Système nerveux

Jusqu'à 46 jours d'injections quotidiennes, 25 jours de L-Dopa, puis cinq séances de deux heures enfermée dans un cylindre de plexiglas pour observation, voilà ce que traverse chaque souris de ce projet. 13 896 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, après une chirurgie cérébrale de trente minutes injectant une toxine qui détruit leurs neurones dopaminergiques. La L-Dopa provoque ensuite les mouvements anormaux recherchés, que le porteur décrit comme pouvant gêner l'accès à l'eau et à la nourriture pendant deux à trois heures après chaque injection. L'effectif intègre des lots prévus pour refaire une troisième fois les expériences en cas de résultats discordants, et le porteur annonce que la "production" d'animaux sera réduite si moins de molécules sont retenues.

Objectifs

Le traitement classique des symptômes de la maladie de Parkinson est la L-Dopa. Au début du traitement la L-Dopa réduit les symptômes moteurs, mais après quelques années de traitement, des mouvements anormaux involontaires handicapants, appelés dyskinésies et induits par L-Dopa, se développent. L’objectif de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de molécules anti-dyskinétiques déjà commercialisées, ou non, sur ces mouvements involontaires dyskinétiques induits par le traitement chronique par L-Dopa. Ce projet permettra aussi d‘évaluer un potentiel effet protecteur de ces mêmes molécules sur les neurones atteints lors de la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

La maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente au monde. Originairement considérée comme une maladie des personnes âgées, elle est de plus en plus diagnostiquée avant l’âge de 65 ans, notamment comme dans les formes génétiques étudiées ici. Les seuls traitements disponibles sont symptomatiques, mais malgré leurs efficacités dans la réduction des symptômes moteurs, ils induisent des effets indésirables comme les dyskinésies qui sont des mouvements anormaux. D’où la nécessité d’explorer de nouvelles thérapies. Ce projet fera progresser les connaissances dans les domaines de la physiopathologie de la maladie de Parkinson et des dyskinésies induites par le traitement par L-Dopa. Ces recherches thérapeutiques sont en amont d’une application pratique en médecine humaine et requièrent une expérimentation animale afin d’apporter la preuve de concept concernant leur efficacité. Il est à noter que si la preuve de concept est apportée dans le domaine de la maladie de Parkinson, des approches similaires pourront être développées pour soigner d’autres maladies neurologiques. En étudiant l’expression des gènes dans certains régions du cerveau après traitement, on espère pouvoir mieux comprendre les mécanismes d’action de ces molécules anti-dyskinétiques que nous allons utiliser dans ce projet et identifier des nouvelles cibles thérapeutiques pour la prise en charge de la maladie de Parkinson. Les résultats de ce projet pourront également participer à un développement clinique chez les patients parkinsoniens.

Procédures

Les animaux seront soumis à une unique procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie, pour une injection dans une zone spécifique du cerveau pour la mise en place de notre modèle. Elle durera 30 minutes environ. Les animaux recevront des injections des molécules à évaluer (1 fois par jour pendant 46 jours maximum, seulement pour les groupes d’animaux qui seront traités avant la chirurgie) et du traitement de la maladie de Parkinson (L-Dopa, 1 fois par jour pendant 25 jours maximum). Les animaux seront placés chacun dans des cylindres en plexiglas pour pouvoir être observés, 5 fois pendant les 25 jours de traitement par L-Dopa, et pour une durée maximale de 2 heures, afin d’évaluer l’intensité des mouvements anormaux induits par la L-Dopa et l’action des molécules sur cette intensité. Tous les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

La chirurgie sera associée à un risque de douleur dans les heures ou les jours suivants. De plus l’injection réalisée pour la mise en place du modèle pourra générer un retard de récupération transitoire pour l’animal (difficultés transitoire motrices causant des difficultés pour s’abreuver et s’alimenter et engendrant des pertes de poids). L’anesthésie générale nécessaire pour la chirurgie génèrera une hypothermie et une sécheresse oculaire, elle pourra également être associée à des problèmes cardiorespiratoires. L’injection du traitement pour la maladie de Parkinson (L-Dopa) générera des mouvements anormaux (dyskinésies) pouvant générer un stress et pouvant aller jusqu’à provoquer des difficultés à s’alimenter et s’abreuver pour l’animal de façon très transitoire, dans les 2 à 3 heures suivant l’injection de la L-Dopa puis l’animal reviendra à son état habituel. Le changement d’environnement pour les tests comportementaux pourrait provoquer un peu de stress. Les injections peuvent également générer du stress et une douleur légère et de courte durée. Pour les injections répétées il existe un risque d’induration de la zone injectée, d’inflammation ou d’hématome.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour prélever les tissus d’intérêt pour permettre les analyses afin de répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Notre projet propose d’étudier les conséquences de la mort des neurones dopaminergiques et sur d’autre partie du cerveau, et de trouver de nouveaux traitements pour les pallier. Le fonctionnement de ces neurones et leurs implications dans la production des mouvements normaux ou anormaux ne peut, à ce jour, pas être évaluée avec des modèles in vitro (cellulaires) ou computationnels. Le projet étudie des fonctions spécifiques du système nerveux dont l’exploration requiert un cerveau avec le moins d'altérations possibles, nécessitant des souris transgéniques et ne peut se faire qu'à l'aide d'études sur l'animal. D'une façon générale, nous nous efforçons continuellement à réévaluer nos approches et adapter nos expériences pour des modèles in vitro ou computationnels autant que possible.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués sera de 13896 maximum. La taille des groupes expérimentaux est estimée en se basant sur des travaux précédents. 15 à 22 animaux par groupe seront nécessaires dans le cadre de ce projet pour obtenir des effets statistiquement significatifs dans les réponses que nous proposons de tester. Ces lots ont été définis en utilisant des tests statistiques afin de limiter au strict minimum les effectifs par groupe tout en obtenant des résultats statistiquement exploitables. En fonction des besoins expérimentaux pour les projets de recherche il est possible que nous produisions moins d’animaux que prévu. Par exemple, ce nombre inclut les lots expérimentaux nécessaires pour effectuer les procédures une troisième fois en cas de non-concordance lors de l’expérience de vérification des résultats initiaux. Ces lots ne seront utilisés qu’en cas de résultats non concordants lors des deux expériences. La production d’animaux sera réduite et adaptée en fonction du nombre de molécules anti-dyskinétiques qui seront sélectionnées lors des premiers résultats sur un nombre réduit d'animaux et le nombre total d’animaux s’en verra réduit. Tous les animaux participant à ces procédures conduiront à des analyses biochimiques en rapport avec les comportements observés, afin de réduire le nombre d’animaux qui auraient été utilisés si les analyses biochimiques étaient effectuées sur d’autres lots. Les doses de traitements et le schéma d’injection de toxine intracérébrale seront également optimisés pour limiter le nombre d’animaux qui ne développeraient pas de dyskinésies et qui ne pourraient pas être inclus dans les groupes expérimentaux après chirurgie, cela permettra de réduire le nombre total d’animaux opérés pour obtenir le bon nombre dans groupe expérimental.

Raffinement

L'hébergement et les protocoles expérimentaux utilisés ont été optimisés pour réduire au minimum la douleur et l'inconfort des animaux. Les souris provenant d’un fournisseur externe seront placées dans une salle d’acclimatation pendant au moins 6 jours avant toutes utilisation. Les animaux seront hébergés en groupe de 2 à 5, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne nocturne de 12h à changement progressif. L'eau et la nourriture seront fournies ad libitum. Un carré de coton pour nidifier ainsi qu’un bâtonnet à ronger seront placés dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux un enrichissement. Si besoin, lors d’un petit effectif ou de tension dans le groupe un complément d’enrichissement peut être apporté par des maisonnettes ou des lanières de kraft. Les animaux seront observés quotidiennement, en cas d’anomalie un processus de déclaration au comité interne responsable du bien-être animal et à l’équipe de recherche est mis en place pour assurer la meilleure prise en charge des animaux. Pendant les procédures, les animaux seront observés, manipulés et pesée régulièrement. La chirurgie sera réalisée chez des animaux endormis et avec traitements anti-douleur adaptés. On maintiendra la température de l’animal à l’aide d’une chambre d’induction et de réveil chauffées et d’un tapis chauffant au cours de la chirurgie. Un gel oculaire sera mis en place pour éviter toute sécheresse oculaire. Après la chirurgie, les animaux recevront de la nourriture gélifiée et/ou réhydratée pour faciliter leur récupération, éviter de la déshydratation ou une perte de poids trop importante. Ils seront surveillés jusqu’à 2 fois par jour en période post-chirurgicale et seront pesés tous les 1-2 jours après chirurgie et jusqu’à récupération de leur poids initial. Le suivi que nous mettrons en place devrait permettre de détecter précocement tout signe de souffrance et mettre en place la prise en charge adaptée. L'évaluation de la douleur et de la détresse sera réalisée en observant l'aspect des souris et leur comportement. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Pour les traitements injectés, nous vérifierons la souplesse de la peau avant injection et nous changerons de site d’injection chaque jour. Une partie des animaux sera euthanasiée par injection d’un agent euthanasiant, cette injection sera précédée d’une pré-sédation afin de réduire le stress et la douleur induits par l’euthanasiant.

Choix des espèces

Dans le projet, la souris sera utilisée afin de tirer profit des techniques de transgénèse très efficaces dans cette espèce. La souris est le modèle le plus utilisé pour les maladies humaines du mouvement, notamment la maladie de Parkinson et donc la dyskinésie induite par traitement avec la Lévodopa. Pour l’études des dyskinésies, la méthode de lésion sélective des neurones dopaminergiques avecune toxine est très efficace et maitrisée chez cette espèce depuis de nombreuses années. La souris a des mouvements coordonnés des pattes pour des comportements moteurs élaborés qui sont fortement impactés par la dégénérescence des neurones dopaminergiques, ce qui en fait un modèle particulièrement pertinent pour l’étude de la maladie de Parkinson. Le striatum murin, comporte également une organisation anatomo-fonctionnelle proche de celles des primates non humains et humains, ce qui permet relativement facilement d’extrapoler les mécanismes découverts chez la souris à l’humain. La maladie de Parkinson étant une maladie qui touche les adultes, les expériences auront lieu que chez des animaux adultes adultes âgés de 6 à 10 semaines environ, afin de ne pas interagir avec les phénomènes développementaux.

Cinq semaines d'hébergement individuel pour 125 souris porteuses d'une prothèse fixée sur le crâne : 483 souris au total sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal subit une ou deux chirurgies cérébrales sous anesthésie, 45 d'entre eux reçoivent quatorze injections en une semaine, et 150 sont conduits vers un second établissement pour y être anesthésiés puis tués, leurs tissus servant à des expériences sur cerveau prélevé. L'objet du travail est de comprendre comment les neurones stockent les souvenirs et par quels mécanismes ils s'effacent. Le porteur reconnaît que l'isolement empêche les souris d'exprimer leur comportement social et qualifie la tâche de mémoire de "légèrement aversive", sans dire ce qu'elle leur inflige.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes cellulaires et neuronaux impliqués dans le stockage de la mémoire à court et à long terme au sein du cerveau des rongeurs. Cette recherche s’appuie sur des travaux antérieurs, qui ont révélé que certaines propriétés des neurones se modifient suite à une expérience ou une tâche comportementale. Nous cherchons à approfondir ces observations en explorant les facteurs moléculaires et les processus cellulaires responsables des changements observés. Pour les raisons techniques, le projet se déroule dans deux Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2

Bénéfices attendus

Notre projet aborde des défis importants pour comprendre les bases neurobiologiques de la formation de la mémoire. Grâce à la combinaison d'approches utilisées, le projet permettra : i) une meilleure compréhension du rôle du cerveau dans le stockage de la mémoire, ii) l'identification des mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine de l'oubli.

Procédures

Tous animaux subissent à une ou deux intervention(s) chirurgicale(s) (chacun d'une durée < 60 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Certains animaux (125) subiront une intervention sous sédation (sans acte invasif) d'une durée d'environ 60 minutes pour la pose d'une prothèse sur la tête. Pour des raisons techniques liées à la présence d'une prothèse, il est nécessaire d'adapter les conditions d'hébergement de ces animaux. 125 animaux seront hébergés individuellement pendant une période de 5 semaines, avec des périodes d'échange entre congénères. Ces mêmes animaux seront progressivement habitués à accepter la pose d'un appareil d'imagerie sur leur tête au cours de séances d'entraînement, dont la durée augmentera progressivement de 2 à 15 minutes. Tous les animaux sont soumis à une tâche comportementale classe de sévérité modère. La tâche comportemental se compose de deux séances, l'apprentissage de la mémoire associative et le rappel (chaque séance dure 6 à 7 minutes). Certains animaux (45) reçoivent également des injections bi-quotidiennes pendant 7 jours (14 injections en totale). Toutes ces interventions sont réalisées au sein de l' EU1. Certains animaux (150) seront transportés (trajet à pied de 5 minutes) vers une zone annexe de l'EU 2, où ils seront profondément anesthésiés, puis euthanasiés. Leurs tissus seront ensuite utilisés pour des expériences physiologiques aiguës.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent une ou deux procédures chirurgicales sous anesthésie. Les effets indésirables potentiels de ces interventions incluent un inconfort modéré, une perte de poids potentielle et un risque d'infection. Ce projet comprends également un test comportemental légèrement aversif. Ce test comportemental peut être stressant pour les souris. Les injections répétées peuvent également être une source d'inconfort. Certains animaux seront hébergés individuellement pendant 5 semaines. Cela représente un stress, car ils ne peuvent pas exprimer leur comportement social naturel.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet se concentre sur l'étude des mécanismes sous-jacents à la formation et au stockage de la mémoire dans le cerveau. Il comprend les tests comportementaux. Pour mener à bien cette étude, nous avons besoin d'un modèle qui soit : i) complexe et intact, ii) modifiable génétiquement, iii) doté de la structure cérébrale ciblée, et iv) adapté aux approches comportementales complexes et les tests invasifs.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous avons estimé le nombre nécessaire pour obtenir une signification statistique en nous basant sur des études antérieures et des recherches bibliographiques. Nous nous engageons à utiliser le nombre minimal d'animaux requis pour atteindre les objectifs de l'étude. Pour ce faire, nous avons prévu une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce des données (c'est-à-dire, analyse effectuée en petits lots avec une expérience par jour). Cette approche nous permettra d'ajuster la taille de l'échantillon en fonction des résultats préliminaires et de détecter rapidement tout problème potentiel avec la procédure, afin de modifier notre approche pour les lots suivants si nécessaire. En ce qui concerne l'approche statistique, nous appliquerons les tests appropriés en fonction des caractéristiques de nos données.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne : Les animaux seront surveillés chaque jour pour assurer leur bien-être général. ii) Vérification de l'état de l'animal : Avant chaque manipulation, l'état de l'animal sera vérifié selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Critères d’évaluation de la souffrance : L’apparence générale et le comportement de l’animal seront observés pour détecter tout signe de souffrance, douleur ou détresse (par exemple : état prostré, pelage non toiletté, griffures, etc.). Tout signe de souffrance déclenchera une réponse immédiate et appropriée, comme des mesures conservatoires (isolement temporaire, administration de glucose, réchauffement en couveuse, soins des blessures, etc.). Si aucune amélioration n'est constatée après ces interventions, l'expérimentateur décidera de l'euthanasie de l'animal, en consultation avec le vétérinaire et l'équipe des zootechniciens si nécessaire. iv) Les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et analgésie. v) Manipulation quotidienne : Les animaux seront manipulés quotidiennement avant les expériences pour réduire leur niveau de détresse. vi) Intégration des techniques de raffinement : Nous intégrerons régulièrement de nouvelles techniques de raffinement en formant les expérimentateurs et en consultant des ressources éducatives visant à renforcer le respect des principes de raffinement. vii) Conditions d’hébergement : Les animaux seront maintenus dans des cages collectives avec un enrichissement comprenant des tubes en carton et du matériel pour la nidification.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris pour les raisons techniques liées à la réalisation du projet. Actuellement, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, de manière routinière, de modifier le génome, et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés tant au niveau comportemental que moléculaire. Les protocoles comportementaux décrits dans ce projet sont déjà validéspour ce modèle. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines. Nous ne pouvons pas utiliser de souris plus âgées en raison de l'effet du vieillissement sur la formation de la mémoire. De plus, les souris de moins de 6 semaines (avec un cerveau en développement) peuvent avoir des mécanismes différents sous-jacents à la formation de la mémoire et sont également sujettes à un oubli plus rapide.

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune passant par une chirurgie du cerveau de quarante-cinq minutes puis par une quarantaine de séances comportementales, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après l'injection de vecteurs viraux dans le cerveau, elles enchaînent trente séances d'accès à une solution sucrée, six tests de motivation de quatre-vingt-sept minutes et trois séances où la boisson est rendue amère par la quinine. Les souris de huit cohortes sur douze reçoivent en plus une injection sous-cutanée dix minutes avant chacune de ces trente séances. Le porteur justifie le choix de la souris comme un "compromis phylogénétique", assez proche de l'humain pour valoir modèle et assez éloignée d'espèces qu'il qualifie de "plus sensibles éthiquement", au premier rang desquelles les primates non-humains.

Objectifs

La surconsommation de sucre est à l’origine de nombreuses maladies chroniques et est un enjeu de santé publique. Des travaux ont montré que le sucre exerce ses effets récompensants non seulement par l'intermédiaire des voies gustatives, mais également via des voies post-ingestives (i.e., la signalisation inconsciente provenant de l'intestin et de la veine porte hépatique). Les voies gustatives et post-ingestives induisent la libération de dopamine via le circuit neuronal « noyau caudal du tractus solitaire /aire tegmentale ventrale /striatum ventral », tandis que la voie purement post-ingestive déclenche la libération de dopamine via le circuit « noyau caudal du tractus solitaire /noyau parabrachial dorsolatéral /Substantia nigra pars compacta /striatum dorsal ». Récemment, il a été proposé que la motivation inconsciente induite par les sucres, et détectée par la voie intestin-cerveau, constituerait la principale cause de surconsommation de sucre. Compte tenu des spécificités des différents circuits neuronaux, nous postulons qu'ils ont une contribution différentielle dans le développement de la surconsommation de sucre. Notre hypothèse principale est donc que les deux circuits neuronaux de la voie post-ingestive favorisent la motivation accrue pour le sucre et sa surconsommation compulsive. Notre projet a pour but d’évaluer le rôle de cette voie post-ingestive dans le développement d’une consommation compulsive de sucre. Tout d’abord, nous évaluerons l’impact de la surconsommation de sucrose sur la motivation à consommer le sucre et sur le recrutement de ces circuits neuronaux chez des souris C57BL/6J de type sauvage. Nous testerons ensuite de manière causale les rôles respectifs de ces circuits dans le développement de l’addiction au sucre en combinant des approches d’activation ou d’inhibition sélective des circuits neuronaux et des approches comportementales chez des souris transgéniques. Nous évaluerons l'impact de l’activation et de l’inhibition de chaque circuit sur la consommation de sucre et la motivation. Nos recherches devraient fournir des informations inédites sur le rôle de l’axe intestin-cerveau dans le développement d’une consommation compulsive de sucre.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont essentiellement d’ordre scientifique. Le premier bénéfice sera de fournir des informations inédites sur le rôle de l’axe intestin-cerveau dans le développement d’une consommation compulsive de sucre et dans la motivation accrue pour consommer le sucre. Le second bénéfice sera de préciser les différents mécanismes neurobiologiques en jeu. Plus généralement, notre projet pourrait avoir des implications importantes pour les stratégies d'intervention en santé publique. En effet, si notre hypothèse est confirmée, les interventions ciblant la voie post-ingestive implicite devraient être plus efficaces que les interventions standards ciblant des choix conscients pour limiter la consommation de sucre.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une chirurgie stéréotaxique (45 min en moyenne) pour l’injection intracérébrale de vecteurs viraux. Cette chirurgie est effectuée sur couverture chauffante en conditions aseptiques alors que les animaux sont sous anesthésie gazeuse et sous analgésie. L’ensemble des souris seront soumises à différents tests comportementaux : accès différentiel à l’auto-administration orale de sucre (30 séances de 20 min ou de 3h), établissement d’une courbe concentration-réponse (2 séances de 20 min ou 3h), test de motivation (6 séances de 87 min) et test de dévaluation de la boisson sucrée par la quinine (3 séances de 20 min). Enfin, une injection sous-cutanée sera effectuée 10 min avant chacune des 30 séances d’accès différentiel à la solution sucrée et avant le test final de 80 min (Jour 85) pour 8 des 12 Cohortes de souris.

Impact sur les animaux

Les animaux seront testés dans différentes procédures successives dont le degré de gravité principal est léger et qui ne dépassera pas le degré modéré. Bien que toutes les précautions soient prises afin de prévenir ou de minimiser les nuisances au maximum (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi postopératoire…), des nuisances ou effets indésirables peuvent éventuellement survenir suite à la chirurgie stéréotaxique. Les nuisances attendues après la chirurgie comprennent : un possible risque d'inflammation ou d'infection, une apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée, une perte des points de suture avant cicatrisation complète. Nous n’anticipons pas de nuisances particulières pendant l’ensemble des tests comportementaux qui suivent. Les souris des cohortes 5 à 12 seront soumis à des injections sous-cutanées de façon quotidienne pendant la phase d’accès différentiel et pendant le test final. Les animaux seront sous surveillance quotidienne pour repérer et prévenir tout problème éventuel.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux seront prélevés postmortem pour effectuer des mesures d’expression protéiques cérébrales par analyse immunohistochimique.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation de la souris de laboratoire (Mus Musculus, jeunes adultes, mâles et femelles), sauvages ou transgéniques, vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal se justifie pour les raisons éthiques suivantes : 1) l’éthique humaine actuelle interdit l’utilisation d’interventions invasives chez l’homme, compliquant ainsi l’étude directe des relations causales entre activité de certains circuits neuronaux et surconsommation de sucre ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces relations causales et 3) la consommation compulsive de sucre malgré les conséquences négatives associées est un désordre comportemental complexe qui ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire au projet est réduit au minimum. Un effectif final de 10 souris par sous-groupes est un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet scientifique proposé. Nous devons en effet avoir un nombre suffisant d’animaux en fin d’expérience pour que nos expériences soient concluantes au plan statistique et que la puissance de nos tests soit satisfaisante. Le pourcentage d’attrition moyen est estimé à 15 % en fin d’expérience, l’effectif initial par groupe devra donc être de 12 souris (12-(12x15/100) = 10 souris). Donc le nombre total d’animaux utilisés pour tester les variables du projet sera égal à 768 souris (384 souris mâles et 384 souris femelles). Les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques paramétriques. Le seuil de significativité statistique sera fixé à p< 0.05.

Raffinement

Toutes les chirurgies stéréotaxiques (45 min-1h en moyenne par animal) seront réalisées sous analgésie, sous anesthésie gazeuse et en conditions aseptiques sur couverture chauffante. Un anesthésique local sera infiltré sous la peau du crâne au niveau du site d’incision pour prévenir toute douleur locale additionnelle. En fin de chirurgie, l’animal recevra une injection sous-cutanée de sérum physiologique pour favoriser la réhydratation. L’animal sera ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal sera relogé dans sa cage de stabulation avec ses congénères. Les animaux seront sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter d’éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et y remédier rapidement. Nos méthodes d’interventions pour réduire ou supprimer l’inconfort ou la douleur seront gradées. Quand nous constaterons les premiers signes d'inconfort chez un animal, nous mettrons en place des mesures de nursing avec un accès facilité à l’aliment (nourriture posée sur le sol de la cage). Si cela ne suffit pas, l’animal recevra plusieurs doses d’analgésique. L'animal sera aussi réhydraté par injection sous-cutanée de sérum physiologique . Enfin, si cela ne suffit pas au rétablissement de l'animal, celui-ci sera mis à mort sans souffrance. Avant le début des expériences, les souris connaissent une période d’acclimatation de 7 jours, durant laquelle elles sont délicatement manipulés de façon quotidienne. Cette approche permet de limiter le stress des animaux lors du démarrage des procédures en les habituant à la préhension et à la contention. Elles sont également habituées aux cages expérimentales (pendant 2 jours consécutifs, 2h/jour) afin de limiter le stress et l’anxiété.

Choix des espèces

Le choix de la souris de laboratoire constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche de l’homme d’un point de vue phylogénétique pour servir de modèle animal valide des phénomènes « d’addiction au sucre » par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (e.g., primates non-humains). Les espèces invertébrées peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains comportements alimentaires mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine « des addictions alimentaires ». De plus, la souris transgénique, est un modèle animal unique, nous permettant d’étudier le rôle spécifique de certains neurones dans la surconsommation de sucre, ce qui est irréalisable avec les autres modèles animaux. Les animaux utilisés seront tous de jeunes adultes au début des expériences (plus vieux que 6 semaines). Ce stade du développement correspond à une maturation complète du cerveau et à une stabilisation de la fonction des systèmes neurobiologiques d'intérêt.

Abrasion de la cornée, instillation d'endotoxines, ablation des glandes lacrymales et instillations d'un conservateur de collyre deux fois par jour pendant une semaine : 168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend les mêmes symptômes que chez les patients humains, picotements, brûlures, larmoiements, sensation de corps étranger et sensibilité accrue à la lumière. L'analgésie s'arrête vingt-quatre heures après la chirurgie, parce qu'au-delà, écrit-il, elle "inhiberait l'évolution du modèle expérimental". La douleur oculaire que le projet veut comprendre est donc aussi celle qu'il faut laisser s'installer chez les souris pour que l'expérience fonctionne.

Objectifs

La douleur oculaire est un symptôme d'alerte en réaction à une inflammation ou un traumatisme, affectant particulièrement la cornée, la sclérotique et la conjonctive. La douleur oculaire est remarquable par la variabilité de l'intensité qu'elle peut générer, allant d'une simple gêne oculaire à une douleur intense, voire insupportable. Les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une réelle altération de leur qualité de vie puisqu'on estime que près de 60 pourcents des patients sont gênés dans leurs activités quotidiennes. Diverses maladies inflammatoires ou infectieuses, des troubles neurologiques et des interventions chirurgicales oculaires peuvent être la cause sous-jacente de douleur cornéenne chronique. Dans les cas pathologiques graves, les lésions des nerfs cornéens peuvent entraîner une sensibilité accrue à la lumière et/ou des douleurs, une altération des fonctions physiques et sociales, une privation de sommeil, une anxiété et une dépression. Le poids des maladies de la surface oculaire, associant des symptômes douloureux intenses, des comorbidités émotionnelles et des altérations psychosociales, nous a conduit à en étudier les mécanismes sous- jacents. Une meilleure compréhension de ces mécanismes est un des enjeux cruciaux pour le développement de stratégies de prise en charge et de thérapeutiques efficaces pour soulager la douleur oculaire chronique.

Bénéfices attendus

L’objectif est de définir, le rôle fonctionnel de ces chimiokines dans les interactions entre les cellules immunitaires et les neurones sensoriels et leurs implications spécifiques dans les mécanismes d'initiation et de maintien des syndromes douloureux au cours de la douleur oculaire. Globalement, ce projet apportera le rationnel pour l'utilisation des antagonistes des récepteurs de chimiokines comme traitement contre la douleur oculaire chronique. Ainsi, nous faisons l'hypothèse que ces chimiokines après une atteinte cornéenne pourraient induire, le recrutement et l'activation de cellules immunitaires localement au niveau de la lésion cornéenne et dans le système trigéminal, et ainsi participer aux mécanismes conduisant à la centralisation et à la chronicité de la douleur oculaire.

Procédures

Trois modèles seront mis en œuvre dans le cadre de ce projet. Le modèle douleur inflammatoire est obtenu par des instillations 2 fois par jour pendant 7 jours d’un conservateur de collyre ; il nécessite la contention pendant quelques secondes de l’animal. Le modèle de douleur lié à une infection est induit par l’abrasion de la cornée effectuée sous anesthésie et analgésie (1 fois, 10 minutes) associé à l’instillation d’endotoxines le jour de l’abrasion lors de la même anesthésie (quelques secondes) et une seconde fois 3 jours après sur animal vigile par simple contention (quelques secondes). Le modèle de sécheresse oculaire est induit par exérèse des glandes lacrymales. Cette chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie et dure au maximum 15 minutes. Ces modèles reproduisant le contexte de la maladie étudiée sont réalisés sous anesthésie et analgésie dans le respect des normes et recommandations concernant le bien-être animal et l’éthique en vigueur

Impact sur les animaux

Modèles : les nuisances attendues dans les 3 modèles sont celles observées chez l’Homme à savoir, des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, des larmoiements, la sensation de corps étranger dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. Ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. Le modèle d’instillation répétée d'un conservateur correspond classiquement aux traitements (collyres) donnés aux patients en clinique humaine. Son application topique sur le long terme est connue en clinique humaine pour être toxique pour la surface oculaire et engendrer des gènes ou des irritation ou brûlure, d’œil sec voir une inflammation d’intensité variable. Dans le second modèle, l’abrasion de la cornée entrainera une douleur post-opératoire. L’instillation de toxine entrainera une inflammation de la cornée et une rougeur de la conjonctive. Chirurgie : la chirurgie qui permet de mettre en place le modèle de sècheresse oculaire entrainera une douleur post opératoire. L'anesthésie durant la chirurgie peut entrainer une détresse respiratoire ou cardiaque, une hypothermie. Les nuisances attendues seront celles observées dans la sécheresse oculaire en clinique à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure car les prélèvements d'organes pour analyse post mortem par imagerie sont nécessaires.

Remplacement

À l’heure actuelle, ce projet nécessite l’utilisation d’animaux car aucune alternative in vitro permet : 1) mimer la pathologie de sécheresse et douleur oculaire qui lui sont liées. 2) la complexité et l’interaction des circuits neuronaux mis en jeu (connectant la cornée, ganglions trigéminés et cerveau) ainsi que l’interaction avec l’activité du système immunitaire inné, ne peuvent également être étudier et remplacer par un modèle d’étude vitro. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mis en jeu au cours de cette pathologie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur. De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun model in silico n’existe pour répondre à ces questions.

Réduction

Nous utiliserons au maximum 168 souris dans ce projet d’une durée de 5 ans. Afin de respecter la règle de réduction, notre étude portera sur plusieurs structures (cornée, ganglion trigéminal, cerveaux) de chaque animal. Nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Le choix de faire 4 animaux par groupe, repose essentiellement sur un choix volontaire de « réduction » tout en satisfaisant le critère de reproductibilité. Cette étude présente en grande partie un aspect descriptif de la distribution et de la forme des cellules n'impliquant pas necessairement de test statistique. Dans cette approche nous considérons chaque animal de manière pairée avec son control, mais aussi au sein même d’un animal (œil control vs œil lésé). Néanmoins des tests statisitiques pourront être réalisés sur certaines quantifications à l’échelle de la cellule unique. Le nombre d’image peut être plus ou moins augmenté par animal, ainsi le nombre de point comparés étant très grand nous atteignons largement les effectifs minimaux requis par les tests de calcul de puissance. Cependant nous satisfaisons aux critères de reproductibilité de la manip en faisant 4 fois cette quantification (2 males et 2 femelles traités vs 4 contrôles). D’expérience si aucune différence n’est observée sur ce nombre d’animaux il ne sert à rien d’accumuler des tests. Cette étude par microscopie et cette approche statistique nous permet donc de travailler avec un nombre réduit d’animaux.

Raffinement

Dans le cadre d’une démarche de raffinement nous devons chercher à préserver l’animal de la douleur. Pour cela, les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire sur 24h. Au delà de 24h cela inhiberait l’évolution du modèle expérimental et interférerait avec les résultats attendus pour ce projet. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ses différentes constantes. Si un animal anesthésié lors de l'induction du modèle présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours. Au delà des 24h post-op, le bien être animal sera évalué à l’aide de points limites établis. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie afin de limiter au maximum la souffrance prolongée. Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. Chaque cage contient au moins un élément d'enrichissement, bâton à ronger ou tunnel en carton. Les enrichissements de nidification (craft, ouate) sont exclus pour réduire les risque de poussière dans les yeux, la litière utilisée a été validée par la structure pour son faible taux de poussière. Les animaux sont hébergés dans les conditions de notre établissement avec température et hygrométrie contrôlée, cycle jour/nuit 12/12, avec au maximum 5 animaux par cages. La surveillance quotidienne du bien-être animal est prise en charge par un personnel dédié au soin et à l’expérimentation. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies à volonté.

Choix des espèces

Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car elle possède les structures oculaires et cérébrales adéquates, et que nous avons accès à tous les outils génétiques requis. Les animaux arriveront à l’animalerie à l’âge de 7-8 semaines et entreront en procédure entre 10 et 12 semaines. Cela permettra de travailler sur des souris adultes tout en évitant des biais liés au changement physiologique de l’animal vieillissant. En effet l’ensemble des procédures de ce projet durant entre 4 à 11 semaines maximum. Les souris auront donc au maximum 23 semaines en sortie de procédure.

Jusqu'à trente jours de séances quotidiennes la tête fixée, sous une restriction alimentaire qui leur fait perdre 10 à 15 % de leur poids : 764 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent d'abord une chirurgie de trente minutes pour la pose d'un dispositif de maintien de la tête, ou d'une heure et demie pour l'injection d'un vecteur viral et l'implantation d'une fibre ou d'une lentille optique dans le cerveau. Le RNT annonce cette seconde chirurgie "sans effets adverses" tout en décrivant plus loin une douleur post-opératoire modérée et une possible perte de poids. Tout cela vise à comprendre comment une action réfléchie devient une habitude, le porteur affirmant qu'un modèle mammifère s'impose faute de structures équivalentes chez les autres vertébrés.

Objectifs

Le projet vise à comprendre en profondeur le processus d'apprentissage procédural, qui repose sur l'automatisation et l'exécution de séquences cognitivo-motrices complexes, telles que la conduite automobile ou la réalisation de gestes comme attacher ses lacets. Ce processus d'apprentissage se développe à travers de multiples répétitions réussies, progressant ainsi des comportements dirigés vers un but vers l'établissement d'habitudes. Le striatum, une région du cerveau, joue un rôle clé dans cet apprentissage, avec la région dorsomédiane (DMS) associée à l'acquisition des actions orientées vers un but, et la région dorsolatérale (DLS) impliquée dans l'acquisition des habitudes. Les recherches précédentes ont montré que différentes parties du striatum sont impliquées à différentes étapes de l'apprentissage, mais il reste à comprendre comment la mémoire procédurale est transférée entre ces régions lorsque les comportements évoluent vers des habitudes. Pour cela, une exploration longitudinale de la plasticité du réseau striatal est nécessaire, en suivant l'activité électrophysiologique ou en imagerie in vivo des différentes composantes du réseau dans le DMS et le DLS pendant tout le processus d'apprentissage procédural.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à découvrir comment nous apprenons des actions de manière automatique. En utilisant des techniques d'imagerie et d'électrophysiologie, nous allons suivre comment la plasticité synaptique change pendant que nous apprenons. Cela nous aidera à comprendre comment des actions initialement réfléchies et flexibles deviennent des habitudes automatiques, inconscientes. Le projet contribuera à la compréhension de la formation de la mémoire implicite lors d’un apprentissage procédural, ce qui aidera à éclaircir les mécanismes impliqués dans l'automatisation et l'exécution de séquences cognitivo-motrices complexes.

Procédures

Les souris, selon les groupes expérimentaux, subiront ou une chirurgie de courte durée (environ 30 minutes) sous-anesthésie générale pour la pose du dispositif de maintien de la tête, ou une chirurgie d’environ une heure et demi sous anesthésie générale, prévoyant l’injection du vecteur et l’implant de fibre ou lentille optique, sans effets adverses. Toutes les souris vont réaliser une tache comportementale, envisageant un apprentissage procédural (une session par jour pendant 3, 8, 21 ou 30 jours selon les besoins expérimentaux).

Impact sur les animaux

Après intervention chirurgicale, les animaux peuvent éprouver une douleur post-opératoire modérée, pouvant conduire à une éventuelle perte de poids. De plus, la restriction alimentaire entraînant une diminution de poids (entre 10 et 15%), la configuration tête-fixée, les manipulations liées aux enregistrements électrophysiologiques, comme le branchement et le débranchement des équipements, peuvent engendrer un stress chez l’animal.

Devenir

Il est nécessaire de mettre à mort les animaux dans toutes les procédures pour pouvoir effectuer une vérification histologique des aires corticales ciblées

Remplacement

Aucun modèle mathématique ou in vitro n'existe actuellement pour décrire les dynamiques des réseaux de neurones impliqués dans l’apprentissage procédural. Ainsi, l'utilisation d'animaux éveillés s'avère indispensable pour comprendre les mécanismes par lesquels le cerveau sélectionne une stratégie motrice ainsi que pour étudier les plasticités mise en place, au fur et à mesure de l’apprentissage. Pour ce faire, l'emploi d'un modèle animal mammifère est essentiel afin d'obtenir des résultats pouvant être extrapolés à la compréhension du processus d’apprentissage humain.

Réduction

En suivant la même souris à travers plusieurs sessions comportementales, nous parvenons à réduire le nombre d'animaux requis pour obtenir des résultats fiables, tout en atténuant la variabilité inter-individuelle. La méthode d'imagerie 2-photons employée offre la possibilité d'observer simultanément de multiples neurones.

Raffinement

Des éléments d'enrichissement supplémentaires, tels que la présence de sizzled pad et des petites bûches en bois, sont introduits dans la cage d’hébergement des souris. Les conditions chirurgicales (anesthésie, analgésie, asepsie) et les soins post-opératoires appliqués garantissent une prise en charge appropriée pour diminuer toute souffrance de l’animal après chirurgie. La restriction alimentaire est légère, et nous avons élaboré un protocole qui ne requiert pas l'isolement des animaux en restriction, favorisant ainsi leur bien-être social. Pour réduire le stress des animaux lié au dispositif expérimental, nous avons mis en place un protocole d'habituation progressive. De plus, afin d'associer positivement les souris au dispositif expérimental, elles reçoivent des récompenses pendant la phase d'habituation (et également pendant le protocole). L'appareil expérimental employé permet aux souris de se déplacer et de réaliser des tâches de manière active, même lorsqu'elles sont maintenues par la tête, réduisant ainsi le stress lié à cette contrainte. Les lignées transgéniques utilisées présentent un phénotype non-dommageable. Les vecteurs viraux et les protéines exprimées sont utilisés à des fins techniques uniquement (telles que l'imagerie et l'optogénétique) et ne semblent pas avoir d'effets néfastes sur les souris. Par ailleurs, les implants utilisés sont miniaturisés et légers (< 2g avec ciment inclus), et n'interfèrent donc pas avec le comportement normal des animaux. Enfin, une évaluation rigoureuse de l’état de santé et du bien-être des animaux est assurée pendant la durée du protocole experimental, grâce à des points limites pré-établis, qui permettent de définir des actions à prendre, qu’il s’agisse de soins de soutien, du retrait de l’animal du protocole expérimental ou, en cas de souffrance importante non réversible, d'une euthanasie éthique. Les critères d’arrêt associés à ces points limites garantissent une prise en charge rapide et adaptée, dans le respect de la réglementation et des principes de bien-être animal.

Choix des espèces

Il est nécessaire d'utiliser un modèle animal mammifère pour obtenir des résultats potentiellement transposables à l'Homme, car les structures des ganglions de la base ne sont pas présentes, ou sont organisées différemment chez les autres vertébrés (et absentes chez les invertébrés). Parmi les modèles animaux mammifères, l'utilisation du modèle souris permet l'accès aux nombreuses lignées transgéniques indispensables pour notre projet. Les animaux en comportement seront utilisés au premier stade adulte (à partir de 50 jours), ce qui permet d'avoir des taux d'apprentissage élevés, tout en étudiant l'activité des réseaux neuronaux dont le développement post-natal est fini.

Une ou deux chirurgies du crâne sous anesthésie attendent chacune des 483 souris de ce projet, et 125 d'entre elles portent ensuite une prothèse fixée sur la tête. Ces 125 souris vivent seules pendant cinq semaines, ce que le porteur reconnaît comme un stress puisqu'elles ne peuvent pas exprimer leur comportement social. Toutes sont soumises à une tâche de mémoire associative, 45 reçoivent en plus quatorze injections en sept jours, et toutes sont tuées pour prélèvement de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le RNT qualifie cette tâche de "légèrement aversive" sans dire en quoi consiste l'aversion infligée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes cellulaires et neuronaux impliqués dans le stockage de la mémoire à court et à long terme au sein du cerveau des rongeurs. Cette recherche s’appuie sur des travaux antérieurs, qui ont révélé que certaines propriétés des neurones se modifient suite à une expérience ou une tâche comportementale. Nous cherchons à approfondir ces observations en explorant les facteurs moléculaires et les processus cellulaires responsables des changements observés. Pour les raisons techniques, le projet se déroule dans deux Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2

Bénéfices attendus

Notre projet aborde des défis importants pour comprendre les bases neurobiologiques de la formation de la mémoire. Grâce à la combinaison d'approches utilisées, le projet permettra : i) une meilleure compréhension du rôle du cerveau dans le stockage de la mémoire, ii) l'identification des mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine de l'oubli.

Procédures

Tous animaux subissent à une ou deux intervention(s) chirurgicale(s) (chacun d'une durée < 60 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Certains animaux (125) subiront une intervention sous sédation (sans acte invasif) d'une durée d'environ 60 minutes pour la pose d'une prothèse sur la tête. Pour des raisons techniques liées à la présence d'une prothèse, il est nécessaire d'adapter les conditions d'hébergement de ces animaux. 125 animaux seront hébergés individuellement pendant une période de 5 semaines, avec des périodes d'échange entre congénères. Ces mêmes animaux seront progressivement habitués à accepter la pose d'un appareil d'imagerie sur leur tête au cours de séances d'entraînement, dont la durée augmentera progressivement de 2 à 15 minutes. Tous les animaux sont soumis à une tâche comportementale classe de sévérité modère. La tâche comportementalel se compose de deux séances, l'apprentissage de la mémoire associative et le rappel (chaque séance dure 6 à 7 minutes). Certains animaux (45) reçoivent également des injections bi-quotidiennes pendant 7 jours (14 injections en totale). Toutes ces interventions sont réalisées au sein de l' EU1. Certains animaux (150) seront transportés (trajet à pied de 5 minutes) vers une zone annexe de l'EU 2, où ils seront profondément anesthésiés, puis euthanasiés. Leurs tissus seront ensuite utilisés pour des expériences physiologiques aiguës.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent une ou deux procédures chirurgicales sous anesthésie. Les effets indésirables potentiels de ces interventions incluent un inconfort modéré, une perte de poids potentielle et un risque d'infection. Ce projet comprends également un test comportemental légèrement aversif. Ce test comportemental peut être stressant pour les souris. Les injections répétées peuvent également être une source d'inconfort. Certains animaux seront hébergés individuellement pendant 5 semaines. Cela représente un stress, car ils ne peuvent pas exprimer leur comportement social naturel.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet se concentre sur l'étude des mécanismes sous-jacents à la formation et au stockage de la mémoire dans le cerveau. Il comprend les tests comportementaux. Pour mener à bien cette étude, nous avons besoin d'un modèle qui soit : i) complexe et intact, ii) modifiable génétiquement, iii) doté de la structure cérébrale ciblée, et iv) adapté aux approches comportementales complexes et les tests invasifs.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous avons estimé le nombre nécessaire pour obtenir une signification statistique en nous basant sur des études antérieures et des recherches bibliographiques. Nous nous engageons à utiliser le nombre minimal d'animaux requis pour atteindre les objectifs de l'étude. Pour ce faire, nous avons prévu une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce des données (c'est-à-dire, analyse effectuée en petits lots avec une expérience par jour). Cette approche nous permettra d'ajuster la taille de l'échantillon en fonction des résultats préliminaires et de détecter rapidement tout problème potentiel avec la procédure, afin de modifier notre approche pour les lots suivants si nécessaire. En ce qui concerne l'approche statistique, nous appliquerons les tests appropriés en fonction des caractéristiques de nos données.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne : Les animaux seront surveillés chaque jour pour assurer leur bien-être général. ii) Vérification de l'état de l'animal : Avant chaque manipulation, l'état de l'animal sera vérifié selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Critères d’évaluation de la souffrance : L’apparence générale et le comportement de l’animal seront observés pour détecter tout signe de souffrance, douleur ou détresse (par exemple : état prostré, pelage non toiletté, griffures, etc.). Tout signe de souffrance déclenchera une réponse immédiate et appropriée, comme des mesures conservatoires (isolement temporaire, administration de glucose, réchauffement en couveuse, soins des blessures, etc.). Si aucune amélioration n'est constatée après ces interventions, l'expérimentateur décidera de l'euthanasie de l'animal, en consultation avec le vétérinaire et l'équipe des zootechniciens si nécessaire. iv) Les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et analgésie. v) Manipulation quotidienne : Les animaux seront manipulés quotidiennement avant les expériences pour réduire leur niveau de détresse. vi) Intégration des techniques de raffinement : Nous intégrerons régulièrement de nouvelles techniques de raffinement en formant les expérimentateurs et en consultant des ressources éducatives visant à renforcer le respect des principes de raffinement. vii) Conditions d’hébergement : Les animaux seront maintenus dans des cages collectives avec un enrichissement comprenant des tubes en carton et du matériel pour la nidification.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris pour les raisons techniques liées à la réalisation du projet. Actuellement, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, de manière routinière, de modifier le génome, et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés tant au niveau comportemental que moléculaire. Les protocoles comportementaux décrits dans ce projet sont déjà validéspour ce modèle. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines. Nous ne pouvons pas utiliser de souris plus âgées en raison de l'effet du vieillissement sur la formation de la mémoire. De plus, les souris de moins de 6 semaines (avec un cerveau en développement) peuvent avoir des mécanismes différents sous-jacents à la formation de la mémoire et sont également sujettes à un oubli plus rapide.