Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
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Comportements sociaux-sexuels et anxiété chez les souris femelles : une dépendance aux androgènes et neurostéroides ?
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
280 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, après ovariectomie et injections d'inhibiteurs de l'aromatase. La chirurgie peut provoquer une hémorragie et une douleur postopératoire de deux à trois jours, et un score de souffrance supérieur à six déclenche la mise à mort. L'étude porte sur le rôle de stéroïdes cérébraux dans le comportement sexuel de lordose et l'anxiété chez la femelle. Toutes sont tuées et leur cerveau prélevé, y compris celles utilisées comme stimulus olfactif.
Objectifs
Des hormones régulent finement les comportements sociaux-sexuels en agissant sur les régions cérébrales spécifiques de ces comportements. Notre étude se structure autour de deux objectifs : (1) Analyser la production rapide de stéroïdes dans le cerveau en réponse à des stimuli olfactifs et sociaux ; (2) Déterminer le rôle spécifique d’un de ces stéroïdes dans la préparation du comportement sexuel de lordose et dans l'anxiété.
Bénéfices attendus
Cette étude est essentielle pour comprendre le rôle des stéroïdes cérébraux sur les comportements sociaux-sexuels chez la femelle. En effet, la majorité des études, y compris celles menées chez les rongeurs, se concentrent sur les mâles. En outre, des principes actifs inhibant la synthèse de ces stéroïdes sont largement utilisés pour traiter le cancer du sein, mais leurs effets sur le système nerveux central ont surtout été étudiés sous l’angle de la mémoire et de la cognition. Notre étude permettra aussi d’élargir nos connaissances sur les effets secondaires de ces traitements.
Procédures
Les gonadectomies peuvent entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies. Cette intervention chirurgicale peut aussi induire une douleur post opératoire pendant 2-3 jours. L'injection intrapérotonéale peut parfois générer une douleurs et hématome au point d'injection. Le véhicule dans lequel sont dilués les deux inhibiteurs d'aromatase peut dans de rares cas, entrainer une toxicité hépatique et réactions immunitaires. Les inhibiteurs de l’aromatase peuvent dans de rare cas entrainer des arthralgies chroniques. Un stress dû à la manipulation des animaux pour récolter leurs urines est possible. Il s’agira d’un stress aigu de quelques minutes n’induisant pas d’effet à long terme. Les animaux expérimentaux isolés avant les tests olfactifs pourront présenter du stress lié à leur hébergement individualisé.
Impact sur les animaux
Les stérilisations peuvent entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies. Cette intervention chirurgicale peut aussi induire une douleur post opératoire pendant 2-3 jours. L'injection intrapéritonéale peut parfois générer une douleurs et hématome au point d'injection. Le véhicule dans lequel sont dilués les principes actifs peut dans de rares cas, entrainer une toxicité hépatique et réactions immunitaires. Les principes actifs peuvent dans de rare cas entrainer des douleurs articulaires. Un stress dû à la manipulation des animaux pour récolter leurs urines est possible. Il s’agira d’un stress aigu de quelques minutes n’induisant pas d’effet à long terme. Les animaux expérimentaux isolés avant les tests olfactifs pourront présenter du stress lié à leur hébergement individualisé.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études ultérieures. Les animaux stimuli seront euthanasiés par le personnel animalier.
Remplacement
A ce jour aucune méthode alternative non animale (in vitro et/ou de modélisation) peut être utilisée pour comprendre la production locale d’œstradiol dans le cerveau et ses effets sur les comportements sociaux chez les femelles. En effet, cette production dépend de l'interconnectivité de neurones appartenant à plusieurs structures olfactives et cérébrales. Il est donc impératif d’utiliser un animal entier pour comprendre les mécanismes de régulations des comportements sociaux par les œstradiols.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum compte tenu des techniques utilisées et pour maintenir la possibilité d'une mise en évidence statistique. Les mêmes animaux stimuli seront utilisés pour toutes les procédures. La taille des échantillons est définie à partir des résultats obtenus lors d'expériences précédentes effectuées par notre groupe dans le cadre de tests similaires ainsi que des tailles d'effet observé dans la littérature. Nous avons aussi tenu compte de la variabilité entre les expériences, de la prévalence comportementale, de la survie post-opératoire, et de l'efficacité des injections. La taille de nos échantillons sera de 20 animaux par condition.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe sociaux en présence d’enrichissements (abri cartonné complémenté de matériel de nidification et de jouet en bois) avec un accès à la nourriture et boisson ad libitum. Les souris seront anesthésiées lors des chirurgies avec une première administration d'anesthésique pour générer une sédation analgésique suivi d’une anesthésie gazeuse (isoflurane 3% pour l'induction puis 1,5% pour le maintien). Les animaux recevront un traitement analgésique post-opératoire par injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroidien permettant une couverture analgésique de 24h). L’administration de l'anti-inflammatoire non stéroidien sera poursuivie pendant 2 à 3 jours post-opératoires si nécessaire. Les yeux de l'animal seront protégés au moyen d'une pommade ophtalmique pendant la chirurgie pour éviter le dessèchement. Durant la procédure et la période de réveil, les animaux seront maintenus sur un matelas chauffant et leur température sera monitorée afin d'éviter une hypothermie. La fréquence respiratoire sera également monitorée pendant la procédure. Si une hypothermie et/ou une détresse respiratoire est observée (diminution fréquence respiratoire d’au moins 50%), l’animal recevra une dose antisedan pour antagoniser les effets de l'anesthésique et la procédure sera interrompue. Si l’état de santé de l’animal le permet, une nouvelle tentative sera effectuée après 7 jours de récupération. Dans le cas contraire, l’animal sera euthanasié conformément aux points limites définis dans nos procédures. De plus, une surveillance quotidienne des animaux ayant subi la chirurgie sera effectuée tout au long de l'expérimentation. Concernant les points limites post-opératoires, 3 facteurs seront estimés : 1) Le poids corporel ; 2) L'apparence physique ; 3) Le comportement. Un score combiné supérieur à 6 ou un score individuel> ou égal à 3 entrainera l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
Notre recherche porte sur la mise en évidence des régulations des comportements socio-sexuels induits par les neurostéroides chez les mammifères. La souris est un excellent modèle animal de référence. La souris est une espèce sociale présentant des comportements socio-sexuels innés bien décrits. En outre, cette espèce permet des approches génétiques fonctionnelles (génération d'animaux mutants) qui ne sont pas ou peu possibles sur d'autres espèces. Nous utiliserons des femelles adultes qui seront âgés de 9 à 11 semaines au début des expériences.
Codage neuronal de l?information vocale chez le macaque
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le crâne ouvert sous anesthésie pour environ six heures afin d'y implanter une chambre d'enregistrement, cinq macaques rhésus sont soumis à des enregistrements électrophysiologiques quotidiens, dans des procédures classées de souffrance modérée. Chaque animal est installé chaque jour en chaise de contention, avec un contrôle de sa consommation d'eau, cinq jours par semaine pendant six à vingt-quatre mois. Le porteur met en avant que tous les animaux sont gardés vivants à l'issue. Après une chirurgie de désimplantation, les électrodes sont pourtant laissées dans le lobe temporal, trois macaques pouvant être réutilisés et deux replacés en élevage.
Objectifs
La voix humaine est l?un de nos signaux sociaux les plus puissants. En une fraction de seconde, nous reconnaissons qui parle, percevons son ?motion et devinons son intention. Cette aptitude remarquable n?est pas propre ? l??tre humain : les macaques, les ouistitis et d?autres primates extraient eux aussi des informations sur l?identit? et l??tat affectif ? partir des vocalisations, afin de s?orienter dans leurs environnements sociaux complexes. Les ?tudes de neuroimagerie ont mis en ?vidence des ? patchs vocaux? (? voice patches ?) chez l?humain?, et plus r?cemment chez le macaque et le ouistiti, sugg?rant l?existence d?une architecture neuronale conserv?e pour le d?codage des voix, fa?onn?e par des millions d?ann?es d??volution des primates. Cependant, nous ne disposons toujours pas d?un mod?le au niveau neuronal expliquant comment les voix sont repr?sent?es dans le cerveau. L?IRM fonctionnelle permet de localiser les r?gions du cerveau sensibles ? la voix, mais ces cartes ne permettent pas d?expliquer comment les populations de neurones encodent les voix. Ce projet vise ? combler ce foss? en passant des cartes corticales aux neurones individuels chez le macaque. Le projet cartographiera les neurones s?lectifs aux voix chez n=5 macaques ? l?aide d?enregistrements des neurones ? haute densit? guid?s par IRM fonctionnelle. Il mod?lisera comment les neurones respondent aux voix ? partir de descripteurs acoustiques et de r?seaux neuronaux profonds, afin de r?v?ler les strat?gies de repr?sentation vocale chez le macaque.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une compr?hension unique de l?information vocale contenue dans l?activit? de populations de neurones individuels du cortex auditif secondaire. Ceci contribuera ? notre connaissance des m?canismes neuronaux de la communication, avec un impact potentiel sur le d?veloppement des nouvelles g?n?rations d?implants corticaux pour restaurer/augmenter l?audition.
Procédures
Chaque animal sera soumis aux interventions suivantes : - D?placement au centre IRM pour acquisition d'images IRM, sous anesth?sie pour une dur?e totale d'environ 3h ; - Chirurgie d'implantation de chambre d'enregistrement, sous anesth?sie, pour une dur?e d'environ 6h ; - La prise quotidienne de l'animal en chaise pour entrainement et enregistrements ?lectrophysiologiques, environ 2h, 5 jours par semaine, ainsi que le contr?le hydrique . Un maximum de 5 sessions d?imagerie par animal sera effectu? pour la localisation des aires sensibles ? la voix (limit?es ? 1 ou 2 en cas de r?sultats concluants). L?entrainement ? la t?che et l?enregistrement pendant la t?che seront effectu?s 5j/semaine pendant la dur?e de l'exp?rience, qui n'est pas d?finissable a priori. Une estimation vraisemblable serait entre 6 et 24 mois (entrainement 3- 6 mois / enregistrement 3-18 mois) selon l'avancement de l'entra?nement des animaux et la qualit? des enregistrements. Dans le cas d'un protocole d'enregistrement plus long, une prolongation serait demand?e ? la SBEA.
Impact sur les animaux
Stress li? ? la capture en cage de contention: Douleur li?e ? la piq?re pour les anesth?sies; Risques li?s ? l'anesth?sie pour l?IRMf et la chirurgie d?implantation; Irritation de la trach?e li?e ? l?intubation pour l?anesth?sie gazeuse; Douleur post-op?ratoire pour l'implantation; Possibles infections au niveau des implants.
Devenir
Tous les animaux sont gard?s en vie ? l'issue de la proc?dure. Une fois les enregistrements termin?s, les animaux subissent une chirurgie de d?-implantation du connecteur (les ?lectrodes subdurales sont laiss?es en place pour ?viter une nouvelle craniotomie). Apr?s cicatrisation et r?cup?ration, ils peuvent soit ?tre r?utilis?s dans es projets pour lesquels la pr?sence d??lectrodes dans le lobe temporal n?est pas g?nante (potentiellement 3/5), ou replac?s dans des groupes reproducteurs dans des ?levages (potentiellement n=2).
Remplacement
Le but du projet est de comprendre comment les neurones dans les aires s?lectives ? la voix du cortex auditif traitent l?information vocale. Les enregistrement de neurones isol?s dans les aires de la voix sont inexistants chez l?humain, il est donc n?cessaire d?avoir recours ? des animaux pour cette recherche.
Réduction
R?duction du nombre d?animaux au minimum (n=5) pour obtenir des r?sultats chez au moins deux (voire trois singes) sur chacune des exp?riences pr?vues sur 5 ans, ?tant donn?e la complexit? de la chirurgie qui implique un certain risque, et la possibilit? que des matrices cessent de donner du signal exploitable apr?s quelques mois. Si nous obtenons suffisamment de donn?es neurophysiologiques pour une analyse statistique satisfaisante chez trois animaux, nous n'en utiliserons pas d?autres. Pour chaque animal, l?enregistrement avec plusieurs micro?lectrodes multi-contacts permettra de mesurer l?activit? de populations neuronales dans plusieurs structures corticales et sous-corticales. La richesse des enregistrements multi-?lectrodes offre la possibilit? de r?aliser de tr?s nombreux types d?analyses portant sur les potentiels d?actions de neurones isol?s (modulation de fr?quence de d?charges ou de synchronisation entre neurones dans diff?rentes p?riodes de la t?che ou dans diff?rentes structures), sur les populations de neurones (distribution spatiale de l?activit?, moyennes de populations), sur les potentiels de champs locaux (LFP) et sur la synchronisation entre LFP et potentiels d?actions. La r?p?tition des s?ances d?enregistrement sur plusieurs mois a pour objectif d?augmenter le nombre de neurones diff?rents enregistr?s dans chaque structure. Cette augmentation permet d?augmenter la puissance statistique de nos analyses La dur?e totale des enregistrements pour un animal est ?troitement d?pendante de la quantit? de neurones enregistr?s quotidiennement. De fait, elle ne peut ?tre d?finie ? priori.
Raffinement
Les animaux sont h?berg?s en paires dans des cages et voli?re enrichis de perchoirs, de cordes et de jeux suspendus, pour favoriser les comportements exploratoires et aussi le retour ? une activit? normale en p?riode post-chirurgicale. Apr?s un d?lai minimal d'une semaine et selon l'?tat de r?cup?ration apr?s l?implantation, l'animal sera sorti en chaise afin de reprendre une routine qui lui est famili?re. Les m?thodes de renforcement positif (training et habituation) seront utilis?es afin de r?duire le stress des sujets. L'IRM anatomique et fonctionnelle seront r?alis?s sous anesth?sie g?n?rale afin de s'assurer de l'inconscience de l'animal, r?duisant de fait le stress de l'animal lors de la r?alisation de la proc?dure. Lors d'interventions chirurgicales, en plus de l'anesth?sie, un analg?sique sera administr? et prolong? en p?riode post-op?ratoire. Des points limites pr?coces et adapt?s seront appliqu?s.
Choix des espèces
Les raisons justifiant le choix des macaques comme esp?ce de comparaison sont les suivantes : - Ils sont relativement proches de nous sur le plan phylog?n?tique de sorte que les r?sultats nous renseigneront sur l'histoire de l'?volution relativement r?cente ; - Ils utilisent des vocalisations complexes et vari?es, bien caract?ris?es acoustiquement; - Il s'agit d?un mod?le neuroscientifique largement ?tudi?, en particulier pour les neurosciences auditives, de sorte que les r?sultats obtenus seront interpr?tables en relation avec une grande quantit? de donn?es compl?mentaires; - Enfin, ils peuvent ?tre scann?s en IRMf sur le m?me scanner que les humains, ce qui constitue un pont unique entre l'IRMf humaine et la litt?rature ?lectrophysiologique sur les singes. Les animaux seront pr?f?rentiellement utilis?s au stade de jeune adulte/adulte. A ce stade du d?veloppement, les animaux ne sont plus en croissance et leurs besoins physiologiques sont stabilis?s. Cela permet un contr?le plus pr?cis des protocoles exp?rimentaux, que ce soit en termes de volume des r?compenses utilis?es pour l'apprentissage par renforcement, de contr?le du r?gime alimentaire dans la cage ou de localisation des structures c?r?brales cibles pour les implants chirurgicaux. Par ailleurs, les animaux ?tant encore jeunes, ils pr?sentent une meilleure tol?rance aux proc?dures exp?rimentales et une meilleure r?cup?ration suite aux proc?dures n?cessitant une anesth?sie. Des animaux plus jeunes mais ayant d?j? atteints leur maturit? sexuelle pourraient ?tre utilis?s pour les premi?res phases d'habituation (entrainement ? la t?che auditive) et ?tre ainsi jeunes adultes lors du commencement des parties ult?rieures de la proc?dure (implantation, ?lectrophysiologie).
Caractérisation des circuits nerveux associés à la sensibilité de la langue chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Pour cartographier les circuits nerveux de la sensibilité de la langue, 220 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit des injections dans la langue, l'application de molécules et jusqu'à deux chirurgies d'une heure sous anesthésie. Le porteur rattache ce travail au syndrome de la bouche qui brûle, une douleur orale touchant surtout les femmes ménopausées, et évoque un rôle des hormones. Les perspectives thérapeutiques annoncées restent renvoyées au long terme, les souris étant tuées pour le prélèvement de tissus.
Objectifs
La langue est un organe essentiel au bon déroulement de nombreuses fonctions orales (mastication, gustation, phonation etc.). Sa sensibilité conditionne le bon déroulement de ses fonctions. Certaines conditions médicales ou environnementales altèrent la bonne exécution de ces fonctions, dégradent la santé et altèrent la qualité de vie. Par exemple, le syndrome de la langue qui brûle correspond à une pathologie douloureuse encore mal comprise. Cliniquement, ce syndrome se manifeste par une sensation persistante de brûlure au niveau de la pointe de la langue, caractérisée par une douleur modérée à sévère sans lésion apparente. Avec son impact significatif sur la qualité de vie, elle représente un véritable enjeu de santé publique ainsi qu’un enjeu socio-économique majeur. Les traitements actuellement disponibles ne traitent pas les causes de la pathologie et ne soulagent que trop peu la douleur. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués pour permettre une meilleure prise en charge de la pathologie. Il faut noter que le syndrôme de la bouche qui brûle affecte 7 femmes pour 1 homme, et atteint principalement les femmes au moment de la ménopause. Ceci suggère un rôle des hormones dans cette pathologie. Ici, l’objectif du projet est de caractériser les circuits nerveux impliqués dans la sensibilité de la langue et d’évaluer l’effet des changements hormonaux sur cette sensibilité dans des modèles murins reproduisant la carence hormonale associée à la ménopause, et leur contrôle.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra une meilleure caractérisation des circuits nerveux du syndrôme de la bouche qui brûle, inconnus à ce jour. Plus largement, il permettra également d’évaluer les effets des modifications hormonales survenant à la ménopause, qui restent très peu étudiées du point de vue de la sensibilité (douleur, tact, goût, sensation de bouche sèche etc.). A plus long terme, l’identification des mécanismes sous-tendant ce syndrome et les circuits nerveux de modulation de la sensibilité ouvrira des perspectives thérapeutiques ciblées pour les patients.
Procédures
Injection (2x, 20 secondes, sous anesthésie), application de molécule (1x, 10 minutes, sous anesthésie), injection (jusqu’à 3x, 20 secondes, animal vigile), chirurgie (jusqu’à 2x, 1 heure, sous anesthésie).
Impact sur les animaux
La chirurgie peut engender une douleur post-opératoire transitoire et légère de quelques heures à quelques jours. Les procédures d’injection de molécules peuvent également induire une douleur transitoire de quelques heures à quelques jours, notamment localement au niveau des sites d’injection.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de procéder à des prélèvements de tissus pour des études immunohistochimiques.
Remplacement
L’innervation précise des neurones sensitifs innervant la langue, et les projections descendantes pouvant médier l’apparition des douleurs spécifiques à la langue n’est pas connue à ce jour. Cela nécessite donc une caractérisation chez l’animal vivant par traçage neuronal. En effet, il n’existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico permettant de modéliser des voies nerveuses qui n’auraient été caractérisées sur modèle vivant au préalable.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Le bien-être des animaux sera garanti grâce à l’utilisation d’anesthésie générale et grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout au long des procédures, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Des points limites pour lesquels les animaux seront mis à mort ont été définis.
Choix des espèces
Le travail sera effectué sur la souris car il s’agit d’un excellent modèle pour étudier le système nerveux et les pathologies pouvant affecter la sensibilité. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et humain, permettant l’extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout majeur dans l’analyse et l’interprétation des résultats. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, car les circuits neuronaux sont développés et matures.
Effets d’un exercice nocturne sur le fonctionnement de l’horloge principale et la synchronisation à la lumière ambiante chez un rongeur diurne
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour tester si un exercice nocturne agit sur l'horloge biologique d'un rongeur diurne, 51 animaux vont être utilisés, tous tués, dont 48 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés en cage individuelle pendant toute l'expérience, source d'un stress d'isolement reconnu comme modéré, avant une chirurgie terminale sous anesthésie. La mise à mort sert à mesurer les hormones circulantes et l'activation de neurones de l'horloge centrale à deux moments précis. Le porteur ne nomme pas l'espèce diurne employée, la désignant seulement comme 'un rongeur diurne'.
Objectifs
Les mécanismes neuronaux qui sous-tendent la diurnalité sont encore mal connus, en partie car la grande majorité des études chronobiologiques ont été réalisées chez les mammifères nocturnes, sauf pour les humains. Comprendre comment fonctionnent les rythmes circadiens dans un modèle animal diurne permettra d’améliorer les applications chronothérapeutiques appropriées dans l’espèce humaine. Les ryhtmes circadiens sont majoritairement contrôlés par une horloge centrale localisée à la base du cerveau. Cette horloge principale est surtout mise à l'heure par la lumière, mais elle est également sensible à d'autres facteurs. Parmi eux figurent des facteurs comportementaux associés à l’éveil. L’objectif de ce projet est de tester chez un rongeur diurne si un exercice nocturne peut agir sur l’horloge principale et/ou modifier sa mise à l'heure par la lumière ambiante.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont tout d’abord une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels une activité physique peut rétroagir sur l’horloge circadienne principale et moduler la synchronisation à la lumière chez un modèle animal diurne. Si notre hypothèse est validée (déphasages de l’horloge principale par un exercice nocturne, et augmentation par l’exercice des déphasages induits par la lumière), ces données pourront servir à des applications biomédicales en utilisant l’activité physique pour améliorer la synchronisation des rythmes circadiens et/ou prévenir la désynchronisation circadienne.
Procédures
Pendant toute la durée de l’expérience, les animaux seront hébergés en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement social. Les animaux seront soumis à une chirurgie terminale sous anesthésie (durée 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement d'intensité modérée. Les injections terminales pourront induire une douleur transitoire modérée et un stress passager aux animaux.
Devenir
La mise à mort de tous les animaux est nécessaire déterminer pour les changements plasmatiques d'hormones et de métabolites circulants, ainsi que l’activation des neurones des noyaux suprachiasmatiques en réponse à l'exercie, à l'exposition à la lumière ou à la combinaison des deux facteurs aux deux points-horaires choisis.
Remplacement
La régulation des rythmes circadiens, dont le cycle veille-sommeil, la détection de la lumière et l’effet d’un exercice physique impliquant plusieurs organes à la fois (notamment, rétine, cerveau et muscles striés) ainsi que des relais nerveux et hormonaux, l’investigation des interactions entre horloges circadiennes et activité physique nécessite l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro ou de modéliser in silico la réponse de ce circuit multi-organes.
Réduction
Notre approche longitudinale (jusqu’à 3 traitements chez le même animal) permet de réduire d’autant le nombre d’animaux utilisés et d’augmenter la robustesse des données, chaque animal étant son propre témoin. De plus, les animaux de l’approche comportementale seront systématiquement ré-utilisés pour l’approche moléculaire. Pour les tests in vivo circadiens et comportementaux, le nombre d’animaux proposé (n=12 par condition) est basé sur une évaluation de la puissance statistique .
Raffinement
Les rongeurs seront placés en cages individuelles pour la durée des procédures, ce qui pourrait générer un stress d'isolement social que nous limiterons par ajout de frisure en plus de l'enrichissement classique des cages, à savoir: bâton à ronger et coton pour faire un nid. Pour les animaux en actimétrie, bien que maintenus en cages individuelles, ils auront des contacts visuels (parois de cage transparentes) et olfactifs (couvercle de cage grillagé) avec leurs congénères. La frisure permettra de soutenir la thermorégulation des animaux individualisés, tout en apportant un enrichissement supplémentaire pour la construction du nid. Tout au long de la procédure, nous ferons un suivi de l’état général des animaux à l'aide d'une grille de scores. Des points limites spécifiques ont été établis pour limiter la souffrance animal en arrêtant la procédure dès que nécessaire. Le suivi en temps réel des données générées par l’activité locomotrice renseignera également sur l’état de santé des animaux.
Choix des espèces
Les mammifères diurnes sont des modèles expérimentaux appropriés pour la recherche biomédicale. Leur utilisation dans le projet présent est pertinente pour comprendre les mécanismes de la rétroaction comportementale sur l’horloge circadienne principale chez les espèces diurnes, comme l’est l’espèce humaine. De jeunes adultes (2-6 mois) seront utilisés pour étudier le système circadien mature et non-senescent.
Etude de la neurogenèse dans le système nerveux central de la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
2 244 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger visant à suivre la naissance des neurones. Les femelles gestantes reçoivent un composé par sonde gastrique, susceptible d'avoir un effet abortif au dernier tiers de gestation, et les souriceaux une injection pouvant léser ou infecter le point de piqûre. Les tissus sont prélevés après mise à mort aux stades voulus, les femelles reproductrices étant réutilisées puis tuées au plus tard à 45 semaines. Le porteur chiffre l'effectif à 2 244 sans autre justification que l'expérience passée du laboratoire et des tests statistiques.
Objectifs
L’objectif du projet est de caractériser le processus de génération des neurones dans différentes régions du système nerveux d’un mammifère, la souris. Pour cela, nous allons utiliser des modèles de souris génétiquement modifiées adaptés à notre étude qui expriment des marqueurs fluorescents permettant de marquer les cellules qui donnent naissance aux neurones, et d’identifier ainsi des groupes de neurones issus d’une même cellule mère. Nous emploierons cette stratégie n’impliquant pas de chirurgie pour suivre le devenir des cellules composant le tube neural embryonnaire et déterminer comment ces cellules contribuent individuellement à la construction du tissu neural dans différentes régions du cerveau impliquées dans la mémoire et la cognition, ainsi que dans la rétine (siège de la perception visuelle), en contexte normal ou pathologique. Nous utiliserons en fonction de la question biologique posée des lignées de souris exprimant des marqueurs fluorescents permettant de visualiser les neurones, ou bien d’étudier leur activité. Les tissus marqués seront analysés post-mortem par des techniques de microscopie de fluorescence permettant de reconstruire très précisément en 3D les régions étudiées, ou de caractériser l’activité des neurones.
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet sera d’apporter une meilleure compréhension de la construction du cerveau et de la rétine en contexte normal et pathologique. Le but est d’une part d’augmenter nos connaissances sur le développement normal du cerveau et de la rétine, encore incomplètement compris, et d’autre part de caractériser comment ce processus peut être affecté par différents problèmes survenant dans les cellules neurales en prolifération qui entrainent des désordres neurodéveloppementaux, épilepsies ou cancers. Ceci permettra de mieux comprendre l’origine de ces pathologies et comment les cibler thérapeutiquement. Pour cela, nous devons avoir une vue précise de la construction du tissu neural et de la contribution des cellules souches neurales à ce processus. Ce projet permettra une telle caractérisation dans différentes régions du système nerveux central d’une espèce mammifère (souris) proche de l’homme. Ce projet procurera des données de référence intégrant anatomie et développement du système nerveux central en contexte normal et pathologique. Ces données constitueront une base pour le développement de futures thérapies ciblant spécifiquement certaines des pathologies mentionnées ci-dessus.
Procédures
Pour déclencher l’expression des marqueurs fluorescents dans les cellules neurales, nous administrerons un composé chimique aux animaux en suivant deux méthodes distinctes en fonction du stade ciblé : Pour déclencher le marquage à un stade embryonnaire, le composé chimique sera administré par voie orale en une fois à l’aide d’une sonde gastrique à des femelles adultes gestantes vigiles (acte durant moins d’une minute). Pour déclencher le marquage à un stade postnatal précoce, le composé chimique sera administré par injection en une fois à des souriceaux vigiles (acte durant moins d’une minute).
Impact sur les animaux
La contention des animaux nécessaire à l’administration du composé chimique cause un stress temporaire. L’administration par voie orale à l‘aide d’une sonde gastrique aux animaux vigiles cause un inconfort temporaire et présente des risques de « fausse-route » et de microlésions. L’administration du composé chimique par voie orale, réalisée durant la gestation, est susceptible d’avoir un effet abortif ou de causer des problèmes à la naissance des animaux, en particulier lorsqu’il est administré durant le dernier tiers de gestation. La procédure d’injection utilisée sur les jeunes animaux est quant à elle potentiellement source de douleur localisée au point d’injection, et présente un risque d’infection au site d’injection. Il existe également un risque d’altération de croissance.
Devenir
Les animaux chez lesquels le marquage est déclenché à un stade embryonnaire seront euthanasiés aux stades demandés pour l’analyse et les tissus collectés pour des études histologiques ou le monitoring de l’activité neuronale sur tissu frais. Les femelles utilisées pour produire ces animaux et ayant reçu le composé chimique par voie orale seront réutilisées si possible et euthanasiées au plus tard à 45 semaines d’âge. Les animaux chez lesquels le marquage est déclenché à un stade postnatal par injection du composé chimique seront euthanasiés aux stades demandés pour l’analyse et les tissus collectés pour des études histologiques ou de d’activité neuronale sur tissu frais. Les femelles utilisées pour produire ces animaux injectés seront si possible réutilisées et euthanasiées au plus tard à 45 semaines d’âge.
Remplacement
En application du principe de remplacement, des études préliminaires sur nos systèmes de marquages sont préalablement réalisées in vitro dans des systèmes de culture cellulaire, permettant de valider les modifications génétiques que nous utiliserons dans nos modèles animaux (souris). Cependant, l’utilisation de la souris reste indispensable dans ce projet du fait des particularités et de la complexité de l’organisation du tissu nerveux des mammifères.
Réduction
Ce projet impliquera au maximum 2244 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique de ce projet. Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Ce nombre est basé sur notre expérience passée au laboratoire sur des expériences similaires. Nous utilisons en parallèle un logiciel statistique adapté. De même, la significativité de nos résultats sera évaluée à l’aide d’outils statistiques adaptés à nos études.
Raffinement
En application du principe de raffinement, les souris seront examinées quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergées dans les conditions conformes à la règlementation. Les animaux provenant de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant les expérimentations. Les souris seront hébergées dans des cages ventilées en stabulation standard avec enrichissement (bâtons en bois, coton, tunnel), avec nourriture et eau ad libitum. Le nombre d'animaux par cage est limité à 5. La température et l’hygrométrie des cages sont contrôlées conformément à la législation. Des points limites ont été définis et les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure chargée du bien-être animal. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin d’euthanasier l’animal en dernier recours. Les animaux bénéficieront quand nécessaire d’une anesthésie générale. Enfin, une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée qui indique les actes effectués, permettant une surveillance adaptée aux procédures afin de s’assurer de leur bien-être.
Choix des espèces
La souris est très similaire à l’Homme anatomiquement, physiologiquement et génétiquement (98 pour cent de conservation du génome). Sa petite taille et sa courte gestation favorisent ce modèle standard pour l’étude du système nerveux, qui permet d’établir des lignées ayant les caractéristiques nécessaires à nos études. Les études se feront à plusieurs stades de développement (embryonnaire, première semaine après la naissance, deuxième/troisième semaines après la naissance, entre 3 semaines et 3 mois après la naissance), nous permettant ainsi d’adresser nos questions biologiques d’intérêt durant les différentes étapes clefs du développement et de la maturation du système nerveux central (avant et durant la genèse des neurones, durant leur migration, pendant et après leur maturation fonctionnelle).
Etude par imagerie de l’impact de la neurostimulation pour améliorer les capacités ventilatoires suite à un trauma cervical sur un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
Opérées d'une lésion de la moelle épinière cervicale, 350 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, la moitié classée sévère, toutes tuées à l'issue. La lésion entraîne une perte sensorielle et une réduction de la capacité respiratoire d'un côté du corps, avant deux semaines de stimulation électrique des muscles sous anesthésie et un suivi par IRM. Elles sont ensuite mises à mort pour l'analyse des tissus, le porteur indiquant que les méthodes alternatives n'y répondent pas. Les retombées pour les patients tétraplégiques sont présentées comme un 'objectif ultime' et une preuve de concept, à distance de toute application.
Objectifs
Chaque année, près de 500 000 personnes dans le monde subissent des lésions de la moelle épinière, que ce soit à la suite d'un accident ou d'une autre cause. La plupart de ces blessures touchent la région cervicale, ce qui entraîne non seulement une paralysie des muscles, mais aussi une réduction importante de la capacité pulmonaire, ce qui peut entraîner des difficultés respiratoires graves. De nombreuses personnes tétraplégiques (paralysées des quatre membres) ont besoin d’une assistance respiratoire, parfois à vie, ce qui a un fort impact sur leur qualité de vie et sur la société en général. Nos recherches visent à trouver des solutions alternatives à l’utilisation permanente de la ventilation mécanique. Dans ce cadre, après une lésion de la moelle épinière, nous travaillons sur une stratégie de réparation des réseaux neuronaux et des fonctions musculaires basée sur une stimulation électrique neuromusculaire. L’objectif de l’étude est de voir si une simulation électrique neuromusculaire permet d'augmenter l'activité neuronale au niveau de la moelle et/ou de réduire la lésion, afin de mieux comprendre comment se déroule la récupération de fonction qui a été observée et d'avoir des pistes pour optimiser plus avant cette stimulation. Pour réaliser ces observations, nous allons d’une part mettre en place l’imagerie fonctionnelle IRM de la moelle épinière de la souris et d’autre part de caractériser par imagerie IRM, au niveau anatomique et fonctionnelle, les effets de la stimulation électrique neuromusculaire. Ces informations sur l'impact de la stimulation électrique neuromusculaire sont importantes pour pouvoir, à terme, porter cette technique chez l'homme.
Bénéfices attendus
Notre objectif ultime est d’apporter des preuves de concept de la récupération de l’activité ventilatoire partielle ou totale après une lésion de la moelle épinière. Les résultats de cette étude serviront à montrer qu’il est possible de réactiver et de soutenir la plasticité de la moelle épinière, même dans les conditions les plus toxiques et néfastes d'une lésion de la moelle épinière, tout en apportant des nouvelles données scientifiques sur les mécanismes de récupération respiratoire et des indications pour une utilisation chez l’humain. Certains patients restent dépendants à vie d’une assistance respiratoire, un équipement qui les coupe d’une vie sociale et des centres de rééducation, et diminue par conséquent leur espérance de vie. Trouver une solution est indispensable.
Procédures
Tous les animaux subiront une chirurgie qui consiste en une lésion ou une incision pour les animaux contrôles (durée inférieure à 40 min), chirurgie réalisée sous anesthésie et analgésie. Par la suite, les animaux seront impliqués dans un traitement basé sur la stimulation des muscles (30 min, 5 fois par semaine pendant 2 semaines, réalisé sous anesthésie). Tous les animaux seront également impliqués dans un suivi par imagerie IRM (3 sessions en 3 semaines).
Impact sur les animaux
Les nuisances principales attendues sur les animaux sont celles induites par la chirurgie de lésion de la moelle épinière. Lors de l’anesthésie, il y a un risque d’hypothermie et de douleur au réveil. La lésion entraine également un inconfort dû à la perte sensorielle des pattes postérieures et antérieures correspondant au côté lésé, ainsi qu’une réduction de la capacité respiratoire liée à l’atteinte de la conduction nerveuse vers la partie du diaphragme qui correspond au côté lésé de la moelle épinière. Ces atteintes ne sont cependant que d'un côté, et elles permettent donc à l’animal de se mouvoir, de se nourrir et de respirer mais cela peut entrainer un inconfort du fait de ne pas se mouvoir complètement librement. Une diminution du volume d'air inspiré à chaque respiration est possible les premiers jours mais elle est compensée naturellement par une augmentation de la fréquence respiratoire. Les animaux sont sous analgésie injectée par voie sous-cutanée trois fois par jour pendant 2 jours (le jour de la chirurgie + 2 jours suivants). Cela peut entrainer un stress. Il peut aussi exister un risque de soif et de dénutrition si les animaux n’arrivent pas à se nourrir et boire suffisamment les jours après la chirurgie. Un stress pourra également être ressenti par les animaux lors des tests fonctionnels, notamment lorsqu’ils seront dans le tube permettant de mesurer le volume respiratoire (durée 20 min) où ils peuvent ressentir une limite de leur liberté d’expression physique.
Devenir
Chaque animal sera euthanasié à l’issue des expériences, afin de réaliser des études des tissus à l'échelle cellulaire sur les prélèvements post-mortem. Ces analyses constituent une part importante des projets sur lesquels nous travaillons, auxquelles les méthodes alternatives ne répondent pas.
Remplacement
À l'heure actuelle, il n'y a pas de modèle expérimental clinique autre que les sujets humains ou animaux pour étudier les réponses physiologiques intégrées. Ce projet a pour but de développer des preuves de concept de réparation d’une neuropathologie pour laquelle aucune thérapie n’est proposée aux patients. Nous ne serions pas en mesure d'effectuer les manipulations nécessaires chez l'homme (par exemple, une intervention pharmacologique dans les systèmes de neurotransmetteurs, des observations à l'échelle cellulaire, des prélèvements de moelle épinière), et nous devons donc recourir à l'expérimentation sur les espèces de mammifères non humains. Les connectivités neuronales de ces systèmes intégrés nécessaires pour mener "des études de modélisation" ne sont pas disponibles, ou encore, aucun comportement suite à un traitement innovant ne peut être prédit, et il n'existe actuellement aucun substitut à l'expérimentation animale. Les concepts qui ont guidé cette recherche sont nouveaux dans le domaine et, à ce titre, doivent être soigneusement étudiés dans des situations biologiquement pertinentes.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Nous réaliserons un suivi par imagerie IRM, ce qui permet de suivre un même animal à plusieurs temps et ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Une semaine d'acclimatation est prévue à l'arrivée des animaux avant toute expérience. Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies, selon le protocole mis en place à l'animalerie. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur (critères pris en compte : prostration, renfoncement des yeux, arrêt du nettoyage du pelage). Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). Une couverture analgésique et anesthésique est prévue pour chaque intervention pouvant générer de la douleur (par exemple chirurgie) ou du stress (par exemple imagerie). En cas d'anesthésie, les animaux sont placés sur une couverture chauffante pour maintenir leur température corporelle et leurs yeux sont couverts d'un gel oculaire pour éviter le déssèchement. En situation où l'animal serait affaibli (par exemple juste après une chirurgie), une nourriture hypercalorique et hydratée sera fournie.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux d’expérimentation très utilisés dans la recherche préclinique sur le traumatisme du système nerveux, afin d’améliorer la connaissance de la pathologie et de développer des stratégies thérapeutiques adaptées. Malgré des différences entre l’homme et les rongeurs, les changements pathologiques, la réponse inflammatoire et l’expression des gènes précoces après une lésion sont les mêmes. L’induction de la lésion est très reproductible et standardisée chez le rongeur et de nombreux tests comportementaux ont été très bien établis. Les outils disponibles sont multiples et permettent de caractériser l’évolution d’une lésion (par exemple microscopie optique ou imagerie IRM). L’ensemble des animaux utilisés seront adultes afin de travailler sur un système nerveux mature et stable.
Etude de la thermorégulation et prise en charge pharmacologique du coup de chaleur
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Maintenues sous anesthésie deux heures et poussées jusqu'à 41 °C de température corporelle, 246 souris vont être utilisées pour étudier la thermorégulation, 230 d'entre elles opérées sous anesthésie et tuées sans réveil. Injectées d'agonistes et d'antagonistes, elles basculent dans des états hypothermiques ou hyperthermiques, selon qu'elles portent ou non une mutation du gène TRPV1. Le projet est présenté comme le premier modèle animal du coup de chaleur, avec une perspective d'imagerie transférable à la clinique. Sur le remplacement, le porteur se borne à indiquer que la mesure de la température corporelle ne peut se faire que sur animal vivant.
Objectifs
Le coup de chaleur se caractérise par une augmentation soudaine de la température corporelle au-dessus de 40 °C, entrainant un dysfonctionnement du système nerveux central. La mortalité est élevée et les survivants d'un coup de chaleur peuvent souffrir de séquelles à long terme. Il est essentiel d'améliorer nos connaissances et notre capacité à mesurer les mécanismes biologiques impliqués dans la thermorégulation. Chez les mammifères, la production de chaleur est un processus indispensable pour maintenir la température à environ 37 °C. Cette production de chaleur repose sur la mitochondrie, qui « brûle » la plupart des nutriments pour produire de l’énergie et de la chaleur. Récemment, un thermostat mitochondrial a été découvert et la stimulation de ce gène d’intérêt induit une hypothermie chez les animaux et chez l'Homme. Ce projet vise à explorer in vivo la fonction de thermostat moléculaire en caractérisant les changements de température dans le cerveau et les muscles de souris lors de défis environnementaux ou pharmacologiques qui favorisent ou limitent la dissipation thermique cellulaire et organique chez des souris exprimant ou non une variante défectueuse de ce thermostat. Ce projet vise également à développer les outils IRM qui nous permettront de caractériser cette faible production et dissipation de chaleur en mesurant de manière non invasive la température.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de caractériser de manière non invasive le premier modèle animal pour étudier le coup de chaleur et d'explorer le rôle du TRPV1 dans la thermorégulation en évaluant l'impact des défis thermiques sur le thermostat mitochondrial. Ce projet nous permettra de caractériser de manière non invasive le premier modèle animal pour étudier le coup de chaleur et d'explorer le rôle du TRPV1 dans la thermorégulation en évaluant l'impact des défis thermiques sur le thermostat mitochondrial. Enfin, ce modèle est également particulièrement pertinent d'un point de vue physiologique et mécanistique pour comprendre la fonction du canal TRPV1. Bien que le TRPV1 soit désormais une cible thérapeutique validée pour le traitement de certains types de douleurs aiguës et chroniques, l'industrie pharmaceutique a eu du mal à développer des analgésiques en raison des effets secondaires liés à la température. Nous pensons pouvoir tirer parti de ces observations, avec des perspectives thérapeutiques pour lutter contre les coups de chaleur, précisément en utilisant des agents qui réduisent considérablement la température corporelle. Il convient de noter que, en cas de succès, le transfert des méthodes vers une étude clinique incluant la méthodologie de thermométrie par IRM est possible et serait d'une importance capitale.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés sur une période de 2 heures et seront soit dans un environnement dont la température permettra un maintien de la température corporelle en normothermie ou en hyperthermie. Les animaux recevront également des injections d'anesthésiques et d'agents pharmacologiques en bolus.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances pour les animaux seront liées à la durée d’anesthésie (2 heures) pour pouvoir atteindre la valeur de température corporelle cible (41°C) par challenge thermique environnemental mais également aux températures corporelles cibles associées à l’hyperthermie. Les animaux seront également soumis à l’injection d’agonistes et d’antagonistes pouvant entraîner des phénotypes hypothermiques ou hyperthermiques.
Devenir
Les souris de la première procédure visant à mettre au point l'anesthésie seront conservées et seront intégrées aux lots d'animaux de la procédure 2. Les animaux utilisés lors des procédures 2, 3 , 4, 5 et 6 seront mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
L'expérimentation ayant pour objet l'évaluation de la température corporelle, elle ne peut être conduite que sur animal vivant.
Réduction
Le choix de réaliser une étude pilote va nous permettre de tester par palier les différentes conditions expérimentales, en particulier les dosages et donc potentiellement de ne pas réaliser tous les groupes prévus à partir du moment où l’objectif sera atteint. En complément de cette approche permettant potentiellement de réduire le nombre d’animaux, des individus des deux sexes seront intégrés à l’étude.
Raffinement
Les animaux recevront les soins classiques de la structure avec régulation de température, accès sans limite à la nourriture et à l'eau, enrichissement des cages (frisotti papier, carré bois et cabanes). Les animaux auront une phase d’acclimatation de 5 jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress Pendant la l’anesthésie, un dépôt de gel ophtalmique sur la cornée sera effectué et le suivi de la qualité de l’anesthésie sera évalué par mesure de la fréquence respiratoire. Lorsque les points limites seront atteint, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicales.
Choix des espèces
Le modèle génétique altéré étant un modèle murin, cette étude doit être menée sur ce modèle animal donc sur des souris porteuses ou non d’une mutation du gène TRPV1. Il s’agira d’animaux âgés de 8 à 12 semaines ayant atteint la maturité sexuelle et immunitaire.
MODIFICATION Codage synaptique de l’entrée sensorielle dans le cortex insulaire postérieur (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses d'électrophysiologie ou d'anatomie, 1 942 souris vont être utilisées dans des travaux d'un niveau de souffrance modéré sur le cortex insulaire. Elles subissent une ou deux chirurgies crâniennes, l'implantation d'une fenêtre crânienne, une fixation de la tête répétée et un hébergement individuel de 21 jours, avec une injection de chlorure de lithium provoquant une nausée. Le projet vise à décrire comment ce territoire du cerveau traite le goût, le toucher, le son et la température, des connaissances que le porteur qualifie de 'très limitées'. Les bénéfices restent formulés comme l'espoir d'ouvrir 'la voie' à une meilleure compréhension, sans application annoncée à court terme.
Objectifs
L'objectif principal du projet est de déterminer les propriétés des circuits neuronaux du cortex insulaire postérieur (CIP) et les mécanismes par lesquels ces circuits traitent les informations sensorielles. En effet le cortex insulaire est impliqué dans une grande variété de fonctions, notamment l'interoception, les états émotionnels et, dans sa partie postérieure, le traitement sensoriel du goût, du toucher, du son et de la température. Nos connaissances sur les propriétés des circuits neuronaux du CIP et sur sa connectivité fonctionnelle dans des conditions physiologiques et pathologiques sont très limitées. Il a été postulé que la plasticité à court terme est un facteur clé dans le façonnement du traitement sensoriel, permettant par exemple de distinguer des stimuli de nature similaire. Cependant, cette hypothèse n'a pas encore été testée directement. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire allant du traçage anatomique et fonctionnel in vitro à l'imagerie fonctionnelle in vivo et enfin nous évaluerons la pertinence de nos résultats avec des tests comportementaux spécifiques. Nous activerons ou inactiverons des voies spécifiques et testerons les conséquences sur la fonction des circuits et le traitement sensoriel. Nous modifierons, au niveau d'une synapse spécifique, la plasticité à court terme en éliminant ou en surexprimant des protéines clés impliquées dans la transmission synaptique et nous testerons les conséquences sur la fonction du circuit, le traitement sensoriel et le comportement.
Bénéfices attendus
Nous espérons identifier les principales projections sous-corticales vers le CIP et comprendre le circuit synaptique par lequel les informations sensorielles sont intégrées dans le CIP. Grâce à l'approche expérimentale impartiale conçue ici, nous espérons acquérir des notions fondamentales sur l'anatomie et la fonction du circuit sous-cortical-cortical impliqué dans le traitement sensoriel gustatif. Dans une perspective plus large, cela ouvrira la voie à une meilleure compréhension de la physiologie du CI, une région proposée pour orchestrer les entrées sensorielles, cognitives et émotionnelles.
Procédures
- 1 procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30 et 60 min - 1 procédure chirurgicale avec implantation fenêtre cranienne : entre 1 et 2H. L'habituation à la fixation de la tête devrait durer entre 5 et 60 minutes par jour sur 2 à 5 jours. L'habituation à la stimulation sensorielle devrait durer de 2 à 5 jours. Les manipulations opto- ou chimiogénétiques des assemblages neuronaux sont réalisées sur un animal éveillé. L'ensemble de la procédure dure environ 1 à 2 heures. Du chlorure de lithium sera injecté une fois aux souris lors d'une procédure de test d'aversion gustative conditionnée, lequel durera au total 11 jours. MODIFICATION LES ANIMAUX SERONT MAINTENUS EN HEBERGEMENT INDIVIDUEL PENDANT 21 JOURS
Impact sur les animaux
Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie stéréotaxique bien que toutes les précautions soient prises pour être dans des conditions d’asepsie et pour réduire au maximum ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse (anesthésie, analgésie, anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi post-opératoire, raffinement des conditions d’hébergement ...). La fixation des souris par la tête peut générer une gêne qui sera minimisée par une habituation lente à l’aide de plusieurs sessions. En ce qui concerne la restriction hydrique, nous nous attendons à une perte de poids qui sera surveillé quotidiennement. L'injection de chlorure de lithium induit une nausée transitoire.
Devenir
Tous lea animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure pour des études d'électrophysiologie ou d'anatomie.
Remplacement
La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent le rôle des propriétés et des plasticités synaptiques dans le traitement sensoriel dans le CIP chez des animaux au comportement éveillé. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici.
Réduction
La solidité de nos hypothèses de travail vérifiées par nos études précédentes, le caractère innovant des méthodes utilisées (imagerie chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l'expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre d'animaux. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex de la souris présentent de nombreuses similitudes avec le néocortex d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. Comme la taille du cerveau varie entre 3 semaines et 6 mois, les coordonnées stéréotaxiques seront ajustées en conséquence. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.
Mistime :conséquences métaboliques et cognitives d’une désynchronisation des rythmes métaboliques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Nourries huit semaines d'un régime gras et sucré à des horaires décalés, elles passent des tests métaboliques et cognitifs, avec un prélèvement de sang derrière l'œil sous anesthésie locale. Le projet veut montrer qu'un désalignement des rythmes jour-nuit dérègle le métabolisme et la mémoire. Cette "preuve de concept" reste annoncée au conditionnel, quand les prélèvements et le régime imposé sont, eux, bien réels.
Objectifs
Les mammifères présentent un rythme circadien de 24 heures, permettant de synchroniser les fonctions biologiques aux variations environnementales, notamment l’alternance jour/nuit. Cette synchronisation repose sur l’interaction entre l’horloge centrale et les horloges périphériques, et est principalement régulée par la lumière. La régulation du métabolisme est fortement dépendante de cette coordination pour maintenir l’homéostasie énergétique. Cependant, la pollution lumineuse et/ou des rythmes alimentaires irréguliers peuvent perturber cette synchronisation, induisant un désalignement entre horloges centrale et périphériques. La lumière artificielle nocturne inhibe la sécrétion de mélatonine, perturbant le rythme veille/sommeil et les horloges métaboliques (foie, muscles). Ces désynchronisations augmentent le risque de troubles métaboliques, surtout lorsqu’elles sont combinées à une prise alimentaire durant la phase de repos. L’axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien (HHT), régulateur des hormones thyroïdiennes (HT), joue un rôle central dans le fonctionnement du cerveau, le métabolisme et les rythmes circadiens. Les HT influencent la neurogenèse, le métabolisme énergétique et interagissent avec les horloges biologiques. Leur production est essentielle pour maintenir la rythmicité des horloges métaboliques. Des dérèglements métaboliques peuvent entraîner une inflammation chronique favorisant la neuroinflammation. Celle-ci altère la plasticité neuronale, affecte les fonctions cognitives et augmente le risque de neurodégénérescence. La flexibilité métabolique apparaît comme un facteur clé de prévention des déséquilibres métaboliques. Elle dépend des horloges circadiennes, qui optimisent les processus métaboliques selon le cycle jour/nuit. La flexibilité métabolique pourrait être améliorée en synchronisant la prise alimentaire avec le rythme circadien naturel d’utilisation des nutriments. Ainsi, des approches comme le Time-Restricted Feeding (TRF), ou alimentation à horaires restreints, limitant la prise alimentaire à certaines plages horaires, ont montré des effets bénéfiques sur la régulation métabolique, bien que les mécanismes impliqués restent à élucider. Grâce au TRF, nous étudierons à l’aide d’une souche de souris sensible à l’obésité induite, les effets métaboliques, neuroinflammatoires et cognitifs d’une désynchronisation, ainsi que le potentiel de la resynchronisation alimentaire avec le cycle jour/nuit à restaurer l’équilibre métabolique et cognitif.
Bénéfices attendus
Notre projet pourrait apporter la preuve de concept des effets néfastes des perturbations circadiennes sur la régulation du métabolisme et de leurs conséquences sur la cognition. La désynchronisation devrait exacerber les perturbations métaboliques et promouvoir la prise de poids et une augmentation de la neuroinflammation, associée à une diminution de la neurogenèse, pouvant conduire à des altérations cognitives. Toutefois, ces effets devraient être réversibles grâce à la resynchronisation. Ces résultats devraient appuyer l’hypothèse selon laquelle les désalignements circadiens affectent à la fois le métabolisme et la santé cérébrale, augmentant les risques de vieillissement précoce et de neurodégénérescence.
Procédures
Les animaux ne seront soumis qu’à une seule procédure, qui sera constituée de 4 actes : - alimentation riche en gras et en sucre (45 % des calories apportées par la graisse et 17% des calories apportées par du sucrose) restreinte dans le temps (soit à volonté, soit durant le jour, soit durant la nuit) pendant 8 semaines - caractérisation métabolique : prise de poids hebdomadaire, test de tolérance au glucose avec mesure de la glycémie après gavage à partir d'une goutte de sang prise à la queue+prise de sang pour dosages hormonaux, mesure de composition corporelle par bioimpédance, mesure de la production de chaleur par caméra thermique - évaluation de capacités cognitives avec différents tests de comportements - prélèvement sanguin avant euthanasie
Impact sur les animaux
Les animaux ne devraient pas subir d’effets indésirables majeurs, le régime HFHS étant équivalent à une nourriture occidentale. On attend une prise de poids variable entre les individus, mais qui selon notre expérience ne devrait pas dépasser un gain de poids supérieur à 7% par rapport au poids initial.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de procéder aux prélèvements des différents tissus nécessaires à nos analyses.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer le recours aux animaux car les études physiologiques portant sur des influences métaboliques ne peuvent être réalisées que chez des animaux vivants, dans un système intégré. Par conséquent, l’impact du régime HFHS et de la synchronisation/désynchronisation de la prise alimentaire avec le cycle circadien de l’animal sur ses capacités cognitives ne sera observable qu’en réalisant des tests de mémoire sur animaux vivants. De même, nous ne pouvons pas mimer la flexibilité métabolique in vitro ou ex vivo, il est donc nécessaire d’utiliser l’animal entier.
Réduction
Dix animaux par groupe seront utilisés (6 pour les prélèvements de tissus et 4 pour les analyses immunohistochimiques), un nombre estimé à partir de nos expériences passées avec ce type d’analyses et qui est le minimum pour garantir une exploitation et une puissance statistique des résultats obtenus. Un nombre d'animaux plus faible serait dommageable dans l'exploitation de nos données et contribuerait à utiliser des animaux inutilement. Ainsi, nous évaluons le nombre d’animaux à 30 souris pour ce projet. Pour ne pas perdre en puissance statistique, l’analyse des résultats obtenus sera effectuée à l’aide d’un test non paramétrique avec permutation qui utilise une méthode de calcul exact avec une estimation par Monte Carlo
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (gel lidocaïne (gel ophtalmique à 2 %) pour anesthésie locale pendant la prise de sang en rétro-orbital). Les animaux disposent de nourriture selon le rythme décrit (mais leur permettant d’avoir l’apport calorique nécessaire sur 24h) et de l’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de nid en plastique. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de celles-ci grâce à une surveillance attentive (points limites, énoncés ci-après) et des soins adaptés. Même si nous n’attendons pas d’effets délétères marqués suite à notre procédure qui est légère, les indicateurs habituels comme la prostration, détectée par les animaliers ou par l’expérimentateur, l’absence d’alimentation (la diminution des quantités de nourriture disponible entre deux nourrissages est vérifiée par pesée), des symptômes apparents de gêne ou de douleur (irritations, grattement, léchage) ou enfin des troubles du comportement (agressivité, sur-léchage, agitation anormale ou hyperréactivité) seront particulièrement suivis. Dans le cas où un ou plusieurs des symptômes cités varient de manière significative, l’animal sera dans un premier temps sorti de la procédure, et/ou euthanasié dans les cas les plus extrêmes. Une bonne maîtrise de la procédure et un suivi assidu des groupes expérimentaux doit prémunir de la survenue d’incidents de ce type. Tout signe d'atteinte du système nerveux central (inclinaison de la tête, spasmes, convulsions, troubles de l'équilibre) entraînera systématiquement le retrait de l'animal de la procédure et son euthanasie.
Choix des espèces
Le modèle biologique choisi est la souris. Les connaissances accumulées par la communauté scientifique sur les souris, et particulièrement sur les C57Bl6/J dans les modèles d’obésité, ont permis d’identifier de nombreux mécanismes physiologiques impliqués dans le maintien de la balance énergétique et de valider des tests comportementaux permettant de mesurer les capacités mnésiques des souris. Tous les protocoles utilisés dans ce projet de recherche ont été optimisés et validés pour la souris, avec un contrôle maximum des paramètres vitaux. Nous utiliserons des animaux adultes (âgés de plus de 8 semaines au début de l’expérience), afin que les résultats ne soient pas faussés par la prise de poids induite par la croissance des animaux s’ils sont trop jeunes.
MOFDIFICATION Codage synaptique de l’entrée sensorielle dans le cortex insulaire postérieur (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une injection de chlorure de lithium qui provoque une nausée, une fenêtre ouverte dans le crâne et jusqu'à vingt et un jours en cage individuelle : 1 942 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent aussi une injection de virus dans le cerveau, une fixation de la tête et une restriction d'eau pour les motiver à une tâche gustative. Le projet étudie comment une région du cortex traite les informations sensorielles du goût. Toutes sont tuées pour des analyses d'électrophysiologie ou d'anatomie.
Objectifs
L'objectif principal du projet est de déterminer les propriétés des circuits neuronaux du cortex insulaire postérieur (CIP) et les mécanismes par lesquels ces circuits traitent les informations sensorielles. En effet le cortex insulaire est impliqué dans une grande variété de fonctions, notamment l'interoception, les états émotionnels et, dans sa partie postérieure, le traitement sensoriel du goût, du toucher, du son et de la température. Nos connaissances sur les propriétés des circuits neuronaux du CIP et sur sa connectivité fonctionnelle dans des conditions physiologiques et pathologiques sont très limitées. Il a été postulé que la plasticité à court terme est un facteur clé dans le façonnement du traitement sensoriel, permettant par exemple de distinguer des stimuli de nature similaire. Cependant, cette hypothèse n'a pas encore été testée directement. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire allant du traçage anatomique et fonctionnel in vitro à l'imagerie fonctionnelle in vivo et enfin nous évaluerons la pertinence de nos résultats avec des tests comportementaux spécifiques. Nous activerons ou inactiverons des voies spécifiques et testerons les conséquences sur la fonction des circuits et le traitement sensoriel. Nous modifierons, au niveau d'une synapse spécifique, la plasticité à court terme en éliminant ou en surexprimant des protéines clés impliquées dans la transmission synaptique et nous testerons les conséquences sur la fonction du circuit, le traitement sensoriel et le comportement.
Bénéfices attendus
Nous espérons identifier les principales projections sous-corticales vers le CIP et comprendre le circuit synaptique par lequel les informations sensorielles sont intégrées dans le CIP. Grâce à l'approche expérimentale impartiale conçue ici, nous espérons acquérir des notions fondamentales sur l'anatomie et la fonction du circuit sous-cortical-cortical impliqué dans le traitement sensoriel gustatif. Dans une perspective plus large, cela ouvrira la voie à une meilleure compréhension de la physiologie du CI, une région proposée pour orchestrer les entrées sensorielles, cognitives et émotionnelles.
Procédures
- 1 procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30 et 60 min - 1 procédure chirurgicale avec implantation fenêtre cranienne : entre 1 et 2H - L'habituation à la fixation de la tête devrait durer entre 5 et 60 minutes par jour sur 2 à 5 jours. L'habituation à la stimulation sensorielle devrait durer de 2 à 5 jours. Les manipulations opto- ou chimiogénétiques des assemblages neuronaux sont réalisées sur un animal éveillé. L'ensemble de la procédure dure environ 1 à 2 heures. Du chlorure de lithium sera injecté une fois aux souris lors d'une procédure de test d'aversion gustative conditionnée, lequel durera au total 11 jours. MODIFICATION LES ANIMAUX SERONT MAINTENUS EN HEBERGEMENT INDIVIDUEL PENDANT 21 JOURS MAXIMUM
Impact sur les animaux
Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie bien que toutes les précautions soient prises pour être dans des conditions d’asepsie et pour réduire au maximum ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse (anesthésie, analgésie, anti-inflammatoire, suivi post-opératoire, raffinement des conditions d’hébergement ...). La fixation des souris par la tête peut générer une gêne qui sera minimisée par une habituation lente à l’aide de plusieurs sessions. En ce qui concerne la restriction hydrique, nous nous attendons à une perte de poids qui sera surveillé quotidiennement L'injection de chlorure de lithium induit une nausée transitoire.
Devenir
Tous lea animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure pour des études d'électrophysiologie ou d'anatomie.
Remplacement
La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent le rôle des propriétés et des plasticités synaptiques dans le traitement sensoriel dans le CIP chez des animaux au comportement éveillé. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici.
Réduction
La solidité de nos hypothèses de travail vérifiées par nos études précédentes, le caractère innovant des méthodes utilisées (imagerie chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l'expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre d'animaux. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L'expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex de la souris présentent de nombreuses similitudes avec le néocortex d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. Comme la taille du cerveau varie entre 3 semaines et 6 mois, les coordonnées stéréotaxiques seront ajustées en conséquence.Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.
Etude des effets de l’exposition dévéloppementale aux mélanges de contaminants environnementaux sur la fonction et les comportements de reproduction chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Exposées aux contaminants dès la vie intra-utérine à travers leur mère, 300 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Une partie subit une chirurgie de retrait des gonades avec pose d'un implant hormonal sous anesthésie, des injections répétées, puis des tests de comportement sexuel pouvant durer jusqu'à dix heures. Le projet évalue les effets d'un mélange de polluants du lait maternel sur la fertilité. 240 souris sont tuées pour des prélèvements et 60 mâles sont transférés vers d'autres projets de l'équipe.
Objectifs
Dans le cadre de la santé environnementale, l’un des défis actuels majeurs est l’évaluation de risque pour les mélanges de contaminants chimiques auxquels la faune et l’humain sont exposés au quotidien. Cette évaluation se fait encore actuellement substance par substance. L’équipe a récemment participé à l’élaboration d’une méthodologie visant à faire l’évaluation de mélanges de contaminants. Cette méthodologie a été appliquée à un mélange de substances identifiées pour les contaminants du lait maternel en France. Cette première évaluation théorique des risques combinés a suggéré un risque élevé pour les nourrissons, en particulier lié à des effets potentiels neuraux et neuroendocriniens. Ce projet s’inscrit dans le cadre de partenariats, un national et un Européen, aux expertises complémentaires et pluridisciplinaires, qui visent à produire les données expérimentales permettant d’établir et d'améliorer cette méthodologie pour l'évaluation des mélanges de polluants chimiques. Il s’agit de caractériser chez la souris les effets neuraux de l’exposition développementale, i) au mélange de polluants persistants identifié dans le lait maternel humain, et ii) au mélange de contaminants non persistants identifié dans des cohortes humaines. Ce travail combinera des approches complémentaires d’analyses comportementales, neuroendocrines, cellulaires et moléculaires.
Bénéfices attendus
Les données obtenues seront d'une grande pertinence car elles participeront à i) l'évaluation des effets potentiels sur la santé humaine de l'exposition aux cocktails de contaminants environnementaux, ii) l’identification des biomarqueurs pertinents de l’exposition, et iii) l’établissement et l’amélioration de l'approche théorique nouvellement développée pour l'évaluation générale des risques de mélanges de contaminants chimiques à des doses de l'ordre de l'exposition environnementale
Procédures
L’ensemble des souris subiront une exposition in utero (20 jours anténatal) et développemental (25 jours après la naissance) à deux mélanges de contaminants. Cette exposition se fait à travers la mère par prise spontané quotidienne d’une céréale exposée aux mélanges de contaminants. Une partie de ces animaux seront impliqués à l’âge adulte dans une unique chirurgie associée à une pose d’implant hormonal sous anesthésie générale d’une durée maximale de 30 minutes et avec une prise en charge analgésique pré et post-opératoire. Un lot de souris stimuli subira une deuxième chirurgie sous anesthésie générale afin de remplacer l’implant hormonal. De plus, les souris femelles vigiles subiront une injection (de l’ordre de la minute) répétés maximum 4 fois. L’ensemble des animaux de cette demande d’autorisation de projet seront impliqué dans des tests de comportements sexuels (durant entre 5 min et 10h en fonction du comportement reproducteur testé) permettant d’étudier les effets d’une exposition développementale à un mélange de contaminants chimiques environnementaux sur la fertilité. Enfin, l’euthanasie des animaux sera réalisée par différentes méthodes réglementaires.
Impact sur les animaux
Au sein de ce projet, nous pratiquerons sur certains animaux une chirurgie sous anesthésie générale afin de retirer les gonades et insérer des implants d’hormones. De manière générale, cette chirurgie dure en moyenne 15 à 30 minutes. La chirurgie peut causer d’éventuels douleurs post-opératoires et des symptômes à court et à long terme liés à cette chirurgie qui seront prises en charge par l’expérimentateur. Les tests de comportement sexuel se font pendant la période d’activité des animaux, phase obscure, et sont filmés en lumière rouge afin d’interférer le moins possible avec le comportement des animaux. Il n’est pas prévu de nuisances ou d’effets indésirables de ces tests de comportement qui sont des comportements exprimés de manière spontanée chez la souris. Un léger inconfort peut être généré par la première introduction des souris dans les dispositifs liés aux tests comportementaux d’activité locomotrice et d’état d’anxiété. Les injections d’hormones chez les femelles avant chaque test de comportement peuvent générer une douleur légère au point de piqûre. De même, les injections d’anesthésiques et d’antalgiques au moment de l’euthanasie peuvent également générer une douleur légère au point de piqûre.
Devenir
240 souris seront euthanasiées à la fin des différentes procédures afin de réaliser des prélèvement et analyses post-mortem nécessaires à l’étude des effets reproducteurs et neuroendocrines d’une exposition developpementale à des mélanges de polluants chimiques. 60 souris utilisés pour tester les comportements de reproduction mâle seront réutilisés dans d’autres projets au sein de l’équipe de recherche.
Remplacement
L’évaluation pour la santé humaine des effets de l’exposition aux polluants chimiques dont les perturbateurs endocriniens repose sur l’utilisation des modèles rongeurs et la caractérisation dans ces modèles in vivo des effets, des modes d’action endocriniens et du lien entre l’effet et le mode d’action. Jusqu’à présent, ces critères ne peuvent être étudiés que dans ces modèles in vivo. En effet, l’étude de la fonction et du comportement de reproduction ne peut se faire que sur l’organisme entier. Une méthode alternative ne peut remplacer l’animal entier pour la définition des trois critères cités ci-dessus. Néanmoins, certains aspects de cette étude seront remplacés par de la modélisation mathématique et une approche in vitro de cultures des neurones générés par la technologie des cellules souches pluripotentes induites, comme décrit ci-dessous.
Réduction
Dans cette demande d’autorisation de projet, un total de 300 animaux (120 mâles et 180 femelles) seront impliqués. L’expertise scientifique de l’équipe et du porteur de projet permet de connaitre le nombre d’animaux par groupe nécessaire pour des résultats fiables et consistants. Les effectifs utilisés ont été calculés à l'aide d'un calcul de puissance afin de garantir une analyse statistique significative le cas échéant, compte tenu de la variabilité interindividuelle. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons les mêmes cohortes d’animaux pour les analyses neuroendocrinologiques et comportementales qui seront ensuite divisé en deux groupes pour les analyses moléculaires et cellulaires. De plus, l’utilisation des animaux servira seulement pour l’exposition au mélange complet, afin de caractériser les effets induits par le mélange, les modes d’action endocrinien et le lien entre les deux. La comparaison des effets de certaines substances seules à ceux des mélanges, ou la dissection de certains mécanismes moléculaires et cellulaires des polluants du mélange seront effectuées in vitro sur des cultures des neurones générés par la technologie des cellules souches pluripotentes induites. Pour finir, plusieurs zones du cerveau (hypothalamus, bulbe oflactif, amygdale médiane, etc…) seront collectées et stockées pour des études futures, les autres organes (sang, hypophyse, dents, squelette…) seront proposés aux membres et/ou collaborateurs de l’équipe.
Raffinement
Les animaux seront produits et hébergés dans une animalerie, sous la supervision des soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010-63-EU en termes d’espaces et d’environnement. Les souris seront soumises à un cycle de lumière-obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l’enrichissement, un nid végétal sera placé dans la cage. Afin de minimiser les effets indésirables de la chirurgie tels que la douleur, l’apathie ou la léthargie, les animaux seront prises en charge avec des anti-inflammatoire et des opioïdes toutes les 24h pendant 3 jours suivants l’opération. Les nombreuses études réalisées pas l'équipe et précédemment publiées montrent que l'exposition directe ou indirecte à des contaminants chimiques à des doses faibles, proches de l'exposition environnementale humaine, ne génère aucune souffrance, douleur ou inconfort. Les souris sont surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement. De plus, une habituation à l'expérimentateur est pratiquée pendant au moins une semaine avant le début des tests comportementaux, afin d'éviter tout stress lié à la manipulation. Des points limites adaptés à la chirurgie et aux tests comportementaux auxquels sont soumis les animaux sont mis en place afin d’arrêter la procédure en cas de besoin.
Choix des espèces
La souris commerciale est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et comportementales grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...), et de données dans la littérature permettant d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Dans le cadre de la problématique de la perturbation endocrinienne, l'équipe de recherche et le porteur de projet ont déjà effectué de nombreuses études par le passé dans ce domaine, qui servent de base pour les projets en cours. Les animaux rentreront dans les procédures expérimentales après sevrage, qui aura lieu entre le 21 ème et 25 ème jour postnatal. Les analyses se feront chez les juvéniles après sevrage et à l’âge adulte. Les stades juvéniles et adultes permettent de suivre ces animaux après la fin de l’exposition (effets à court terme) et à l’âge adulte (effets à long terme). Chaque souris sera identifiée soit par un tatouage aux doigts soit par encoche au niveau des oreilles au moment du sevrage.
Rôle des contacts microglie-synapses dans les mécanismes de consolidation de la mémoire chez la souris (EU 2/3)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une chirurgie du crâne de quatre heures, une contention de la tête portée jusqu'à trois heures par séance et une restriction d'eau de douze heures répétée six fois : 3 480 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Pour les motiver à une tâche tactile, un souffle d'air leur est envoyé en cas de mauvaise réponse. Le projet veut comprendre pourquoi une anesthésie prolongée peut laisser des troubles de mémoire, en observant les cellules immunitaires du cerveau. Au-delà des organes étudiés, d'autres sont prélevés pour constituer une banque de tissus mise à disposition d'autres laboratoires.
Objectifs
L’anesthésie générale est utilisée tous les jours à l’hôpital, notamment lors d’opérations chirurgicales ou pour maintenir un patient endormi en soins intensifs. Dans certains cas, notamment lorsqu’elle dure longtemps, elle peut être suivie de troubles de la mémoire ou de la concentration. Ce phénomène a été observé chez plusieurs patients après leur séjours en réanimation, notamment pendant la pandémie de COVID-19, mais les causes exactes de ces effets restent encore mal connues. Le sommeil et l’anesthésie peuvent sembler similaires (on ne bouge plus, on ne sent plus les choses, l’activité du cerveau ralentit), mais ils ne reposent pas sur les mêmes mécanismes. De plus, le sommeil est réparateur pour le cerveau, alors que l’anesthésie prolongée pourrait avoir des effets plus néfastes sur son fonctionnement. Chez la souris, il a été montré que rester longtemps sous anesthésie modifie certaines connexions dans le cerveau. Jusqu’à présent, les chercheurs ont surtout étudié les neurones, les cellules qui permettent la communication dans le cerveau. Mais les cellules immunitaires du cerveau, les microglies, pourraient aussi jouer un rôle important. Ces cellules aident normalement à entretenir et à remodeler les connexions dans le cerveau, surtout pendant l’apprentissage ou lorsqu’on forme des souvenirs. Ce projet multi-établissement (3 établissements utilisateurs), vise à mieux comprendre comment l’anesthésie prolongée pourrait perturber les interactions entre neurones et microglies chez la souris, à différents moments de la mémoire : quand on apprend, quand on consolide l’information, et quand on se souvient. Ces recherches pourraient aider à mieux comprendre pourquoi certaines personnes ont des troubles de la mémoire après une anesthésie, et à trouver des solutions pour mieux les prévenir.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’approfondir notre compréhension des effets à long terme de l’anesthésie générale prolongée sur le cerveau, notamment sur la mémoire et les capacités cognitives. En explorant pour la première fois le rôle potentiel des microglies dans ces effets, il pourrait: 1) Améliorer la compréhension des troubles cognitifs post-anesthésie, en identifiant les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués, au-delà des seuls neurones. 2) Contribuer à la recherche médicale humaine, en proposant des pistes pour prévenir ou limiter les séquelles cognitives chez les patients ayant subi une anesthésie prolongée (par exemple après chirurgie lourde ou séjour en réanimation). 3) Orienter de futures stratégies thérapeutiques ciblant la plasticité cérébrale et les cellules gliales pour favoriser une meilleure récupération cognitive. 4) Fournir un nouveau modèle préclinique expérimental pour étudier les effets de l’anesthésie sur la mémoire, intégrant non seulement l’activité neuronale mais aussi les interactions cellules gliales-neurones. 5) Réduire les impacts socio-économiques des déficits cognitifs post-opératoires, en apportant des solutions de prévention ou d’accompagnement adaptées à ces patients.
Procédures
Une chirurgie sous anesthésie pour placer implant et des électrodes d'enregistement sur le crane (4h00) au sein de l'EU1/3. Habituation à la contention longue de la tête au sein de l'EU2/3 (10 jours par session quotidienne allant progressivement de 5 minutes à 3h00). Comportement (tâche de discrimination tactile par les vibrisses) et imagerie, 2 sessions de 3h maximum/jour pendant 3 jours avec des pauses de 3 heures minimum au sein de l'EU2/3. Restriction hydrique pendant 12 heures répétées 6 fois maximum. Mise à mort sous anesthésie générale (animaux inconscients) au sein de l'EU3/3.
Impact sur les animaux
Nous réalisons une chirurgie afin de coller un implant sur le crâne de la souris, implantons des électrodes sur le crane et dans les muscles de la nuque pour évaluer leur activité et déterminer si la souris est endormie ou éveillée, et amincissons le crâne sans corrompre l'intégrité du système nerveux central sous anesthésie. Cette chirurgie peu invasive réalisée sous analgésie et anesthésie entraine des douleurs post opératoire pendant 48h00. Les complications au stade de la chirurgie sont extrêmement rares. Nous réalisons ensuite une habituation progressive des souris par renforcement positif pour qu'elles restent en condition tête restreinte pendant les sessions d'apprentissage et de rappel et pendant la phase de sommeil (séances allant de 5 minutes à 3 heures progressivement sur 7 jours). Il arrive rarement que certaines souris présentes des difficultés à s'habituer. Cette contention entraine certainement un stress léger, difficile à évaluer car nous n'observons pas de manifestations physiques (grattage, vocalisations, mictions/défécations, posture ou comportements compulsifs), le stress potentiel, est atténué par le renforcement positif (récompense avec des friandises). Afin de motiver les souris à s'engager dans la tâche d'apprentissage une restriction hydrique est réalisée pendant 12 h max sur 24h, cette restriction d'accès à l'eau peut être reproduite pendant 3 jours, elle entraine un inconfort transitoire de la souris (sensation de soif). Un stimulus aversif, puff d'air (durée 1s) en cas de mauvaises réponses est utilisé dans la phase initiale de l'apprentissage pour aider les souris à comprendre la tâche à réaliser, le puff d'air est utilisé uniquement si elle ne répondent pas aux pénalités de temps. Ces puffs d'air utilisé en dernier recours et potentiellement répétés peuvent engendrer un stress, difficile à quantifier en absence de signes cliniques. 2 séances de comportement et d'imagerie en tête restreinte de 3 heures maximum chacune ont lieu chaque jour et sont répétées au maximum pendant trois jours, ses séances peuvent occasionner un stress identique voir plus faible que lors de l'habituation.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Les organes d'intérêt pour l'étude sont alors prélevés et d'autres organes sont collectés pour constituer un banque de tissus à disposition d'autres équipes et laboratoires (muscles ou rétine).
Remplacement
Il s’agit d’un projet de recherche fondamental visant à étudier le rôle d’une protéine jusqu’à présent inconnue. Les expériences réalisées dans ce projet ne peuvent donc pas être modélisées par informatique. Nous utilisons généralement des cultures cellulaires ou des explants de cerveaux mais modifier l’environnement des microglies entraine un changement morphologique et fonctionnel. Afin de comprendre le rôle des microglies dasn le cerveau sain, il faut donc les étudier in vivo. Les données obtenues seront partagées avec des mathématiciens afin de modéliser la morphodynamique microgliale.
Réduction
Les lots et procédures ont été élaborés de manière à optimiser les groupes contrôles et à éviter la redondance. Il s’agit de travaux originaux jamais réalisés sur la base de notre connaissance de la littérature. Les comparaisons seront faites en utilisant des statistiques non paramétriques ne nécessitant pas de distribution normale et compatible avec nos effectifs réduits pour la partie in vivo. D'autre part, dans certaines expériences ex vivo et in vivo, chaque souris est son propre contrôle ce qui permet de réduire drastiquement le nombre d'expériences et d'animaux requis.
Raffinement
Notre expérience du modèle nous permet d’affirmer que la morbidité due à l’implantation de la fenêtre est quasi nulle. Après plus de 10 ans d'expérimentation avec ce modèle, nous n'avons observé qu'une désimplantation et aucun signe de souffrance ou de stress. Nous veillerons à limiter le mal être des animaux en réalisant des habituations progressives de nos souris à la manipulation. La gestion de la douleur et de l'inflammation sera réalisée de la façon suivante : injection d'anesthésique local avant la chirurgie, injection d'anti inflammatoire non stéroidiens en s.c en début de chirurgie, puis 24 et 48h après. En complément le bien-être des animaux sera évalué de façon quotidienne. Ils seront observés dans leur cage pendant plusieurs minutes puis pesés. L’évaluation se fera selon un scorage établi tenant compte de différents paramètres classiquement utilisés (posture, poids, toilettage) de sorte à identifier les points limites. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (nid et roue d'activité), tout au cours de l'expérience. Une partie des expérimentations seront réalisées ex vivo. Les expérimentations ex vivo sur tissus post-mortem ont été pensé pour compléter l'approche in vivo sur animal vigile tout en réduisant la nécessité de prélèvements impliquant des gestes invasifs ou la durée d'inconfort des animaux. Le transport des souris d'une UE à l'autre (5 minutes de transport) se fait dans des cages opaques et en triple emballage pour limiter le stress lié au transport.
Choix des espèces
Les souris permettent d’avoir recours à des animaux transgéniques. Il existe une abondante littérature sur le fonctionnement synaptique chez la souris ce qui évitera de reproduire certaines expériences pour valider notre modèle. Enfin l'architecture corticale est proche de celle de l'homme et il s'agit donc d'un des meilleurs modèles non primate pour étudier la plasticité synaptique. Les souris seront des souris jeunes adultes utilisées entre 6 et 10 semaines car la taille du crâne n'évolue plus dans le temps.