Système nerveux
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Imagerie fonctionnelle par IRM du cerveau chez le rat (Rattus norvegicus) lors de tests comportementaux de résolution de problèmes : contribution à l’étude de l’évolution des fonctions cognitives de haut niveau chez les vertébrés.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tués à la fin de l'acquisition IRM parce que le manganèse qui leur a été injecté les exposerait à une dégradation rapide de leur état de santé, 60 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est hébergé seul, entraîné jusqu'à vingt sessions d'une heure à ouvrir une boîte munie de loquets, puis contenu pour recevoir l'injection de manganèse avant deux heures d'IRM sous anesthésie générale. Un rat qui montre des signes de douleur reçoit un antidouleur mais sort alors de l'expérience, l'analgésie faussant les résultats d'imagerie. L'effectif, lui, ne vient d'aucun calcul exposé ici, seulement d'études d'imagerie antérieures que le porteur ne cite pas.
Objectifs
De nombreuses espèces de mammifères, d’oiseaux, et même de poissons, possédant des cerveaux bien différents, présentent des capacités cognitives complexes comme la résolution de problème. Ces capacités sont apparues dans un petit nombre d’espèces de chaque groupe de façon indépendante au cours de l’évolution. Cette étude, utilisant le rat comme modèle mammifère, nous servira de point de comparaison avec les données chez les oiseaux et les poissons, et permettra ainsi de mieux comprendre comment les cerveaux de rongeurs, d’oiseaux et de poissons, bien différents morphologiquement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires Notre projet consiste à identifier les régions du cerveau impliquées dans ces comportements. En parallèle d’un projet en cours visant à étudier la résolution de problèmes chez les oiseaux et les poissons téléostéens (un très grand groupe de poissons osseux), nous souhaitons étudier les bases neuroanatomiques de la résolution de problèmes chez les mammifères en utilisant le rat (Rattus norvegicus) comme modèle. En effet, ces rongeurs sont connus comme étant capables d’accéder à des sources de nourriture pourtant bien protégées, notamment en utilisant leur intelligence. Pour tester ces capacités, nous avons mis au point un test comportemental (ouverture de boite puzzle munie de plusieurs loquets pouvant être assemblés les uns aux autres pour augmenter la complexité de la tâche ; et nécessitant la manipulation fine de ces objets ainsi que la compréhension du lien logique entre chaque élément de la boite pour résoudre le problème). Nous voulons désormais identifier les régions cérébrales activées chez le rat lors de la résolution de plusieurs versions, plus ou moins complexes, de ce test, en utilisant l’IRM fonctionnelle comme modalité d’imagerie.
Bénéfices attendus
Les projets sur la neuroanatomie fonctionnelle de la résolution de problèmes chez les oiseaux et les poissons téléostéens montrent qu’il existe plusieurs organisations cérébrales différentes susceptibles de produire des comportements similaires. En élargissant notre étude à un modèle rongeur, le rat, nous complèterons les connaissances fondamentales sur l’évolution du cerveau et de la cognition chez les vertébrés, en identifiant les structures cérébrales impliquées dans la résolution de problèmes chez les mammifères. Cette étude sera à mettre en miroir avec des études similaires chez les primates (y compris l’Homme) pour identifier les potentielles différences entre les rongeurs et les primates.
Procédures
Entrainement à la tache de comportement : jusqu’à 20 sessions (1 heure par session, une session par jour). Contention puis injection de manganèse (moins de 5 minutes), indispensable pour l’acquisition d’images d’IRM fonctionnelle, test comportemental (une session d’1 heure) et, à la suite de la session de comportement, imagerie par résonance magnétique (IRM) sous anesthésie générale durant environ 2 heures. Chaque animal est soumis à la procédure une seule fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont le stress lié à l’hébergement individuel, de l’injection de manganèse et à l’anesthésie, ainsi qu’à la douleur potentielle liée à l’injection de manganèse
Devenir
Etant donné la toxicité potentielle à moyen terme du manganèse, les animaux sont euthanasiés à la fin de l’acquisition IRM. Leur réutilisation, adoption ou replacement n’est pas possible, le risque d’une dégradation rapide de l’état de santé de l’animal dans les semaines suivant la fin de la procédure étant très important.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, l’usage d’animaux est essentiel, puisque nous étudions l’évolution du système nerveux et de la cognition. Le rat est un modèle rongeur adapté à notre question scientifique, étant donné ses capacités cognitives (capable de résoudre le test comportemental) et la possibilité de réaliser de l’imagerie fonctionnelle par résonance magnétique.
Réduction
Pour ces expérimentations, le nombre d’animaux utilisés sera limité aux stricts besoins de nos analyses statistiques. Des études IRM précédemment publiées chez les rongeurs nous ont permis de déterminer le nombre d’individus nécessaire et suffisant.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux sont pris en charge et leur bien-être est évalué régulièrement par des zootechniciens compétents. La température de la pièce est surveillée. Aussi, la communication entre le personnel de zootechnie et les expérimentateurs est optimisée pour permettre un suivi adéquat des animaux. Pour cela nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la présence d’un pelage sale, de posture anormale ou de comportements susceptibles d’indiquer une douleur. En cas de douleur, une analgésie est appliquée (injection d’antidouleurs), mais l’animal devra être sorti de la procédure, l’analgésique pouvant impacter les résultats d’imagerie fonctionnelle Enfin, la présence de lésions visibles (plaies, fracture) sera également surveillée. De nombreux éléments permettant la construction de nids seront ajoutés à l'hébergement pour fournir de l'enrichissement. Les animaux étant isolés afin de suivre la performance individuelle de chaque rat (la boite puzzle ne doit être accessible qu’à un seul rat à la fois), les cages seront placées les unes à côté des autres pour permettre un contact visuel entre les animaux et réduire les effets du stress qu’un isolement serait susceptible de causer. De plus, il sera possible aux animaux d’entendre les vocalisations de leurs congénères, ainsi que de sentir leur odeur. Les IRMs, non invasives et indolores, seront réalisées sous anesthésie par un opérateur qualifié.
Choix des espèces
Nous utilisons des rats pour plusieurs raisons : d’une part, il s’agit d’une espèce connue pour son intelligence et la facilité avec laquelle elle peut être entrainée à réaliser une tâche comportementale. D’autre part, notre scanner IRM est adapté aux rongeurs et plusieurs articles précédemment publiés attestent de la possibilité d’utiliser ce type d’imagerie chez le rat. Enfin, des atlas et outils de traitement d’images IRM spécialement développés pour le rat nous permettent d’analyser nos résultats de façon optimale et de les comparer facilement aux données de la littérature. Nous travaillons sur des animaux adultes, car il nous est nécessaire d’étudier un cerveau pleinement développé.
Etude de l’implication de l’activateur tissulaire du plasminogène et des récepteurs NMDA dans le développement du réseau vasculaire rétinien et du tractus visuel
- Recherche fondamentale
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- Système nerveux
2 600 souris vont être utilisées, 1 400 anesthésiées sans être réveillées et 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur rétine et leur tractus visuel. Chaque acte a son effectif, 1 040 poses de cathéter intraveineux caudal de quinze minutes, 600 séances d'échographie d'une heure, 360 fonds d'œil avec électrorétinogramme de quarante-cinq minutes, 200 IRM de quatre-vingt-dix minutes et 360 chirurgies terminales. 360 souris passent quatre tests comportementaux de cinq minutes portant sur l'acuité visuelle, le réflexe oculomoteur et la perception de la profondeur. Le bénéfice avancé, dépister au fond d'œil des lésions cérébrales chez les nouveau-nés prématurés, est renvoyé à d'éventuels projets ultérieurs, alors que les souris sont utilisées dès le troisième jour après leur naissance.
Objectifs
Au cours du développement du système nerveux central (SNC), les vaisseaux sanguins se développent en même temps que la formation des neurones. De nombreuses études ont mis en évidence que les petits vaisseaux sanguins soutiennent la migration neuronale. Cependant les mécanismes moléculaires sous-jacents à cette interaction sont encore mal connus. Il a été montré que des récepteurs présents sur les cellules des vaisseaux sanguins sont nécessaires à la bonne migration des neurones corticaux. Ce processus est également régulé par une molécule (protéase), qui régule plusieurs fonctions comme la formation du cortex (corticogenèse) et la plasticité neuronale. Cette protéase exerce ces fonctions en interagissant avec ces mêmes récepteurs des cellules des vaisseaux sanguins. De plus, cette interaction régule les fonctions de la barrière hémato-encéphalique (BHE) située entre le sang et le cerveau et composée par des vaisseaux sanguins particuliers. Au sein du SNC, la rétine, miroir du cerveau, apparait comme particulièrement intéressante pour des études neuro-développementales. En effet, la rétine présente de multiples similitudes avec le cerveau comme une origine embryonnaire commune et la formation simultanée de réseaux neuronaux et vasculaires. Au même titre que la corticogenèse, la rétinogenèse ou développement de la rétine, est régulée par de nombreux facteurs, dans laquelle nous supposons que cette protéase et les récepteurs des vaisseaux sanguins, avec lesquels elle intéragit, puissent être des acteurs clés. Bien que cette protéase soit exprimé dans les cellules de la rétine et les cellules des vaisseaux sanguins du SNC, à ce jour aucune étude n'a exploré leur interaction dans le développement rétinien. L'objectif de ce projet est de déterminer ces deux acteurs influencent le développement de la rétine et du système visuel, en étudiant différentes étapes du développement des vaisseaux sanguins de la rétine jusqu'à l'âge adulte, à l’aide de souches de souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de démontrer que les problèmes de développement des vaisseaux sanguins dans la rétine des nouveau-nés reflètent des anomalies similaires dans le cerveau. Si cela se confirme, l'examen du fond d'œil chez le nouveau-né pourrait devenir un outil clé pour détecter précocement des problèmes vasculaires et neuronaux dans le cerveau, notamment chez les bébés prématurés, et ainsi repérer les enfants à risque de développer des lésions cérébrales. Dans ce projet, nous proposons de déterminer l'expression de deux nouvelles cibles thérapeutiques, un récepteur présent sur les cellules des vaisseaux sanguins de la rétine et du cerveau ainsi qu'une molécule exprimée par les cellules et vaisseaux sanguins de la rétine et du cerveau. Nous évaluerons également ces effets thérapeutiques sur les atteintes visuelles, l'inflammation et les dysfonctionnements des vaisseaux sanguins au cours de maladies rétiniennes ou d'anomalies développementales. Cette étude nous permettrait d'améliorer nos connaissances sur les mécanismes de développement et de fonctionnement de la rétine ainsi que les troubles pouvant survenir au cours du développement et/ou à l'âge adulte. A terme, cela pourrait déboucher sur d'autres projets permettant d'évaluer le potentiel thérapeutique de ces acteurs dans des rétinopathies liées à des problèmes de circulation, des accidents vasculaires cérébraux (AVC), la prématurité ou encore les maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux seront soumis à : 1. 4 tests comportementaux (5 minutes par test, n =360). Ces tests permettront d’étudier l’acuité visuelle, le réflexe oculomoteur et la perception de la profondeur dans l’espace des animaux, 2. Pose d'un cathéter intraveineux caudal (15 minutes, n=1040), 3. Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (90 minutes, n=200), 4. Imagerie par ultrasons (60 minutes, n=600), 5. Imagerie de fond d'œil et examen de l'activité de la rétine ou électrorétinogramme (45 minutes, n=360), 6. Chirurgie terminale (10min/animal, n= 360).
Impact sur les animaux
Selon la procédure, des nuisances ou effets indésirables sont susceptibles d'apparaitre chez les animaux. Les procédures d'évaluation comportementale ou d’imagerie sont indolores, mais peuvent engendrer un léger stress qui ne perdure pas dans le temps, dû soit à un nouvel environnement soit à l’isolement social. Les animaux retournent à un état basal dès qu’ils sont de retour dans leur cage et leur boxe de stabulation. Des douleurs per-opératoires induites suite à l'injection de molécules, incision de la peau ou lors de l'exsanguination ; ainsi que des douleurs post-opératoires suite à la pose d'un cathéter veineux peuvent avoir lieux. C’est pourquoi les animaux seront toujours soumis à une couverture analgésique et anesthésique appropriées aux gestes à effectuer et à la sévérité de chaque procédure entamée. Ces effets sont connus dans l’expérimentation au laboratoire. Une surveillance accrue sera réalisée à chacune de ces étapes. L’animal sera gardé en vie uniquement dans le cas où une personne compétente atteste de l’état de bien-être de l’animal suite à chaque étape de la procédure.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant l'étude de l'intégrité anatomique et vasculaire de la rétine d'une part et du tractus visuel d'autre part.
Remplacement
Nous ne pouvons souscrire au principe de remplacement dans ce protocole. En effet, il est nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de notre projet. Les procédures expérimentales pour mener à bien celui-ci ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Cette étude repose sur une bibliographie solide, rendant cette étude sérieuse et fondée sur des bases scientifiques existantes. De plus, la chronologie du développement de la rétine et de son réseau vasculaire est bien connue chez la souris et permet d'étudier des mécanismes similaires à ceux présent in utero chez l'Homme. Ce modèle est largement utilisé et documenté dans la littérature scientifique, ce qui en fait un choix pertinent pour notre étude. En effet, il s’agit d’étudier des mécanismes de développement des vaisseaux sanguins dans la rétine et le cerveau ainsi que le développement des capacités visuelles.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, selon nos travaux précédents publiés et des données de la littérature. A partir de ces données, nous avons utilisé des outils statistiques afin de déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. 2600 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation de tests comportementaux et d’outils d’imagerie non invasive permettant d'évaluer l'intégrité anatomique et vasculaire in vivo du tractus visuel permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. L'utilisation d'un animal pour un enchainement de procédures légères et modérées réduit également le nombre total d'animaux.
Raffinement
Pour respecter le principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et recevront des analgésiques adaptés au niveau de sévérité du geste, durant chaque procédure pour minimiser la douleur. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. En effet, en fonction des gestes réalisés des points limites adaptés ont été défini et seront appliqués tout au long de la vie de l'animal afin de veiller à son bien-être et l'absence de souffrance par une prise en charge adaptée. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7 et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et les animaux auront un accès libre à l’eau et à la nourriture. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux, notamment par l'hébergement en groupes sociaux de 5 ou 6 animaux et l'enrichissement de leur environnement en particulier avec du matériel nécessaire à la fabrication d'un nid. Tout sera mis en œuvre pour réduire le stress, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le métabolisme. Cette espèce est aussi moins sensible que des modèles plus complexes, tout en gardant une organisation suffisamment proche de celle de l’Homme pour pouvoir y être comparée. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques où l'expression des molécules d'intérêt est déficiente de manière globale dans leur organisme ou spécifiquement dans les vaisseaux sanguins. Les animaux seront utilisés à des stades post-nataux précoces et au stade de jeunes adultes. En effet c'est à ces stades du développement que les animaux sont classiquement utilisés dans la littérature pour l'étude de l'intégrité anatomique et fonctionnelle du tractus visuel car ils correspondent aux stades de développement du tractus visuel chez l'Homme, rendant notre étude plus appropriée pour une étude translationnelle et sa transposition à des atteintes pathologiques telles que la rétinopathie du prématuré ou encore l'accident vasculaire rétinien ou cérébral. Ainsi, les animaux utilisés seront âgés de 3, 5, 15, 30 et 60 jours postnataux, correspondant respectivement aux stades P3, P5, P15, P30 et adultes. En effet, les stades P3, P5 et P15 correspondent à des stades clés du développement du réseau vasculaire rétinien et le stade P30 se situe à un stade intermédiaire de la maturation du système visuel c'est à dire dans la période critique du développement de ce dernier. Le stade P60 correspond au stade adulte où le système visuel est considéré comme mature. Ces différents stades permettront ainsi de déterminer le rôle de chacune de nos cibles d'intérêt dans le développement du réseau vasculaire rétinien et du tractus visuel.
Etude de la molécule de surface, ITGA7, dans les tumeurs cérébrales.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
845 souriceaux nouveau-nés reçoivent dans le cerveau une électroporation d'une minute qui déclenche un glioblastome. Toutes ces souris sont tuées à l'issue, 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 45 un niveau sévère, 590 d'entre elles lors d'une chirurgie terminale de cinq minutes destinée à prélever le cerveau. Le porteur indique que les symptômes, activité réduite et poil hérissé, n'apparaissent qu'à partir de quarante jours et qu'une cohorte de 3,5 % des animaux sera suivie au-delà de ce seuil. Il justifie l'espèce par des contextes génétiques mutants qui, écrit-il, n'existent que chez la souris.
Objectifs
Les glioblastomes (GBM) représentent la forme la plus fréquente et la plus agressive des tumeurs primaires du cerveau avec un pronostic de survie très bas. Lors d’expériences pilotes, nous avons établi un modèle murin de GBM qui permet d’étudier le développement d’un glioblastome dès les étapes les plus précoces de l’induction du cancer et ce, dans un contexte physiologique conservant ainsi toute la complexité environnementale de la tumeur. Nous avons également observé qu’une protéine appelée Intégrine alpha7 (ITGA7) était présente dans les cellules tumorales au centre de la tumeur mais absente des cellules tumorales migrant à l’extérieur de la tumeur. Notre projet est de comprendre le rôle que joue ITGA7 dans le développement et la progression des glioblastomes. Pour cela 1) nous comparerons l’évolution des tumeurs quand elles sont induites en présence ou en absence d’ITGA7, en utilisant une lignée mutante pour ITGA7 et une lignée contrôle, 2) nous regarderons si la présence d’ITGA7 dans les cellules tumorales qui en sont dépourvues normalement influence leur destinée ou leur comportement.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra une meilleure compréhension des propriétes des cellules tumorales dans les glioblastomes et notamment les différences entre les cellules tumorales du cœur de la tumeur et la sous-population qui se trouve à la marge de la tumeur et qui envahit les tissus sains adjacents. Ainsi, ce projet de recherche permettra d’évaluer le rôle d’une protéine présente à la surface des cellules cancéreuses, appelée ITGA7 dans l’évolution tumorale et peut-être d’envisager des approches thérapeutiques qui pourraient utiliser cette protéine comme cible pour limiter les propriétés invasives des cellules de glioblastome.
Procédures
Interventions: 1) Electroporation du cerveau: Ce geste est réalisé sous anesthésie générale. Durée de l'acte: 1 minute maximum, effectué sur 845 animaux nouveau-nés, 1 seule fois par animal. 2) Chirurgie terminale sous anesthésie générale en vue du prélèvement du cerveau. Durée: 5 minutes, 1 seule fois car conduit à la mort de l'animal, sur 590 animaux.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont les effets liés au développement des tumeurs cérébrales. Ces effets ne se manifestent qu'à partir de 40 jours, apparaissent de façon soudaine et se caractérisent par une activité réduite de l’animal et un poil hérissé. Nous euthanasions ces animaux dès l’apparition de ces symptômes car il est synonyme de tumeurs très invasives. Dans la grande majorité de notre projet, nous euthanasierons les animaux au maximum à 28 jours soit bien avant l’apparition de tout symptôme. Toutefois, une cohorte représentant 3,5 % des animaux expérimentés sera sera suivi au-delà de 40 jours. Pour cette cohorte, l’apparition des symptômes décrits plus haut entrainera l’euthanasie immédiate des animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure car nous devons prélever leur cerveau en vue d’analyses histologiques et moléculaires des tumeurs.
Remplacement
Des cultures complexes de tissus tumoraux commencent à être utiliser pour étudier certains comportements cellulaires. Cependant, ces cultures ne récapitulent pas la complexité des interactions entre les cellules tumorales et son environnement, que l’on observe au cours du développement d’un glioblastome et notamment l’évolution des interactions avec les systèmes immunitaire et vasculaire qui sont fondamentales dans la progression tumorale. De plus, ces modèles utilisent des cellules tumorales issues de glioblastomes à un stade avancé, empêchant l’analyse du comportement cellulaire aux premiers stades de l’induction tumorale.
Réduction
Nous utiliserons une méthode expérimentale simple et rapide que nous maitrisons depuis plus de 15 ans, et pour laquelle des études antérieures nous permettent de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement relevants. Le nombre d’animaux a été estimé en s’appuyant sur des tests statistiques appropriés adaptés aux petits échantillons. Les groupes témoins et les groupes tests seront constitués à partir des mêmes portées, sans distinction de sexe, afin d’optimiser le nombre de nouveau-nés utilisés par portée et donc de réduire le nombre de portée par expérience.
Raffinement
Les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. Cinq personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin aux animaux. Les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute procédure. Après l’expérimentation, ils sont hébergés dans une salle spécifiquement dédiée à la stabulation post-expérimentation, avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Tout au long de l’expérimentation et de la surveillance post-expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété et à les soulager si elles apparaissent, à agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, à noter les observations faites et les actions entreprises. pour éviter toute souffrance, une prémédication d’un anti-douleur est administrée Lors de la chirurgie terminale sous anesthésie. L'acte n'est réalisé qu'après s'être assuré que l'animal est sans réaction.
Choix des espèces
De façon générale, la souris est le modèle mammifère le plus utilisé par la communauté scientifique pour établir des modèles de cancers in vivo permettant l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires pendant le développement de cancer. Nous avons montré dans des travaux précédents que le modèle d'induction de GBM que nous utilisons était pertinent car il mime les différentes caractéristiques cellulaires et moléculaires de la genèse et du développement des glioblastomes. Notre méthode originale est basée l’électroporation de souris nouveau-né. Ceci permet, de façon unique, de cibler spécifiquement les cellules à l'origine des glioblastome et ainsi d'étudier les étapes d’induction et de développement précoce des GBM dans des contextes génétiques mutants qui n’existent que chez la souris.
Etude des fonctions cognitives et de la formation des circuits neuronaux dans un modèle de souris muté pour un gène associé à l’autisme EU2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
799 souris vont être utilisées entre les deux établissements de ce projet, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 394 d'entre elles et modéré pour 405. Sur ce second site, une partie des animaux subit une chirurgie terminale sous anesthésie, quand les autres passent par une biopsie de queue puis une série de tests comportementaux répétés sur plusieurs semaines. Il s'agit de caractériser une lignée porteuse d'une mutation identifiée chez des personnes autistes, en suivant la formation des circuits corticaux du stade fœtal à l'âge adulte. Des expériences en éprouvette ont déjà établi que la mutation altère la fonction du gène, mais le porteur affirme que l'approche in vivo est "une nécessité" et que l'étude des circuits corticaux "empêche le remplacement par un modèle invertébré".
Objectifs
Contexte de l’étude : La perturbation de la formation des réseaux neuronaux pendant le développement embryonnaire est une cause de troubles graves du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique (TSA), le retard mental, l’épilepsie ou les déficits cognitifs. Les TSA concernent aujourd’hui près de 1% des naissances et sont considérés comme l’un des troubles les plus répandus de l’enfance. Cette étude a pour but d’étudier un gène muté dans les TSA et important pour le développement du cortex cérébral de la souris. Des travaux précédents ont permis de décrire les conséquences de l’inactivation complète de ce gène sur le développement cérébral et le comportement chez la souris. Mais à ce jour aucun modèle avec une mutation liée à l’autisme n’a été étudié. Objectif principal : Les modèles d’étude actuellement disponibles pour ce gène ne sont pas adaptés à l’étude des mutations retrouvées dans les troubles autistiques. Ce projet a pour but de caractériser un nouveau modèle de souris possédant une mutation identifiée à l’origine chez les patients autistes. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs nommés EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Il est important de comprendre comment les gènes, lorsqu’ils sont mutés, entraînent des maladies, pour améliorer le diagnostic et le conseil aux familles, et imaginer des pistes thérapeutiques. La création d’un nouveau modèle de souris permet de suivre quelles étapes du développement embryonnaire sont affectées et conduisent à l’installation de la maladie. Ceci ne peut pas être réalisé chez l’homme car ces mutations sont détectées après le diagnostic, quand la maladie est déclarée. Ce projet étudiera donc un nouveau modèle murin qui mime mieux la pathologie humaine et permettra 1) de valider le caractère pathologique des mutations de ce gène dans les troubles du neurodéveloppement et plus largement 2) une meilleure connaissance des causes des pathologies neurodéveloppementales.
Procédures
Dans l'EU1, l’essentiel des expériences seront observationnelles. Tous les animaux subiront une biopsie, une seule fois, pour le génotypage. La biopsie dure moins d'une minute. Les animaux seront de plus soumis à des tests d’exploration des fonctions comportementales, non invasifs, et non douloureux, mais qui nécessiteront de manipuler régulièrement les animaux. Chaque test sera réalisé une fois par animal, au maximum 4 test par animal. Chaque test dure quelques minutes. L’ensemble des tests se déroule sur plusieurs semaines. Ces procédures peuvent entraîner un stress léger. Certaines femelles subiront une chirurgie avec réveil, sous anesthésie gazeuse (isoflurane) et en respectant les règles d’analgésie et d’asepsie chirurgicale. La chirurgie dure environ 30 minutes et sera réalisée une seule fois. La procédure peut entraîner une douleur et du stress dans les heures suivant la chirurgie. Dans l'EU2, certains animaux subiront une procédure chirurgicale terminale, sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances les plus sévères qui aient jamais été observées pour le gène d'intérêt chez la souris sont un retard de croissance, et des changements des fonctions cognitives comme par exemple une perturbation de la mémoire à long terme. Dans ce projet, nous nous attendons à des manifestations moins sévères car la mutation étudiée n’abolit qu’une partie des fonctions du gène. Les animaux subiront une biopsie, une seule fois, entraînant un stress et une douleur passagers. Certains animaux subiront une procédure chirurgicale avec réveil, selon une procédure bien maîtrisée par les expérimentateurs. Elle sera réalisée sous anesthésie générale avec analgésie péri- et post-opératoire, ainsi qu’un suivi post-opératoire adapté. Dans de très rares cas, cette technique peut entraîner une difficulté à la mise bas ou une mortalité intra-utérine d’embryons. Les tests d'exploration du comportement sont non invasifs mais peuvent entraîner un stress lié à la manipulation.
Devenir
Les animaux sont des souris génétiquement modifiées, nous ne pouvons donc pas les replacer à l’issue de ce projet. Par conséquent tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Ce projet a pour objectif de mieux caractériser un modèle murin possédant une mutation retrouvée chez des patients autistes . En préalable à ce projet, nous avons réalisé des expériences in vitro prouvant que la mutation étudiée altère la fonction du gène , ce qui nous permet de nous assurer que l’étude est pertinente. Néanmoins dans l’état actuel des connaissances scientifiques, les étapes de développement du cerveau ne peuvent être modélisées entièrement in vitro. L’approche in vivo est une nécessité afin d’aborder des troubles complexes de la cognition et du comportement. L’étude de circuits corticaux nécessite d’avoir recours à un animal possédant une structure corticale et par conséquent empêche le remplacement par un modèle invertébré.
Réduction
Les accouplements seront optimisés afin de produire strictement le nombre nécessaire d’animaux pour la caractérisation initiale du modèle. Une partie des animaux qui ont subi uniquement des observations (par exemple pesée) pourront être utilisés dans des tests de comportement, pour réduire le nombre total d'animaux Le nombre d’animaux utilisés est limité au minimum nécessaire pour déterminer la significativité statistique des résultats, et a été déterminé par un calcul préalable de puissance statistique.
Raffinement
Pour l'ensemble des procédures, nous avons défini des points limites prédictifs et précoces afin de prédire au mieux et le plus tôt possible des manifestations conduisant à la mise en place de traitements ou à l’arrêt de la procédure. Nous veillerons à adapter les conditions d’élevage aux phénotypes observés. La procédure chirurgicale est bien maîtrisée par les expérimentateurs et sera réalisée uniquement par un chercheur expérimenté. Un recours à l’analgésie péri-opératoire, ainsi qu’à une analgésie post-opératoire (calibrée par rapport à une grille d’évaluation de la douleur) nous permettra de limiter le stress et la douleur subis par les animaux. Concernant les évaluations comportementales, les animaux sujets aux tests de comportement seront acclimatés à la salle de test au préalable afin de réduire le stress causé par un nouvel environnement. Les différents tests seront réalisés les uns à la suite des autres, avec un temps de pause suffisant entre chaque test pour limiter un stress éventuel des animaux. A noter que les tests de comportement ne sont pas invasifs et ne portent pas atteinte à l’intégrité de l’animal.
Choix des espèces
L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales tels l’autisme et/ou les déficiences mentales. Par ailleurs, nos précédents travaux nous ont permis de décrire que des mutations dans notre gène d'intérêt et associées à la pathologie autistique perturbent le développement cérébral et le comportement chez la souris (. Dans ce projet qui s'intéresse au neurodéveloppement, nous observerons des animaux depuis la naissance jusqu’à un stade adulte. L’étude de la formation des réseaux neuronaux se fera chez des fœtus au 3ème tiers de la gestation chez la souris. Les tests de comportement seront réalisés sur des animaux jeunes adultes, idéalement entre 60 et 90 jours mais cet âge peut différer légèrement selon la disponibilité des animaux et la composition des cohortes.
Etude des fonctions cognitives et de la formation des circuits neuronaux dans un modèle de souris muté pour un gène associé à l’autisme EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une biopsie de queue pour le génotypage, jusqu'à quatre tests comportementaux et, pour certaines femelles, une chirurgie de trente minutes avec réveil : 799 souris vont être utilisées entre les deux établissements du projet, toutes tuées à l'issue. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 394 d'entre elles et modéré pour 405. L'objectif est de caractériser une lignée porteuse d'une mutation retrouvée chez des personnes autistes, en observant le développement du cortex du stade fœtal à l'âge adulte. Les tests comportementaux, annoncés comme non invasifs et non douloureux, ne sont jamais nommés, et la mise à mort de tous les animaux est justifiée par leur statut d'organismes génétiquement modifiés.
Objectifs
Contexte de l’étude : La perturbation de la formation des réseaux neuronaux pendant le développement embryonnaire est une cause de troubles graves du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique (TSA), le retard mental, l’épilepsie ou les déficits cognitifs. Les TSA concernent aujourd’hui près de 1% des naissances et sont considérés comme l’un des troubles les plus répandus de l’enfance. Cette étude a pour but d’étudier un gène muté dans les TSA et important pour le développement du cortex cérébral de la souris. Des travaux précédents ont permis de décrire les conséquences de l’inactivation complète de ce gène sur le développement cérébral et le comportement chez la souris. Mais à ce jour aucun modèle avec une mutation liée à l’autisme n’a été étudié. Objectif principal : Les modèles d’étude actuellement disponibles pour ce gène ne sont pas adaptés à l’étude des mutations retrouvées dans les troubles autistiques. Ce projet a pour but de caractériser un nouveau modèle de souris possédant une mutation identifiée à l’origine chez les patients autistes. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs nommés EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Il est important de comprendre comment les gènes, lorsqu’ils sont mutés, entraînent des maladies, pour améliorer le diagnostic et le conseil aux familles, et imaginer des pistes thérapeutiques. La création d’un nouveau modèle de souris permet de suivre quelles étapes du développement embryonnaire sont affectées et conduisent à l’installation de la maladie. Ceci ne peut pas être réalisé chez l’homme car ces mutations sont détectées après le diagnostic, quand la maladie est déclarée. Ce projet étudiera donc un nouveau modèle murin qui mime mieux la pathologie humaine et permettra 1) de valider le caractère pathologique des mutations de ce gène dans les troubles du neurodéveloppement et plus largement 2) une meilleure connaissance des causes des pathologies neurodéveloppementales.
Procédures
Dans l'EU1, l’essentiel des expériences seront observationnelles. Tous les animaux subiront une biopsie, une seule fois, pour le génotypage. La biopsie dure moins d'une minute. Les animaux seront de plus soumis à des tests d’exploration des fonctions comportementales, non invasifs, et non douloureux, mais qui nécessiteront de manipuler régulièrement les animaux. Chaque test sera réalisé une fois par animal, au maximum 4 test par animal. Chaque test dure quelques minutes. L’ensemble des tests se déroule sur plusieurs semaines. Ces procédures peuvent entraîner un stress léger. Certaines femelles subiront une chirurgie avec réveil, sous anesthésie gazeuse (isoflurane) et en respectant les règles d’analgésie et d’asepsie chirurgicale. La chirurgie dure environ 30 minutes et sera réalisée une seule fois. La procédure peut entraîner une douleur et du stress dans les heures suivant la chirurgie. Dans l'EU2, certains animaux subiront une procédure chirurgicale terminale, sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances les plus sévères qui aient jamais été observées pour le gène d'intérêt chez la souris sont un retard de croissance, et des changements des fonctions cognitives comme par exemple une perturbation de la mémoire à long terme. Dans ce projet, nous nous attendons à des manifestations moins sévères car la mutation étudiée n’abolit qu’une partie des fonctions du gène. Les animaux subiront une biopsie, une seule fois, entraînant un stress et une douleur passagers. Certains animaux subiront une procédure chirurgicale avec réveil, selon une procédure bien maîtrisée par les expérimentateurs. Elle sera réalisée sous anesthésie générale avec analgésie péri- et post-opératoire, ainsi qu’un suivi post-opératoire adapté. Dans de très rares cas, cette technique peut entraîner une difficulté à la mise bas ou une mortalité intra-utérine d’embryons. Les tests d'exploration du comportement sont non invasifs mais peuvent entraîner un stress lié à la manipulation.
Devenir
Les animaux sont des souris génétiquement modifiées, nous ne pouvons donc pas les replacer à l’issue de ce projet. Par conséquent tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Ce projet a pour objectif de mieux caractériser un modèle murin possédant une mutation retrouvée chez des patients autistes . En préalable à ce projet, nous avons réalisé des expériences in vitro prouvant que la mutation étudiée altère la fonction du gène , ce qui nous permet de nous assurer que l’étude est pertinente. Néanmoins dans l’état actuel des connaissances scientifiques, les étapes de développement du cerveau ne peuvent être modélisées entièrement in vitro. L’approche in vivo est une nécessité afin d’aborder des troubles complexes de la cognition et du comportement. L’étude de circuits corticaux nécessite d’avoir recours à un animal possédant une structure corticale et par conséquent empêche le remplacement par un modèle invertébré.
Réduction
Les accouplements seront optimisés afin de produire strictement le nombre nécessaire d’animaux pour la caractérisation initiale du modèle. Une partie des animaux qui ont subi uniquement des observations (par exemple pesée) pourront être utilisés dans des tests de comportement, pour réduire le nombre total d'animaux Le nombre d’animaux utilisés est limité au minimum nécessaire pour déterminer la significativité statistique des résultats, et a été déterminé par un calcul préalable de puissance statistique.
Raffinement
Pour l'ensemble des procédures, nous avons défini des points limites prédictifs et précoces afin de prédire au mieux et le plus tôt possible des manifestations conduisant à la mise en place de traitements ou à l’arrêt de la procédure. Nous veillerons à adapter les conditions d’élevage aux phénotypes observés. La procédure chirurgicale est bien maîtrisée par les expérimentateurs et sera réalisée uniquement par un chercheur expérimenté. Un recours à l’analgésie péri-opératoire, ainsi qu’à une analgésie post-opératoire (calibrée par rapport à une grille d’évaluation de la douleur) nous permettra de limiter le stress et la douleur subis par les animaux. Concernant les évaluations comportementales, les animaux sujets aux tests de comportement seront acclimatés à la salle de test au préalable afin de réduire le stress causé par un nouvel environnement. Les différents tests seront réalisés les uns à la suite des autres, avec un temps de pause suffisant entre chaque test pour limiter un stress éventuel des animaux. A noter que les tests de comportement ne sont pas invasifs et ne portent pas atteinte à l’intégrité de l’animal.
Choix des espèces
L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales tels l’autisme et/ou les déficiences mentales. Par ailleurs, nos précédents travaux nous ont permis de décrire que des mutations dans notre gène d'intérêt et associées à la pathologie autistique perturbent le développement cérébral et le comportement chez la souris (. Dans ce projet qui s'intéresse au neurodéveloppement, nous observerons des animaux depuis la naissance jusqu’à un stade adulte. L’étude de la formation des réseaux neuronaux se fera chez des fœtus au 3ème tiers de la gestation chez la souris. Les tests de comportement seront réalisés sur des animaux jeunes adultes, idéalement entre 60 et 90 jours mais cet âge peut différer légèrement selon la disponibilité des animaux et la composition des cohortes.
Évaluation des effets promnésiques des dérivés de l’ibogaïne chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tester si deux dérivés de l'iboga améliorent la mémoire conduit à utiliser 160 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une ou deux injections dans l'abdomen, attend trente minutes, puis passe quatre minutes dans un labyrinthe de Barnes, un test que le porteur retient pour son caractère moins anxiogène que la piscine de Morris. Aucun effet délétère des composés n'est annoncé, les molécules étant décrites comme anxiolytiques et antidépressives aux doses prévues. La mise à mort intervient juste après ces quatre minutes de test, pour prélever les cerveaux entiers et y doser les monoamines.
Objectifs
La mémoire constitue une fonction cognitive essentielle, permettant l’acquisition, la consolidation et la récupération des informations, tout en facilitant l’adaptation aux expériences antérieures. Son altération représente un enjeu majeur en neurosciences, en raison de son implication dans de nombreuses pathologies neurodégénératives et troubles cognitifs. Parmi celles-ci, la maladie d’Alzheimer constitue un problème de santé publique majeur, affectant plusieurs millions de personnes dans le monde. D'autres affections, telles que la maladie de Parkinson, les troubles cognitifs liés à l’âge, ainsi que les séquelles d’un accident vasculaire cérébral (AVC) ou d’un traumatisme crânien, s’accompagnent également de déficits mnésiques significatifs. Dans ce contexte, notre projet vise à étudier les effets pro-mnésiques de deux composés ibogalogues chez la souris. Afin de tester les éventuels effets bénéfiques des ibogalogues, plusieurs études ont mis en évidence le rôle central de la transmission sérotoninergique dans la modulation des processus mnésiques. Afin de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents, nous nous intéresserons à l’implication de différents sous-types de récepteurs sérotoninergiques susceptibles de participer aux effets de ces composés. À cette fin, des antagonistes sélectifs de ces récepteurs seront utilisés. Leur administration permettra de mieux caractériser le rôle de chaque récepteur dans les effets mnésiques induits par les ibogalogues.
Bénéfices attendus
Les traitements actuellement disponibles pour améliorer la mémoire, notamment chez les personnes âgées ou atteintes de maladies comme Alzheimer, offrent des bénéfices limités. Ils soulagent parfois certains symptômes, mais ne permettent pas d’agir en profondeur sur le fonctionnement du cerveau, ni d’améliorer durablement les capacités de mémorisation. De plus, ces traitements peuvent provoquer des effets secondaires (nausées, confusion, somnolence) et leur efficacité diminue souvent avec le temps. Ce projet explore une nouvelle voie prometteuse, en étudiant deux substances issues d’une plante africaine appelée iboga. Ces molécules, appelées ibogalogues, pourraient renforcer durablement la mémoire en favorisant des changements positifs dans les connexions entre les neurones, un phénomène appelé plasticité cérébrale. Ces recherches visent donc à découvrir de nouvelles approches thérapeutiques, potentiellement utiles non seulement en cas de maladie, mais aussi dans des contextes comme le vieillissement, le stress important ou certaines difficultés d’apprentissage. Les effets de ces substances sur la mémoire sont encore peu connus, d’où l’intérêt d’une évaluation approfondie.
Procédures
Selon le protocole expérimental, chaque animal reçoit, en fonction du groupe auquel il appartient, soit une injection unique (d’une durée inférieure à une minute) de la substance étudiée, soit deux injections successives en cas de prétraitement. Dans ce dernier cas, l’animal reçoit tout d’abord un agent de prétraitement, suivi, 30 minutes plus tard, de l’administration de la substance principale à tester. Après l’injection, un délai d’environ 30 minutes est respecté afin de permettre à la substance d’agir. Chaque sujet sera ensuite soumis à un test comportemental standardisé d’une durée de 4 minutes. Le test envisagé est un test de comportement qui permet d’ évaluer les effets des agents pharmacologiques sur la mémoire et la capacité d’apprentissage chez les souris en mesurant la mémoire spatiale de la souris. À l’issue du test, les animaux seront mis à mort conformément aux directives éthiques en vigueur. Les cerveaux sont ensuite prélevés pour des analyses neurochimiques, notamment le dosage des monoamines dans les régions cérébrales d’intérêt.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables potentiels anticipés chez les animaux figurent les réactions liées aux injections. Afin de minimiser le stress et l’inconfort associés à ces manipulations, des aiguilles ultrafines seront utilisées, et les injections seront systématiquement réalisées dans le cadran inférieur droit de la cavité abdominale. Par ailleurs, le test du labyrinthe de Barnes a été choisi en raison de son caractère moins anxiogène comparé à d’autres paradigmes comportementaux, tels que le labyrinthe aquatique, permettant ainsi de réduire significativement le niveau de stress induit chez les animaux au cours de l’expérimentation. Chaque session de test ne dure que 4 minutes. À l’issue de celle-ci, les animaux seront immédiatement replacés dans leur cage habituelle, ce qui contribuera à restaurer un environnement familier et à limiter le stress résiduel. Concernant les effets indésirables liés aux agents pharmacologiques testés : aucun effet délétère majeur n’est attendu a priori. Les deux composés étudiés présentent principalement des effets anxiolytiques et antidépresseurs, déjà documentés dans la littérature. Aucune toxicité ou altération comportementale notable n’a été rapportée aux doses envisagées.
Devenir
L’ensemble des animaux seront mis à mort conformément aux dispositions de l’annexe IV de la directive 2010/63/UE relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. La méthode retenue permettra un prélèvement rapide et intact des cerveaux entiers, condition indispensable à la réalisation d’analyses neurochimiques de haute précision. Cette étape a pour objectif de mettre en relation les effets comportementaux observés avec les modulations neurochimiques induites par les traitements expérimentaux, contribuant ainsi à une meilleure compréhension des mécanismes d’action sous-jacents.
Remplacement
Cette étude porte sur les mécanismes de l’apprentissage et de la mémoire, lesquels nécessitent l’observation d’un cerveau intact et fonctionnel au sein d’un organisme vivant. À ce titre, le recours à un modèle animal s’avère indispensable. L’espèce choisie est la souris, largement utilisée en neurosciences pour l’étude des fonctions cognitives et l’évaluation des effets de traitements pharmacologiques. À ce jour, les modèles alternatifs disponibles (cultures cellulaires in vitro, simulations informatiques) ne permettent pas de reproduire de manière satisfaisante la complexité des interactions neuronales, notamment celles impliquées dans les processus mnésiques. C’est pourquoi l’expérimentation animale demeure essentielle pour comprendre ces mécanismes et orienter le développement de stratégies thérapeutiques innovantes. Les capacités mnésiques seront évaluées à l’aide d’un test comportemental simple, bref et non invasif, reposant sur le comportement d’exploration naturelle de la souris : l’animal est amené à rechercher spontanément un abri, évitant les zones ouvertes et lumineuses. Ce test respecte les comportements instinctifs de l’espèce, n’induit ni douleur ni stress significatif, et permet une évaluation fiable de l’efficacité des substances testées. Dans une démarche de raffinement, les injections seront réalisées selon un schéma rotatif, en alternant les côtés du corps, afin de minimiser l’inconfort potentiel. Par ailleurs, une partie complémentaire du projet sera réalisée par nos collaborateurs aux États-Unis, à l’aide de modèles alternatifs tels que les cultures cellulaires, permettant d’explorer les mécanismes à l’échelle moléculaire. Enfin, bien que les études cliniques ou post-mortem fournissent des informations précieuses, elles ne permettent pas, à elles seules, de caractériser les dynamiques fonctionnelles du cerveau en condition physiologique. Le recours à un modèle animal demeure, dans ce cadre, scientifiquement justifié et nécessaire
Réduction
Dans le cadre de cette étude, une approche méthodologique rigoureuse a été adoptée afin de déterminer le nombre minimal d’animaux requis pour atteindre les objectifs scientifiques fixés, tout en respectant les principes éthiques de l’expérimentation animale. Cette estimation s’appuie sur une analyse statistique utilisant un test non paramétrique comme le test de Mann-Whiteny qui est un test non paramétrique qui permet de tester si deux échantillons sont issus de populations indépendantes a la même moyenne. Différence attendue: 20 %, SD = 10 %, puissance: 80 %, alpha = 0,05. Ainsi, il a été estimé que 10 animaux par groupe sont nécessaires pour garantir la robustesse et la fiabilité des résultats obtenus. Par ailleurs, conformément aux principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner), les collaborateurs impliqués dans ce projet s’engagent à recourir à des méthodes alternatives, telles que les cultures cellulaires in vitro, lorsque cela est scientifiquement pertinent. Ces approches permettent de limiter davantage l’utilisation d’animaux, tout en assurant la qualité et la pertinence des données recueillies.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages conformes aux normes réglementaires en vigueur, au sein d’un environnement contrôlé et enrichi. Celui-ci comprendra notamment des cylindres en carton, afin d’augmenter la complexité de l’habitat et de favoriser l’activité physique. Ce dispositif vise à améliorer le bien-être animal et à limiter l’apparition de comportements stéréotypés. Une surveillance rigoureuse sera assurée: état général, prise alimentaire, consommation d’eau, comportement et poids corporel feront l’objet d’un suivi quotidien. Avant les expérimentations, une période d’acclimatation sera instaurée pour permettre aux animaux de s’adapter progressivement à leur nouvel environnement. En complément, une phase de handling doux sera réalisée durant 5 à 7 jours consécutifs avant les tests comportementaux. Chaque animal sera manipulé environ 5 minutes par jour par le même expérimentateur, dans un environnement calme, sans contention ni contrainte, afin d’habituer progressivement les animaux au contact humain. Cette étape vise à réduire le stress lié aux manipulations et à améliorer la fiabilité des mesures comportementales. Les souris seront ensuite placées dans la salle d’expérimentation, en présence de l’expérimentateur, pendant une heure avant le test. Afin de limiter le stress lié à la capture, les animaux seront manipulés à l’aide de tunnels transparents (plastique ou carton) disposés dans les cages. Cette méthode, moins intrusive que la capture par la queue, permet un transfert volontaire des animaux et contribue à une meilleure qualité des données comportementales. Les cages seront enrichies (abris, objets, matériaux de nidification) pour favoriser l’expression de comportements naturels. Une surveillance rigoureuse des points limites permettra de détecter rapidement toute anomalie comportementale (immobilité, prostration, tremblements, troubles locomoteurs, isolement). Si l’utilisation d’un analgésique s’avère nécessaire, nous pourrons utiliser le méloxicam, dont l’efficacité antalgique a été démontrée chez la souris.
Choix des espèces
L’espèce de souris choisie est largement utilisée dans les recherches sur la mémoire et l’apprentissage en raison de son profil comportemental bien caractérisé. Son emploi dans des tests tels que le labyrinthe de Barnes permet une comparaison fiable avec des données existantes, renforçant la validité et la reproductibilité des résultats. La procédure expérimentale prévue a déjà été validée sur cette souche. De plus, sur la base d’une comparaison inter-souches appuyée par des travaux de référence, l’espèce choisie présente une réactivité au stress plus modérée que d’autres lignées, ce qui favorise une expression comportementale plus stable dans les paradigmes cognitifs et émotionnels. Le choix de cette souche est donc scientifiquement pertinent, conforme aux standards de la recherche en neurosciences, et contribue à minimiser les biais expérimentaux tout en assurant le respect du bien-être animal, conformément aux recommandations éthiques et réglementaires en vigueur. Les expérimentations seront menées sur des souris ayant atteint une maturité cérébrale complète. À ce stade, leur système nerveux central est pleinement développé, ce qui permet une évaluation fiable des fonctions mnésiques et cognitives. Par ailleurs, la majorité des études sur la mémoire et l'apprentissage utilisent des souris adultes, ce qui assure une meilleure comparabilité et reproductibilité des résultats obtenus.
Caractérisation du rôle de la phospholipase A2 sécrétée de groupe 5 dans un modèle murin de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Pesées, scorées et surveillées tous les jours week-ends compris à partir du septième, les souris reçoivent eau et nourriture en gel quand leurs troubles moteurs les empêchent de s'alimenter. 3 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La maladie, proche de la sclérose en plaques, est déclenchée par un rasage et deux injections sous anesthésie, suivies d'une troisième deux jours plus tard, avec une paralysie partielle des membres postérieurs et une perte de poids attendues entre le huitième et le dix-huitième jour. Tout cela pour caractériser le rôle, "totalement inconnu" selon le porteur, d'une enzyme dans deux régions du cerveau, l'identification de cibles thérapeutiques restant une perspective lointaine.
Objectifs
Les phospholipases A2 sécrétées sont des enzymes clés dans le métabolisme lipidique. Chaque enzyme présente des localisations tissulaires et cellulaires uniques ainsi que des propriétés enzymatiques spécifiques, ce qui suggère des rôles biologiques distincts et complexes. Récemment, nous avons découvert qu'une de ces phospholipases sécrétées était exprimée dans 2 régions particulières du cerveau de souris: les plexus choroïdes, qui forment l'interface entre le sang et le liquide cérébrospinal et l'éminence médiane, un organe situé à la base de l'hypothalamus servant de barrière par une communication étroite entre les boucles de capillaires fenêtrés et une population de cellules gliales spécialisées, les tanycytes. Nous souhaitons donc mener des études afin d’étudier le rôle de cette phospholipase dans les processus neuro-inflammatoires et plus spécifiquement dans un modèle murin de sclérose plaques. Si son implication est avérée, nous étudierons alors le potentiel d'un inhibiteur pharmacologique sur ces phénomènes.
Bénéfices attendus
Il est important de mener des recherches approfondies pour comprendre le rôle encore totalement inconnu de cette phospholipase dans le cerveau et en particulier dans les processus neuroinflammatoires. La neuroinflammation est un phénomène pathophysiologique commun à un grand nombre de pathologies du système nerveux, telles que la maladie d'Alzheimer, la sclérose en plaques, la maladie de Parkinson et l'accident vasculaire cérébral. Cette phospholipase est une enzyme déjà impliquée dans la régulation de l'inflammation en périphérie, mais son rôle dans le cerveau reste largement méconnu. De par son expression très localisée dans ces 2 régions du cerveau chez la souris, comprendre comment cette phospholipase contribue aux processus neuroinflammatoires dans un modèle murin de sclérose en plaques aiderait à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de cette pathologie.
Procédures
Induction de la pathologie avec 1 rasage et 2 injections sous anesthésie (1 fois pendant x 15min) puis 2 jours après : 1 injection sur animal vigile (1 fois pendant x 30 secondes). Génotypage des souris : un prélèvement de queue sera réalisé sur animal vigile (1 fois pendant 10 secondes).
Impact sur les animaux
Biopsie pour génotypage : stress inhérent à la préhension et contention et douleur légère de courte durée lors du prélèvement. Induction de la pathologie : douleur légère de courte durée suite aux injections. Pathologie : entre 8 à 12 jours suivant la phase d’induction, apparition de déficits moteurs des membres inférieurs (paralysie partielle induisant une mobilité réduite et une perte de poids progressive jusqu'à 18 jours post-induction) puis amélioration avec régression des signes durant 1 semaine suivie d’une phase de léger rebond.
Devenir
Après leur production, tous les animaux en expérimentation seront euthanasiés afin de collecter les organes d’intérêt pour réaliser nos dosages et observations histologiques.
Remplacement
Notre projet se base sur des données de transcriptomique spatiale disponibles publiquement qui montrent l'expression ciblée et spécifique d'une phospholipase dans certaines zones cérébrales. Si certaines de ses fonctions sont connues en périphérie (coeur, poumons...), rien n'est encore connu à ce jour sur ses fonctions dans le cerveau, et en particulier sur son rôle dans les processus neuroinflammatoires. La neuroinflammation est un processus complexe qui fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires et moléculaires d'origine cérébrale (microglie, astrocytes...) et périphérique (cellules immunes sanguines) ainsi que les structures d'interface entre le sang et le cerveau (barrière hématoencéphalique et barrière sang-liquide cérébrospinal). Il s'agit d'un phénomène complexe et multisystémique qui ne peut être modélisé in vitro, in silico ou ex vivo. Ces questions ne peuvent trouver de réponse qu’en étudiant la physiologie d'un organisme vivant entier et la souris est un modèle de choix.
Réduction
Nous utiliserons des mâles et des femelles qui seront randomisés dans les groupes d’étude, soit une perte minimale due au genre. Nous avons également pu réaliser une étude pilote qui a permis de mettre en évidence un léger retard dans l’induction de la phase inflammatoire, une absence de la phase de rebond et une plus forte perte de poids dans les phases de rémission partielle et rebond chez les souris KO. L’analyse statistique de cette étude nous a donc permis d’évaluer la puissance de cet effet et nous indique de travailler avec des groupes expérimentaux de 10 souris par groupe.
Raffinement
Le bien-être animal est une préoccupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (cachette, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 5 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures. Les souris auront libre accès à l'eau et à la nourriture. Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Les injections seront réalisées par des opérateurs expérimentés. Les animaux seront suivis sur plusieurs critères, comme le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement. Les points limites établis seront scrupuleusement respectés en cas de nécessité. Après immunisation, les souris sont surveillées tous les jours, week-end compris à partir de J7 post immunisation. Elles sont pesées, scorées et de la nourriture et de l’eau gélifiée sont ajoutées dans la cage pour leur permettre de s’hydrater et s’alimenter facilement malgré leurs problèmes de motricité. Enfin, il est à noter que les animaux seront anesthésiés lors de l’immunisation et avant leur mise à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour caractériser les fonctions des phospholipases A2 sécrétées. Pour l’une de ces phospholipases, des données récentes sur le cerveau de souris ont montré que son expression est localisée dans des régions très spécifiques, comme chez l'Humain. Les souris déficientes pour ce gène nous permettront donc de tester notre hypothèse de l'implication de cette enzyme dans les processus neuro-inflammatoires, en modulant notamment la composition du liquide cérébrospinal et le recrutement de cellules immunes périphériques. Des études sur l'expression génique de cette phospholipase nous indique qu'elle ne varie pas significativement chez la souris en fonction de l'âge. De ce fait, nous utiliserons préférentiellement des souris jeunes adultes de 8 à 20 semaines pour l’induction de la pathologie. Enfin, le génotypage des animaux sera réalisé sur des souriceaux de 21 jours.
Effet du blocage de la triglyceridémie sur la réaction microgliale cérébrale.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un cathéter est posé chirurgicalement dans l'estomac de chaque souris, qui passe ensuite onze jours seule en cage avant de recevoir un repas perfusé directement dans l'estomac pendant trois heures. 220 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'étude porte sur la réaction inflammatoire qui suit un repas gras chez "l'individu sain dans un contexte de physiologie normale", alors que les animaux observés sont opérés, isolés et alimentés par sonde. Le sang entier et le cerveau doivent être prélevés, ce qui impose la mise à mort de chaque animal.
Objectifs
L’existence de la réaction inflammatoire après repas (PIR) systémique est maintenant bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme et les mécanismes biologiques sous-jacents induisant la PIR sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas, qui est exacerbée lors d’une consommation d’un repas gras. Récemment, il a été montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, elle se caractérise par une activation des cellules spécifiques chez l’individu sain en réponse à un repas gras. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas, et elle se produit dans une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. Les médiateurs biologiques qui déclenchent la PIR cérébrale ne sont pas identifiés. Une hypothèse serait que les lipides nutritionnels qui se retrouvent dans la circulation générale après digestion et absorption soient capables de stimuler la réponse des cellules du cerveau cependant d’autres facteurs circulants après un repas pourraient aussi activer la PIR. La stratégie consistera à manipuler la concentration de lipides dans le sang postprandiale et à mesurer la réponse cellulaire cérébrale. La concentration de lipides dans le sang sera suivie par analyse biochimique sanguine, et la réponse cellulaire cérébrale sera mesurée par microscopie sur coupes de cerveau. Nous utiliserons : une solution de nutrition à base d’un régime enrichi en gras, elle sera perfusée dans le tube digestif, ce qui permettra d’élever artificiellement les lipides plasmatiques en l’absence de prise de repas et un agent pharmacologique qui limitera cette élévation des lipides et nous permettra de mettre en évidence une action des autres facteurs sur l’activation de la PIR. Un dosage sanguin des triglycérides au cours du temps sera réalisé aux temps : T0, T1h, T2h, et T3h. Les cerveaux de ces animaux seront étudiés après mise à mort afin d’analyser la réponse cellulaire cérébrale dans différentes conditions. 220 souris seront utilisées dans ce projet.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de mieux comprendre les déterminants de la PIR cérébrale chez l’individu sain, et donnera des informations nouvelles sur l’impact des lipides nutritionnels sur le cerveau. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie qui durera 30 minutes pour la mise en place du cathéter gastrique. De plus, ils seront placés dans des cages individuelles durant 11 jours. Le jour de l’expérience ils recevront un traitement dans l’estomac (temps = 1.5 minutes) puis la perfusion du repas dans l’estomac dure de 0 à 3 heures. La contention des animaux et les injections pour l’anesthésie générale avant la mise à mort représentent des nuisances sur les animaux dans ce projet. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
La chirurgie pour la mise en place du cathéter gastrique peut provoquer les nuisances suivantes : - Hypothermie transitoire, induite par l’anesthésie générale - Douleurs post-chirurgie transitoires, induites par la chirurgie - Trouble potentiel du comportement alimentaire et du métabolisme, induit par la chirurgie affectant le tube digestif - Stress lié à l’isolement en cage individuelle - Stress lié à la contention des animaux et aux injections d’anesthésique et de sédatifs avant la mise à mort. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort, en effet la totalité du sang et le cerveau doivent être prélevés.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.
Réduction
Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits
Raffinement
Depuis l’arrivée des animaux dans l’animalerie, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux. Les animaux seront hébergés dans un environnement calme, enrichi, et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h (cycle inversé permettant d’étudier les animaux pendant leur phase active, avec extinction des lumières à 10h30). L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidification et carrés de coton ainsi que des frisures de papier qui permettent aux animaux de se cacher. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes mâles, âgées de 8 semaines au moins. D’un point de vue scientifique, la PIR se développe uniquement chez les mâles, de plus cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé.
Evaluation de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle de syndrome X fragile
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Jusqu'à 800 séries de sons par session d'enregistrement, jusqu'à 20 administrations dans la vie de l'animal, deux à dix mois en cage individuelle avec contrôle alimentaire : 400 rats porteurs d'une mutation du gène de l'X fragile vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun subit d'abord une neurochirurgie d'environ une heure sous anesthésie générale, qui laisse un connecteur fixé à son crâne dont la cicatrisation doit être surveillée. Les prélèvements sanguins, jusqu'à trois par semaine, se font sous anesthésie générale quand le protocole l'exige. L'objet est d'évaluer par électroencéphalographie des candidats médicaments en cours de développement, le porteur présentant le recours à un modèle animal comme le moyen d'optimiser un développement pharmaceutique qu'il décrit comme long et coûteux.
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer des signaux électroencéphalographiques (EEG) dans un modèle animal de syndrome du chromosome X fragile, qui est une maladie génétique entrainant un déficit intellectuel, des troubles du comportement et des anomalies physiques. Les patients présentant le syndrome de l’X fragile présentent des troubles mentaux approchant ceux du spectre autistique : anxiété sociale, hypersensibilité sensorielle, retard mental. Ce syndrome est causé par la mutation d’un gène unique. Un modèle de rat porteur d’une mutation analogue du même gène est disponible, et ce rat mutant présente des caractéristiques qui rappellent fortement le syndrome de l’X fragile. L'électroencéphalographie est un outil de choix pour aborder l’activité cérébrale, en raison de son caractère transposable entre le rat et l’homme. En effet, les activités cérébrales de base sont largement conservées chez les mammifères. Les observations effectuées chez le rongeur permettent donc de prédire des résultats chez l’homme. Il est donc intéressant d’utiliser ce rat mutant pour évaluer des candidats médicaments en cours de développement et visant à améliorer la qualité de vie des patients victimes du syndrome X fragile. Ces candidats médicaments seront évalués sur le rat mutant, et leurs effets seront évalués à travers l’électroencéphalographie. Des marqueurs biologiques mesurés permettront d’évaluer l’impact sur les rats mutants, et permettront de prédire une efficacité chez le patient. Ces marqueurs biologiques seront de deux types. Des marqueurs spontanés seront évalués : les animaux seront laissés libres, éveillés et dans des conditions calmes, sans intervention dans leur environnement. Les différences spontanées entre les rats mutants et contrôles pourront être comparées, et les effets des candidats médicaments sur ces différences seront évalués. Des marqueurs évoqués seront également évalués : les animaux seront toujours laissés libres et éveillés, et des stimulations sonores leur seront présentées. Ces stimulations sonores induiront des réponses neuronales qui seront mesurées et quantifiées. A nouveau, les différences entre les deux types de rats seront comparées, et les effets des candidats médicaments seront évalués.
Bénéfices attendus
Le développement de nouveaux médicaments est très coûteux et prend beaucoup de temps. Afin d’optimiser ce développement et ainsi fournir aux patients des traitements efficaces, l’utilisation d’un modèle animal pertinent est nécessaire. L’utilisation d’une lignée de rats mutants, modélisant le syndrome X fragile humain, permettra de mettre en évidence de nouvelles molécules thérapeutiques susceptibles d’améliorer la qualité de vie des patients victimes de ce syndrome.
Procédures
L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores une à deux fois par semaine. Une diminution de l’activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaître dans les heures suivant l’intervention chirurgicale. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores qui seront réalisées sur l’animal éveillé une à deux fois par semaine. Les pulsations sonores individuelles dureront un maximum de 100 ms à une intensité de 90 dB maximum. Ces pulsations sonores seront regroupées soit en paires avec 1 seconde d’écart entre les 2 sons, soit en train de 2 secondes avec un son toutes les 25 ms. Chacune de ces séries de sons pourront être répétées jusqu’à 800 fois au cours d’une session d’enregistrement : jusqu’à 400 fois avant administration et jusqu’à 400 fois après administration. Lors des tests pharmacologiques le nombre d’administrations (durée d’une minute en moyenne) sera limité à 20 dans la vie de l’animal, avec un minimum de 3 jours entre chaque jour d’administration. Lors des tests pharmacologiques en administrations répétées, les injections pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. Différents prélèvements sanguins pourront être faits au cours des procédures expérimentales. Ils seront conduits sous anesthésie générale si nécessaire, en fonction du protocole établi dans chaque étude (durée : moins de 20 min par prélèvement). Le nombre de prélèvements sanguins sera limité à 3 par semaine. Les animaux seront hébergés en cage individuelle tout le long du projet (entre 2 à 10 mois) et seront soumis à un contrôle alimentaire tout au long de leur hébergement (quelques mois).
Impact sur les animaux
Le modèle de rats utilisé ne présente pas d’effets indésirables aboutissant à une mortalité précoce des animaux. La chirurgie aboutira à la présence d’un connecteur attaché au crâne de l’animal. La cicatrisation autour de ce connecteur devra être surveillée et soignée. Des administrations pharmacologiques nécessiteront la manipulation des animaux, induisant un stress. Au point d’injection, des indurations ou des inflammations locales et temporaires pourront apparaître. Les prélèvements sanguins induiront un stress de contention, une douleur brève au point de prélèvement. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l’inverse une excitation du fait des mécanismes d’action des molécules testées. Un stress pourra être induit par l’hébergement individuel et le contrôle alimentaire.
Devenir
Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électroencéphalographiques. De plus, dans certains cas, une vérification d’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus cérébraux seront nécessaires. Les animaux seront donc tous mis à mort à la fin du projet.
Remplacement
Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes, produit par le cerveau dans son ensemble qui ne peut pas être modélisé par un système plus simple (ex. culture cellulaire ou informatique).
Réduction
Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Il a été estimé selon notre expérience antérieure nous ayant permis d'obtenir un nombre suffisant d’animaux enregistrés pour réaliser les tests statistiques précédents et garantir la prédiction d’effets transposables à l’humain.
Raffinement
Le raffinement a été appréhendé à travers les conditions d'expérimentation et d'hébergement qui sont optimisées afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long des procédures expérimentales. Le projet prévoit des procédures engendrant des douleurs post-opératoires modérées. Toutefois, les animaux recevront un protocole de soins pré et postopératoires comprenant une anesthésie, des antidouleurs, des anti-inflammatoires et une évaluation clinique quotidienne. Des critères d’arrêt anticipé de l’expérimentation en cas de survenue d’une complication ont été identifiés. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et définissant les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Pour les expériences d’enregistrement EEG en réponse à des stimulations sonores , ces stimulations seront limitées à une intensité sonore en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress sur les animaux.
Choix des espèces
Nous utiliserons une lignée de rats mutants, dont la mutation est similaire à celle présente chez les patients du syndrome de l’X fragile. Le choix de l’espèce est donc directement lié à cette similarité : la mutation de ce même gène chez l’homme et le rat induit en effet des troubles similaires dans les deux espèces. Les animaux sont manipulés au minimum à l’âge de 8 semaines puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. A ce stade, le cerveau est mature et présente des caractéristiques intéressantes pour reproduire les troubles observés chez le patient humain.
role des omega-3 dans les altérations cognitives
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Cinq injections intrapéritonéales au sevrage, des régimes carencés en oméga-3, jusqu'à cinq tests comportementaux de quelques minutes à l'âge de trois mois : les procédures s'arrêtent là. 5 498 souris vont être utilisées, dont 3 839 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 659 un niveau léger, toutes tuées pour le prélèvement de structures cérébrales. Le porteur affirme pourtant que les régimes n'impactent en rien le bien-être des animaux non-humains, que les tests ne provoquent qu'une anxiété légère et passagère, et que les souris transgéniques utilisées ne présentent aucune altération de leur état général. Rien dans le texte n'explique ce qui, dans ces procédures, conduit à classer 3 839 souris en gravité sévère, ni comment l'effectif de 5 498 a été établi.
Objectifs
Le vieillissement s’accompagne d’une inflammation chronique à bas bruit, c’est-à-dire qu’elle est silencieuse, le mécanisme inflammatoire se situe alors sous le seuil de la douleur et cause des dégâts dans l’organisme. Cette inflammation est associée à des modifications du comportement et des fonctions cognitives. Les fonctions cérébrales impliquent notamment la communication entre les cellules du cerveau. Cette communication repose entre autres sur des petites vésicules, qui participent aux fonctions cognitives et aux réponses inflammatoires. L’alimentation à laquelle nous sommes exposés tout au long de la vie est clé dans le bon fonctionnement du cerveau et le vieillissement de la mémoire. Certains nutriments tel que les oméga 3 ont un rôle bénéfique sur les mémoires. Cependant, leurs mécanismes d’action pour prévenir ou atténuer les altérations de la mémoire restent à ce jour méconnus. Ce projet consiste à identifier les changements de mémoire en lien avec l'alimentation et de déterminer des combinaisons de nutriments pour maintenir la mémoire. Dans ce contexte, le projet de recherche que nous souhaitons développer a pour objectif d’identifier des marqueurs des mécanismes du cerveau associés aux déficits de mémoire.
Bénéfices attendus
Notre étude associe une approche nutritionnelle à une approche comportementale et électrophysiologique dans le cadre de troubles de la mémoire, afin de mettre en avant la communication entre les cellules du cerveau. Elle apportera des connaissances nouvelles visant à mieux comprendre l'origine des troubles de la mémoire en lien avec l'alimentation.
Procédures
Les animaux seront soumis à des régimes carrencés ou équilibrés en oméga-3. Ils seront soumis à maximum 5 tests comportementaux à 3 mois permettant d'évaluer la mémoire, l'anxiété et la motricité de quelques minutes par test. Des injections intrapéritonéales au sevrage seront réalisées (5 injections/1 par jour).
Impact sur les animaux
Certains tests comportementaux génèrent une légère anxiété et du stress passager, sans entrainer d'altération de l'état général des animaux. Les autres tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Les régimes équilibré, carencé ou supplémenté en Oméga 3 n’impactent en rien le bien-être de l’animal. L’injection intrapéritionéale au sevrage n’induit pas d’effets indésirables en dehors de la douleur liée au geste de l'injection. Les animaux transgéniques utilisés ne présentent pas d'altérations de l'état général de santé.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.
Remplacement
L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence nutritionnelle en omega-3 sur le fonctionnement des cellules du cerveau chez la souris. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche de solutions alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et que le travail proposé n'a pas déjà été effectué.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientifique.
Raffinement
Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.
Choix des espèces
Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Leurs données préliminaires ont été générées chez la souris et la genèse de données nouvelles sur le modèle murin permettra de raffiner les données existantes par leur analyse commune avec les nouvelles données générées. La souris est un modèle pertinent et reconnu en nutrition et déclin cognitif, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier notamment le cerveau et son fonctionnement. Le modèle murin de vieillissement présente des similitudes avec le vieillissement chez l'homme et permets de comprendre les mécanismes potentiellement impliqués afin de découvrir de nouvelles méthodes pour vieillir en bonne santé.
Etude de la vascularisation lors de la réparation dans un modèle murin de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trois administrations sous anesthésie générale, puis une quatrième deux jours plus tard sur animal éveillé, suffisent à déclencher chez la souris une maladie qui reproduit en partie la sclérose en plaques. 100 souris vont être utilisées, 80 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 20 un niveau léger, toutes tuées pour le prélèvement de tissus. Elles développent des troubles de la marche et de la coordination, une faiblesse musculaire et une perte de poids, qui atteignent un pic de trois à cinq jours au bout de deux semaines environ, le porteur signalant aussi un risque de lésion cutanée au point d'injection. Le RNT ne nomme à aucun moment les produits injectés pour induire la maladie, ni la grille de score utilisée pour suivre les animaux non-humains.
Objectifs
La sclérose en plaque (SEP) est une pathologie du système nerveux central présentant une démyélinisation et une dégénérescence axonale. La forme la plus courante de la maladie est la forme récurrente-rémittente (RRMS), dans laquelle des poussées répétées de symptômes neurologiques sont suivies de périodes de récupération partielle ou complète. Les altérations de la structure et de la fonction du système vasculaire jouent un rôle essentiel dans les troubles neurodégénératifs chroniques telle que la sclérose en plaques. Des études récentes réalisées en imagerie cérébrale sur des cohortes de patients atteints de SEP ont décrit le remodelage vasculaire pendant la formation et l'évolution des lésions, mais aucune donnée n’existe à ce jour sur l’évolution de la vascularisation lors du processus de remyélinisation, un processus nécessitant un fort soutien métabolique dont les éléments (nutriments, oxygène, prises en charge des déchets..) sont apportés via les vaisseaux sanguins. Notre objectif sera de caractériser précisément les modulations de la vascularisation lors de la remyélinisation en utilisant un modèle murin de la SEP.
Bénéfices attendus
La sclérose en plaque (SEP) est la seconde cause de handicap chez l’adulte jeune en France, elle touche plus de 120 000 personnes en France, et plus de 2 millions dans le monde. Il n’existe présentement aucun traitement curatif pour cette pathologie. Ce projet permettra d'étudier le processus de réparation dans un modèle murin de Sclérose en plaques dans l'organisme entier et ainsi de compléter des mécanismes récemment observés par imagerie cérébrale chez les patients. Cela pourrait permettre notamment de mieux comprendre le rôle de la vascularisation et sa modulation dans la physiopathologie de la SEP. A plus long terme, la compréhension des modulations de la vascularisation dans cette pathologie pourrait permettre d'envisager des stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du handicap chez les patients et donc améliorer leur prise en charge.
Procédures
Les animaux, sous anesthésie générale, recevront 3 administrations pour la mise en place du modèle (10 minutes maximum). Deux jours après, ils recevront une deuxième administration ( durée inférieure à 1 minute par animal, vigile). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser des prélèvements d’intérêt pour nos analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
Après induction de notre modèle pathologique, les souris peuvent développer des troubles de la marche, de la coordination, une faiblesse musculaire et une perte de poids. Ces symptômes s’installent progressivement au bout de 2 semaines environ et atteignent un pic durant 3-5 jours, puis sont suivis d’une récupération partielle ou complète en quelques jours. L’anesthésie gazeuse mise en place pour minimiser le stress lié à la manipulation lors de l’induction de la pathologie sera très courte (inférieure à 10 minutes) et sera donc associée à un risque infime de détresse cardio-respiratoire et d’hypothermie. Les injections génèreront un stress et une brève et légère douleur au point d’injection. Lors des injections d’induction de la pathologie, il existe également un risque de lésion cutanée du point d’injection dû à la molécule injectée.
Devenir
Des analyses seront réalisées post mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux pour le prélèvement des tissus d’intérêt.
Remplacement
Dans un effort de remplacement, nous travaillons en première approche avec des modèles ex vivo. Les modèles murins in vivo sont ultimement nécessaires pour l’étude fondamentale de la sclérose en plaques, car ils permettent d'étudier la réparation tissulaire dans un contexte intégré, impliquant des interactions entre tissus nerveux et cellules immunitaires sanguines, ainsi que les apports métaboliques en lien avec le réseau sanguin, qui sont des composantes essentielles à étudier de cette pathologie, d’après les travaux en imagerie effectués chez le patient.
Réduction
Des approches statistiques permettront d’optimiser le nombre d’animaux utilisés, estimés à 100 maximum, et de ne pas sur-dimensionner le nombre d’animaux étudiés lors de nos expériences : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul statistique après la première expérience. Les données obtenues seront analysées avec les tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’un environnement enrichi comprenant du matériel de nidification, une cachette (maisonnette, dôme) et un bâtonnet de bois à ronger. Nous respecterons une période d’acclimatation d’une semaine à l’arrivée des animaux dans l’animalerie avant toute inclusion dans la procédure. Les animaux sont manipulés uniquement par un personnel qualifié et sensibilisé au bien-être animal. Ils seront observés quotidiennement et surveillés de manière spécifique par l’équipe dès l’induction de la pathologie : afin de surveiller l’évolution des signes cliniques nous utiliserons une grille de score adaptée à notre modèle quotidiennement voir bi-quotidiennement lors de la phase aiguë de la pathologie. Nous mettrons en place une assistance nutritionnelle dès l’apparition de difficultés motrices (alimentation humide ou en gelée, facilement accessible dans la cage). L’induction de la pathologie sera réalisée sous anesthésie pour minimiser le stress et la douleur des animaux et faciliter la réalisation des injections. Des points limites seront définis et respectés pour éviter toute souffrance animale non nécessaire pour la procédure.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, son système nerveux, sa physiologie et sa génétique sont bien connues et sont relativement proches de l'Homme. Le modèle expérimentale développé chez la souris tel qu’utilisé ici, est un modèle classique de sclérose en plaques, permettant de reproduire en partie les symptômes et lésions observés chez les patients. Nous utiliserons des souris adultes, âgés de 10-12 semaines au moment de l’induction de la pathologie. L’usage de jeunes adultes permet de reproduire les conditions d’initiation de la sclérose en plaques chez l’humain et limite les risques d’artefacts liés au vieillissement de l’animal.
Caractérisation de la stéatohépatite associée à un dysfonctionnement métabolique précoce dans des modèles de trisomie 21
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Des souris de seize lignées différentes, porteuses de duplications partielles reproduisant la trisomie 21, vont être utilisées pour repérer les gènes qui lient ce syndrome aux maladies du foie. Elles sont 720, dont 672 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 48 sous anesthésie profonde sans réveil. Ces 48 souriceaux de sept et quinze jours reçoivent une ponction de sang directement dans le cœur et sont tués sans reprendre conscience. Les autres subissent dix semaines de régime appauvri ou enrichi en graisses, avec l'installation possible d'une maladie du foie, des difficultés à se déplacer et une perte de poids, puis des tests d'apprentissage rendus plus attirants par l'acidification de leur eau de boisson, avant d'être tuées pour le prélèvement d'organes.
Objectifs
Ce projet adopte une approche interdisciplinaire pour comprendre les pathologies du foie associées à des dysfonctionnements chez les personnes atteintes du Syndrome de Down (SD) ou Trisomie 21 (T21). La T21 affecte 1 naissance sur 1 000, c’est la déficience intellectuelle la plus courante et elle est souvent accompagnée de comorbidités comme l'obésité, le diabète et des pathologies du foie. Le projet s'appuie sur des recherches antérieures financées par l'UE, qui ont montré que la pathologie du foie est présente chez 82 % des personnes atteintes de T21 et d'obésité, et chez seulement 45 % des personnes atteintes de T21 avec un indice de masse corporelle moyen. Les études sur des modèles murins mimant la T21 ont révélé que cette pathologie du foie contribue aux troubles cognitifs. Ces modèles présentent une inflammation du foie, une accumulation d'acides biliaires, une diminution du cholestérol et une augmentation de la bilirubine dans le sang. De plus, une suractivation des voies inflammatoires est observée dans divers tissus, y compris le foie, les muscles, les tissus adipeux et le cerveau. L'hypothèse du projet est que la perturbation de la biologie des acides biliaires et du cholestérol, due à la présence de trois copies de certains gènes (Trisomie) au lieu de deux, est un facteur intrinsèque conduisant aux pathologies du foie dans la T21. Le projet utilisera 16 modèles murins de la T21 avec différentes duplications partielles pour identifier les gènes candidats et étudier leurs effets sur le métabolisme et la cognition. L'identification de ces gènes permettra également d'étudier l'origine du dysfonctionnement hépatique au cours du développement, en se concentrant sur la biologie des acides biliaires et du cholestérol de la naissance à l'âge adulte.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de l’obésité dans la trisomie 21 (T21). L’identification des gènes du chromosome 21 impliqués et la compréhension du changement dû à l’obesité est essentielles. En effet, de meilleures thérapeutiques peuvent être proposées pour cibler cette obésité et en réduire les conséquences directes sur les différents organes du corps, y compris le cerveau. Cette étude ouvrira la voie à de futures investigations et déclencher de nouvelles voies thérapeutiques. Le développement de médicaments nécessitera une compréhension approfondie de la physiopathologie de l’obesité dans la T21. De plus, seule une analyse et une compréhension détaillées de la régulation de l’obesité fourniront un ensemble de marqueurs moléculaires essentiels au développement d’un candidat médicament. La T21 est toujours la forme la plus courante de déficience intellectuelle. Même après un diagnostic prénatal, la prévalence est toujours d’environ 1 sur 2000 naissances dans les pays industrialisés, alors que dans d’autres endroits, le risque est d’environ 1 sur 700 nouveau nés. En Europe, la T21 est responsable de 8 % des troubles congénitaux et d'environ 17 000 décès dans le monde. Pour les enfants atteints, les chances de survie au-delà de la première année de vie se sont améliorées ces dernières années : 90 % des enfants atteints survivent désormais au-delà de 5 ans. Ce taux montre l'importance du besoin médical d'améliorer la qualité de vie des personnes atteintes. Le bénéfice majeur de ce projet sera de documenter les mécanismes génétiques et physiopathologiques aboutissant à l’obésité dans la T21, très peu investigués à ce jour, alors que l’obésité est une comorbidité largement présente chez plus de 30% des individus avec les patients T21.
Procédures
Les souris âgées de 7 et 15 jours auront un prélèvement de sang terminal (sans reveil) intracardiaque sous anesthésie profonde (quelques min) Les souris âgées de 60 jours ou plus auront un prélèvement de sang (5 min) après avoir réalisé ou non des tests de comportement non invasifs pour une évaluation de l’apprentissage et la mémoire. Deux groupes de souris seront nouries avec un régime appauvri ou enrichi en graisses pendant 10 semaines.
Impact sur les animaux
Nuisances liées à la maladie : L’installation d’une maladie hépatique peut entraîner une obésité, certaine gêne/douleur au niveau du foie en cas d’inflammation et/ou de fibrose. Dans le cas extrême d’évolution vers une insuffisance hépatique, les animaux pourraient présenter des signes de fatigue avec difficulté à se déplacer dans la cage et avoir une perte de poids. Nuisances liées au prélèvement de sang : Pour les souris nouveaux nés, le prélèvement de sang sous anesthésie peut engendrer un stress. Pour les souris plus âgées, le prélèvement du sang peut entrainer un stress lié à la contention et une douleur légère de courte durée au point de prélèvement. Celles liées aux tests de comportements : Les souris seront soumises à un stress léger lors des tests comportementaux (changement d’environement, changement ponctuel du pH de l’eau (acidification de l’eau de boisson en cage d’hébergement, qui rend plus appétent le lait sucré lors des tests d’apprentissage réalisés en dehors de la cage d’hébergement)) afin de favoriser l’apprentissage et ainsi réduire la durée des tests. Celles liées au régime alimentaire riche ou pauvre en graisses qui entraine : l’installation d’une maladie du foie impliquant une certaine gêne/douleur au niveau du foie en cas d’inflammation. Les animaux peuvent présenter des signes de fatigue (difficulté à se déplacer dans la cage), des crampes musculaires, une perte d’appétit, une perte de poids).
Devenir
Tous les animaux sont mis a mort à l'issue de chaque procédures et certtains organes seront prélevés pour des études histologiques et moléculaires.
Remplacement
L’étude de perturbations comme les maladies du foie est possible chez la souris qui récapitule plusieurs aspects moléculaires et histopathologiques de la pathologie humaine dans la trisomie 21. Le modèle souris mutante est essentiel pour élucider le rôle des différentes régions du chromosome humain 21 dans les déficits cognitifs et comportementaux observés chez les personnes atteintes de T21, car elles sont très utiles pour reproduire le déficit intellectuel de ce syndrome. Comme l'objectif du projet est d'étudier les comorbidités de la T21, et l'ensemble des processus d'obésité nécessitent non seulement des régulations au sein du tissu mais également des communications inter-organes et avec l'environnement, qui n'existent que dans l'organisme entier. Les organoides ne permettent pas ce niveau d’échange et d'intégration physiologique, d'où l'utilisation d’un modèle animal.
Réduction
Nos expériences de base sont construites sur des groupes de 16 animaux pour avoir un résultat significatif. Pour les tests de comportement, la taille des groupes a été déterminé grâce aux résultats de nos précédentes études qui nous ont permises de déterminer le nombre minimum d’animaux à utiliser, soit 16 (8 mâles et 8 femelles) par groupes pour avoir des résultats significatifs. Comme les tests comportementaux sont sans contraintes, certains animaux ne répondront pas, c'est pourquoi nous testerons 4 animaux de plus dans chaque groupe. D’autre part, la stratégie de croisement utilisées ne produit que les animaux nécessaires au déroulement du projet.
Raffinement
Un tube de transfert sera placé dans les cages pour manipuler les animaux sans les toucher et servira également comme enrichissement du milieu durant toute l’expérience, Les animaux aiment bien s’y réfugier et il servira aussi à éviter les contentions par la queue tout au long de leur vie, cela limitera le stress chronique. Tout le personnel impliqué est formé pour réaliser le prélèvement de sang et minimiser le stress. Les souris seront évaluées 2 fois par semaine pour détecter tout signe de souffrance. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués Nous utilisons notamment en score basé sur la mobilité des animaux. Les prises de sang à 7 et 15 jours après la naissance seront réalisées sous anesthésie de manière à limiter l’inconfort.
Choix des espèces
Il existe de nombreux modèles animaux d’obésité mais peu sont ceux qui récapitulent la physiologie, l'histologie, les résultats et les changements transcriptomiques observés chez les humains. Ces modèles sont différents de l’humain, soit parce qu'ils nécessitent des manipulations alimentaires non physiologiques, soit parce qu'ils ne présentent pas de résistance à l'insuline spécifique de la pathologie humaine. Ce qui n’est pas le cas chez la souris. De plus, la souris est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Il existe un grand nombre de modèles murins qui miment la trisomie 21. De plus, son temps de génération associé aux techniques d’édition du génome existantes permettent de réaliser des études complexes et de récapituler de manière assez fidèle les mécanismes chez l’humain. Les souris seront utilisées à l'âge 7 et 15 jours après la naissance pour déterminer à quel moment se met en place l’obésité. Les animaux seront placés sous régime spécial, dès 10 semaines d’âge et pendant 10 semaines, soit l’âge adulte,moment où le développement cérébral est achevé. Les animaux seront prélevés à 60 jours après la naissance ou plus pour les groupes qui passeront les tests de comportement, soit l’âge adulte, moment où le développement cérébral est achevé, chez la souris, ce développement du cerveau se poursuit après la naissance.