Système respiratoire

208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour deux gènes de l'horloge biologique, elles sont gavées cinq jours par semaine pendant trois semaines et placées dans des caissons appauvris en oxygène, en continu ou par cycles reproduisant l'apnée du sommeil, avant une mesure de pression cardiaque et la mort pour prélever les organes. Le porteur indique que l'hypoxie provoque une perte de poids et que les caissons génèrent stress, bruit et fatigue par mauvais sommeil. Il cherche à savoir si le rythme circadien protège de la sénescence pulmonaire et reconnaît que ce rythme s'étudie difficilement in vitro.

Objectifs

L’impact de la sénescence sur le fonctionnement du rythme circadien, et inversement, commence à être mis en évidence dans plusieurs travaux montrant des altérations de l’horloge circadienne avec l’âge, chez l’homme et chez la souris. La sénescence cellulaire correspond à l’arrêt de la prolifération et à la perte des fonctions initiales de la cellule. C’est un phénomène qui peut survenir après différents stress ou bien naturellement au cours des divisions successives. La sénescence cellulaire est aujourd’hui considéré comme un processus important dans de nombreuses maladies liées à l’âge. Les protéines p21 et p16, régulateurs du cycle cellulaire, sont deux des principaux marqueurs de la sénescence. D’autre part, le rythme circadien chez les mammifères est généré par des oscillations de l’expression de gènes spécifiques au niveau cellulaire (gènes circadiens). Rev-Erb alpha et Bmal -1, deux composants clés de l’horloge circadienne, sont capables d’interagir avec p21, indiquant un lien avec le cycle cellulaire, et potentiellement avec la sénescence. Des résultats obtenus dans un modèle d’apnée du sommeil chez la souris montrent une dérégulation de ces gènes circadiens, ainsi qu’une altération de l’expression de p21 dans le poumon. D’autre part, l’exposition de souris à l’hypoxie chronique (pour modéliser l’hypertension artérielle pulmonaire) induit une accumulation de cellules sénescentes dans le poumon. Nous cherchons à déterminer si le rythme circadien joue un rôle protecteur contre la sénescence, dans des conditions normales ou pathologiques. Nous utiliserons pour cela deux modèles de souris dans lesquels les gènes Rev-Erb alpha ou Bmal-1 sont non-fonctionnels. Ces souris seront exposées à l’hypoxie chronique, ou à l’hypoxie intermittente (modèle d’apnée du sommeil) afin de reproduire des conditions similaire à celles observées dans deux pathologies humaines affectant le poumon. Nous traiterons les souris avec une molécule permettant d’éliminer spécifiquement les cellules sénescentes (molécule sénolytique). Cette étude permettra finalement de comprendre : 1) comment est impacté le processus de sénescence cellulaire chez des souris génétiquement modifiées présentant un rythme circadien altéré. 2) comment l'élimination des cellules sénescentes par un traitement pharmacologique corrige les altérations induites par l’exposition au stress hypoxique et par le défaut des gènes circadiens.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations permettront de décrire plus précisément le lien suspecté entre rythme circadien et sénescence, suggéré dans plusieurs travaux récents, ainsi que d’explorer les mécanismes d’interaction entre les deux processus. A terme, cette étude permettra d’envisager de nouvelles pistes thérapeutiques pour agir indirectement sur la sénescence en ciblant le rythme circadien. Comprendre les différents facteurs pouvant impacter la sénescence est important pour pouvoir envisager des traitements et/ou déterminer des facteurs de risques, dans le contexte d’une population vieillissante.

Procédures

Les animaux seront gavés 5 jours par semaine pour les traitements par la molécule sénolytique ou le placebo pendant une durée de 21 jours. Pendant cette durée, ils seront placés dans des caissons à hypoxie et hypoxie intermittente, dans lesquels est injectée de l’azote afin de réduire la concentration en oxygène soit : en continu pour l’hypoxie chronique, afin d’induire l’hypertension artérielle pulmonaire observée chez les patient atteint de broncho-pneumopathie obstructive chronique ; de façon cyclique pour reproduire les cycles d’hypoxie/réoxygénation observés chez les patients atteints d’apnée du sommeil. A la fin de la procédure, les animaux seront profondément anesthésiés et analgésiés pour la prise de la pression ventriculaire, suite à quoi ils seront euthanasiés pour le prélèvement des organes.

Impact sur les animaux

Une perte de poids modérée est attendue pour les souris exposées à l'hypoxie et l'hypoxie intermittente en début de procédure. Les caissons d'hypoxie intermittente peuvent créer un stress dû au bruit généré par la machine et à l'hypoxie au début de l'expérimentation, ainsi qu'une fatigue chez les souris dû à une faible qualité de sommeil. Le gavage est aussi une source de stress pour les souris.

Devenir

L'étude nécessite le prélèvement des organes (poumons, cœur, foie rein, rate) afin de mesurer différents paramètres biologique (quantification des marqueurs de sénescence, expression des gènes circadiens) et histologiques (évaluation de dommages structurels au niveau du poumon) les animaux seront donc mis a mort à la fin des procédures.

Remplacement

Le rythme circadien peut difficilement être étudié in vitro. En effet une fois mise en culture, les cellules ont tendance à perdre l’expression rythmique des gènes circadiens et à se désynchroniser entre elles, ce qui est problématique pour étudier des effets à moyen et long terme. De plus, les modèles de culture cellulaire ne permettent pas de reproduire fidèlement les concentrations d’oxygène qui varient de manière complexe en fonction des organes, tissus et du métabolisme, ce qui est problématique pour étudier un modèle impliquant l’hypoxie et l’hypoxie intermittente, où les changements de la concentration d’oxygène sont récurrents. Cependant, nous utiliserons en parallèle un modèle de culture cellulaire pour étudier l’interaction entre Rev-Erb alpha et p21.

Réduction

Nous choisissons de réaliser des groupes de taille suffisante pour atteindre une puissance statistique satisfaisante, ce qui nous évitera d’avoir à recommencer l’expérience pour cette raison. Par ailleurs, les groupes ont été pensés afin de réduire le nombre d’animaux tout en ayant les contrôles nécessaires à l’analyse correcte des résultats. Dans la mesure du possible, les groupes seront constitués de souris de même sexe, même âge, même portées pour réduire au maximum la variabilité des données. Suite à la collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques.

Raffinement

Les zootechniciens et les investigateurs du projet seront en communication concernant le bien-être et la santé des animaux qui seront surveillés quotidiennement. L'environnement des souris sera enrichi par des maisons ou tube en carton, du papier kraft et du coton. Le gavage sera effectué par un même expérimentateur afin de réduire le stress des souris. Les souris recevront une anesthésie et analgésie adaptée avant la mise à mort. Pendant la durée des procédures, des critères d’évaluation et des points limites adaptés seront utilisés afin de détecter des signes de souffrance, et de procéder si nécessaire à la mise à mort anticipée de l’animal.

Choix des espèces

Les modèles d'hypoxie intermittente et d'hypoxie chronique que nous souhaitons utiliser sont bien décrits dans la littérature, ils ont fait l'objet de plusieurs publications notamment dans le domaine des maladies vasculaires et pulmonaires. On utilisera des souris à partir de l’âge de 2 mois. Le développement pulmonaire continue chez la souris après la naissance, et on considère que ces animaux ont des poumons matures à partir de 2 mois. Nous suivrons leur évolution tout au long des différentes procédures. Nous étudierons également des souris âgées de plus de 18 mois pour évaluer dans quelle mesure l'accumulation de cellules sénescentes altère le rythme circadien.

150 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en cinquante protocoles de trois animaux, ils reçoivent une injection sous-cutanée d'antigène couplé à l'adjuvant complet de Freund puis trois prélèvements de sang, avant mise à mort à dix jours, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur reconnaît que l'injection peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et un inconfort. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et présente la production sur animal vivant comme "indispensable", au service d'une activité commerciale répondant aux "besoins" des laboratoires.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole envisagé est particulier, car il vise à récupérer uniquement les anticorps générés lors d'une réponse primaire. Par conséquent, la procédure expérimentale est plus courte que des protocoles classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et ne nécessitera qu'une seule injection. Les anticorps seront récupérés à l'aide de prélèvement d'échantillons de sang, dont les volumes seront adaptés au poids de l'animal en suivant des recommandations. Le protocole durera 10 jours, ce qui est plus court que les protocoles classiques de 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une subtsance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 50 protocoles sont envisagés.

Procédures

1 injection en sous cutanée de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 2% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J10.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquilisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes sont exposées à la fumée de cigarette deux heures par jour, sept jours sur sept, de l'accouplement jusqu'à la mise bas, et leurs petits, dont certains reçoivent des injections, sont mis à mort pour prélever leurs poumons. Le porteur indique que les souriceaux exposés naissent avec un retard de croissance et une fonction pulmonaire diminuée, l'objectif étant d'étudier la régénération pulmonaire in vitro à partir de ces poumons. Il affirme que l'effet d'une molécule sur un organe "aussi complexe que le poumon" ne permet pas encore le recours à des méthodes de remplacement.

Objectifs

L'exposition au tabagisme actif et passif génère des coûts de santé importants à court et long terme. L'exposition au tabac perturbe la croissance globale et pulmonaire des foetus. Le tabagisme actif pendant la grossesse est un facteur de risque de certaines anomalies congénitales et est associé à un risque accru de mort foetale in utero. Le tabagisme passif pendant la grossesse est associé à un risque de prématurité avec une relation dose-effet. Le tabagisme maternel est aussi associé aux morts inattendues du nourrisson et à une diminution de la fonction respiratoire chez les enfants avec une augmentation de la susceptibilité aux infections respiratoires virales. On sait depuis quelques années que la croissance pulmonaire dans l'enfance impacte la fonction pulmonaire à l'âge adulte. Une croissance perturbée augmente le risque de bronchopneumopathie chronique obstructive à l'âge adulte. L'identification des mécanismes permettant la régénération de la structure pulmonaire chez les fœtus et nouveau-nés exposés au tabagisme passif dès la période in utero est essentielle dans un contexte où aucune thérapie n'est disponible. Nous supposons que la consommation de tabac par la mère pendant la grossesse module les différentes populations de cellules pulmonaires fœtales du micro-environnement . Les capacités du poumon à se réparer seraient altérées conduisant à un développement alvéolaire et bronchique pulmonaire anormal. Ceci serait lié à une altération du contenu en graisses et de son utilisation par les tissus pulmonaires qui contiennent des cellules souches. L'administration de médicaments stimulant ces voies métaboliques reprogrammerait ces cellules. Ceci pourrait contribuer à créer un environnement favorable à la croissance et la multiplication des cellules pulmonaires nécessaires pour induire la régénération alvéolaire chez les fœtus exposés en prénatal au tabac. L’objectif principal est donc de comparer les capacités de régénération alvéolaire des cellules pulmonaires de souris exposées ou non au tabagisme passif, en évaluant leur capacité à former du nouveau tissu pulmonaire in vitro. Dans les objectifs secondaires, nous espérons favoriser la régénération alvéolaire in vitro grâce à des traitements médicamenteux ciblés .

Bénéfices attendus

Nous espérons mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à une diminution de la construction de nouvelles alvéoles et tenter de corriger ce défaut avec des médicaments stimulant le métabolisme et l’assimilation des lipides.

Procédures

Les animaux seront exposés à la fumée de cigarettes ou à de l'air filtré. Les animaux du groupe d’exposition à la cigarette sont exposés à la fumée filtrée grand public avec une machine à fumer. Les animaux sont placés dans une boîte, et les cigarettes sont délivrées de manière cyclique afin d’imiter de près le comportement tabagique typique dans la mesure du possible. Une procédure similaire est utilisée pour les animaux témoins, sauf qu’ils sont exposés à l’air ambiant filtré plutôt qu’aux cigarettes. L’exposition aux cigarettes ou à l’air filtré est faite pendant 2 heures/jour, 7 jours/semaine, en commençant 2 semaines avant l’accouplement et sont poursuivies pendant les 3 semaines de gestation jusqu’à l’accouchement. Des souriceaux seront exposés durant leur "adolescence" aux mêmes procédures. Les souriceaux vigiles pourront recevoir dans les premiers jours de vie une injection intra-péritonéale de médicaments (durée

Impact sur les animaux

L'exposition anténatale au tabac a déjà été réalisée et a montré que la fertilité était la même chez les souris exposées ou non au au tabac. Les portées sont équivalentes en nombre. Les souriceaux dont les mères étaient exposées au tabac lors de leur gestation ont un retard de croissance intra-utérin. Le rattrapage pondéral est complet en trois semaines. Les souriceaux dont les mères ont été exposées au tabac lors de leur gestation ont une diminution de leur fonction pulmonaire sans anomalie du nombre d'alvéoles. Certains animaux vont recevoir des injections médicamenteuses par voie intra-péritonéale.

Devenir

Les souris adultes seront mises à mort au moment où leurs petits seront sevrés. Les souriceaux seront mis à mort pour prélever leurs poumons qui seront étudiés en totalité pour analyse des cellules pulmonaires ou pour des analyses biochimiques.

Remplacement

Le tabagisme pendant la grossesse est associé à un risque accru de faible poids de naissance et de retard de croissance intra-utérin. L'exposition au tabac secondaire a un impact direct sur le développement pulmonaire et la morbidité respiratoire. La manière dont la fumée de cigarette affecte le développement pulmonaire et induit des conséquences à long terme reste à déterminer. Cependant, la consommation de tabac isolée induit rarement chez l’Homme une mort in utero. Le fœtus étant alors souvent porteur d’autres pathologies ce qui rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. D’autre part, les prélèvements pulmonaires humains sont difficilement accessibles dans l’enfance. Dans cette étude, le tabagisme passif chez la souris permettra d’étudier des lésions directement et uniquement liées au tabagisme passif. Les souris adultes seront exposées pendant la gestation exposant les souriceaux dès la période in utero. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. L'étude de l’effet d'une molécule sur un organe aussi complexe que le poumon ne nous permet pas d'utiliser pour le moment de méthodes de remplacement.

Réduction

Les souris gestantes seront exposées pendant toute la gestation au tabac ou à un air filtré (contrôle). Les souriceaux issus de ces souris seront étudiés dans les différentes expériences. Les animaux issus d'une même portée seront tous étudiés pour les différentes techniques choisies. Les animaux seront mis à mort à J21 ou J49 de vie pour étude des modifications fonctionnelles et cellulaires. Un seul animal sera utilisé pour répondre à plusieurs questions en utilisant diverses technologies et notamment les cultures cellulaires. A partir des poumons de souris exposées ou non au tabac, nous récupérerons des fibroblastes et des pneumocytes de type 2 pour générer des organoïdes alvéolaires en culture cellulaire. Nous prélèverons aussi des poumons pour effectuer des analyses biochimiques. Afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées pour ces cultures, les cellules seront congelées à chaque fois que cela sera possible, permettant ainsi de réutiliser les cellules d'une même souris à plusieurs reprises et de multiplier par ce fait les expériences sans nécessité de réaliser de nouvelles mises à morts. Le nombre de souris et de groupes expérimentaux ont été limités au strict nécessaire. La quantité de 6 à 8 animaux / groupe est la quantité adéquate pour nos études immunohistochimiques et moléculaires.

Raffinement

Afin de respecter la règle des 3R (raffiner, réduire, remplacer) dans notre projet, les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière à l'aspect (général et vivacité), la mesure du poids et de la quantité de nourriture ingérée (femelles gestantes) et à l'aspect (trophique et vivacité) et la mesure quotidienne du poids pour les souriceaux. Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. En cas de mal-être, les souriceaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes chez la souris et la mise au point d'animaux génétiquement modifiés est bien développée chez la souris. Les souris ont à la naissance un développement pulmonaire très immature sans alvéole,. Ainsi, l'alvéolisation chez la souris se déroule pendant les trois premières semaines de vie post-natale ce qui en fait un modèle de choix pour l'étude de leurs poumons. Les souris adultes seront étudiées à partir de l’âge de deux mois. Les souriceaux seront étudiés dès la période anténatale et jusqu’à la fin de l’adolescence.

144 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à vingt-trois instillations intranasales d'allergène sous anesthésie et deux injections intra-péritonéales, avant des mesures respiratoires par trachéotomie, pour tester si le blocage d'une enzyme du métabolisme des acides gras réduit le remodelage bronchique dans un modèle d'asthme chronique. Le porteur indique que la sensibilisation peut provoquer une inflammation des voies respiratoires et une dyspnée. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'évolution du remodelage bronchique et conclut au recours à la souris.

Objectifs

L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. Le terme « d’asthme sévère » s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses. Un des besoins non couvert dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Ces exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes d'essoufflement, de toux, de respiration sifflante ou d'oppression thoracique et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Le remodelage bronchique est un changement structurel qui comprend entre autres l’augmentation de la taille du muscle lisse bronchique. La taille du muscle lisse bronchique est une valeur très importante, car son augmentation est associée à une fonction respiratoire dégradée et à un taux d’exacerbation plus élevé. L’objectif de ce travail est d’étudier si le blocage du métabolisme des acides gras par un fragment d’anticorps contre une des molécules de cette chaine métabolique à un moment où tous les signes de l’asthme sont bien développés peut réduire les symptômes de la maladie dans le modèle murin de l’asthme chronique allergique.

Bénéfices attendus

Ce projet montrera si le blocage d’une des molécules qui jouent le rôle important de régulation du métabolisme énergétique dans les muscles lisses bronchiques permet de diminuer les symptômes d’asthme et notamment de remodelage du muscle lisse bronchique chez les animaux de laboratoire. Les données ainsi obtenues ouvriront la voie pour la nouvelle thérapie de cette pathologie respiratoire.

Procédures

Les animaux seront soumis aux vingt-trois (maximum) instillations intranasales sous anesthésie gazeuse (durée jusqu’à 2 minutes) et les deux injections intra-péritonéales de l’allergène (2 injections). Les mesures de paramètres respiratoires d’une durée de 10 minutes seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés dans la procédure sans réveil.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir un léger stress suite aux contentions pour l’injection/l’instillation des allergènes et un bref placement dans une boîte en plexiglass. Les souris ressentiront une légère douleur des piqûres pendant l’injection. L’anesthésie sous isoflurane induit également un léger stress. La sensibilisation aux allergènes induit des symptômes asthmatiques chez l’animal : l’inflammation des voies respiratoires et éventuel remodelage bronchique. Ces symptômes peuvent survenir après l’instillation de l’allergène et éventuellement provoquer une dyspnée (un essoufflement).

Devenir

L’objectif de ce projet est d’estimer l’efficacité de traitement contre le remodelage bronchique dans l’asthme. Suite au développement des symptômes d’asthme, les animaux recevront le traitement et les paramètres respiratoires seront réalisés. Puis les animaux seront mis à mort et les organes seront prélevés et analysés au laboratoire.

Remplacement

En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. Grace au modèle animale, nous testerons les hypothèses apparues après nos résultats in-vitro sur les lignées cellulaires. Il est bien que l'asthme bronchique chez l’homme est une maladie multifactorielle, où les facteurs génétiques, l'âge, les conditions environnementales, l'ontogenèse et l'anamnèse de la maladie jouent un rôle important. Le contrôle de ces facteurs dans nos expériences avec des souris de laboratoire nous permettra de révéler l'effet physiologique réel du blocage du métabolisme des acides gras sur le développement des symptômes de la maladie. L’utilisation du modèle murin d’asthme chronique allergique dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes et à terme de proposer des traitements plus efficaces pour la prise en charge des personnes asthmatiques.

Réduction

Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Nous allons comparer les organes des groupes de souris asthmatiques avec ceux des animaux témoins qui recevront ou non le traitement pouvant diminuer les symptômes d’asthme. Chez une partie des souris de chaque groupe, les paramètres du système respiratoire seront mesurés par pléthysmographie invasive. Comme il a été déjà démontré par nos travaux précédents, les groupes de souris doivent être composés de 10 souris minimum afin de mettre en évidence une différence significative sur les différents paramètres analysés grâce à la pléthysmographie invasive notamment la résistance bronchique dont la variabilité est importante. Dans la deuxième partie des souris de chaque groupe, nous étudierons les processus inflammatoires dans le lavage broncho-alvéolaire (BAL). Dans ce but, nous avons besoin 6 souris dans chaque groupe. Le nombre de souris à inclure a été réduit au maximum selon les tests statistiques définis.

Raffinement

Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupe sociaux, frisottis et bâtonnets), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle induite par les instillations intranasales peut être traitée par la nébulisation pendant 15 s d’un broncho-dilatateur d’action rapide.

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux utilisés sont des femelles. La majorité des études sur l’asthme est menée sur les souris femelles. L’utilisation des femelles permet de rapprocher le modèle murin de la maladie humaine car la sévérité de l’asthme est plus fréquente chez la femme que chez l’homme. Les animaux utilisés pour commencer le protocole sont des jeunes souris âgés de 5 à 10 semaines. La plupart des études scientifiques dans le domaine pneumologique sont réalisées sur les animaux de cet âge.