Système nerveux
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Rôle de la protéine matricellulaire hevin dans la résilience au stress et la réponse aux antidépresseurs dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour chercher si une protéine du cerveau, l'hevin, prédit la réponse aux antidépresseurs, 4 696 souris vont être utilisées, 3 126 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 570 un niveau léger, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leur cerveau. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique d'environ 45 minutes sous anesthésie, puis dix jours de défaite sociale à raison d'une séance quotidienne de cinq minutes, puis jusqu'à quatre semaines de tests comportementaux et des prises de sang. Le porteur décrit les effets attendus du protocole de stress, anxiété accrue, anhédonie, retrait social et perte de poids, et signale que les mâles logés ensemble peuvent se battre et se blesser. Les souris qui servent d'agresseuses ou de partenaires d'interaction sont tuées après six à neuf mois d'utilisation.
Objectifs
L’objectif général du projet est de définir le rôle des astrocytes et de la protéine hevin dans la réponse au stress et aux antidépresseurs et de déterminer si hevin pourrait servir de biomarqueur de la réponse aux antidépresseurs dans un modèle murin.
Bénéfices attendus
Le projet s’intéresse aux mécanismes de la dépression, la maladie psychiatrique la plus fréquente chez l’homme (prévalence de 6 à 12 pourcent) Nos résultats attendus aideront à comprendre le rôle des glycoprotéines de la matrice extracellulaire dans la plasticité de la résilience et à identifier le réseau de protéines régulatrices et d'effecteurs qui pourraient représenter des cibles thérapeutiques pour le trouble de dépression majeure. Plus important encore, nous émettons l'hypothèse que les changements dans les biomarqueurs sanguins de ces protéines, impliqués dans la motivation, la réponse aux antidépresseurs et la neuroplasticité, seraient corrélés aux changements dans les réponses comportementales et émotionnelles chez les individus déprimés (recevant des antidépresseurs) avant et après la réponse thérapeutique. L'identification de biomarqueurs sanguins prédictifs de la réponse future aux antidépresseurs aurait un impact clinique important, permettant aux cliniciens d'optimiser les plans de traitement, d'adapter la thérapie à chaque patient et de personnaliser les plans de traitement afin d'améliorer les chances de réussite des résultats thérapeutiques dans la dépression.
Procédures
Les interventions prévues incluent une procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec réveil, d’une durée d’environ 45 minutes par souris, accompagnée d’injections d’anesthésiques et d’analgésiques en préopératoire, ainsi que de traitements anti-inflammatoires et analgésiques en postopératoire pendant 1 à 3 jours. Les souris seront également soumises à une procédure de stress répétés, consistant en des sessions quotidiennes de 5 minutes pendant 10 jours, suivie de tâches comportementales réparties sur une période maximale de 4 semaines, à raison d’un test par jour d’une durée allant de 10 minutes à 1 heure. Les souris ayant subi les stress répétés seront regroupées après la défaite sociale jusqu’à la fin des expériences. Enfin, des prélèvements sanguins et une exposition à un stress aigu pour un test de reconnaissance émotionnelle seront également réalisés.
Impact sur les animaux
La chirurgie stéréotaxique peut engendrer dans certains cas une hypothermie ou un arrêt cardio-respiratoire suite à l’anesthésie. Des douleurs post-opératoires ainsi que des risques infectieux sont possibles. Le protocole de stress peut entraîner une augmentation de l’anxiété, une prise de poids, une anhédonie (symptôme psychologique caractérisé par une incapacité ou une diminution marquée à ressentir du plaisir ou de l'intérêt pour des activités ou situations qui étaient auparavant agréables) et un retrait social chez un sous-groupe d’individus. Les souris qui seront hébergées individuellement pendant les tests de comportement pourront montrer une perte du poids (5-10 pourcent), une diminution du toilettage ou une diminution de la locomotion ainsi qu’une anxiété et une anhédonie si l’hébergement individuel dépasse 6 semaines, ce qui correspond à un stress social. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées. Le prélèvement sanguin peut entrainer une douleur légère et transitoire au moment du prélèvement ainsi qu’un hématome et un saignement incontrôlé.
Devenir
Chaque animal sera euthanasié et le cerveau collecté pour analyse histologique de l'injection virale ou analyse anatomique. Les souris utilisées pour la défaite ou l’interaction seront euthanasiée après 6 à 9 mois d’utilisation
Remplacement
Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro, les effets du stress se produisent à l’échelle de l’organisme. Les procédures décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre la signification des évènements causés par le stress sur des circuits neuronaux intacts. Il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. Les résultats obtenus au laboratoire sont toutefois complémentaires à ceux obtenus chez l’homme. L’anatomie, la physiologie et les comportements murins sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques récentes pour l’étude de la fonction des gènes et des circuits cérébraux dans le cerveau.
Réduction
Un nombre important d’animaux est nécessaire, au total 4696, car, pour plusieurs tests, une seule tâche doit être effectuée par cohorte du fait de l’interférence entre différents tests. Nous avons cependant réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum en calculant le nombre nécessaire par groupe expérimental grâce à une analyse prédictive du nombre d’animaux en réalisant un calcul de puissance. Nos travaux passés nous indiquent aussi que ces études comportementales nécessitent entre 40 et 60 souris par groupe expérimental pour atteindre une puissance statistique satisfaisante. Lorsque cela sera possible, un même groupe d’animaux sera utilisé dans plusieurs tests comportementaux. Ainsi un même groupe d’animaux passera par une séquence de comportements allant du moins stressant au plus stressant : 1- Interaction sociale 2- Anxiété 3- Anhédonie 4- Reconnaissance d’objet
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal. Les souris hébergés individuellement seront également dans des cages avec du nid végétal et un igloo. Les animaux seront suivis 7 jours sur 7 durant l'ensemble de la procédure (acclimatation et manipulation par l’experimentateur puis expériences). Une pesée bi-mensuelle sera effectuée. Un tapis chauffant après la chirurgie stéréotaxique est utilisé. La durée de l’anesthésie est de 60 min. Elles commencent à se réveiller au bout de 60 min et sont réveillées au bout de 90 min. La souris revient à elle peu de temps après la chirurgie. Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement une euthanasie pour éviter toute souffrance. Pour nos chirurgies, nous utilisons : a) analgésiques et lubrifiant (protecteur ophtalmique) pendant la procédure chirurgicale b) anesthésiques pour les procédures qui entrainent de la douleur lors de l’injection stéréotaxique. Pour le prélèvement de sang, la procédure ne dure que quelques econdes et ne nécessite pas d’endormissement. Dans le cas où la souris n’est pas controlable, elle sera anesthésiée. La lancette pour éliminer les problèmes liés à l'utilisation d'un scalpel ou d'une aiguille pour prélever du sang sur la joue au niveau submandibuliare. Elle facilite la procédure de prise de sang et permet d'obtenir des quantités constantes de sang, sans risque de blesser la souris.
Choix des espèces
L’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. L'avantage du modèle murin est qu'il peut être utilisé afin de tirer profit des techniques de transgénèse (souris transgéniques et transgénèse induite par des virus). En effet, l’intérêt croissant pour la souris comme modèle a alimenté le développement de techniques sophistiquées pour l’étude de la fonction des gènes dans le cerveau de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux utilisés seront tous adultes (âge entre 8 et 20 semaines), pour étudier la plasticité neuronale induite par les drogues chez l’adulte.
Exploration, caracterisation et distinction des phenotypes schizophreniques et autistiques dans les modeles murins Scn2a
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Six minutes suspendues par la queue, six minutes de nage forcée, trente minutes dans une arène très éclairée, quatre heures par jour de séparation d'avec leur mère pendant dix jours pour les souriceaux de trois à douze jours. 1 434 souris vont être utilisées, 894 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 540 un niveau léger, toutes tuées à l'issue. Le porteur cherche à déclencher chez elles des états qu'il rapproche de la schizophrénie et de l'autisme, par le bruit, la litière mouillée, la surpopulation, la contention ou des injections quotidiennes, avant de mesurer le toilettage, l'enfouissement de billes et la réaction à un son fort. Il écrit que l'induction d'un stress étant l'objectif, aucun raffinement n'est prévu pour ces procédures.
Objectifs
Nous étudions des pathologies cérébrales associées à des mutations dans les gènes codant pour des canaux ioniques laissant passer le sodium. Nous avons identifié un patient porteur d’une mutation qui présente une schizophrénie à début précoce. La schizophrénie est une maladie psychiatrique chronique grave chez l’humain et caractérisée par l’apparition de symptômes positifs (délires, hallucinations et discours ou comportement désorganisé) avant l’âge de 13 ans ; il est associé à d’autres troubles comportementaux, comme les Troubles du Spectre Autistique et le trouble du déficit de l’attention. Chez les souris modèle de la même mutation que le patient cité ci-dessus, les jeunes souris présentent des déficits de type autistique associés à des altérations des processus émotionnels et cognitifs, tandis que les souris adultes ne présentent qu'un déficit de communication sociale. Les souris mutantes présentent aussi de la schizophrénie qui est apparemment déclenché par un stress. En particulier, ces souris présentent des signes de psychose aiguë après le transport. Pour ce projet, nous souhaitons approfondir la caractérisation comportementale de ce modèle et d’un second modèle de mutation du même canal ionique servant de contrôle, en mettant spécifiquement l'accent sur les caractéristiques schizophréniques. Nous utiliserons des stress chronique ou aigu chez des souris juvéniles pour tenter d'induire la schizophrénie. Nous ferons ensuite une surveillance comportementale hebdomadaire et une validation finale de la schizophrénie à l'âge adulte. Les évaluations comportementales comprendront des tests pertinents pour les troubles du spectre autistique et pour la schizophrénie. L’objectif du projet est de déterminer si la mutation identifiée chez la patiente schizophrène permet d'observer les symptômes décrits chez les patients humains (troubles du spectre autistique et schizophrénie) alors qu'une autre mutation contrôle ne devrait pas déclencher de schizophrénie. Cela permettra de mieux comprendre les mécanismes pathologiques et d'en déduire de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal est de comprendre comment les mutations du même canal ionique contribuent différemment à l’autisme et à la schizophrénie, ce qui fournira des informations précieuses sur les mécanismes distincts et superposés sous-jacents à ces conditions. Ces connaissances pourraient aider à identifier les interactions génétiques (les mutations) et environnementales spécifiques (les procédures de stress utilisées) qui conduisent au développement de ces troubles et à approfondir dans des études futures les mécanismes cellulaires aboutissant à un comportement normal ou anormal. En fin de compte, les connaissances acquises grâce à ce projet pourraient ouvrir la voie au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées pour l’autisme et la schizophrénie. En identifiant et en caractérisant les voies affectées par les mutations, nous pourrions découvrir de nouveaux points d’intervention pour les thérapies pharmacologiques ou comportementales. De telles avancées ont le potentiel d’améliorer les résultats cliniques et la qualité de vie des patients touchés par ces troubles neuropsychiatriques complexes.
Procédures
Tous les animaux subiront une biopsie de la queue (5 s) afin de connaitre leur génotype. La majorité des animaux seront ensuite soumis à une procédure, et les animaux restants seront utilisés comme simple partenaire. Etant l’objectif du projet, dans chacune des procédures les souris seront soumises à une unique forme de stress parmi un des 4 suivants : - Bruit et cage sur un support mouvant pendant 3h sur 3 jours (souris âgées de 25 à 28 jours), - Répétition d’un unique stress léger parmi plusieurs possibles (litière neuve, mouillée, ou absente, cage, inclinée, contention, présence de congénères inconnus, cage surpeuplée) 1h à 4h chaque jour pendant 24 jours (souris âgées de 25 à 49 jours), - Isolement maternel de souriceaux pendant 4 heures par jour pendant 10 jours (souris âgées de 3 à 12 jours), - Injection quotidienne (durée 3 à 5 s) pendant 10 jours (souris âgées de 25 à 35 jours). Puis une évaluation du comportement afin d’évaluer les conséquences du stress et des mutations sera effectuée à partir de l’âge de 70 jours avec une série de tests. Un unique test utilisé par jour parmi les suivants. Les premiers tests permettent d'évaluer les comportements de type schizophrénique : l’exploration d’une arène très éclairée pendant 30 min, une contention dans un tube pendant deux séances d'habituation de 10 min et pendant la durée du test (environ 20 min) qui consiste en une exposition à un bruit fort précédent un autre son standard, une analyse de comportement automatisée ou les souris seront isolées pendant 3 jours dans une cage classique, une unique injection (durée 3 à 5 s) qui déclenche une hyperlocomotion. La seconde série de tests permet d'évaluer le comportement autistique: mesure du toilettage (20 min) et de l'enfouissement de billes (20 min). La dernière série de tests permet d'évaluer de l'anxiété ou de la dépression: une suspension par la queue pendant une 6 minutes, 6 min de nage forcée dans de l'eau, et 5 fois la possibilité de nager pendant 3 minutes.
Impact sur les animaux
L’utilisation de tests comportementaux permettent de révéler des troubles de type autistique caractérisés par des degrés variables de déficits dans l'interaction sociale et la communication, qui peuvent ou non être accompagnés de comportements stéréotypés et d'anomalies sensorielles. Les différentes interventions vont provoquer un stress et nous nous attendons également à observer des caractéristiques schizophréniques pour un des deux modèles de mutation. Pour évaluer ces symptômes, nous effectuerons une série de tests spécifiques ciblant les comportements de type schizophrénique. Tous les animaux subissent une biopsie sur la queue qui peut provoquer des saignements et un stress léger et passager. Les injections quotidiennes sur 10 jours consécutifs peuvent induire un stress léger et passager ainsi que des irritations cutanées., L'hébergement individuel pendant 3 jours pour un des tests comportementaux peut induire un stress léger des animaux.
Devenir
Tous les animaux produits subissent un prélèvement sur la queue, puis la moitié subiront une procédure modérée puis seront mis à mort. Les animaux restant seront mis à mort.
Remplacement
Nous avons réalisé des expériences in vitro et ex vivo sur des cellules exprimant des canaux ioniques porteurs des mutations citées ci-dessus, et identifié des mécanismes associés aux mutations. Les modèles animaux sont essentiels pour ce projet car ils nous permettent d'étudier les interactions génétiques (mutations) et environnementales (différents stress) qui causent l'autisme et la schizophrénie dans un contexte d'organisme entier qui ne peut pas être reproduit in vitro. La caractérisation du comportement de souris porteuses des mêmes mutations est une étape essentielle pour valider in vivo ce mécanisme.
Réduction
Le nombre d’animaux à utiliser a été calculé par une analyse de puissance statistique. Dans toutes les procédures, nous n’utiliserons que les souris mutantes et comparerons les résultats obtenus avec les deux lignées. Les souris non mutées seront utilisées comme souris partenaire. Nous utiliserons les souris mâles et femelles des portées.
Raffinement
Une fois sevrés, les animaux seront élevés dans un environnement enrichi : avec matériau de nidification, buchette en bois et igloo en polycarbonate offrant un abri sombre dans lequel les animaux peuvent se rassembler. Les animaux seront régulièrement manipulés pour réduire le stress dû à la présence d’un humain et une feuille de score sera utilisée pour évaluer les nuisances et apporter les réponses adéquates. Des périodes d’habituation seront réalisées pour diminuer le stress provoqué par les appareils et lors de la séparation maternelle les souriceaux sont maintenus sur une plaque chauffante et couverts par du papier absorbant pour éviter un refroidissement. L'induction d'un stress pendant les différentes procédures étant l'objectif il n'y a pas de raffinement prévu. Utilisation d'une liste de points limites avec des actions précises à mettre en oeuvre.
Choix des espèces
La souris permet un élevage rapide avec une période de gestation de 21 jours et un sevrage également après 21 jours. Sa petite taille permet également d’optimiser le nombre d’animaux dans le volume contraint des animaleries. Plusieurs tests comportementaux sont disponibles pour une caractérisation approfondie du phénotype de type schizophrénique chez les souris. Nous travaillons déja avec les deux lignées de souris que nous avons au laboratoire, par conséquent nous connaissons bien ce modèle. Dans une des procédures, les animaux seront utilisés dès le 3e jour postnatal, car le stress induit consiste a séparer les nouveau-nés de la mère pendant quelques heures. Pour les autres procédures, les souris seront utilisées entre les 25e et 49e jours postnataux, ce qui correspond à l'adolescence chez l'humain. Cette fenêtre d'âge est la plus sensible au développement potentiel de la psychose et est pertinente pour la schizophrénie humaine à début précoce. Les tests comportementaux seront effectués sur les souris à l’âge adulte (à partir du 70e jour postnatal) afin de laisser le temps à un éventuel phénotype de type schizophrénique de se mettre en place.
Effets centraux et périphériques de la cocaïne et de la nicotine dans leur potentialité à provoquer la rechute
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
112 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun commençant par une heure trente de chirurgie pour l'implantation d'un cathéter et d'un émetteur dans une artère. Soixante d'entre eux passent ensuite seize séances d'auto-administration de cocaïne ou de nicotine, quinze séances où l'appui sur le levier ne délivre plus rien, et huit séances de rechute, à raison de deux heures par séance en cage individuelle. Les cinquante-deux autres reçoivent vingt-deux injections, dont la moitié sous anesthésie. Les bénéfices annoncés, de nouvelles voies thérapeutiques contre l'addiction, restent à l'état de perspective, l'objectif immédiat étant de vérifier une hypothèse sur le rôle du rythme cardiaque et de la pression artérielle dans le déclenchement de la rechute.
Objectifs
L’addiction aux drogues est un trouble chronique aux conséquences très préjudiciables. La caractéristique déterminante de l’aspect chronique, quelle que soit la drogue, est la très forte probabilité de rechute dans la consommation même apres de longues périodes d’abstinence. Ainsi une nouvelle consommation après abstinence peut être suffisante pour faire rechuter l’individu et ceci quelquesoit la drogue reconsommée. Cette vulnerabilté permanente à rechuter vient du fait que toutes les drogues agissent sur le même circuit cérébral de la récompense et de la motivation. Néanmoins, à côté de ces effets centraux cérébraux, la drogue produit également des modifications du rythme cardiaque, du péristaltisme intestinal, de la pression artérielle…etc. Notre hypothèse de travail stipule que ces signaux périphériques perceptibles très rapidement par l’individu et spécifiques à chaque drogue (ici cocaïne et nicotine) peuvent participer à précipiter la rechute.Le projet à trois objectifs : L’objectif 1 vise à identifier et dissocier les effets périphériques des substances étudiées en utilisant leurs analogues qui ne passent pas dans le cerveau et en mesurant l’activité du cœur via l’implantation d’un capteur en intra-artériel. Nous comparerons leurs effets avec ceux des drogues elles-mêmes. Nous comparerons un état de conscience anesthésié et un état vigile et nous comparerons mâles et femelles. L’objectif 2 vise à démontrer que la cocaïne et la nicotine induisent la rechute dans la consommation de drogues, mais pas leurs analogues qui ne passent pas dans le cerveau. Pour cela nous utiliserons un modele de rechute chez le rat tres proche de ce qui se passe chez l’Homme. L’objectif 3 vise à relier l’absence de rechute observée avec les analogues qui ne passent pas dans le cerveau avec des mesures du cœur très différentes et spécifiques à chaque substance lors de l’absence de rechute. Au niveau opérationnel ces trois objectifs se déclinent en deux procédures.
Bénéfices attendus
D’un point de vue de santé publique, les résultats de ce projet apporteront des informations essentielles pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques des addictions aux drogues en mettant en évidence le rôle crucial des signaux périphériques de ces drogues dans le risque de rechute. Il sera alors possible de proposer de nouvelles voies thérapeutiques.
Procédures
112 animaux subiront une chirurgie de 1h30 avec implantation d’un cathéter et d’un implant télémétrique. Parmi ces 112 animaux, 52 animaux recevront par l’expérimentateur 11 injections (1/jour/ pendant 3 sec) en état vigile et 11 injections (1/jour/pendant 3 sec) avec 3 injections maximum par semaine en état anesthésié avant d’être euthanasiés. Soixante autres animaux s’auto administreront volontairement (durée de chaque autoadministration est de 3 sec) des drogues (cocaïne pour le groupe Cocaïne et nicotine pour le groupe Nicotine) dans des cages spécifiques en hébergement individuel au cours de 16 séances quotidiennes de 2h par jour, 5 jours sur 7. Ensuite, une procédure d’extinction sera imposée sur 15 séances quotidiennes (2h/ jour sans drogues) dans les mêmes cages, en hebergement individuel à raison de 5 jours sur 7. Chaque animal subira ensuite 8 sessions de rechute en hébergement individuel de 2 heures chacune avec injection soit de cocaïne soit de nicotine soit de leurs analogues respectifs sur une période de 13-14 jours à raison de 5 jours sur 7 et avec une séance extinction entre chaque jour d’injection de drogue. Ils seront ensuite euthanasiés. 112 animaux subiront une chirurgie de 1h30 avec implantation d’un cathéter et d’un implant télémétrique. Parmi ces 112 animaux, 52 animaux recevront par l’expérimentateur 11 injections (1/jour/ 3 secondes) en état vigile et 11 injections (1/jour) avec 3 injections maximum par semaine en état anesthésié avant d’être euthanasiés. Soixante autres animaux s’auto administreront volontairement (durée de l’auto administration est de 3 sec) des drogues (cocaïne pour le groupe Cocaïne et nicotine pour le groupe Nicotine) dans des cages spécifiques au cours de 16 séances quotidiennes de 2h par jour, 5 jours sur 7. Ensuite, une procédure d’extinction sera imposée sur 15 séances quotidiennes (2h/ jour sans drogues) dans les mêmes cages à raison de 5 jours sur 7. Chaque animal subira ensuite 8 sessions de rechute de 2 heures chacune avec injection soit de cocaïne soit de nicotine soit de leurs analogues respectifs sur une période de 13-14 jours à raison de 5 jours sur 7 et avec une séance extinction entre chaque jour d’injection de drogue. Ils seront ensuite euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirurgie longue pouvant induire des douleurs modérées traitées par l’utilisation d’analgésiques. Ils seront ensuite soumis à la possibilité de s’auto-administrer des drogues puis à des sessions d’extinction. Ces sessions où l’animal appuiera sur le levier sans recevoir de drogues peut créer un stress modéré. Enfin la nicotine et la cocaïne peuvent provoqués des effets secondaires sur l’organisme comme des problèmes cardiovasculaires modérés. Lors de ces séances d'autoadministration et d'extinction les animaux sont placés dans des cages spécifiques et en hébergement individuel pendant 2 heures /séances ce qui peut créer un stress modéré. Ils sont ensuite remis en cages collectives jusqu'à la prochaine séance.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour réaliser des prélèvements de cerveau et récupérer le capteur de télémétrie intra-artériel.
Remplacement
Remplacer les animaux dans ces expériences est difficile car ces expériences mettent en jeu des systèmes biologiques complexes et des comportements spécifiques, comme la recherche de drogue et la rechute. Les interactions entre le cerveau, les organes et les signaux corporels ne peuvent pas être reproduites avec des modèles in vitro ou informatiques actuels. De plus, ces études nécessitent d’observer les effets simultanés et globaux des drogues sur l’organisme entier, ce qui est impossible avec des alternatives. Malgré les progrès dans les modèles alternatifs, les animaux restent indispensables pour comprendre ces mécanismes.
Réduction
L’utilisation d’implants télémétriques permet de multiplier les injections de molécules dans des expérimentations de screening de molécules. Cette technique permet de réduire le nombre d’animaux car il n’est plus utile de multiplier celui-ci par le nombre de molécules. de plus les tests statistiques qui seront fait pourront être pairés réduisant la variabilité inter-individuelle et permettant des tests plus puissants avec moins d’individus.
Raffinement
L’utilisation de la télémétrie permet de raffiner les protocoles éthiques en réduisant le stress et les manipulations des animaux, en permettant des mesures non invasives en continue et en augmentant la qualité des données. Non seulement elle évite d’utiliser beaucoup d’animaux comme dit précédemment mais elle évite aussi les procédures répétées invasives. La chirurgie d’implantation télémétrique est faite sous anesthésie et analgésie. Les animaux sont surveillés minimum 2 fois par jour pendant 3 jours post-opératoire puis quotidiennement. Grâce à cette technique, les animaux sont ensuite laissés libres de leurs mouvements dans la cage d’hébergement. Les animaux seront hébergés par deux minimum afin de respecter leur caractère grégaire, dans des cages de taille réglementaire avec un milieu enrichi (tunnel, matériel de nidification). Une feuille de scoring pos-opératoire a été faite : elle comporte des points limites généraux et spécifiques permettant une intervention des expérimentateurs en fonction du niveau de gravité
Choix des espèces
Le rat est le modèle le plus communément utilisé pour les expérimentations d’autoadministration. Les connaissances sur celui-ci sont solides et sa physiologie reste, malgré ses différences, proches de celle de l'humain. Enfin, le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies (pose de capteur télémétrique et cathéter intre-veineux). Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte soit entre 7 et 8 semaines. Ils devront faire 225/250gr afin d’avoir le poids recommandé pour l’implantation des capteurs télémétriques.
Impact de l’exposition de facteurs environnementaux sur le développement et la progression des cancers pédiatriques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
8 314 souris vont être utilisées, dont des souriceaux de cinq à dix jours opérés du cerveau pour y recevoir des cellules tumorales. 7 263 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 008 un niveau sévère, 43 un niveau léger, et toutes sont tuées pour analyse post-mortem. Chaque animal greffé est ensuite imagé une fois par semaine sous anesthésie et exposé, par l'eau de boisson ou la nourriture, à un fongicide, à un insecticide ou à un régime riche en graisses, avec perte d'équilibre, tête penchée et perte de poids attendues. Le porteur décrit ses organoïdes de cervelet issus de cellules souches humaines comme un moyen de remplacer une partie des animaux, avant de conclure que le modèle souris reste "indispensable".
Objectifs
Les cancers sont la seconde cause de mortalité chez les enfants âgés de 1 à 15 ans dans les pays industrialisés. Parmi eux, les cancers cérébraux sont la deuxième cause de cancers pédiatriques et la cause majeure de mortalité liée au cancer. 2500 enfants et adolescents sont diagnostiqués pour un cancer par an en France. Alors que la moyenne du taux de survie est passée à 80% grâce aux avancées scientifiques et médicales, il existe encore une grande différence dans la réponse aux traitements selon les types de cancer. Pour réduire la survenue du cancer chez les enfants et les adolescents, il est important de mieux comprendre les mécanismes associés au développement et à l’initiation des différents cancers pédiatriques. L’objectif principal du projet est de comprendre les causes et l’origine des cancers agressifs intervenant durant l’enfance. Pour y répondre, l’étude se focalisera sur 2 types de cancer pédiatrique : le médulloblastome et le neuroblastome. L’objectif principal du projet est d’identifier le rôle des polluants et d’un régime riche en graisse dans les causes et l’origine des cancers agressifs intervenant durant l’enfance. L’étude permettra de mieux comprendre les conséquences biologiques de l’exposition aux polluants ou régime alimentaire riche en graisse dans le développement tumoral.
Bénéfices attendus
L’étude de l’impact de l’exposition des polluants et d’un régime riche en graisse dans le développement de cancers pédiatriques permettra de mettre en évidence les effets délétères de ces composés sur la santé et de mieux comprendre les mécanismes associés à l’initiation et la croissance tumorale. Les expositions étudiés dans cette étude regroupent plusieurs familles de composés tel qu’un fongicide, un pesticide et un régime riche en graisse ayant un impact sur la survenue de l’obésité. Le pesticide retenu dans notre étude cible le système nerveux des insectes. Il est autorisé et utilisé au quotidien comme un insecticide chimique par vaporisation sur les vêtements et sur les mammifères (sauf le chat) et l’environnement, Cf : Article « Le Monde » publié le 24/04/25 : Pesticides : l’Anses lance une alerte d’ampleur après un examen des effets de produits toujours autorisés L’utilisation du fongicide étudié est autorisée et est inclus dans de nombreux produits phytosanitaires largement utilisés par les agriculteurs européens. Le taux d’enfants (de 6 à 17 ans) en surpoids ne cesse d’augmenter depuis les années 1990, en 2015 il était de 13%, et 4% des enfants étaient touchés par l’obésité. Actuellement, la surcharge pondérale concerne près de la moitié des adultes: la prévalence du surpoids est de 37% chez les hommes et 27% chez les femmes. A long terme, nous pourrions envisager que cette étude puisse avoir un impact majeur sur l’utilisation de ces composés dans l’environnement.
Procédures
Des cellules tumorales seront implantées dans le cerveau d’animaux sous anesthésie (1 fois au cours de l’expérience/ 10 minutes/souris) puis suivi à l’imagerie sous anesthésie (1 fois par semaine/ environ 20 minutes/souris). Les souris seront ensuite traitées via l’eau de boisson ou la nourriture pendant toute la durée de l'expérience.
Impact sur les animaux
Des cellules seront implantées chez des souris Ces souris développeront des nuisances suite à la chirurgie telesl qu’une perte de poids, des douleurs au niveau du site d’injection, d’éventuelles perte d’équilibre. Ces symptômes peuvent durer jusqu’à 4 jours. Ces souris développeront par la suite des tumeurs et recevront des traitements . Suite à la survenue de la tumeur, une perte d’équilibre, tête penchée, une perte de poids peuvent être observée pendant 2 à 3 jours. Les nuisances liés aux éventuels traitements seront celles liées à l’injection en elle-même, (piqûres : douleur légère de courte durée). . Quand le modèle le permettra, les souris seront suivies de manière longitudinale à l’imagerie, pour cela elles devront recevoir une injection (piqûre : douleur légère de courte durée). Suite à la chirurgie, une perte de poids peut être observée jusqu’à environ 4 jours post-greffe . Les nuisances liées au développement spontanément des tumeurs cérébrales chez les animaux génétiquement modifiés similaire à la survenur de tumeurs cérébrales chez les animaux greffées tel qu’une perte d’équilibre, tête penchée, une perte de poids peuvent être observée et duré pendant environ 2 à 3 jours. Les nuisances attendues suite à l’introduction d’un régime riche en graisse chez les souris sont la prise de poids, des difficultés de mobilité éventuellement.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour analyse post-mortem
Remplacement
Concernant l’étude sur le médulloblastome, nous disposons au laboratoire de nombreux modèles : des cellules de cervelet , obtenues à partir de souriceaux âgés de 3 à 8 jours ainsi que des lignées cellulaires sur lesquelles de nombreux résultats prometteurs in vitro ont déjà pu être obtenus. Des expériences préliminaires in vitro sur cellules tumorales sont toujours réalisées en amont de l’approche in vivo chez la souris afin de ne poursuivre qu’avec les axes de recherche les plus solides. Les travaux dans notre laboratoire sur la génération d’organoïdes de cervelet à partir de cellules souches humaines permettent d’augmenter nos approches in vitro et de remplacer une partie des animaux utilisés à des fins expérimentales afin de ne réaliser que les expériences prometteuses in vivo. Cependant, ces modèles in vitro ne récapitulent pas un organisme entier et nous avons donc recours à l’utilisation de modèles animaux pour pouvoir obtenir des résultats fiables prenant en compte toutes les composantes d’un organisme intégré Des études épidémiologiques couplées à des expériences in vitro sur lignées cellulaires ont permis dans un premier temps de sélectionner les polluants à tester dans cette étude. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (cultures in vitro), l’utilisation du modèle souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
1. Pour minimiser le nombre d’animaux tout en cherchant à répondre aux objectifs scientifiques, nous aurons recours à des études longitudinales avec l’utilisation de l’imagerie du petit animal (suivi du même animal au cours du temps). Concernant la partie utilisant des modèles de souris modifiées génétiquement, nous veillons à optimiser les croisements pour la génération des lots selon les génotypes attendus. 2. Pour réduire le nombre d’animaux, les expériences seront faites dans un ordre précis permettant de déterminer la dose optimale pour la suite des expériences et/ou de ne pas réaliser la suite des expériences si les premières ne permettent pas d’observer les effets attendus 3. Pour limiter le nombre d’animaux, nous travaillerons par lot de manière à avoir un nombre suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux par groupe sera de 8 souris quand cela sera possible. Chaque expérience sera répétée 2 fois et une 3ème si nécessaire (= dans le cas où les résultats seront discordants entre les 2 premières expériences réalisées). Les résultats seront analysés avec des tests statistiques.
Raffinement
Une méthode d’anesthésie sera utilisée pour réaliser les gestes techniques invasifs ou douloureux. De plus, des méthodes analgésiques seront appliquées avec l’utilisation d’analgésiants locaux ou généraux pendant l’opération et si besoin post-opératoire. Le réveil de l’animal se fera sous lampe chauffante et sera surveillé par l’expérimentateur. La chirurgie est réalisée par du personnel expérimenté ce qui permet de réduire la durée totale de la chirurgie et donc les effets secondaires potentiels ainsi qu'un meilleur rétablissement post-opératoire. Des méthodes sont mises en place durant la chirurgie pour le bien-être de l’animal avec par exemple l’utilisation d’un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie, l’utilisation de vaseline pour éviter le dessèchement des yeux, et en post-opératoire en favorisant l’accès à la nourriture molle en déposant au fond de la cage des cupules d’aliment gélifié. Nous habituerons les animaux quelques jours avant la chirurgie à se nourrir à base de ces cupules d’aliments gélifiés pour diminuer encore le stress et l’angoisse. Les animaux greffés seront observés régulièrement par l’expérimentateur pour le suivi de la croissance tumorale (par imagerie notamment) et pour vérifier leur état général de santé. Une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Des soins support seront mis en place quand nécessaire. Dès atteinte d’un point-limite, non soulagé par les soins,l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de prédilection pour les expériences menées en recherche en thérapeutique du cancer, en particulier pour sa parenté physiologique avec l’Homme. Ce modèle permet également des expériences de greffes ainsi que l’utilisation de lignées murines génétiquement modifiées permettant une bonne modélisation des cancers humains. Les chirurgies seront réalisées au stade de nouveau-nés autour de 5 à 10 jours après la naissance. Le suivi des animaux se fera tout au long de leur vie. Des adultes seront également utilisés dans le cadre de souris immunodéficiente si l’expérience de chirurgie n’est pas concluante sur les souriceaux. Nous étudierons également l’impact des expositions durant le développement en traitant directement femelle gestante, puis sa descendance. Ceci nous permettra d’avoir une étude complète sur l’effet de ces expositions en fonction de l’âge auquel l’organisme a été exposé. Nous nous intéressons plus particulièrement aux stades correspondant au dernier tiers de gestation et au nouveau-né puisque qui représentent des stades d'intérêt pour les cancers pédiatriques.
Imagerie des agrégats protéiques par IRM-CEST pour les maladies neurodégénératives
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 40
Deux heures d'IRM sous anesthésie, la tête maintenue par des barres d'oreilles : 240 souris et 40 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour confronter les images aux analyses histologiques. Avant cela, chaque animal subit une chirurgie stéréotaxique de 45 minutes pour recevoir dans le cerveau un vecteur viral ou une protéine pathologique, avec douleur et perte de poids possibles pendant un à trois jours. Une lignée de souris présente en outre un risque de crises d'épilepsie vers l'âge de deux mois. Le porteur défend le choix des rongeurs en concédant que ces modèles des maladies d'Alzheimer et de Parkinson sont "imparfaits", tout en les qualifiant d'"indispensables".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer, la maladie de Huntington ou la maladie de Parkinson appartiennent à une classe de maladies neurodégénératives (les protéinopathies) causées par des protéines mal repliées ou mal dégradées qui s’agrègent dans le cerveau. Outre leur perte de fonction initiale due au mauvais repliement, ces protéines solubles acquièrent des fonctions toxiques, notamment en s’agrégeant et se propageant dans le cerveau. De plus, il existe actuellement un débat scientifique sur la nature des agrégats de ces protéines qui présentent des degrés variables de toxicité et des caractéristiques de propagation conduisant à différentes formes de maladies. De plus en plus de personnes âgées souffrent de protéinopathies, et en particulier de la maladie d’Alzheimer et de la maladie de Parkinson. Il est d’un intérêt considérable de pouvoir distinguer les formes solubles et agrégées des protéines impliquées dans les maladies d’Alzheimer et de Parkinson, de quantifier leur agrégation précocement et de surveiller leur propagation de manière non invasive. Cela permettra de mieux comprendre la physiopathologie de ces maladies neurodégénératives en recherche fondamentale et préclinique, et à terme, de disposer d’un outil de diagnostic et de suivi. Une modalité d'IRM relativement récente appelée CEST (Chemical Exchange Saturation Transfer) a été proposée pour imager les protéines avec une excellente résolution spatiale. Elle pourrait notamment permettre de distinguer les protéines solubles des agrégats de protéines. Ainsi, l'objectif principal de notre projet est d'établir un outil de surveillance et de diagnostic des maladies d’Alzheimer et de Parkinson reposant sur l'imagerie non invasive d'agrégats protéiques spécifiques impliqués dans ces maladies neurodégénératives. Notre deuxième objectif est de mieux comprendre les voies pathologiques (agrégation, propagation à travers les structures cérébrales) de chaque type de protéines, et comment celles-ci, selon leurs propres caractéristiques, peuvent provoquer des formes de maladies différentes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de faire de l’IRM-CEST une nouvelle modalité diagnostique pour les maladies neurodégénératives. Cette approche offrirait des avantages significatifs à la recherche fondamentale et préclinique pour une meilleure compréhension des processus pathologiques impliqués dans ces maladies et en fournissant des biomarqueurs pertinents pour l’évaluation des traitements futurs. Elle profiterait également à la recherche clinique, puisque toutes les méthodes développées sont transférables sur des scanners cliniques.
Procédures
- Tous les animaux (280) seront scannés à l’IRM sous anesthésie (durée : 2h00). - L’injection d’un vecteur viral (qui permet d’introduire dans les cellules cérébrales un gène codant pour la protéine pathologique) sous anesthésie profonde (durée de la chirurgie : 45 min) sera réalisée sur 40 animaux et sous conditions stériles. - L’injection de la protéine d’intérêt ou d’un liquide contrôle sous anesthésie profonde (durée de la chirurgie : 45 min) sera réalisée sur 240 animaux et sous conditions stériles. L’analgésie est toujours utilisée avec l’anesthésie lors des chirurgies.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à ce que certaines chirurgies puissent causer de la douleur, du stress ou une perte de poids temporaire. Des effets indésirables (stress ou douleur) peuvent durer pour un temps variable d’une journée à 3 jours après l’opération. Un risque de stress cardio-respiratoire est aussi présent lors de l’anesthésie. Cetrtaines souris peuvent présenter un risque de crise d’épilepsie vers l’âge de 2 mois.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de confronter les mesures in vivo aux résultats histologiques.
Remplacement
Ce projet fait appel à deux modèles de souris de la maladie d'Alzheimer ainsi qu’un modèle rat de la Maladie de Parkinson déjà caractérisés. A l’heure actuelle, ce projet ne peut pas être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être simulé par des techniques informatiques. En effet, les symptômes neurologiques cognitifs de la maladie ne peuvent être répliqués que chez l’animal. Par ailleurs, les régulations hormonales ou les réactions inflammatoires liées aux maladies d’Alzheimer et de Parkinson ne peuvent pas être reproduites dans des modèles cellulaires 2D ou des organoïdes. Enfin, l’étude de la diffusion des protéines Tau dans le cerveau requiert toute la complexité des réseaux neuronaux qui se mettent en place au cours de la maturation et du vieillissement du cerveau. Il est donc nécessaire de réaliser ce projet sur des espèces modèles mammifères comme la souris et le rat, présentant le plus possible de similitudes avec la physiologie humaine, c’est-à-dire possédant un cerveau complexe permettant d’exprimer des comportements sophistiqués.
Réduction
Le nombre maximal d’animaux utilisés pour ce projet (280 animaux dont 240 souris et 40 rats) a été défini au plus juste pour atteindre les objectifs scientifiques et être statistiquement pertinent compte-tenu de nos connaissances au début du projet. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation d’un logiciel in vivo, approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis. Par ailleurs, les techniques de neuro-imagerie développées dans ce projet permettent un suivi des animaux au cours du temps. Ceci permet d’augmenter la puissance statistique et de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre l’objectif scientifique.
Raffinement
- Examens IRM (sous anesthesie) : la douleur liée à l’utilisation de barres d’oreilles pour stabiliser l’animal est minimisée par application locale d'analgesie 5 minutes avant. - Stéréotaxies (sous anesthésie) : Un analgésique est administré 30 min avant la chirurgie ainsi qu’en post-opératoire. Une analgésie locale est mise en place 5 minutes avant l’incision chirurgicale et la douleur liée à l’utilisation de barres d’oreilles pour stabiliser l’animal est minimisée par application locale d'analgésie 5 minutes avant. Les animaux sont thermorégulés durant toute l’anesthésie jusqu’au réveil complet après réversion de l’anesthésie. - Points limites établis pour réduire la souffrance et le stress des animaux. En cas de perte de poids des animaux, une administration d’eau gélifiée enrichie en vitamines et glucose sera mise en place. - Des points limites spécifiques sont également prévus pour couvrir le risque de crise convulsive d'une lignée souris . Une surveillance quotidienne sera également mise en place pour minimiser les risques de crises d’épilepsie non détectées. - Les animaux sont hébergés en groupe, dans environnement à température contrôlée, avec un cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Les animaux sont examinés quotidiennement par les donneurs de soin, sous supervision permanente du vétérinaire du centre, également en charge du bien-être animal. L’environnement est enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire.
Choix des espèces
Les modèles rongeurs sont pertinents car ils peuvent être observés in vivo par des scanners IRM à haute performance et ce, malgré la petite taille de leur cerveau. Par ailleurs, le projet de recherche est basé sur des modèles reconnus de la maladie d’Alzheimer et de la maladie de Parkinson. Bien qu'imparfaits, les modèles rongeurs de ces maladies neurodégénératives permettent d'étudier certains aspects de la pathologie et sont indispensables pour progresser dans la compréhension des mécanismes qui lui sont associés. Les animaux seront adultes afin de se placer dans des conditions expérimentales qui permettent de reproduire l’évolution de la maladie qui touche des adultes.
Implication du microbiote intestinal dans le développement de l’Arthrite Juvénile Idiopathique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Cinq injections intrapéritonéales espacées de deux jours déclenchent chez les souris un emballement du système immunitaire qui provoque une perte de poids caractéristique et une fatigue généralisée. 380 souris vont être utilisées, 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 140 un niveau modéré, toutes tuées puis autopsiées. Une partie, née sans microbiote et maintenue en isolateur stérile, reçoit par gavage orogastrique le microbiote des souris précédentes avant de subir à son tour cinq injections. Le porteur décrit un modèle "pas mortel" et réversible, tout en indiquant qu'il est impossible de soulager ces effets par des antalgiques sans compromettre l'intérêt du modèle animal.
Objectifs
L'objectif du projet est d'étudier l'implication du microbiote dans le développement de l'Athrite Juvenile Idiopathique au travers de la relation hôte-microbiote
Bénéfices attendus
Ce travail doit permettre de mettre en évidence l'implication du microbiote et/ou les groupes bactériens susceptibles d'être impliqués dans le processus d'inflammation chez les personnes souffrant d'Arthrite Juvénile Idiopathique, et ainsi, de mieux comprendre la relation hôte-microbiote dans ce contexte pathologique.
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 types d'interventions au cours de projet : 1) 5 injections tous les 2 jours pour les souris conventionnelles avec soit d'ODN 1826 (nom de l'oligomère qui va entrainer un emballement du système immunitaire et reproduire les conséquences métaboliques que l'on retrouve dans l' Arthrite Juvénile Idiopatique) soit de l'eau stérile. ces injections seront réalisées en moins de 30 secondes en intra-péritonéale, sous contention du manipulateur, permettant ainsi l'induction du syndrome d'activation des macrophages caractéristique de l'Athrite Juvénile Idiopathique. 2) les souris axéniques recevront les microbiotes des lots SHAM (lot ayant reçu l'eau stérile) et ODN (lot ayant reçu l'ODN 1826) par gavages orogastriques. 1 seule intervention, en tout début de procédure et d'une durée inférieure à la minute est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés et enfin 3) Des prelèvements de fecès seront réalisés avant implantation du microbiote, 15 jours après l'implantation, et de façon hebdomadaire pendant la durée du projet, cette intervention peut prendre quelques minutes ne fonction de l'animal mais il n'est tenu que le temps de récupération des fecès, soit une dizaine de seconde. 10 jours avant la fin du projet, 5 injections intrapéritonéales seront réalisées tous les 2 jours, en moins de 30 secondes, avec soit l'oligomère, pour les souris des lots ODNi (fecès ODN+ODN 1826), soit avec le véhicule (eau stérile) pour le lot Shami (fecès eau stérile + ODN 1826), enfin 4) les animaux seront anesthésiés à l'isoflurane pour effectuer le prélèvement d'un maximum de volume sanguin puis seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale., cette intervention est réalisée en 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Ce modèle infectieux de stimulation des TLR-9 mime la "tempête" inflammatoire retrouvée chez les patients souffrants d'AJI qui provoque un déréglement globale du système immunitaire, qui n'est pas mortel et qui est réversible quelques jours après l'arrêt des injections. Toutefois, il provoque chez l'animal une perte de poids caractéristique et une fatigue généralisée, de plus malgré la rapidité de l'intervention (une dizaine de seconde), les souris vont subir la douleur liée à l'introduction de l'aiguille en intrapéritonéale et le stress lié à la contention. En ce concerne le modèle de souris à microbiote contrôlé, les effets décrits ci-dessus seront potentiellement retrouvés chez les animaux recevant les injections d'ODN et potentiellement chez les animaux constituant les autres lots. Les animaux subiront également le stress dû à la contention lors du gavage orogastrique bien que cette manipulation ne dure que quelques secondes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure, puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.
Remplacement
L’étude des mécanismes de l'Arthrite Juvénile Idiopathique (AJI), plus particulièrement l’implication du microbiote intestinal et la relation dans le développement de la pathologie, ne peut être évaluée que sur un organisme vivant, pris dans sa globalité.
Réduction
Pour le respect de la règle des 3Rs, le nombre de chaque groupe d’animaux a été réduit au minimum nécessaire pour discriminer un effet statistiquement significatif entre les traitements. Les résultats obtenus dans les différents lots seront comparés à l’aide d'un test statistique adapté. Les animaux utilisés sont des souris mâles et femelles conventionnelles et axéniques (nées sans microbiote), ces dernières seront, hébergées dans des isolateurs stériles. Un projet pilote de 20 souris (10 femelles et 10 mâles) sera préalablement réalisé pour valider le modèle au sein de notre établissement utilisateur. 3 séries d’expérimentations seront réalisées sur 1) un modèle murin de stimulation de recepteurs,(les TLR-9) qui jouent un rôle très important dans les réponses immunitaires et qui, dans ce cas, permettent de déclencher le syndrome d'activation des macrophages, désordre immunologique caractéristique de l'Athrite Juvénile Idiopathique puis sur 2) un modèle murin axénique de transplantation du microbiote provenant du premier modèle. Chaque expérience sera constituée de 2 lots de 20 souris conventionnelles (10 femelles et 10 mâles pour chaque lot) - un lot de 20 souris (nommé ODN) recevra une injection d'un l'oligonucléotide (l'ODN 1826) qui se fixe sur TLR-9 déclenchant ainsi l'activation des macrophages - un lot de 20 souris (nommé Sham) qui recevra une injection du seul véhicule de l'ODN 1826 (Eau stérile). Le microbiote de chaque lot sera ensuite transplanté dans 4 lots de 20 souris axéniques (10 femelles et 10 mâles) : - un lot de 20 souris qui recevra le microbiote provenant des souris ODN - un lot de 20 souris qui recevra le microbiote provanant des souris Sham - un lot de 20 souris qui recevra le microbiote provenant des souris ODN plus une injection intrapéritonéale de l'oligomère (nommé ODN injec) - un lot de 20 souris qui recevra le microbiote provenant des souris Sham plus une injection intrapéritonéale de l'oligomère ( nommé Sham injec) Ainsi, 380 souris au total seront utilisés pour ce projet, 140 conventionnelles et 240 axéniques.
Raffinement
le modèle de stimulation des TLR-9 est un modèle communément utilisé pour les études concernant le syndrome d'activation des macrophages caractéristique de l'Arthrite Juvénile Idiopathique (AJI), cependant ce sera la première fois qu'il sera mis en place au sein de notre établissement utilisateur, c'est pourquoi nous souhaiterions, au préalable du projet, réaliser une étude pilote sur un effectif de 20 souris conventionelles C57Bl6 (10 femelles et 10 mâles) répartis selon les lots décrits ci dessus. La réalisation de cette expérimentation pilote nous permettra de valider le modèle, de l'induction aux analyses post mortem, dans notre contexte expérimental. Le modèle de souris à microbiote contrôlé est un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif. La souris est en effet reconnue pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote du donneur. La transfection de microbiote est réalisée, sous contention de quelques secondes, par du personnel formé et expérimenté. Ces modèles infectieux provoquent un déréglement globale du système immunitaire, qui n'est pas mortel et qui est réversible quelques jours après l'arrêt des injections. Toutefois, il provoque chez l'animal une perte de poids caractéristique et une fatigue généralisée. Il est cependant impossible de réduire ces effets par l'emploi d'antalgiques sans compromettre l'intêret du modèle animal. Dautre part, lors de l'étape de transfection et comme pour tout projet d'expérimentation réalisé au sein de l'établissement utilisateur, les animaux utilisés feront l’objet d’une surveillance quotidienne sur le temps d'implantation du microbiote (15 jours) pour détecter tout signe d'inconfort, de douleur, de détresse ou d'angoisse pour le réduire, le soulager, le supprimer. Dès l'apparition de ces signes, l'arbre décisionnel joint sera suivi et, à cette étape, l'animal pourra être sorti du projet sans euthanasie pour une phase de récupération sous protocole de soin visé par le vétérinaire.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies sont des souris femelles et mâles C57BL6 âgés de 6 à 7 semaines conventionnelles ou axéniques. Le modèle de stimulation des TLR-9 est un modèle communément utilisé pour les études concernant le syndrome d'activation des macrophages caractéristique de l'Arthrite Juvénile Idiopathique (AJI). Ce modèle infectieux mime la "tempête" inflammatoire retrouvée chez les patients souffrants d'AJI. Le modèle de souris à microbiote contrôlé est communément utilisé pour les études concernant le tube digestif. L'animal est, en effet reconnu, pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote du donneur. Pour le modèle de stimulation des TLR-9, les souris seront âgés de 8 semaines au moment de l'injection de l'ODN1826. Pour le modèle de transfection fécale chez la souris axénique, les animaux seront âgés de 8 semaines. Pour les 2 modèles, ce stade de développement, jeune adulte, est optimal pour permettre une bonne reproductibilité de l'induction du syndrome d'activation des macropahges et bonne implantation des microbiotes transplantés.
Etude des effets des ultrasons sur l’inflammation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une session d'ultrasons de trente secondes à une minute, précédée d'une injection de microbulles de gaz par un cathéter, puis trente minutes d'imagerie sous anesthésie, 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet existe parce qu'une étude précédente de la même équipe a laissé la moitié des animaux léthargiques après la séance d'ultrasons, des hémorragies cérébrales étant retrouvées chez 80 % de ceux qui ont ensuite été tués et examinés. Le porteur maintient que la technique est "prometteuse" et déjà en voie d'utilisation chez l'être humain, tout en cherchant à caractériser la neuroinflammation qu'elle provoque. Toutes les souris sont tuées pour des analyses complétant l'imagerie.
Objectifs
Le traitement des pathologies neurologiques, en particulier des maladies neurodégénératives, est limité par la présence de la barrière cérébrale qui complique le passage de molécules thérapeutiques au niveau du cerveau. Pour pallier cela, l’utilisation de la technique des ultrasons thérapeutiques semble une approche prometteuse. Cependant, lors d’une de nos précédentes études combinant l’utilisation des ultrasons, des microbulles et d’un composé thérapeutique, nous avons constaté un état léthargique chez environ 50% des animaux dans les heures suivant la session d’ultrasons. Après euthanasie de ces animaux, nous avons constaté, chez 80% des animaux, l’apparition d’hémorrhagie cérébrale. L’objectif de cette étude est donc de s’intéresser aux effets de ce schéma thérapeutique sur le cerveau et notamment sur l’inflammation. En effet, une augmentation locale de l’inflammation cérébrale suite à l’application des ultrasons associés aux microbulles est reportée dans la littérature. Nous souhaitons donc expliquer les effets des US après une ou deux sessions d’ultrasons grâce à l’imagerie basée sur la radioactivité et à l’analyse des molécules impliquées dans l’inflammation.
Bénéfices attendus
Ce projet va apporter des informations sur les effets des ultrasons cérébraux aigus et subaigus, notamment sur la neuroinflammation. En effet, l’utilisation des ultrasons pour perméabiliser la protection cérébrale est en voie d’utilisation chez l’homme et nous souhaitons caractériser la neuroinflammation induite. Cette étude vise à développer des nouveaux traitements dans les maladies neurologiques chez l'Homme
Procédures
Les animaux auront une session d’ultrasons d’une durée de trois minutes : pose de cathéter (1 minute) puis injection de microbulles de gaz (1 minute) et une séquence d’ultrasons (30 secondes à 1 minute, le tout sous anesthésie gazeuse. Ce groupe aura également une session d’imagerie TEP d’une durée de 30 minutes : pose de cathéter (1 minute) puis injection du radiotraceur (1 minute) et une séquence d’ultrasons (30 secondes à 1 minute, le tout sous anesthésie gazeuse. Ces animaux seront maintenus en contention lors du prélèvement sanguin en sous-mandibulaire (1 minute).
Impact sur les animaux
Injection des différentes molécules : un hématome au niveau de la queue à la pose ou au retrait de l’aiguille peut être ressenti. Session d’ultrasons : les souris ayant reçu les ultrasons peuvent présenter des difficultés à récupérer dans les heures suivant la session d’ultrasons. L’apparition d’hémorragies cérébrales est également possible du fait de la ou des sessions d’US.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des études ex vivo complémentaires aux études d’imagerie.
Remplacement
Seules des études chez l’animal vivant peuvent reproduire la complexité de l’ensemble des processus physiopathologiques dans leur intégralité. De plus, il est important de noter que la méthode d’imagerie utilisée basée sur la radioactivité est intégralement transférable à la clinique. A l’heure actuelle il n’existe de méthode alternative permettant d’étudiant les conséquences de l’ouverture de la barrière de protection sur le tissu cérébral.
Réduction
L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo permet de réduire le nombre d’animaux utilisé (-25%) par le biais du suivi longitudinal. Le nombre total d’animaux est néanmoins dicté par les groupes expérimentaux requis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. Ces groupes seront composés de 50% de mâles et 50% de femelles. Nous prévoyons ainsi d’inclure un effectif de 20 animaux/groupe (afin d’assurer un minimum de 8 animaux à exploiter par sexe, par exemple en cas d’échec de l’injection du traceur), nombre qui a été suffisant lors d’études précédentes dans ce modèle. Des analyses statistiques seront réalisées dans ce projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les animaux seront observés quotidiennement. En cas de blessures, la plaie sera nettoyée et désinfectée jusqu’à la cicatrisation complète. Une protection oculaire sera appliquée. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations sur tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés. Dès son réveil, l’animal sera remis dans sa cage d’hébergement. Le protocole expérimental sera mené avec une attention particulière portée au bien-être animal, notamment grâce à l'application de points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
Les modèles murins sont des modèles d'expérimentation animale de choix pour l’étude du système nerveux en condition normale et pathologique, la souris partage environ 99% de ses gènes avec l'homme. La taille du cerveau de la souris est compatible avec la résolution spatiale de la caméra utilisée en imagerie reposant sur la radioactivité. Adulte (6 mois) car les traitements US en clinique, notamment pour les maladies neurologiques, ne concernent que des sujets adultes. Les groupes d’animaux seront composés à 50% de mâles et 50% de femelles afin d’éviter les biais dus au sexe.
Evaluation d’une nouvelle génération de microbulles pour la délivrance de médicaments dans le cerveau de rat par sonoporation.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
96 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, chaque animal étant tué avant tout réveil. Chacun reçoit cinq injections, dont celles de microbulles de gaz et d'un colorant, avant une exposition du cerveau aux ultrasons de trente secondes, et il est tué une heure plus tard pour mesurer la quantité de colorant passée dans le tissu cérébral et l'étendue des microhémorragies. Le projet compare quatre solutions de bulles de taille unique, l'application aux tumeurs cérébrales et aux maladies neurodégénératives restant une perspective. Le porteur décrit des mesures acoustiques et un modèle cérébral en trois dimensions déjà réalisés, et affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité du système cérébrovasculaire.
Objectifs
A ce jour, la délivrance de médicament dans le cerveau par ultrasons exploite principalement des solutions de bulles de gaz de taille très hétérogène. Lorsque nous appliquons une séquence ultrasonore donnée sur une telle population de bulles, nous constatons que nous activons seulement une fraction de ces bulles, limitant ainsi l’efficacité de la délivrance intracérébrale de médicaments par ultrasons. De plus, leur utilisation ne nous permet clairement pas de distinguer les deux principaux régimes ultrasonores responsable de la perméabilisation des tissus, à savoir celui qui est considérée comme le plus sûre pour les tissus et le régime, qui endommagerait les tissus. Dans ce contexte, nous proposons d’exploiter des bulles de taille unique. En effet, nos données préliminaires in-vitro ont montré qu’utiliser de telles bulles permet de solliciter l’ensemble de la population de bulles et de mieux contrôler les deux régimes ultrasonores précédemment cités. Ce projet vise à : Objectif 1 - Évaluer 4 solutions de bulles de taille unique à perméabiliser efficicament le tissu cérébral, en mesurant l’accumulation d’un colorant par histologie, et sans induire des dommages tissulaires (microhémorragies tissulaires), qui seront analysés en histologie, 1 heure après traitement. Objectif 2 - Comparer cette efficacité et cette inocuité à celle d’une solution de bulles de taille très hétérogène.
Bénéfices attendus
Les ultrasons ont émergé comme une stratégie prometteuse de délivrance intracérébrale de médicaments. Cependant, l’utilisation de bulles de gaz de différentes tailles ne permet pas de toutes les activer dans un régime ultrasonore pour assurer une délivrance sûre et efficace de médicaments par ultrasons. L’exploitation de bulles de taille unique pourrait ainsi permettre de contourner les limitations des bulles de différentes tailles et de développer ainsi des protocoles de délivrance sûre et efficace de médicaments dans le cerveau par ultrasons pour le traitement de tumeurs cérébrales et de maladies neuropsychiatriques, neurodégénératives et neurologiques.
Procédures
• Injection de la solution anesthésique, de la solution analgésique, du liquide physiologique, de bulles de gaz, de colorant – 5 injections - 2 min • Exposition du cerveau aux ultrasons – 30 s
Impact sur les animaux
Nuisance 1 – Manipulation des animaux est une source de stress. Nuisance 2 – Positionnement des animaux dans le cadre d'expérimentation est une source de stress. Nuisance 3 – Le point d’injection de la solution d’anesthésie est susceptible d'être douloureuse. Nuisance 4 – Le point d’injection du liquide physiologique, de bulles de gaz et du colorant est susceptible d'être douloureuse. Nuisance 5 – Perméabilisation du tissu cérébral est une source de stress. Nuisance 6 – Le point d’injection de la solution d’analgésie est susceptible d'être douloureuse.
Devenir
A l’issu de la procédure, les animaux seront mis à mort 1h post-injection de la solution de colorant afin de quantifier le colorant dans le tissu cérébral et de mesurer la présence de dommages tissulaires.
Remplacement
Dans une première approche expérimentale, nous avons caractérisé et comparé des solutions de bulles de gaz de taille unique et de taille hétérogène sur des bancs de mesures acoustiques. Nous avons ensuite validé leurs propriétés à perméabiliser le tissu cérébral sur un modèle 3D in-vitro. Ces deux approches ont permis de réduire le nombre de paramètres acoustiques et la concentration et la taille de bulles. Dans la continuité de ce projet, nous souhaitons évaluer la perméabilisation du tissu cérébrale par ultrasons en exploitant des bulles de taille unique in-vivo. Par conséquent, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d’étude in-vitro ou in-silico car à ce jour, aucun modèle d’étude in-vitro ou in-silico ne peut reproduire la complexité d’un système cérébrovasculaire in-vivo.
Réduction
Sur la base de nos études antérieures, cette étude nécessite 96 rats. Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer l’efficacité de la délivrance intracérébrale de colorant et l’innocuité de la procédure. Par rapport au groupe contrôle, il sera considéré comme significatif : 1) Une augmentation de 20% de la quantité de colorant dans le tissu cérébral et 2) Une augmentation de 10% de la quantité de dommages tissulaires (microhémorragies cérébrales).
Raffinement
Le stress des animaux est minimisé par l’implication d’un personnel qualifié pour l’expérimentation animale. Lors de la semaine d’acclimatation, l’habituation à la préhension/contention en renforçant nos actes sera réalisée par l’administration de friandises. Ils seront hébergés en groupe (2/cage) avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant). Les animaux seront observés une fois pour jour. Toutes les stratégies d’analgésie, d’anesthésie et de soins seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. Après une semaine d’acclimatation, les rats seront anesthésiés par une injection d’une solution d’anesthésie et placés dans une boîte pendant 5 min. Dès que les rats auront des signes d’endormissement, ils seront sortis de la boîte et placés sur une couverture chauffante dans un cadre d'expérimentation. Une protection occulaire sera appliquée. La respiration (capteur électronique), la température (sonde endorectale) et le poids (balance) seront mesurés pendant les procédures. Sous anesthésie générale, les animaux seront mis à mort par injection d’un agent euthanasiant vétérinaire.
Choix des espèces
Dans la littérature et dans notre laboraoire, les rats âgés de 6 semaines, physiologiquement mâture sont couramment utilisés pour le développement de protocole de délivrance intracérébrale de médicaments par ultrasons en raison de l’existence de modèles rongeurs de cancers cérébraux, de maladies neuropsychiatriques, neurodégénératives et neurologiques.
Étude du rôle du système neurovasculaire méningé sur la clairance cérébrale dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 310 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement des tissus, dont 810 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Selon les lots, elles subissent une chirurgie du cou pour boucher des veines, une ou deux injections dans une zone précise du cerveau, et jusqu'à trois heures d'anesthésie par intervention, avec des risques de lésions de la cornée et de chute de température. Le porteur compte dans cet effectif les souris consacrées à l'entraînement des opérateurs. Il affirme que les organoïdes ne reproduisent ni la régulation du flux veino-lymphatique ni les réponses physiologiques globales, et conclut que le recours à l'animal est "indispensable".
Objectifs
Des vaisseaux lymphatiques ont récemment été identifiés dans l’enveloppe la plus externe du cerveau, appelée dure-mère. Ils sont aujourd’hui considérés comme jouant un rôle important dans certaines maladies neurologiques. Situés en dehors du tissu cérébral, ces vaisseaux suivent le trajet de certains vaisseaux sanguins dans cette enveloppe. Des études ont montré que la circulation sanguine dans le cerveau peut influencer leur bon fonctionnement ainsi que l’élimination des liquides présents autour du cerveau. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de ces vaisseaux lymphatiques et de la circulation sanguine dans l’élimination de certaines substances produites par le cerveau, dont l’accumulation est impliquée dans plusieurs maladies dégénératives. Pour cela, deux approches seront mises en œuvre chez la souris : -Une première approche consistera à modifier l’activité des vaisseaux lymphatiques en injectant une substance dans le liquide entourant le cerveau. -La seconde approche visera à réduire le flux sanguin du cerveau en occluant certains vaisseaux veineux du cou. Ces modèles permettront d’étudier l’élimination des déchets cérébraux en utilisant des traceurs injectés soit dans le liquide qui entoure le cerveau soit directement dans le cerveau. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans ce système d’élimination et leur lien possible avec les maladies neurologiques.
Bénéfices attendus
Le drainage des fluides cérébraux joue un rôle essentiel dans le bon fonctionnement du cerveau, en permettant l’élimination de substances qui, si elles s’accumulent, peuvent devenir nocives. Ce processus contribue notamment à limiter l’apparition de certaines maladies liées au vieillissement. Des structures situées autour du cerveau, comme certains vaisseaux sanguins et lymphatiques, participent activement à ce mécanisme de nettoyage. Bien que leur implication ait déjà été mise en évidence, les interactions précises entre ces systèmes restent encore mal comprises. En étudiant plus en détail leur rôle, ce projet vise à mieux comprendre les processus d’élimination cérébrale et à explorer de nouvelles pistes pour améliorer ce mécanisme. À terme, cela pourrait ouvrir la voie à des approches innovantes pour retarder ou limiter le développement de certaines pathologies neurologiques.
Procédures
Un premier lot d’animaux aura une chirurgie au niveau du cou sous anesthésie générale, avec une analgésie adaptée (une fois, 1h d’anesthésie maximum) puis recevront ensuite une injection au niveau d’une zone spécifique du cerveau (une fois, 3h d’anesthésie maximum). Un deuxième lot aura une injection au niveau d’une zone spécifique du cerveau sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1h30 d’anesthésie maximum). Un troisième lot aura deux injections avec un intervalle de 4 semaines, au niveau d’une zone spécifique du cerveau sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1h30 ou 3 heures d’anesthésie maximum par intervention). Un quatrième lot aura deux injections avec un intervalle de 16 jours au niveau d’une zone spécifique du cerveau sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1h30 d’anesthésie maximum, réalisée 2 fois), et dans l’intervalle une chirurgie au niveau du cou sous anesthésie générale, avec une analgésie adaptée (une fois, 1h d’anesthésie maximum).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une ou plusieurs interventions chirurgicales au niveau du cou ou du cerveau qui peuvent entraîner un inconfort ou des douleurs temporaires chez les animaux, notamment dans les deux jours suivant l’opération. Des signes comportementaux inhabituels tels que l’agitation, la prostration ou une mobilité réduite peuvent être observés à court terme. Il est également possible d’observer des effets secondaires oculaires : gêne oculaire, lésions de la cornée. Enfin, il existe des risques liés à l’anesthésie générale tels que la baisse de température corporelle, sécheresse oculaire ou rares réactions cardio-respiratoires.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus d’intérêt pour nos analyses pour répondre à notre objectif scientifique.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucune méthode alternative aux modèles animaux permettant d'atteindre les objectifs de ce projet. L’étude des mécanismes physiopathologiques, en particulier les interactions biologiques entre le système neurovasculaire et le drainage des fluides cérébraux, nécessite un modèle vivant pour reproduire de manière réaliste ces processus complexes. La circulation active des fluides cérébraux, ainsi que les dynamiques fonctionnelles du système neurovasculaire, sont des éléments essentiels qui ne peuvent être correctement modélisés par des organoïdes ou des systèmes in vitro. Les organoïdes, bien qu’utiles dans certains contextes, ne permettent ni la reproduction des mécanismes de régulation dynamique du flux veino-lymphatique, ni l’étude des réponses physiologiques globales à une altération fonctionnelle. Par conséquent, le recours à des modèles animaux est indispensable pour analyser les réactions physiologiques complexes, comprendre les mécanismes sous-jacents à l’atteinte de certaines fonctions, et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Réduction
Pour répondre aux exigences du plan expérimental, un total de 1310 souris sera nécessaire. Ce nombre prend en compte plusieurs facteurs, notamment les différentes procédures à réaliser, les analyses post-mortem, les risques de perte liés aux chirurgies, ainsi que les souris requises pour l'entraînement et la formation des opérateurs afin de garantir des interventions standardisées et maîtrisées. Un calcul de puissance statistique rigoureux a été effectué pour déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaires par groupe, en tenant compte des variations expérimentales attendues et des hypothèses formulées. Ce calcul vise à minimiser autant que possible le nombre d’animaux tout en assurant la robustesse et la fiabilité des résultats obtenus. Ainsi a été défini qu’un nombre minimal de 10 à 15 souris par groupe serait nécessaire pour chaque condition ou type d’analyse. Par ailleurs, ce nombre pourra être ajusté en fonction des résultats intermédiaires obtenus au cours de l’étude. Ces analyses intermédiaires permettront d’évaluer la nécessité de poursuivre certains volets expérimentaux ou, au contraire, de réduire le nombre d’animaux requis, en optimisant les procédures en fonction des données déjà collectées. Pour l’analyse des données, nous utiliserons des tests diagnostiques adaptés aux caractéristiques des échantillons et à leur distribution statistique, afin d’assurer une interprétation précise et rigoureuse des résultats. Cette approche garantit une utilisation raisonnée et éthique des modèles animaux tout en maximisant la qualité scientifique des conclusions.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine. Ils seront hébergés dans une animalerie agréée, en groupe et avec un accès à un enrichissement de leur environnement (matériaux de nidification et bâtonnets de bois à ronger). Les paramètres environnementaux, tels que la lumière, la température et l’hygrométrie seront contrôlés quotidiennement. Ils auront un accès permanent à de la nourriture et à de l’eau à volonté. Ils seront observés quotidiennement et toute anomalie sera consignée et transmise à l’équipe de recherche, au vétérinaire et à la structure chargée du bien-être animal pour la mise en place d’une prise en charge adaptée. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Nous maintiendrons la température des animaux tout au long de leur anesthésie et appliquerons un gel de protection oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire. Une injection de sérum physiologique sera également réalisée pour maintenir une bonne hydratation de l’animal. Nous assurerons une surveillance renforcée dans la période post-opératoire ou après les prélèvements sanguins afin de nous assurer de la bonne récupération des animaux. En post-opératoire nous utiliserons un cahier opératoire qui sera rempli le jour de l’intervention, consignant les observations per-opératoires et post-opératoires immédiates, ainsi que les suivis à un, deux et huit jours après la chirurgie. Nous utiliserons également une grille de surveillance pour évaluer la douleur et détecter toute atteinte de points limites. Ce suivi permettra de détecter tout signe de stress ou de douleur
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les systèmes veineux et lymphatiques participent au nettoyage naturel du cerveau, en éliminant certains composés qui peuvent s’y accumuler. Pour cela, un modèle animal est nécessaire. Des souris seront utilisées, car ce modèle est bien adapté à ce type de recherche : les techniques chirurgicales permettant de manipuler le système vasculaire cérébral y sont maîtrisées. L’utilisation combinée de modèles chirurgicaux permettra d’analyser de manière complémentaire le rôle de ces systèmes dans le fonctionnement cérébral. Les procédures expérimentales seront menées sur des souris adultes âgées de 2 mois à 1 an, une période durant laquelle la croissance de la boîte crânienne est achevée, permettant une précision optimale lors des interventions, et où la taille corporelle favorise de bonnes conditions opératoires. Cet âge garantit également que certaines structures impliquées dans la circulation des fluides cérébraux sont encore pleinement fonctionnelles. Tous les animaux seront identifiés par tatouage (au niveau des phalanges) dès leur arrivée au laboratoire, à un âge minimal de 6 semaines.
Effet de deux mutations dans un gène impliqué dans le développement cérébral chez la souris EU1/2 MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des femelles gestantes sont opérées sous anesthésie pendant une trentaine de minutes pour une électroporation in utero qui modifie le cerveau des embryons qu'elles portent. 288 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées, les souriceaux pour prélèvement de tissus, les femelles opérées parce que le porteur écarte une seconde intervention "pour raison éthique", les reproducteurs âgés faute de possibilité de replacement. Deux mutations d'un gène du développement cérébral produisent chez ces souris des défauts de comportement social que le porteur rapproche des troubles du spectre autistique. Il indique que les tests de comportement social sont bien établis dans cette espèce, sans nommer un seul de ceux qu'il emploiera.
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’un gène comme relai intracellulaire pour les signaux émis par les cellules du cerveau au cours de la formation des réseaux de neurones du cortex cérébral. Les connaissances antérieures ont démontré l’importance de ce gène pour le développement cérébral. Des domaines de régulation de ce gène ont été identifiés dans des lignées de cellules, et ont conduit à l’identification de deux mutations qui perturbent la régulation du gène d’intérêt. Lorsque ces mutations sont introduites chez la souris, elles entrainent des défauts du comportement social rappelant les troubles du spectre autistique. Ce projet a pour objectif d’identifier les défauts de connectivité qui expliquent les défauts de comportement, lors de la mutation de ce gène, chez la souris. Le projet nécessite une prolongation dans son exécution sans ajout d’animaux et un changement des deux Etablissements Utilisateurs (MODIFICATION).
Bénéfices attendus
Ce projet répond à une problématique fondamentale qui permettra de mieux comprendre comment se forment les réseaux neuronaux dans le développement normal du cerveau. A terme cette étude permettra de mieux comprendre les causes de troubles du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie (1 injection avant l’opération, et jusqu’à 2 injections après opération), appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Pendant cette procédure, le temps total de l’anesthésie est estimé à 5 minutes.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée des animaux et leur contention peut entraîner un stress modéré qui néanmoins s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. Suite aux accouplements, il est observé chez la majorité des mâles un comportement de bagarre nécessitant leur hébergement en cage individuelle. Certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies développementales. Des animaux subissent une procédure chirurgicale sous anesthésie, pouvant entrainer du stress et de la douleur pendant la phase de réveil et la phase post-opératoire, malgré l’utilisation d’antalgiques.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement. Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique et seront donc mises à mort en fin de procédure. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements postmortem.
Remplacement
Les études préliminaires à ce projet ont été conduites in vitro, ce qui permet de ne tester chez l’animal que les approches qui ont montré un potentiel résultat . Il est à présent nécessaire d’observer le développement cérébral in vivo pour aller plus loin dans l'analyse des conséquences de la mutation du gène d'intérêt et le lien avec les perturbations du comportement social retrouvées chez les animaux mutants. Ces projections dépendent de l’architecture cérébrale et des interactions cellule-cellule, qui sont reproduites de façon imparfaite in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base d'expériences similaires pour tenir compte d'aléas non contrôlables tels que la variabilité entre les expériences, ou le génotype des portées. Certains animaux devront être exclus de l’analyse a posteriori pour des raisons techniques, ce qui est compris dans le calcul du nombre d'animaux. Les groupes expérimentaux seront faits séquentiellement, afin de pouvoir arrêter l'étude en cours si le résultat est négatif. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Ceci permettra de détecter dès la naissance un éventuel problème expérimental (échec de l’électroporation) et de ne continuer inutilement la procédure sur un animal qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude.
Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. L’enrichissement sera contrôlé et strictement identique entre tous les animaux (nidation, cache, objet en boit pour jouer/mâcher…). Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort. Afin de prévenir toute souffrance inutile, des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures réalisées ont été définis. Un arbre décisionnel, à la disposition des expérimentateurs et des zootechniciens, permettra le cas échéant de décider de l’arrêt des souffrances au moyen de critères prédéfinis, sous le contrôle de la SBEA de l’établissement. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, nous utilisons dans l’équipe des outils d’imagerie et d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information. Ce projet se déroule sur deux établissements utilisateurs. Le transport des animaux est rapide et sera réalisé dans des conditions minimisant le stress lié au transport et à l'arrivée dans un nouvel environnement.
Choix des espèces
Le choix d'un modèle rongeur (souris) est justifié par le fait que la souris a un cerveau dont la structure est proche du cerveau humain. Le développement embryonnaire est rapide et le développement postnatal est court, ce qui permet d''obtenir rapidement les résultats de l'étude. Enfin, les tests de comportement social pertinents pour l'étude des troubles autistiques sont bien établis chez la souris, ce qui nous assure que le projet permettra de répondre à la problématique scientifique de ce projet et de projets ultérieurs. Les reproducteurs (mâles et femelles) seront des adultes entre 8 et 30 semaines, au pic de leur fertilité. Les souriceaux seront utilisés soit au moment du sevrage (J21), correspondant à l’âge où la connectivité corticale est établie, pour déterminer un effet sur la formation des projections axonales, soit à J90, âge où les connexions sont matures, pour déterminer un effet des mutations de LKB1 sur la sélection des contacts synaptiques liés à la plasticité cérébrale. Cet âge correspond également à l’âge où nous observons des anomalies du comportement social.
Role de l’acétylcholine sur l’attention
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
268 rats vont être utilisés et tués, dont 40 opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil pour enregistrer l'activité de leurs neurones. 180 subissent une chirurgie intracérébrale d'une heure, avec un stress au réveil, une perte de poids et des douleurs les premiers jours, et 48 réalisent chaque jour pendant soixante et onze jours un test d'attention d'une heure, sous restriction alimentaire pendant toute cette période. Le projet vise à comprendre comment l'acétylcholine agit sur la concentration dans le cortex frontal, avec l'idée lointaine de mieux traiter les troubles de l'attention. Tous finissent par une chirurgie terminale, leur cerveau étant récupéré pour analyse.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet est de mieux comprendre comment une substance dans le cerveau, appelée l’acétylcholine participe à la concentration. Elle agit surtout dans une partie du cerveau appelée le cortex frontal, qui est important pour l’attention. Contrairement à ce que l'on pensait, ses projections vers le cortex frontal ne sont pas diffuses, mais bien organisées en sous-régions. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment ces différentes voies agissent et influencent l’attention, notamment en mesurant l’activité des neurones qui libèrent de l’acétylcholine. Une partie de l’étude se concentre sur l’établissement des conditions nécessaires pour tester l’attention de manière expérimentale chez des rats, avant de pouvoir manipuler ces voies pour étudier leurs effets dans des situations attentionnelles spécifiques.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice de ce projet est qu'il pourrait améliorer la compréhension de la manière dont certaines zones du cerveau, en particulier celles liées à l’attention, fonctionnent et interagissent entre elles. La compréhension de chaque région spécifique du cerveau contribuant à l’attention pourrait ainsi ouvrir la voie à de meilleures stratégies pour traiter des troubles attentionnels ou des problèmes liés à l’attention dans des pathologies psychiatriques.
Procédures
48 animaux vigiles réaliseront 1 test comportemental : d’une durée de 1heure tous les jours pendant maximum 71 jours. 180 animaux anesthésiés auront une chirurgie intracérébrale d'une durée d'1 heure. 40 animaux anesthésiés 1 chirurgie sans réveil pour l’enregistrement des neurones. 268 animaux auront une chirurgie terminale.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux peuvent induire un léger stress transitoire dû à l'isolement de l'animal au cours de la réalisation du test. La chirurgie peut induire un stress au réveil des animaux ainsi qu'une légère perte de poids et des douleurs/un inconfort au cours de premiers jours suivant l'acte chirurgical. Lors du suivi post chirurgical, l’animal peut ressentir un inconfort lors de l’injection d’analgésique en sous cutané. La restriction alimentaire durant 71 jours lors du test peut induire un stress.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort en fin afin de récupérer les cerveaux pour analyse.
Remplacement
Les approches de modélisations informatiques ou basées sur des cultures cellulaires sont impossibles à mettre en place dans ce projet puisque nous nous intéressons aux modifications de réseaux neuronaux et aux comportements associés.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental a été calculé à l'aide d'un test statistique qui tient compte de la variabilité du vivant et permet d'obtenir des résultats robustes. La standardisation des conditions expérimentales et la maitrise des facteurs environnementaux décrits dans le paragraphe raffinement contribuent à limiter la variabilité.
Raffinement
Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet. Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec surveillance de la température corporelle, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivi au lendemain de la chirurgie soit 48heures de couverture antalgique. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances sont définis. Les animaux sont hébergés deux par cage avec eau et nourriture ad libitum. Un enrichissement avec des bâtons de bois est mis dans les cages d'hébergement permettant aux rats d'assouvir leur besoin de ronger. Les animaux sont manipulés au minimum de façon hebdomadaire tout au long du projet permettant une habituation à un binôme d’expérimentateurs, qui reste le même tout au long de l’étude.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée est le rat. La lignée de rat a été choisie en raison des données déjà disponibles pour les tâches attentionnelles. De plus, ces rats viennent de croisements entre différentes familles, ce qui réduit la consanguinité (ils ne sont pas tous très proches génétiquement). Cela permet de maintenir une diversité génétique, offrant ainsi un meilleur reflet de la variabilité observée chez l’Homme. Les animaux utilisés seront des animaux adultes (7 semaines) puisque nous avons besoin d'avoir des circuits et systèmes neuronaux entièrement développés.
Prélèvement de tissu pour la caractérisation d’animaux génétiquement altérés utilisés pour la caractérisation du rôle des phospholipases A2 sécrétées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Deux millimètres de queue coupés en dix secondes sur des souriceaux vigiles, sans anesthésie : 300 souris subissent ce prélèvement dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Celles dont le génotype ne correspond pas à celui recherché sont tuées, les autres partant vers un projet autorisé ou vers le maintien de la lignée, quand elles ne sont pas tuées elles aussi. Le porteur écrit que les méthodes non invasives testées n'ont pas donné de résultats exploitables et qualifie ce projet de "nécessaire". Aucune connaissance n'est produite ici, le prélèvement sert à trier un élevage et à fournir aux laboratoires des lots d'animaux homogènes.
Objectifs
Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale. Dans le cadre de certains projets scientifiques, des lignées d’animaux sont développées et élevées. Pour maintenir ces lignées et fournir des animaux adaptés à ces projets, il est donc important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer des lots expérimentaux homogènes et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. Il n’est cependant pas toujours possible de réaliser des prélèvements de tissus selon des méthodes non invasives. L’objectif de ce projet est de présenter la méthode de prélèvement utilisée par notre équipe pour caractériser les souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre une sélection des animaux d’intérêt et ainsi une optimisation de la gestion et de l’élevage des modèles animaux génétiquement modifiés qui seront mis à disposition des utilisateurs pour les projets scientifiques autorisés.
Procédures
Prélèvement unique de 2mm de l’extrémité de la queue sur animaux vigiles sous contention - Durée: 10 secondes par animal
Impact sur les animaux
Les nuisances engendrées sont le stress inhérent à la préhension et à la contention des animaux et la douleur lors du prélèvement du tissu.
Devenir
Les animaux au génotype non recherché seront mis à mort. Les animaux au génotype recherché seront : a/ Utilisés dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé ; b/ Utilisés pour le maintien de la lignée ; c/ Mis à mort avec ou sans prélèvements post mortem.
Remplacement
A ce jour, les techniques de prélèvements de tissus non invasives que nous avons testées n'ont pas donné de résultats exploitables. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés utilisés dans le cadre d’une utilisation dans les projets scientifiques autorisés.
Réduction
L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consiste à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au strict nécessaire pour leur utilisation dans des projets scientifiques autorisés ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective plusieurs stratégies sont mises en œuvre : - Seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues. Les autres sont conservées congelées. - Les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence. - Les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (croisement entre individus de même génotype).
Raffinement
La méthode utilisée est éprouvée, précise, rapide et standardisée ce qui permet de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par le prélèvement lui-même. Une fois le prélèvement réalisé, l’animal est remis dans sa cage et un suivi de la cicatrisation au point de prélèvement est assuré.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent de poser de nombreuses questions scientifiques en biologie fondamentale, environnementale, santé humaine et animale avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèces, dont l’être humain. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (cancers, maladies neurodégénératives…). Les prélèvements de l’extrémité de la queue seront réalisés entre 10 et 21 jours après la naissance. En effet, durant cette période, l’extrémité distale de la queue est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie car peu douloureux et avec des risques hémorragiques extrêmement réduits.