les descendants des mères exposées. Nous avons également comme objectif de mieux comprendre par quel mécanisme moléculaire le BPA pourrait exercer ses effets néfastes. Nous étudierons les effets du BPA en analysant la composition lipidique de la myéline chez les souriceaux exposés depuis la gestation. Le comportement des souris sera également évalué à différents stades, ainsi que la structure et la composition du cerveau des souris adultes.

Bénéfices attendus

Malgré son interdiction dans les biberons et les contenants alimentaires, le BPA est toujours omniprésent dans l’environnement, exposant les individus de façon permanente dès la conception. La concentration utilisée dans ce projet s’approche des concentrations retrouvées chez l’homme en cas d’exposition importante, et la voie d’exposition choisie (digestive) correspond à la voie d’exposition majoritaire chez l’homme. Ce projet permettra de compléter les connaissances sur la toxicité du BPA dans le cerveau immature en s'intéressant à une cible jusque-là peu étudiée, à savoir la myéline, dont les altérations pourraient participer à l’apparition de pathologies. L’étude des mécanismes moléculaires par lesquels le BPA exerce ses effets permettra d’améliorer l’évaluation de la toxicité de ce composé et notamment de mieux comprendre pourquoi il exerce des effets différents chez les mâles et les femelles.Il est crucial de mieux comprendre comment le BPA et les perturbateurs endocriniens exercent leurs effets sur la santé, particulièrement pendant les périodes critiques développementales, afin de contribuer à l’évaluation du risque qu’ils représentent et ce dans l’optique de protéger les populations les plus vulnérables.

Procédures

Les femelles gestantes puis allaitantes seront soumises à une exposition au BPA par l’eau de boisson pendant 30 jours, sans générer de stress ou de souffrance. Les souriceaux seront soumis à une injection par jour sous la peau pendant les 2 jours suivant sa naissance. En tenant compte du maintien du souriceau, la durée de l'intervention est de 10 secondes au maximum. L'injection elle-même dure 1 seconde. Les souriceaux seront également soumis à 2 tests comportementaux à 8 et 9 jours post-nataux. La durée de séparation avec la mère n’excède pas 10 minutes pour chaque test. Après la fin de l'allaitement, les souris âgées de 1 à 2 mois seront soumises à 3 tests comportementaux. Ces tests sont non invasifs et peu contraignants, les animaux sont libres d’explorer l’enceinte et ne reçoivent pas de stimulus désagréable ou douloureux. Certaines souris seront soumises, à l'âge de 2 mois, à une injection d’anesthésique afin de réaliser une sédation profonde. Une perfusion intracardiaque de solution saline sera réalisée, entrainant la mort rapide de l’animal. Le délai entre la sédation et la mort n’excèdera pas 2 minutes.

Impact sur les animaux

Pour tous les animaux de ce projet, un stress pourra être engendré par la séparation des souriceaux de leurs mères au cours de tests comportementaux et lors de la réalisation d’injections sous-cutanées. Les injections sous-cutanées réalisées chez les souriceaux nouveau-nés pourraient entrainer une douleur locale et transitoire. Au cours des tests comportementaux réalisés chez les souris après le sevrage, un stress pourrait être engendré par la manipulation des souris. La perfusion intracardiaque réalisé sur des animaux profondément anesthésiés pourrait également générer une douleur de courte durée. Afin de minimiser ces nuisances, ce projet prendra en compte la réglementation des 3R selon les modalités décrites par la suite.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de chaque procédure afin de procéder au prélèvement de leurs cerveaux, dans le but de réaliser différentes analyses moléculaires et tissulaires.

Remplacement

La mise en place de la myéline est un processus développemental long et complexe impliquant de nombreuses interactions cellulaires entre les différents types cellulaires du cerveau. Pour cette raison, son étude ne peut être envisagée qu’« in vivo ». En outre, un modèle animal exposé par voie orale est actuellement le seul moyen pertinent de mimer l’exposition humaine au BPA.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été estimé grâce à notre expérience pour les différentes analyses et nous permettra de répondre aux questions scientifiques de ce projet. Différentes analyses seront réalisées sur un même animal, permettant de réduire le nombre total d'animaux. Des tests statistiques adaptés seront réalisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans des cages enrichies en sopalin pour la réalisation des nids. L'administration du BPA par l’eau de boisson, non invasive, ne générera pas de stress ou de souffrance. Les faibles doses de BPA administrées n'affecteront pas le bien-être des animaux. Seules deux injections seront réalisées chez les souriceaux, permettant un traitement efficace sur une période de 3 semaines. Au cours des tests comportementaux, des précautions seront également prises pour minimiser le stress des animaux.

Choix des espèces

Ce projet sera réalisé chez la souris car plusieurs effets du BPA sur le développement cérébral ont été observés chez la souris dans la littérature scientifique. De plus, le laboratoire est spécialisé dans l'étude du développement cérébral chez la souris, pour lequel nous disposons de nombreux outils et approches. L’exposition au BPA pendant la gestation et l’allaitement sera réalisée de la seconde semaine de gestation jusqu'à la fin de l'allaitement. Cette période d’exposition classiquement utilisée dans la littérature permet d'éviter toute malformation potentielle due au BPA pendant les premiers jours de gestation. Chez la souris, la formation de myéline dans le cerveau au cours de la deuxième semaine après la naissance, progresse rapidement et se poursuit au moins jusqu’à un à deux mois. Un effet du BPA ayant été observé chez les femelles âgées de deux semaines pendant le pic de myélinisation, ce stade a été choisi dans ce projet pour étudier le mécanisme d’action du BPA. Nous complèterons les résultats par des analyses comportementales à différents stades et par des analyses moléculaires et tissulaires à 2 mois. Ces différentes études seront réalisés aux stades adéquats en accord avec la littérature scientifique et l'expérience du laboratoire.