Système respiratoire

Âgés de moins de sept jours et élevés en environnement stérile, dépourvus de microbiote, des souriceaux sont infectés par le virus respiratoire syncytial. 1 408 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, l'autre moitié un niveau modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les échantillons. Chaque souriceau reçoit jusqu'à quatre administrations d'une bactérie pulmonaire sous anesthésie, avec au minimum trois pesées et un suivi d'un à quatre jours après l'infection. Le porteur écrit que l'infection ne provoque chez le souriceau ni toux, ni détresse respiratoire, ni perte de poids, et retient cette espèce parce que le système immunitaire d'un souriceau de moins d'une semaine ressemble à celui d'un nourrisson de deux mois.

Objectifs

Le virus respiratoire syncitial (VRS) que nous étudions est l’agent principal responsable des infections respiratoires basses, telles que les bronchiolites, qui constituent une cause majeure de morbidité et de mortalité chez le nourrisson. Dès leur première année de vie, 70 % des enfants sont infectés par ce virus, avec un risque accru de complications en cas d'infection précoce (avant 2 mois), de prématurité ou de faible poids de naissance. Ces infections peuvent avoir des conséquences plus tard, comme favoriser le développement de l’asthme. Nous savons que le microbiote (mélange de différents types de bactéries) qui colonise les poumons à la naissance joue un rôle important dans le développement du système immunitaire, mais cela reste encore mal compris. Nous nous intéressons particulièrement à une bactérie pulmonaire qui pourra aider à protéger les nouveau-nés contre le VRS et à limiter les effets délétères de l’infection Nous allons observer comment cette bactérie modifie la structure et le fonctionnement des poumons pendant son développement précoce, et influence la présence de cellules immunitaires pendant les premiers jours de vie. Pour cela, nous utilisons un modèle animal, le souriceau, car il permet d’étudier de façon précise la réaction de l’hôte face au virus. Le système immunitaire d’un souriceau de moins de 7 jours ressemble beaucoup à celui d’un nourrisson de 2 mois en termes d’immaturité immunitaire. Bien que le virus ne rende pas visiblement malade la souris, il provoque néanmoins une réponse immunitaire (recrutement de cellules immunitaires, facteurs inflammatoires solubles, charge virale). Cela en fait un excellent modèle pour nos études. Pour cela, des souris sans microbiote pulmonaire seront traitées avec une souche bactérienne (issue d’un microbiote pulmonaire complet naturellement présent chez la souris) afin d’être utilisée en traitement probiotique pour favoriser l’élimination du virus et limiter les formes graves de bronchiolite.

Bénéfices attendus

En étudiant l’impact d’une bactérie potentiellement probiotique présent naturellement dans les poumons des nouveau-nés, nous espérons découvrir comment elle peut aider à renforcer les défenses naturelles contre ce virus. Les résultats pourraient permettre de : - Mieux protéger les nourrissons contre les formes graves de bronchiolite. - Développer des traitements préventifs à base de bonnes bactéries (appelées probiotiques). - Réduire le risque de développer des maladies respiratoires chroniques comme l’asthme après une infection au VRS. À long terme, ce projet pourrait donc améliorer la santé respiratoire des jeunes enfants et réduire le nombre d’hospitalisations dues au virus étudié.

Procédures

L’infection des souriceaux avec le virus est faite une seule fois et l’administration de la bactérie probiotique est réalisée en quatre sessions sur des animaux anesthésiés (quelques secondes). Les manipulations pour la pesée ponctuelle (20 secondes, maximum 10 pesées (1/jour si signes cliniques et comportementaux le nécessitant) minimum 3 pesées : le jour de la première administration de la bactérie, 3 jours après (infection), et le jour de l’euthanasie. Chaque animal participe à une seule intervention infectieuse et à une ou plusieurs administrations bactériennes (4 au maximum). Le suivi post-infection dure 1 à 4 jours selon les groupes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont modérés et transitoires. Le stress lié aux manipulations (manipulations lors des administrations, pesées ponctuelles) peut apparaître chez les souriceaux, en particulier les plus jeunes. Des manipulations répétées peuvent également occasionner un refroidissement passager ou une séparation temporaire du nid. Les administrations répétées de produit probiotique pourraient provoquer une irritation locale, transitoire dans le site d’administration) Aucun signe clinique majeur n’a été observé lors des études précédentes (activité conservée, comportement alimentaire normal, pas de détresse respiratoire visible). L’infection par le virus respiratoire syncytial ne provoque pas de symptômes cliniques (toux, détresse respiratoire) chez le souriceau. Elle n'entraîne ni perte de poids, ni détresse respiratoire, ni prostration. Les mères, bien que non infectées, peuvent être temporairement perturbées par les manipulations des petits. Cette situation peut générer un stress ponctuel.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés permettant la collection des échantillons nécessaires à l’analyse de la réponse immunitaire et de la réduction de la charge virale.

Remplacement

Il n’existe, pour l’instant, aucun outil in vitro complet permettant d’étudier l’interaction entre le compartiment pulmonaire et le système immunitaire chez le nouveau-né. Cependant, les tests in vitro réalisés sur cellules et explants pulmonaires ont permis la sélection d’une souche bactérienne ayant démontré une efficacité dans ces systèmes simples. L’efficacité de la souche bactérienne doit être testée in vivo dans un système complet pour démontrer son efficacité sur le système immunitaire qui permet de lutter contre l’infection par le virus respiratoire qui infecte les nouveau-nés.

Réduction

Le nombre minimal d’animaux déterminé par le calcul de puissance statistique permet de déterminer, si elle existe, une différence statistique entre les groupes traités et les groupes contrôles.

Raffinement

Le stress lié à la manipulation des souriceaux est limité par des gestes brefs, réalisés par du personnel expérimenté, sur une surface tiède et avec un temps de séparation du nid aussi court que possible. Les manipulations sont planifiées de manière à minimiser leur fréquence, et chaque souriceau est replacé dans le nid avec précaution afin d’éviter tout rejet par la mère. Des points limites précoces ont été définis pour assurer une prise en charge rapide en cas de signe de souffrance, comprenant trouble alimentaire, retard de croissance observé, comportement anormal (éviction du nid, hypotonie). Les administrations virales et probiotiques se font sous anesthésie. Les souriceaux sont replacés individuellement dans leur nid d’origine, avec manipulation douce et rapide, afin de limiter les perturbations et éviter tout rejet maternel.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser des souriceaux âgés de moins de 7 jours, car ils possèdent un système immunitaire immature semblable à un nourrisson humain de 2 mois. La souris présente également des avantages techniques importants : elle permet de travailler dans un environnement bien contrôlé (ici en travaillant avec des souris sans microbiote donc dans un environnement stérile), d’utiliser des outils génétiques avancés, et d’avoir accès à des virus modifiés exprimant des protéines visibles (comme une lumière ou une couleur), facilitant le suivi de l’infection dans les poumons. Ce modèle permet ainsi de reproduire la fenêtre de vulnérabilité immunitaire observée chez les nourrissons face aux infections respiratoires comme la bronchiolite (qui se contracte majoritairement avant 3 mois chez nourrisson humain).

Infectés au sixième jour de vie par le virus respiratoire syncytial, séparés de leur mère pour recevoir jusqu'à quatre administrations d'une bactérie candidate entre le deuxième et le neuvième jour, les souriceaux sont manipulés sous anesthésie. 5 184 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, l'autre moitié un niveau modéré. Le porteur qualifie ces manipulations de rapides, non invasives et sans douleur ni détresse, alors que 2 592 animaux sont déclarés en souffrance modérée. Tous sont tués pour prélever les échantillons servant à mesurer la réponse immunitaire et la charge virale.

Objectifs

Le virus respiratoire que nous étudions est l’agent principal responsable des infections respiratoires basses, telles que les bronchiolites, qui constituent une cause majeure de morbidité et de mortalité chez le nourrisson. Dès leur première année de vie, 70 % des enfants sont infectés par ce virus, avec un risque accru de complications en cas d'infection précoce (avant 2 mois), de prématurité ou de faible poids de naissance. Ces infections peuvent avoir des conséquences plus tard, comme favoriser le développement de l’asthme. Nous savons que les microbes qui colonisent les poumons à la naissance jouent un rôle important dans le développement du système immunitaire, mais cela reste encore mal compris. Ce projet vise à comprendre comment les bactéries présentes dans les poumons à la naissance influencent la santé et la réaction du corps face au virus étudié. Nous allons observer comment ce microbiote modifie la structure et le fonctionnement des poumons, et influencent la présence de cellules immunitaires pendant les premiers jours de vie. Pour cela, nous utilisons un modèle animal, le souriceau, car il permet d’étudier de façon précise la réaction de l’hôte face au virus. Le système immunitaire d’un souriceau de moins de 7 jours ressemble beaucoup à celui d’un nourrisson de 2 mois. Bien que ce virus ne provoque pas de signes cliniques nets chez la souris, il induit une réponse immunitaire antivirale et inflammatoire reproductible, impliquant les mêmes types de cellules immunitaires. Ces réponses sont comparables à celles observées chez le nourrisson dans la phase précoce de l’infection. Le modèle murin permet donc d'étudier les mécanismes précoces de reconnaissance virale, de recrutement cellulaire, et les facteurs de la susceptibilité néonatale. Cela en fait un excellent modèle pour nos études. Nous nous intéressons particulièrement à certaines bactéries pulmonaires qui pourraient aider à protéger les nouveau-nés contre ce virus et à limiter les effets délétères de l’infection.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à mieux comprendre pourquoi certains bébés sont plus vulnérables aux infections respiratoires comme la bronchiolite causée par le virus VRS. En étudiant le rôle du microbiote présent naturellement dans les poumons des nouveau-nés, nous espérons découvrir comment ils peuvent aider à renforcer les défenses naturelles contre ce virus. Les résultats pourraient permettre de : - Mieux protéger les nourrissons contre les formes graves de bronchiolite. - Développer des traitements préventifs à base de bonnes bactéries (appelées probiotiques). - Réduire le risque de développer des maladies respiratoires chroniques comme l’asthme après une infection au VRS.À long terme, ce projet pourrait donc améliorer la santé respiratoire des jeunes enfants et réduire le nombre d’hospitalisations dues au VRS.

Procédures

Dans ce protocole, les souriceaux recevront deux types d’interventions : une exposition unique au virus (à J6 de vie) et jusqu’à quatre administrations d’une souche probiotique candidate, entre J2 et J9, selon le groupe expérimental. Ces manipulations sont réalisées sous anesthésie légère, sont rapides (quelques secondes), non invasives, et ne génèrent ni douleur ni détresse. Les animaux sont immédiatement replacés dans leur nid auprès de leur mère, ce qui limite fortement le stress. Les souriceaux sont pesés au premier et dernier jour du protocole expérimental. Des pesées peuvent être effectuées ponctuellement, en cas de doute sur la prise alimentaire ou le développement (20 secondes, entre 3 et 10 pesées au maximum.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont globalement modérés et liés aux manipulations nécessaires à l’infection et aux procédures de suivi. Les manipulations peuvent générer un stress transitoire, en particulier chez les très jeunes souriceaux. Réaction locale au niveau de la voie d’infection: les administrations répétées peuvent provoquer une irritation locale, transitoire.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la collection des échantillons nécessaires à l’analyse de la réponse immunitaire et de la réduction de la charge virale.

Remplacement

Il n’existe, pour l’instant, aucun outil in vitro complet permettant d’étudier l’interaction entre le compartiment pulmonaire et le système immunitaire chez le nouveau-né. Cependant, les tests in vitro réalisés sur cellules et explants pulmonaires ont permis la sélection d’une souche bactérienne ayant démontré une efficacité dans ces systèmes simples. L’efficacité de la souche bactérienne doit être testée in vivo dans un système complet pour démontrer son efficacité sur le système immunitaire qui permet de lutter contre l’infection par le virus respiratoire qui infecte les nouveaux-nés.

Réduction

Le nombre minimal d’animaux utilisés par groupe est de 6 (déterminé par test de puissance statistique), permettant de déterminer, si elle existe, une différence statistique entre les groupes traités et les groupes contrôles.

Raffinement

Le stress lié à la manipulation des souriceaux est limité par des gestes brefs, , sur une surface tiède (friction manuelle, plateau chauffant) et avec un temps de séparation du nid aussi court que possible. Les manipulations sont planifiées de manière à minimiser leur fréquence. Des points limites précoces ont été définis pour assurer une prise en charge rapide en cas de signe de souffrance.Les administrations virales et probiotiques se font sous anesthésie. Les souriceaux sont replacés individuellement dans leur nid d’origine, avec manipulation douce et rapide, afin de limiter les perturbations et éviter tout rejet maternel.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris de laboratoire, et plus précisément des souriceaux âgés de moins de 7 jours, car ils représentent un modèle très proche du nourrisson humain sur le plan immunitaire. Chez l’Homme, les formes les plus graves de bronchiolite à virus respiratoire syncytial touchent surtout les bébés dans la fenêtre post-natale de 2 mois. Le système immunitaire d’un souriceau de moins d’une semaine fonctionne de manière similaire à celui d’un bébé humain de cet âge, ce qui en fait un modèle adapté pour comprendre comment les défenses du corps réagissent aux infections à ce stade de la vie. La souris présente également des avantages techniques importants : elle permet de travailler dans un environnement bien contrôlé, d’utiliser des outils génétiques avancés, et d’avoir accès à des virus modifiés exprimant des protéines visibles (comme une lumière ou une couleur), facilitant le suivi de l’infection dans les poumons.

Tester les candidats médicaments d'un client donneur d'ordre suppose ici de provoquer une inflammation pulmonaire aiguë par administration de lipopolysaccharide bactérien. 1 944 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal peut recevoir jusqu'à trente administrations du composé testé et deux prélèvements sanguins sur animal vigile, une partie subissant en fin d'étude une pléthysmographie invasive sous anesthésie profonde, sans réveil. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" d'évaluer les candidats médicaments sur un "organisme vivant entier", et précise que le client s'engage par contrat à avoir eu recours en amont à tous les modèles "nécessaires".

Objectifs

Les lésions pulmonaires aiguës (ALI : Acute Lung Injury) sont considérées comme une sorte de syndrome clinique critique. Le lipopolysaccharide (LPS) est le composant majeur de la membrane des bactéries Gram négatif. De nombreuses études ont indiqué que les infections à ces bactéries sont parmi les causes les plus importantes des lésions pulmonaires aiguës, et que le LPS peut entraîner des lésions pulmonaires et une réponse inflammatoire. Des études ont démontré que l'administration de LPS peut induire la production de médiateurs inflammatoires. Par conséquent, le but de ce projet est de tester de nouveaux traitements contre l'ALI induite par le LPS. Ce projet est un renouvellement, par conséquent le modèle est bien connu et maitrisé.

Bénéfices attendus

Il n’existe pas encore de pharmacothérapie spécifique aux lésions pulmonaires aiguës (ALI) ayant un effet significatif et uniforme sur le développement de la maladie et la mortalité, bien que les essais précliniques aient montré des résultats prometteurs. Ce projet a pour but de tester de nouveaux médicaments à visée anti-inflammatoire permettant de diminuer ou d’inhiber le développement de la maladie en réduisant l’inflammation pulmonaire. Nous avons pu identifier, dans notre précédent projet, l'effet bénéfique d'une molécule sur la résistance pulmonaire. Grâce à ce nouveau projet, nous espérons pouvoir en identifier de nouvelles ayant également des effets anti-inflammatoires.

Procédures

Administrations de composé: maximum 30 administrations (30 secondes/souris); Prélèvements de sang: maximum 2 prélèvements (30 secondes/souris, maximum 1 prélèvement par semaine) durant l'étude sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal (30 secondes/souris). Dans certains cas, les animaux vont être soumis à la pléthysmographie invasive sous xylasine/kétamine (anesthésie profonde) (durée: 15 minutes, analyse en terminale sans réveil). Une étude d'efficacité de composés durera au maximum 21 jours dans cas d’un traitement préventif ou maximum 6 jours dans le cas d’un traitement curatif.

Impact sur les animaux

Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie (pic inflammatoires situé de 3.5h à 24h post administration). La douleur pourra générer une perte de poids (2-5% sur 24h) et être quantifiée par des scores attribués quotidiennement (pesée quotidienne). Aucune nuisance n’est attendue lors de l’induction mis à part un léger stress dû à la manipulation. L’administration de traitement par injections répétées (1 à 2x /j ou 2x/semaine pour les i.v.) pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Pour les traitements en gavage (1 à 2x /j), aucune douleur n'est attendue mis à part un léger stress (quelques secondes) lié à la contention des animaux. Le produit injecté va permettre, selon l’efficacité des molécules, de réduire la maladie (douleurs inflammatoires). Sur les études réalisées lors de la DAP précédente, 99% de animaux étaient en gravité réelle légère et 1% en gravité modéré. Aucune nuisance n'avait été relevée. Lors de l’analyse de la capacité respiratoire, la douleur sera prise en charge par l’ajout d’un analgésique en plus du cocktail de l’anesthésie général. Le rythme cardiaque est régulier et monitoré durant tout l’enregistrement. De plus les animaux seront mis à mort avant réveil, n’engendrant par conséquent aucune douleur post-opératoire

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques.

Remplacement

Nous proposons dans ce projet de mettre en place un modèle d’inflammation pulmonaire chez la souris afin de pouvoir tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies. Les méthodes substitutives à l’expérimentation animale telle que la culture cellulaire, les organoides ou la modélisation informatique ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidats médicaments. Les études in vitro ne permettent pas l’étude des intéractions systémiques (inflammatoires, immunitaires) intervenant dans la maladie. Il est indispensable d’évaluer les candidats médicaments sur un organisme vivant entier. Les effets d’un médicament relèvent en effet de mécanismes extrêmement complexes, qui impliquent la plupart du temps de nombreux organes, interagissant les uns avec les autres. Ces tests permettront notamment de déterminer la dose optimale à administrer lors des essais cliniques qui suivront. Le client donneur d’ordre s’engage sur le contrat signé auprès de notre EU à avoir eu recours à tous les modèles nécessaires, s’ils existent, en amont de l’étude afin de limiter l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire (n=12/groupe maximum, nombre validé par l’expérience acquise des dernières années), dû à la variabilité individuelle observée pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés seront: - le test de Kruskal-Wallis non paramétrique (comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable) - ainsi que la 2way ANOVA (comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 2 variables)

Raffinement

Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, un analgésique sera administré. Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec des cylindres de coton, des frisures kraft ainsi que des dômes/tunnels et objet de rongeage en bois dès leur arrivée permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress de l’animal et faciliter la thermorégulation de l’animal. Dans le cas d'une analyse de la capacité pulmonaire, la pléthysmographie sera effectuée sous anesthésie générale avec administration d'un analgésique et anesthésique local. La température corporelle sera maintenue constante entre 37 et 38°C par un matelas chauffant. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux pour lesquels les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. De plus leur génome possède 99% de similitude avec le génome humain, ne présente aucun gène manquant/supplémentaire pouvant modifier l’intensité de l’inflammation obtenue. Ces souris sont mondialement utilisées, permettant une continuité et un moyen de comparaison unique. Notre modèle a été initialement mis au point et développé à partir de données de la littérature. Ce projet est un renouvellement, le modèle est maintenant parfaitement maitrisé, et nous a permis de réaliser des études avec succès lors du précédent projet. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un poumon avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).

Infectées par des bactéries pathogènes dans les poumons, l'intestin ou la vessie, puis soumises à des gavages et à des instillations intranasales et intratrachéales jusqu'à deux fois par jour, 16 984 souris vont être utilisées, 12 712 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 4 272 un niveau léger. Certaines subissent des prélèvements fécaux deux à trois fois par semaine pendant soixante jours. Le porteur décrit des atteintes brèves, difficultés respiratoires pendant 24 heures au plus, diarrhée pendant 48 heures, "gêne limitée" pour les infections urinaires, tout en prévoyant la mise à mort de toute souris prostrée, ayant perdu plus de 20 % de son poids ou diarrhéique au-delà de deux jours. Aucune ne sort vivante du projet, le porteur indiquant qu'elles sont devenues porteuses potentielles de la bactérie et que la plupart doivent être tuées pour l'analyse de leurs organes vitaux.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de faire avancer les connaissances sur l’utilisation thérapeutique des bactériophages. Les bactériophages sont des virus qui infectent uniquement les bactéries et qui peuvent être utilisés pour traiter des patients infectés par des bactéries résistantes aux antibiotiques. De plus, les bactériophages font partie de la flore microbienne naturelle au même titre que les bactéries. Très abondants dans le tube digestif des animaux ils jouent un rôle important dans le maintien de la santé de l’appareil digestif. Leur utilisation (transplantation virale) pour rétablir une homéostasie intestinale est soutenue par des données cliniques préliminaires encourageantes. Ainsi, ce projet nous permettra d’étudier les interactions dynamiques entre les bactériophages et les bactéries dans trois organes cibles : les poumons, les intestins et la vessie. Les connaissances qui seront acquises permettront de mieux appréhender le potentiel thérapeutique des bactériophages dans le but de permettre leur utilisation plus large en clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont directement liés à l’utilisation thérapeutiques des bactériophages. Aujourd’hui le nombre de personnes en situation d’impasse thérapeutique et qui ont accès à titre compassionnel à la phagothérapie augmente faiblement car nous manquons de données expérimentales pour soutenir les meilleures conditions d’utilisation. Ce projet permettra à terme de fournir les éléments de compréhension sur les mécanismes impliqués dans l’efficacité de la phagothérapie. Nous apporterons aussi des informations relatives à la dose, la fréquence et la voie d’administration les plus appropriées. De même, nous appréhenderons le rôle du système immunitaire dans l’efficacité des traitements. A terme, le déploiement à plus grande échelle de la phagothérapie repose sur les données que nous pourrons obtenir au cours de ce projet.

Procédures

Les prélèvements sur animaux vigiles seront limités à un seul prélèvement sanguin (quelques secondes) au maximum d’une fois par semaine sur 25 jours, ou des prélèvements fécaux deux à trois fois par semaines pendant 60 jours au maximum avec parfois un suivi plus fréquent jusqu’à deux fois par jour pendant 5 jours (chaque animal est placé dans une boite pendant quelques minutes pour collecter les feces). Les administrations par gavage (quelques secondes) ainsi que les instillations intranasales et intratrachéales seront limitées à 2 par jour.

Impact sur les animaux

Les animaux qui seront infectés par des bactéries pathogènes subiront un stress en relation avec l’organe étudié. Lors d’infections pulmonaires les animaux présenteront des difficultés respiratoires pendant une durée maximale de 24h. Lors d’une infection intestinale, des signes de diarrhée peuvent persister pendant 48h au maximum. Ces situations peuvent provoquer un défaut d’alimentation induisant une baisse de la mobilité. Les infections urinaires seront quant à elles d’une courte durée (24h au plus) et induiront une gêne limitée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptibles de la transmettre s’ils étaient réutilisés. De plus, la plupart d’entre eux seront sacrifiés pour analyser des organes vitaux.

Remplacement

L’évaluation des différents points évoqués dans le résumé du projet ne peut malheureusement pas s’envisager dans des systèmes in vitro, qui sont inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). Par ailleurs, s’agissant de bactériophages, l’évaluation pharmacocinétique ne peut s’appuyer sur l’existence de modèles mathématiques. De même, l’étude in vitro des communautés microbiennes d’un tube digestif prenant en compte la structuration spatiale des organes n’est pas encore disponible.

Réduction

L’ensemble de ces études s’appuient sur des données préliminaires obtenus in vitro et dont les résultats permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés puisque seuls les éléments les plus pertinents, au regard de la question scientifique posée, sont évalués chez l’animal. D’autre part, autant que possible, le nombre maximal de paramètres sera collecté pour chaque animal de façon à limiter le nombre total d’animaux utilisé. Un maximum de 6 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 3 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. Pour les données quantitatives, la distribution normale des variables sera vérifiée et les tests statistiques appropriés seront alors choisis. Pour les variables qualitatives d’autres tests seront effectués. Les éventuels effets confondants (sexe et cage par exemple) seront pris en compte au moment de l’analyse en utilisant des modèles linéaires à effets mixtes. L’imagerie sera utilisée pour évaluer l’évolution de l’infection in situ, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.

Raffinement

Les animaux infectés seront évalués 2 à 5 fois au cours du premier jour puis au moins une fois par 24h durant les 2 jours suivants puis ensuite une fois par période de 48h. Ils seront pesés au moins une fois par période de 48h dès le début du protocole. Une grille d’évaluation permettra de suivre l’état de santé de chaque animal. Le score de 1 attribué aux animaux présentant une perte de poids supérieure à 10% et ayant une mobilité réduite, déclenchera l’ajout d’un gel hydrique pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Le score 2 sera attribué aux animaux ne bougeant plus et ayant une posture prostrée, ou présentant une perte de poids supérieur à 20%, ou présentant de signes de diarrhée pendant plus de 48h. Tout animal présentant un score de 2 pour l’un des critères sera mis à mort. Au cours des expériences, toute modification des procédures visant à réduire la douleur des animaux (par exemple, réhydratation sous-cutanée, chauffage des cages) sera évaluée avec le SBEA avant d’être mise en place.

Choix des espèces

A ce stade expérimental du développement de la phagothérapie, la souris représente l’espèce la plus pertinente pour l’évaluation des paramètres pharmacocinétiques et l’innocuité du traitement. Il s’agit d’un mammifère dont le système immunitaire est bien connu et comporte de très grandes analogies avec celui de l’homme. L’utilisation d’autres animaux plus proches de l’homme (primates) ou de références en pharmacocinétique (porc Yucutan) ne peuvent représenter des animaux de première intention à ce stade de nos travaux. De même, la disponibilité d’élevages de souris gnotobiotiques est un outil de choix qui n’est pas encore disponible pour d’autres espèces. Enfin les données et les outils disponibles sur le système immunitaire murin sont aussi une raison justifiant le recours à ces animaux. Dans tous les cas, seuls des animaux adultes seront utilisés (>= à 7 semaines) car leur système immunitaire est arrivé à maturité au contraire d’animaux plus jeunes.

2 823 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant passer jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie après avoir été infectée. 2 571 relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Le protocole commence par une encoche dans l'oreille, se poursuit par deux ou trois injections de vaccin à ARN espacées de quatorze jours et des prises de sang, puis par l'inoculation d'une mycobactérie dans la queue, qui provoque une inflammation locale. Le porteur annonce "peu d'effets indésirables" et un "inconfort léger de courte durée", et justifie l'effectif par une "vaste expérience" d'études in vivo validée par des biostatisticiens, sans donner le calcul.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester et de développer de nouveaux vaccins contre des mycobactéries. Ces agents pathogènes constituent une préoccupation croissante pour la santé mondiale en raison de leur résistance aux antibiotiques et de leur propagation continue. L'infection par ces agents pathogènes entraîne une morbidité à vie chez les personnes immunodéprimées, et leur traitement est extrêmement coûteux, long et complexe. Il est urgent de mettre en place de nouvelles stratégies pour prévenir l'infection et réduire l'impact de ces agents pathogènes sur la population mondiale, comme la vaccination. Le besoin de vaccins contre ces agents pathogènes reste non satisfait à ce jour, et il est urgent de mieux comprendre les corrélats immunologiques de protection contre chacune de ces infections. Cette demande concerne l'analyse fonctionnelle de la réponse immunitaire induite par la vaccination et la détermination de l'efficacité des vaccins à ARN contre le développement des infections mycobactériennes. Le projet a pour objectif de développer de nouveau vaccins en utilisant certains progrès technologiques permettant la découverte et la caractérisation non ciblée de nouveaux antigènes bactériens très certainement reconnus par le système immunitaire lui permettant de contrôler l’infection, et d’inclure ces antigènes dans des vaccins à base d’ARN. Le projet est donc de produire des vaccins ARN permettant l’expression des antigènes de ces mycobactéries et de tester l’efficacité de ces vaccins dans des modèles animaux. Les bénéfices du projet seront la production de vaccins protecteurs efficaces contre ces mycobactéries. Une fois défini, ces vaccins pourront être testés dans des essais cliniques chez l’Homme. Il est prévu dans le projet de tester une vingtaine de candidats vaccins pour chacun des pathogènes dans des expériences de protection chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait apporter des bénéfices de santé publique à court et long terme grâce au développement de nouveaux vaccins à ARN ciblant trois importantes mycobactéries non tuberculeuses (MNT). Ces agents pathogènes sont responsables d'infections graves, en particulier chez les personnes immunodéprimées ne disposant actuellement pas de traitement efficace. Bénéfices à court terme : 1. Avancement scientifique dans le développement de vaccins Le projet permettra l'identification et les tests précliniques de nouvelles cibles antigéniques pour le développement de vaccins à ARN. Il favorisera également le développement d'un nouveau processus de développement de vaccins contre les agents pathogènes mycobactériens, et pourrait être appliqué à divers agents pathogènes bactériens. 2. Évaluation des réponses immunitaires et de la protection En évaluant systématiquement les réponses immunitaires et l'efficacité protectrice dans un modèle murin, le projet identifiera les antigènes des agents pathogènes mycobactériens conduisant à une immunité protectrice. Ces connaissances amélioreront également notre compréhension des interactions hôte-pathogène pour les infections étudiées. De plus, l'étude des réponses immunitaires permettra de mieux comprendre les corrélats immunitaires de la protection contre ces pathogènes. 3. Innovation collaborative L'implication de laboratoires européens de premier plan, dotés d'expertises complémentaires, garantit un échange rigoureux de méthodologies et de connaissances. Bénéfices à long terme : 1. Développement de nouveaux vaccins contre les maladies négligées L'objectif ultime d'identifier les candidats vaccins les plus performants pourrait conduire à de futurs essais cliniques et, à terme, à la mise au point de vaccins humains efficaces. 2. Impact sur la santé publique La réduction de l'incidence et de la gravité des infections à MNT grâce à la vaccination pourrait réduire le recours à des traitements antibiotiques de longue durée, souvent mal tolérés et favorisant l'apparition de résistances aux antibiotiques.

Procédures

Toutes les souris utilisées dans ce protocole seront marquées par encoche à l’oreille prenant quelques secondes. Pour les animaux vaccinés, 2 à 3 injections de vaccins prenant une dizaine de secondes par animal. Les injections sont espacées de 14 jours. Si 2 à 4 prélèvements sanguins s’avéraient nécessaires pour nos analyses à deux semaines d’intervalle, ils prendront quelques secondes par animal. Pour certains animaux vaccinés, une injection sera réalisée prenant une dizaine de seconde par animal. L’injection pour l’infection sera réalisée à l’aide d’un dispositif de contention prenant une trentaine de seconde par animal. L’imagerie sera réalisée une fois par semaine après l’infection sous anesthésie et durera une quinzaine de minutes (8 séances d’imagerie au maximum sont prévues). Une autre infection sera réalisée sous anesthésie et ne prendra que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Pour ces études, nous prévoyons peu d'effets indésirables chez les souris. Les animaux reçoivent deux ou trois doses de vaccin, ou une dose de BCG (le vaccin antituberculeux Bacille Calmette Guérin). Il est maintenant reconnu que les vaccins à base d’ARN ou l’injection du BCG n’entrainent qu’un inconfort léger de courte durée sur le site d’injection lié à l’introduction de l’aiguille lors de la vaccination. Dans certains cas rares, les souris présentent une légère réaction inflammatoire localisée au site d’injection suite à la vaccination par les vaccins ARN. Un petit volume de sang sera prélevé une semaine après chaque vaccination et une semaine après l’infection. Les processus de prélèvement sont courts et n’engendreront qu’un inconfort léger de courte durée lié à l’introduction de l’aiguille. Ces prélèvements seront espacés de deux semaines pour faciliter leur récupération. L’infection des souris par des mycobactéries par voie sous-cutanée engendrera lui aussi un inconfort léger de courte durée lié à l’introduction de l’aiguille au niveau de la queue. Une inflammation pourra être observée au niveau du site d’injection. L’infection des souris sous anesthésie n’engendrera qu’un inconfort léger de courte durée.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort car le projet nécessite de faire des analyses sur des organes vitaux. Ces organes ne pourront être prélevés qu’après mise à mort de l’animal.

Remplacement

Ce projet vise à tester l'immunogénicité et l'efficacité protectrice de différentes formulations de vaccins contre divers agents pathogènes. Toutes les hypothèses pouvant être testées in vitro, telles que l'activation des cellules immunitaires ou l'expression de molécules vaccinales, seront d'abord vérifiées à l'aide de lignées cellulaires ou de cellules sanguines. En effet, ces tests invitro permettent d'analyser certaines composantes de la réponse immunitaire à la vaccination. Cependant, aucun modèle in vitro ne peut reproduire intégralement le développement de l'infection ou sa physiopathologie associée car il existe de nombreux éléments inducteurs et régulateurs impliquées dans ces réponses et certains ne sont pas encore connus. Les bénéfices potentiels des vaccins dans la prévention et le contrôle de l'infection, notamment leur capacité à induire une réponse immunitaire protectrice, ne peuvent être évalués de manière fiable que dans un organisme vivant, rendant ainsi l'utilisation d'un modèle animal indispensable pour leur analyse et leur validation.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans cette étude est basé sur une vaste expérience d’études in vivo pour des modèles d’infection et a été validé par des biostatisticiens. Le nombre d’animaux par groupe a ainsi été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs par l’utilisation de tests statistiques adaptés en fonction des expériences et des groupes analysés en prenant en compte la variabilité attendue de chaque paramètre et des expériences pilotes qui nous permettront d’évaluer la dispersion des valeurs individuelles au sein des groupes. Pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, 6 souris par groupe seront utilisées et deux expériences indépendantes, l’une avec des souris femelles et l’autre avec des souris mâles, seront réalisées. Si des différences entre les sexes est observée, une expérience supplémentaire comprenant des femelles et des mâles sera réalisée sur les vaccins les plus efficaces. Par ailleurs, nos protocoles visent à extraire un maximum d'informations de chaque animal en utilisant plusieurs techniques. Nous prélèverons tous les organes d’intérêt et un important volume de sang de tous les animaux de l’étude pour tirer parti de toutes les informations que peuvent nous apporter les animaux utilisés. Nous utiliserons des techniques expérimentales novatrices qui nous permettront d’analyser sur un seul individu de multiples facteurs d’intérêt pour obtenir le maximum d’information pour chaque animal utilisé maximisant ainsi les données tout en minimisant le recours aux animaux. Les études approfondies d'immunogénicité ne seront menées que sur les candidats vaccins les plus prometteurs afin de réduire davantage le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place pour améliorer le bien-être animal : - Les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation à leur nouvel environnement de deux semaines - Pour les souris vaccinées, après la vaccination, un léger massage est réalisé pour permettre la dispersion du vaccin. En cas de réaction inflammatoire au niveau du site d’injection, un traitement local sera réalisé. - Pour les souris infectées, l’infection va engendrer une inflammation localisée sur la queue au niveau du site d’injection. La zone inflammée sera massée avec de l’eau tiède pour soulager l’inflammation. Une litière plus douce à base de cellulose pourra être utilisée. -Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront réhydratés avec une solution de sérum physiologique pour faciliter leur récupération. - Nous avons choisi les temps d’expérience suite à l’infection pour que les animaux ne développent pas la pathologie associée et qu’ils ne soient pas susceptibles de développer des signes d’inconfort et de souffrance. Néanmoins, les animaux seront évalués une à deux fois par semaine. En cas d’apparition de signes d’inconfort des croquettes humides et du gel hydrique seront ajoutés et la surveillance renforcée à trois visites par semaine. Si des signes de souffrance sont détectés, l’animal sera réhydraté avec du sérum physiologique par voie sous-cutané et surveillé une fois par jour. Si les signes persistent pendant plus de 24h, l’animal sera mis à mort. - Si nécessaire, d’autres moyens de raffinement pourront être utilisés pour améliorer le bien-être des animaux comme une augmentation de l’enrichissement et le chauffage des cages.

Choix des espèces

Le modèle murin représente le meilleur compromis éthique parmi les modèles mammifères, avec des résultats proches de ceux de l'homme. Le système immunitaire de la souris est bien caractérisé et largement comparable à ceux de l'homme. De plus, le modèle murin a été largement utilisé pour la recherche sur les réponses immunitaires aux mycobactéries et sur les vaccins. Chacun de ces modèles d'infection a été précédemment publié dans d'autres laboratoires. Par conséquent, les résultats obtenus peuvent être facilement mis en contexte avec la littérature existante et avec nos connaissances préalables sur ces agents pathogènes. Le modèle murin, largement utilisé dans la recherche sur les maladies infectieuses, présente également l'avantage de disposer d'un large éventail de techniques adaptées et de réactifs. Cela nous permet de réaliser des analyses sur un plus large éventail de facteurs, avec un faible échantillonnage de souris. Des souris adultes âgées de 2 mois seront utilisées. À ce stade, le système immunitaire est pleinement développé et nous permet d'évaluer la réponse vaccinale.