Système respiratoire

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent pendant quatre semaines des instillations intra-trachéales d'un agent pro-inflammatoire sous anesthésie et, pour certains, une exposition continue à un air appauvri en oxygène simulant 4 300 à 5 000 mètres d'altitude, avant d'être tués par exsanguination pour prélever cœur et muscles. Le porteur décrit une baisse transitoire de prise alimentaire et d'activité, sans douleur attendue selon lui. Il affirme que ce dialogue entre organes ne peut s'étudier que sur "l'organisme entier" et retient le rat pour la quantité de muscle qu'il fournit.

Objectifs

Le tissu musculaire squelettique est doté d'une plasticité particulièrement sollicitée en réponse à des contraintes comme l'entraînement, la réhabilitation, la nutrition ou l'environnement permettant une amélioration de la performance sportive mais aussi de la santé au sens large. De nombreux travaux montrent une corrélation entre la masse musculaire et la survie des individus âgés, qu'ils soient en bonne santé ou porteurs de pathologies chroniques. Ainsi, dans les pathologies chroniques, le maintien voire l'amélioration de la masse et de la fonction musculaires sont considérés comme des outils de santé, justifiant le recours à la réhabilitation par l'activité physique. Cependant, que ce soit dans le cadre de l'optimisation de la performance ou dans la prise en charge des patients, on note une fraction non négligeable de personnes ne répondant pas ou pas bien à de tels programmes qui peut aller jusqu'à 30% dans le cas de la maladie respiratoire chronique. Cette non-réponse est encore mal expliquée. A côté des mécanismes classiques de régulation de gènes d'intérêt dont l'expression peut varier fortement avec l'exercice, l'hypothèse d'un rôle significatif du micro-environnement musculaire sur le contrôle de ces adaptations, s'appuyant sur l'existence de régulations d'ordre épigénétique, semble privilégiée, que ce soit chez le sportif de haut niveau ou chez le patient. Ces modifications pourraient conduire à des difficultés à activer les voies de signalisation classiques contrôlant la masse musculaire (protéosynthèse, protéolyse) selon des critères qui restent à préciser (prédisposition, mode de vie, environnement, niveau d'activité physique). Ces critères agiraient via des modifications épigénétiques sur le développement musculaire et en particulier sur les limitations des capacités hypertrophiques du muscle en présence d'hypoxie et d'inflammation. Il convient maintenant de disséquer les mécanismes qui pourraient être à l'origine de ces réponses différentielles. Dans le cadre de la maladie respiratoire, ces échecs pourraient être liés à des modifications de la chromatine (ADN+histones) qui contrôleraient négativement la régulation de la masse musculaire mais dont on ne sait pas comment elle obéit au stress hypoxique et/ou inflammatoire associé. Notre objectif est de déterminer ces modifications pour ensuite proposer des solutions de contournement pour rendre plus efficace la réponse du tissu musculaire des patients au réentrainement à l'effort.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à déterminer la signature épigénétique du tissu musculaire ainsi que ses signaux de réponse à l'exposition à l'hypoxie et/ou à l'inflammation d'origine pulmonaire, pouvant expliquer les niveaux de réponse variables du muscle à un stimulus hypertrophique observée dans des travaux précédents. Nos résultats permettront de relier les caractéristiques de l'épigénome associé à une contrainte environnementale (hypoxie et/ou inflammation) en fonction du type de muscle (oxydatif ou glycolytique) à des indicateurs métaboliques déterminés sur fibres isolées ou mitochondries isolées. L'objectif est ensuite d'utiliser des perturbations du métabolisme énergétique afin de modifier cet épigénome pour le rendre plus favorable, constituant ainsi un outil de personnalisation de la prise en charge de la fonction musculaire dans un contexte similaire d'hypoxie et d'inflammation comme chez le malade respiratoire.

Procédures

Les animaux utilisés pour ce projet subiront soit des instillations intra-trachéales bi-hebdomadaires d'un agent pro-inflammatoire, sous anesthésie gazeuse de courte durée (inférieure à 2 min/session), pendant 4 semaines (groupes Inflammation seule et Hypoxie+Inflamation) représentant un total de 8 instillations. De plus, le groupe Hypoxie+Inflamation sera exposé en continu durant les 2 dernières semaines à un environnement appauvri en oxygène (similaire à une altitude de 4300m à 5000m) ainsi que le groupe Hypoxie seule. Après cette période de conditionnement, les animaux seront endormis (anesthésie gazeuse) et mis à mort immédiatement par exsanguination et prélèvement du coeur, suivis de prélèvements de divers organes ou tissus d'intérêt pour analyses ultérieures in vitro.

Impact sur les animaux

Le statut nutritionnel des animaux exposés à l'hypoxie continue peut être légèrement impacté avec une prise alimentaire diminuée dans les premiers jours en dépit d'un accès à l'eau de boisson et à la nourriture ad libitum mais qui revient ensuite à une quantité de nourriture consommée normale. L'activité locomotrice spontanée peut également être légèrement diminuée les premiers jours d'hypoxie pour revenir à la normale, facilitée en cela par l'hébergement qui se fait dans les mêmes cages que la stabulation normale, en groupe, avec enrichissement du milieu. L'instillation pulmonaire de LPS, génératrice d'une inflammation pulmonaire (avec présence de signes d'atteinte de l'épithélium pulmonaire) n'engendre pas de douleurs ou limitation physiologique chez l'animal au repos sur une période aussi courte (4 semaines). Le laryngoscope utilisé pour insérer la canule pour l'instillation de LPS est adapté à l'anatomie des animaux (diamètre, longueur) et n'est pas susceptible d'induire de gêne ou souffrance. L'exposition à l'hypoxie se faisant dans une enceinte accueillant les cages d'hébergement qui est installée dans une pièce d'hébergement où les paramètres environnementaux sont régulés, aucune nuisance relative à l'environnement thermique ou lumineux n'est attendu.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de prélever divers tissus et organes d'intérêt étudiés in vitro ensuite.

Remplacement

Nous voulons explorer les conséquences d'une perturbation de la disponibilité en oxygène associées à une inflammation pulmonaire similaires à celles engendrées par la maladie respiratoire, sur des tissus périphériques comme les muscles squelettiques en utilisant un modèle combinant une hypoxie et une inflammation environnementale reproduisant les principales conséquences de la maladie respiratoire chronique. Cette relation inter-organes n'est pas possible sur un modèle autre que l'organisme entier. En raison de la quantité de tissus nécessaire pour un rendement d'isolement de mitochondries musculaires ou de fibres perméabilisées suffisant, nous avons choisi le rat qui propose une taille adaptée, par rapport à la souris.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux pour atteindre le seuil de significativité lors de l'analyse statistique des résultats avec une puissance de test cible de 0.8. Les méthodes d'exploration utilisées introduisent une variabilité qui reste limitée à 5%. Les changements attendus sur les paramètres mesurés sont de l'ordre de + ou - 15% par rapport à la valeur moyenne contrôle. Avec ces différents critères pris en compte, notre approche statistique donne un calcul d'effectif de 10 animaux par groupe. Par mesure de précaution, afin de tenir compte des aléas expérimentaux, nous incluerons 12 animaux par groupe soit un total de 48. Nous profiterons de ce protocole pour prélever et stocker des tissus qui ne seront pas directement utilisés dans ce projet. Cependant, ils seront stockés pour éventuellement être analysés dans le cadre d'un projet portant sur le foie, évitant de reconditonner de nouveaux lots d'animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe, en cages ouvertes, avec un enrichissement du milieu (cachettes, litière) dans des locaux où les paramètres d'ambiance (température, hygrométrie, lumière, cascades de pression) sont suivis et enregistrés en continu, avec remontée d'alarme en cas d'écart avec les valeurs de consigne. L'exposition à l'hypoxie sera réalisée dans le même matériel d'hébergement, dans une enceinte pouvant accueillir plusieurs cages de plusieurs animaux. L'instillation intra-trachéale se fera après une légère anesthésie gazeuse d'une durée maximale de 2 min/session et l'animal sera observé jusqu'à son réveil complet avec de retrouver ses congénères. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long du projet et évalué grâce à une grille codifiant les symptômes observés 2 fois par jour après chaque procédure ou 3 fois par jour en cas de symptômes cliniques jusqu'à leur disparition ou la mise à mort de l'animal. Les gestes techniques seront réalisés par des personnes compétentes et formées pour leur exécution. Ceux-ci comprennent l'observation de l'apparition éventuelle de signes cliniques (troubles du comportement, prostration, manque de toilettage) ou une perte de poids supérieure ou égale à 20% de leur poids de départ. Ils seront alors mis à mort et exclus de l'étude. Un examen post-mortem sera pratiqué pour identifier d'éventuelles lésions pouvant expliquer cet état afin de trouver des mesures de correction pour de futurs projets. Le volume à instiller sera limité à 1 µL/g de poids corporel.

Choix des espèces

Ce projet porte sur les conséquences d'une exposition environnementale à l'hypoxie et/ou à une inflammation pulmonaire sur le tissu musculaire squelettique. Le seul moyen d'étudier ce dialogue interorganes et l'influence d'un tissu ou d'un organe sur le fonctionnement d'un autre est d'utiliser l'organisme entier. Il n'existe actuellement aucune alternative scientifiquement validée. Le rat de laboratoire est l'espèce la plus adaptée car sa taille adulte permet d'obtenir des quantités de muscle adaptées aux mesures à réaliser, limitant le nombre d'animaux à utiliser par rapport au recours à d'autres espèces plus petites (souris..). De plus, la littérature scientifique montre que cette espèce présente des signes d'adaptation musculaire et cardiaque à ces facteurs environnementaux semblables à ce que l'on peut observer chez l'être humain dans un contexte de maladie respiratoire chronique, en faisant ainsi un modèle d'étude pertinent. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte moyen (âge en début de projet : 6 à 8 mois), de façon à se rapprocher de l'âge moyen d'apparition de la maladie respiratoire chez l'homme (âge adulte moyen) correspondant à l'entrée dans la 2ème partie de la vie.

448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intra-péritonéales puis une instillation de bléomycine dans le nez, une substance qui déclenche l'inflammation puis la fibrose du poumon, avant d'être mises à mort le jour même de l'administration. Le projet cherche à montrer qu'un récepteur qu'elles expriment, une fois activé, réduit la fibrose pulmonaire, dans l'espoir lointain d'une nouvelle approche thérapeutique. Le porteur indique que les cultures de cellules ne reproduisent pas la complexité des interactions in vivo et juge "nécessaire" le recours à la souris.

Objectifs

De nombreuses maladies pulmonaires interstitielles pouvant évoluer vers la fibrose pulmonaire existe chez l’homme et actuellement il n’existe pas de traitement permettant de guérir la fibrose ; Seuls 2 traitements sont utilisés et ils permettent uniquement de ralentir la progression de la maladie. Nous avons identifié un récepteur exprimé par toutes les cellules dont l'activation permet la mise en place de réponses immunitaires anti inflammatoires et développé une molécule qui active ce récepteur. L'objectif de ce projet est de démontrer que c'est bien l'activation de notre récepteur d'intérêt qui conduit à la diminution de la fibrose pulmonaire chez la souris. Ceci permettrait à terme de développer une nouvelle approche thérapeutique pour traiter les fibroses pulmonaires.

Bénéfices attendus

Ce projet amènera une preuve importante certifiant que l’activation de notre récepteur dans des pathologies inflammatoires et fibrotiques peut être bénéfique, contrairement à ce qui est connu à ce jour. La mise au point de cette nouvelle technique d’étude de l’activation de notre récepteur pourrait être utilisée dans plusieurs autres pathologies pulmonaires, mais aussi être adaptée à d’autres organes. Cette technique permettrait de détecter réellement et efficacement l’activation de notre récepteur in vivo. En effet, aujourd’hui seules les voies de signalisation en aval du récepteur d’intérêt sont étudiées, or ces voies sont communes à l’activation de nombreux récepteurs cellulaires.

Procédures

Les animaux anesthésiés (diminution du stress) seront soumis à une injection par voie intranasale de petits volumes de solution. Ces solutions sont indolores pour l'animal et le geste ne dure pas plus d'une minute. 192 animaux recevront 2 injections intrapéritonéales (ip) à 30 minutes d’intervalle (1 ip flanc droit, 1 ip flanc gauche) suivi d’une instillation par voie intranasale (25 ul narine droite, 25 ul narine gauche). 256 animaux recevront 1 injection intrapéritonéale suivie d’une instillation par voie intranasale (25 ul narine droite, 25 ul narine gauche). Ces injections et instillations sont très bien supportées par les animaux et le geste technique dure une dizaine de seconde à chaque fois.

Impact sur les animaux

L’administration par voie intranasale de petits volumes (25ul par narine) de liquide est certainement désagréable, mais non létale. La littérature montre que l’administration de bléomycine induit une inflammation marquée du poumon qui précède la fibrose (visible à partir du 14ème jour) et que cette dernière est associée à une mortalité de l’ordre de 30% (Jiang D, 2005 PMID 16244651). Néanmoins, malgré ce taux de mortalité élevé, ce modèle reste le modèle de choix pour étudier l’incidence de l’intensité inflammatoire sur l’apparition des fibroses pulmonaires. Dans ce projet, les souris seront mises à mort le même jour que l’administration de la bléomycine, s’affranchissant ainsi des effets létaux et sévères de la bléomycine sur le bien-être animal.

Devenir

tous les animaux sont mis à mort à la fin de chacune des deux procédures

Remplacement

Nous avons utilisé des cellules en culture pour définir les concentrations actives de nos molécules. Néanmoins l'utilisation de cellules en culture ne permet pas de mimer la complexité des interactions cellulaires et moléculaires nécessaire à la caractérisation de l'activation de notre récepteur.

Réduction

Une étude de la littérature a été menée pour s'assurer de la non-reproduction de résultats. L’étude statistique prévisionnelle nous permet de prédire le nombre minimal d’animaux qu’il faut inclure par groupe expérimental.

Raffinement

Nous avons montré l’absence de toxicité de nos composés et de leur véhicule sur des cellules en culture et sur des animaux vigiles. Nous utilisons une technique basée sur l’instillation de bléomycine par voie intranasale, cette technique évite une chirurgie. L’instillation est réalisée sur des souris anesthésiées pour diminuer leur stress et nous utilisons un tapis chauffant pour reverser l’hypothermie associée à l’anesthésie. Pour limiter au maximum la souffrance des souris nous avons établi une grille d’observation qui liste les mesures prises pour assurer le bien-être et nous avons défini des points limites à partir desquels les mesures sont prises pour limiter la souffrance de l’animal ou arrêter l’expérience.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur la souris car l’instillation de la bléomycine chez la souris mime l’état inflammatoire et fibrotique des patients atteints de fibrose pulmonaire. Ayant montré dans le cadre d'un projet antérieur que les modulateurs positifs de notre récepteur d'interet inhibent la fibrose pulmonaire, il est important de démontrer son activation dans les mêmes conditions. Les souris mâles seront mises en expérimentation à un âge de 8 semaines. A cet âge, le système immunitaire des souris est mature et les souris développent une inflammation et une fibrose pulmonaire après l’exposition à la bléomycine .

700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le SRAS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie, reçoivent des injections répétées et des prélèvements sanguins rétro-orbitaux, pour étudier les atteintes cérébrales de la Covid et tester des traitements. Le porteur indique que l'infection peut entraîner une perte de poids allant jusqu'à 20 % et se révéler mortelle en sept jours, avec atteinte du système nerveux central et chute des capacités motrices et respiratoires, les souris M83 développant en plus une paralysie spontanée. Il affirme que l'étude de la physiopathologie ne peut se faire sans inoculer le virus à l'animal vivant, et justifie la mise à mort de toutes les souris par la gestion du risque lié à un agent pathogène de groupe III.

Objectifs

L’émergence de variants de SRAS2 requiert de nouvelles données scientifiques. Des patients continuent à présenter certains symptômes, parfois des mois après leur guérison, et d’autres en développent de nouveaux. Ces symptômes sont regroupés sous le nom de COVID- long. Des signes neurologiques sont observés chez les patients atteints de Covid et pourraient accélérer des pathologies cérébrales à long terme. Par ailleurs, le rôle de la réponse immunitaire innée est questionné dans l’établissement des symptômes de la Covid à court et long terme. Enfin, les mucines, composant du mucus, pourraient avoir un rôle clé dans la diffusion du SRAS2 au sein de la cavité nasale puis vers le tissu pulmonaire. Ce projet a pour objectifs (1) l’étude de la physiopathologie cérébrale des infections à SRAS2, (2) une meilleure compréhension du rôle de la réponse interféron induite par le virus (3) l'exploration du rôle des protéines composant le mucus (mucines) dans l'infection de l'épithélium respiratoire par le SRAS2 et (4) l'évaluation de traitements permettant de diminuer la pathologie cérébrale et l'inflammation à SRAS2. Pour répondre à ces questions, nous utiliserons une souris transgénique qui développe une neuropathologie rappelant la maladie humaine, un modèle de souris qui présente une immunité altérée, et un modèle de souris déficiente pour l'expression de mucines.

Bénéfices attendus

L’étude chez le rongeur des infections à SRAS-CoV-2 et des stratégies de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la COVID-19 et les variants émergents de SRAS-CoV-2. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche. Ce projet va permettre d’évaluer le risque de survenue de troubles de type maladie de Parkinson suite à une infection SRAS-CoV-2, de mieux explorer le rôle de la réponse immune innée dans les infections SRAS-CoV-2 ainsi que de tester des pistes de traitement et de caractériser le rôle des protéines du mucus (mucines) dans l’infection SRAS-CoV-2.

Procédures

Les inoculations par voie nasale sont réalisées sous anesthésie générale. Les administrations par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale ou intramusculaire sont réalisées sur l’animal vigile. Les prélèvements sanguins seront réalisés au sinus rétro orbital sous anesthésie générale et collyre anesthésique. La durée de chacune des interventions décrites est inférieure à 1 minute.

Impact sur les animaux

Selon les données déjà disponibles de la littérature, il a été observé une chute de poids n’excédant pas 20% du poids initial que ce soit suite à une infection avec une souche adaptée à la souris ou un variant du SRAS-CoV-2. Les souris M83 développent spontanément des symptômes. Pour les souris M83, elles seront gardées jusqu’à un âge maximum de 8 mois, sachant que les premiers signes de paralysie spontanés n'apparaissent pas avant l'âge de 8 mois chez ces animaux. Selon la dose administrée et la souche virale considérée l’infection peut s’avérer létale chez la souris transgénique hACE2 à 7 jours post-infection avec une perte de poids et une infection du système nerveux central conduisant à une chute de l’activité motrice et des capacités respiratoires.

Devenir

La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure

Remplacement

L’étude de la physiopathologie de l’infection ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. De plus nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur des évolutions sur le long terme (2 mois) qui ne peuvent être mimés in vitro. En revanche, les stratégies thérapeutiques seront validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées. L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SRAS-CoV-2 sera ainsi entériné par des analyses in vitro. Les essais thérapeutiques seront ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l'innocuité et l’efficacité du traitement.

Réduction

Dans le but de suivre le principe des 3R et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre d’animaux par groupe a été calculé sur la base de notre expérience acquise précédemment et des données bibliographiques (publications scientifiques). Dans notre expérience, des groupes de 6 animaux permettent d’atteindre une significativité statistique. La comparaison des traitements ou entre lignée de souris s’établit à l’aide de tests non paramétriques avec un niveau de confiance de 95%. Les différences entre les groupes seront considérées comme significatives si la valeur P est inférieure à 0,05%. Pour respecter la règle des 3R, les animaux seront utilisés pour plusieurs expériences (études histologiques et moléculaires).

Raffinement

Pour minimiser le stress induit aux animaux, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane avant inoculation intra-nasale du virus. L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et permet d’assurer un réveil rapide en minimisant l’hypothermie. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les souris seront hébergées par 6 dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger.

Choix des espèces

La souris exprimant le récepteur murin ACE2 est sensible à l’infection par les souches adaptée à la souris et certains variants du SRAS-CoV-2. Elle présente l’avantage de pouvoir envisager l’emploi de souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt (surexpression ou suppression) nécessaire à l’exploration des mécanismes biologiques impliqués dans la susceptibilité ou la défense de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale. Les modèles de souris transgéniques exprimant le récepteur humain ACE2 au SRAS-CoV-2 permettent le développement clinique et virologique des infections à l’ensemble des souches circulantes et variants de SRAS-CoV-2. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris de moins de 6 mois au moment de l’infection. Cette tranche d'âge permettra de disposer de lots homogènes des différentes colonies de souris transgéniques. L'âge maximal de 6 mois permet également d'éviter l'apparition de signes sévères associés à l'infection.

30 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par un virus de la grippe porcine par voie trachéale puis, pour certains, par un second virus respiratoire par voie nasale, ce qui provoque fièvre, baisse d'appétit et troubles respiratoires, avant leur mise à mort pour prélever les poumons. L'étude porte sur l'effet de la grippe sur les cellules immunitaires pulmonaires, avec une visée d'élevage et un rapprochement annoncé avec la grippe humaine. Le porteur reconnaît l'existence de modèles in vitro mais les juge trop éloignés de "l'environnement pulmonaire complet".

Objectifs

En élevage porcin, les problèmes respiratoires sont responsables de pertes économiques importantes. Ces troubles sont fréquemment dus à une association d’agents pathogènes et sont alors rassemblés sous le nom de « Complexe Respiratoire Porcin ». Parmi les virus importants impliqués dans le complexe respiratoire porcin figurent les virus de la grippe porcine (swIAV) et celui du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin (PRRSV) qui se retrouvent fréquemment associés en élevage. Pour comprendre les interactions entre ces deux virus, des expériences de co-infections ont été réalisées chez le porc. Ces études ont consisté soit à inoculer les porcs avec les deux virus en même temps ou bien à les inoculer de façon décalée en inoculant d’abord le virus PRRSV puis le virus swIAV quelques jours plus tard. Par ailleurs, la plupart des données récoltées concernent principalement les symptomes, les lésions ou bien la multiplication des virus, mais les réponses immunitaires ont été peu étudiées au niveau des poumons. Notamment, très peu de données sont disponibles sur les macrophages pulmonaires (grosses cellules immunitaires présentes dans le poumon et capables d’ingérer des particules) après infection grippale (swIAV) et/ou infection PRRSV alors que ces cellules font partie de la première ligne de défense contre les agents pathogènes et qu’elles sont la cible principale du PRRSV. Or, des études réalisées chez la souris et le singe ont montré que l’infection par le virus de la grippe pouvait diminuer le nombre de macrophages et influencer leur développement, ce qui pourrait largement influencer le devenir d’une infection ultérieure par un autre virus respiratoire. Dans ce contexte, cette étude a pour objectifs d’évaluer l’impact d’une infection grippale sur la population des macrophages pulmonaires, ainsi que sur les réponses précoces des porcs à une infection secondaire par un virus ayant pour cible ces cellules pulmonaires, à savoir le virus du PRRSV.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude aideront à approfondir les connaissances sur l’immunité pulmonaire chez le porc, plus précisément sur l’impact de l’infection grippale sur les macrophages pulmonaires et sur leur rôle lors d’infections swIAV et PRRSV successives. A terme, ces résultats pourraient permettre d’imaginer de nouvelles stratégies préventives ou curatives des infections virales respiratoires chez le porc ciblant les macrophages. Par ailleurs, compte tenu des similitudes entre les infections grippales chez le porc et chez l’homme, les données récoltées au cours de ce projet pourraient également contribuer à une meilleure compréhension du rôle des macrophages au cours de l’infection grippale chez l’homme.

Procédures

Selon les groupes, les animaux recevront : - du virus grippal swIAV à J0 par voie trachéale puis du PRRSV à J7 par voie nasale (2 groupes de 5 porcs); - du swIAV uniquement à J0 par voie trachéale (1 groupe de 5 porcs); - du milieu de culture à J1 par voie trachéale puis du PRRSV à J8 par voie nasale (2 groupes de 5 porcs); - uniquement du milieu de culture à J1 par voie trachéale (1 groupe de 5 porcs) L’inoculation intra-trachéale prend environ 2 minutes alors que l’inoculation intranasale prend environ 30 secondes. Selon les lots, les porcs seront soumis à : 1/ des écouvillonnages nasaux sur animal vigile : 2 à 5 prélèvements selon les groupes Les écouvillonnages nasaux prennent environ 15 secondes par animal 2/ des prises de sang sur animal vigile : 2 à 5 prélèvements selon les groupes Les prises de sang prennent environ 15 secondes par animal

Impact sur les animaux

Suite à l’inoculation d’un virus grippal par voie trachéale, un épisode de fièvre est attendu, ne persistant guère plus de 4 jours, ainsi qu’une baisse d’appétit pendant les 3 à 4 jours suivant l’infection et des troubles respiratoires (respiration difficile, toux et éternuements) pendant la semaine suivant l’infection. En ce qui concerne l’inoculation par le PRRSV par voie nasale, les signes cliniques attendus se résument à un court épisode de fièvre modérée accompagné d’une légère baisse d’appétit. Chez les animaux co-infectés swIAV/PRRSV, on pourrait éventuellement observer une manifestation clinique légèrement supérieure à celle observée chez les animaux infectés par un seul virus.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour pouvoir récolter les poumons à partir desquels seront collectés les macrophages.

Remplacement

Il existe des modèles d’infection in vitro pour les virus swIAV et PRRSV. Ces modèles reposent le plus souvent sur l’infection d’un seul type cellulaire, notamment l’infection de cellules épithéliales pour le swIAV et l’infection de macrophages pour le PRRSV. Nous avons mis au point un modèle de co-culture cellulaire (cellules épithéliales + macrophages) dans lequel nous évaluons l’effet des infections simultanées ou successives par un swIAV et le PRRSV. Si ces modèles de co-culture cherchent à représenter ce qui peut se produire au niveau de l’arbre respiratoire, ils sont malheureusement encore loin de pouvoir reconstituer la grande complexité de l’environnement pulmonaire complet (manque de nombreux types cellulaires, absence de flore bactérienne, …), d’où l’intérêt d’avoir recours à une étude in vivo.

Réduction

Pour répondre aux objectifs de l’étude, il est nécessaire d’avoir 6 lots d’animaux à comparer : 2 lots inoculés au swIAV puis inoculés au PRRSV 7 jours plus tard (dont 1 mis à mort à 3 j et l’autre à 7 j post-infection PRRSV) ; 1 lot inoculé au swIAV uniquement ; 2 lots inoculés au PRRSV uniquement (dont 1 mis à mort à 3 j et l’autre à 7 j post-infection PRRSV) ; et 1 lot inoculé par du milieu de culture (témoin). Le nombre d’animaux a été déterminé de façon à pouvoir comparer statistiquement les résultats.

Raffinement

Chaque lot sera logé dans une animalerie différente contenant 2 parcs hébergeant chacun 2 ou 3 porcs. Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de toute la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale. En cas d'atteinte d'un des points limites définis préalablement, les animaux seront mis à mort afin qu'ils ne souffrent pas.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du virus influenza porcins et du PRRSV. Les animaux seront sevrés à 4 semaines d’âge et inoculés à 8 semaines et demie d’âge. Cet âge correspond à la fin de la période de post-sevrage, à un moment où le système immunitaire est considéré comme mature. Dans nos conditions expérimentales, nous savons que des animaux de cet âge développent des symptômes grippaux lorsqu’ils sont inoculés par voie trachéale avec un swIAV, c’est pourquoi nous prévoyons d’inoculer les animaux à cet âge, par cette même voie.