Système respiratoire

Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, cessent de se toiletter ou bougent à peine seront mises à mort. 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs poumons. Elles reçoivent des traitements par gavage, par injection dans la veine de la queue et par instillation de gouttes dans le nez sous anesthésie, ainsi qu'une molécule bactérienne qui déclenche une inflammation pulmonaire. Une partie appartient à la lignée Scnn1b, modifiée pour reproduire l'atteinte pulmonaire de la mucoviscidose. Le porteur écrit n'attendre "aucune douleur importante ou stress fort", et renvoie au long terme les retombées annoncées pour les patients.

Objectifs

La mucoviscidose est une maladie génétique caractérisée par une vulnérabilité à l’infection par les microbes de l’environnement qui induit une forte inflammation des poumons, dégradant progressivement cet organe et conduisant à l’insuffisance respiratoire. Une des raisons pouvant participer à la gravité de la réponse inflammatoire est une mauvaise production par ces patients de lipides aidant à résoudre l’inflammation, aussi appelés SPMs. A l’heure actuelle, nous ne comprenons pas encore pourquoi les patients produisent moins de SPMs. Nous étudierons la production de ces SPMs en mimant une infection du poumon. Nous évaluerons aussi si les SPMs peuvent être utilisés pour traiter l’inflammation. Le projet sera utilisé pour définir les protocoles permettant l’étude de ces SPMs dans le contexte d’une inflammation du poumon. Nous utiliserons ici des souris qui reproduisent des symptômes proches des patients vivant avec la mucoviscidose au niveau du poumon pour que notre modèle soit réaliste. Nous nous intéresserons aussi aux différences d’inflammation et de production des SPMs chez les souris mâles et femelles car il existe des différences de l’atteinte respiratoire entre patients et patientes encore inexpliquées. A terme ce projet servira aussi à étudier l’inflammation du poumon après avoir été exposé à la pollution de l’air.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme de ce projet sont : - le développement d’un modèle plus simple, moins contraignant et moins douloureux pour étudier l’inflammation des poumons chez la souris - l’identification de la meilleure façon d’utiliser les SPM pour traiter l’inflammation des poumons. - la compréhension du rôle du système immunitaire et des raisons pour lesquelles les souris atteintes d’une forme proche de la mucoviscidose ne produisent pas assez de SPM. - La description des différences entre animaux mâles et femelles l’inflammation du poumon - L’utilisation des connaissances collectées pour un projet de plus grande ampleur sur l’impact de la pollution de l’air sur la santé du poumon. A long terme, les résultats de cette étude pourront être utilisés pour développer de nouveau traitement de l’inflammation des poumons chez les patients vivant avec la mucoviscidose.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations de traitement en solution soit par gavage, soit par injection dans la veine de la queue soit par aspiration de gouttes par le nez. Conformément aux normes éthiques en vigueur, les deux premiers traitements seront administrés sur souris éveillées, pour le dernier, les souris seront anesthésiées. Ces administrations durent moins de 30 secondes pour le gavage et l'injection dans la veine de la queue et autour de 30 secondes (moins d'une minute) pour l'aspiration de gouttes par le nez.

Impact sur les animaux

Les SPM sont des molécules produites par notre corps de façon naturelle. Elles ne sont pas toxiques et, à ce jour, aucun effet secondaire n’a été observé chez les souris quand elles en ont reçues. Nous ne prévoyons donc pas d’effets indésirables suite à l’utilisation de SPM. De plus, certaines études montrent que les SPM pourraient avoir un effet anti-douleur. Pour provoquer l’inflammation des poumons, nous administrons une solution d’une molécule produite par les bactéries. Cette molécule ne peut pas causer d’infection du poumon mais elle agit comme un signal qui alerte les défenses du corps. Le résultat est une réaction inflammatoire dans le poumon. Cela peut entraîner une perte de poids chez la souris ainsi qu’un inconfort temporaire et une diminution de l’activité. Cependant, aucune douleur importante ou stress fort n’est attendu. Les animaux seront tout de même suivis quotidiennement pour s’assurer de l’absence d’effet néfaste inattendu. Ils seront pesés et observés chaque jour pour détecter tout signe de malaise. Si nécessaire, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage des souris pour faciliter leur alimentation et leur hydratation. Si un animal se trouve dans un état grave imprévu, celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.

Devenir

Les animaux utilisés ici seront mis à mort à la fin des protocoles pour un prélèvement des organes et une analyse de la réponse inflammatoire dans le poumon.

Remplacement

Nous étudions ici un modèle complexe qui repose sur l’interaction entre plusieurs types de cellules, entre différents organes, et le déplacement de cellules d’un organe à un autre. Nous voulons aussi regarder des différences entre mâles et femelles. Malheureusement, à l’heure actuelle seule l’expérimentation sur des animaux vivants permet l’étude de ces différents éléments.

Réduction

Afin d’utiliser le moins d’animaux possible, nous avons lu les études préexistantes et pris en compte leurs résultats pour construire notre projet. Un certain nombre d’expériences ont aussi été effectuées au préalable sur des modèles de cellules pour sélectionner un nombre réduit de SPM à tester dans notre projet sur la souris. Enfin, une étude statistique a été menée pour choisir le nombre minimal de souris à utiliser tout en étant sûr de pouvoir observer toute différence relevante entre nos groupes de souris.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans un environnement adapté où elles disposeront de nourriture et eau à volonté. Les éléments nécessaires pour former un nid et une maisonnette seront fourni dans la cage pour assurer le bien-être des souris. Autant que possible, les souris seront au contact d’une seule personne pour leur permettre de s’habituer à elle et de diminuer leur stress. Le personnel qui manipule les souris est formé pour assurer leur bien-être et leur éviter toute souffrance. Les animaux seront anesthésiés lorsqu'il devront recevoir des traitements par dépot de gouttes sur le nez. Au cours des expériences, les souris seront pesées et observées pour détecter tout mal-être le plus tôt possible et agir en conséquence. Ces observations sur le poids, le comportement et la mobilité des souris, permettront le calcul d'un score clinique spécifique au projet présenté en Annexe 1. Si ce score clinique est élevé les souris des mesure spécifiques au projet seront mises en oeuvre : - Si besoin (faible diminution de la mobilité, perte de poids supérieure à 10%, manque de toilettage) de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage de la souris - Si un animal se trouve dans un état grave imprévu (perte de poids supérieure à 20%, forte diminution de la mobilité, absence de toilettage) , celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour plusieurs raisons : 1. Les souris se reproduisent rapidement, ce qui permet d’avoir assez d’animaux pour l’étude en peu de temps. 2. Le fonctionnement des poumons et du système immunitaire chez la souris est proche de celui de l’humain, ce qui rend les résultats plus utiles pour la recherche médicale. 3. Notre équipe est déjà formée et expérimentée dans le travail avec les souris de laboratoire. 4. C’est l’animal pour lequel on dispose du plus grand nombre d’outils scientifiques pour étudier les tissus, l’inflammation et les SPMs. 5. Cette lignée de souris génétiquement modifiées (appelée Scnn1b) est la seule à reproduire le phénotype pulmonaire des personnes atteintes de mucoviscidose. 6. L'utilisation d'animaux de 8 semaines dans ce projet permet de s'assurer que les défenses immunitaires de l'animal sont complètement développées.

5 450 nouveau-nés, 3 250 ratons et 2 200 souriceaux, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun passant ses quatorze premiers jours de vie enfermé dans une enceinte en hyperoxie pour lui provoquer une hypertension pulmonaire. Leurs mères sont échangées toutes les vingt-quatre heures pour leur éviter l'effet toxique de l'oxygène. Suivent des échographies cardiaques, des mesures de pression cardiaque et une pléthysmographie invasive, sur des animaux gardés jusqu'à un an afin de suivre les séquelles à l'âge adulte. Tous sont tués pour l'extraction du bloc cœur-poumon, le porteur affirmant qu'il est "indispensable" de comprendre les mécanismes de cette maladie et que "seul l'animal entier" permet les interactions entre organes.

Objectifs

La dysplasie broncho-pulmonaire (DBP) est la principale complication liée à la grande prématurité. La DBP peut se compliquer d’une hypertension pulmonaire (HTP-DBP) responsable d’une mortalité importante dans les 2 ans suivant le diagnostic, par défaillance cardiaque droite. Par ailleurs, les altérations pathophysiologiques présentes pendant la période néonatale persistent dans le temps chez les grands prématurés survivants, augmentant leur risque de développer des maladies respiratoires et cardiovasculaires sévères à l’adolescence et à l’âge adulte. Les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’HTP-DBP sont encore méconnus et il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement préventif ni curatif de cette maladie. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. Ainsi, dans ce projet, nous utiliserons des modèles animaux (rats et souris) d’HTP-DBP expérimentale induite par hyperoxie, classiquement décrits dans la littérature et utilisés au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Ces modèles animaux sont les modèles qui reproduisent le mieux la pathologie humaine. Dans ces modèles, nous étudierons de manière longitudinale, l’évolution des altérations pathophysiologiques de l’HTP-DBP à différents âges (jour (J)15, J60, J180 et J365 chez les animaux, ce qui correspond chez l’humain à la période de l’enfance (

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de l’HTP-DBP et leur évolution dans le temps. Cette étude permettra également de mettre en évidence l’effet thérapeutique de substances pharmacologiques sur ces divers mécanismes mis en jeu. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs sera comparée ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme sur les substances bénéfiques identifiées avec un rapport bénéfice-risque minimum pour les patients.

Procédures

Un groupe sera exposé à l’air ambiant (normoxique – groupe contrôle) et un 2ème groupe sera maintenu en hyperoxie chronique dans les 24h suivant la naissance, pour une durée de 14 jours (J). Un échange des mères entre les groupes sera effectué toutes les 24h, afin d’éviter l’effet toxique lié à l’oxygène chez ces mères. La méthode et la fréquence d’injection pendant la mise en place des modèles pathologiques seront ajustées en fonction de la substance considérée. Le protocole préventif sera appliqué dès le début du protocole (au jour 2 de vie des ratons ou souriceaux) et le protocole curatif sera appliqué à la fin des 14 jours d’hyperoxie jusqu’à la fin du protocole J60 (adolescence, 12-18 ans), J180 (jeune adulte, 25-30 ans) et J365 (adulte, 40-50 ans) chez le rat et la souris. Après 14 jours, une partie des ratons/souriceaux sera anesthésiée afin de réaliser des échographies cardiaques (10 minutes/animal), des mesures de pressions cardiaques (10-15 minutes/animal) et des mesures de la fonction respiratoire par pléthysmographie invasive (5-10 minutes/animal) pour diagnostiquer la présence d’une HTP-DBP et en évaluer la sévérité. Tous les animaux auront ces différentes mesures avant l’extraction du bloc-cœur-poumon. Les animaux seront euthanasiés pour l’extraction du bloc cœur-poumon. Des prélèvements de sang pourront être effectués sur certains animaux juste après l’euthanasie et avant de récupérer le bloc cœur-poumon. L’échographie, les mesures hémodynamiques et les mesures de fonction respiratoire permettront également d’évaluer l’efficacité des traitements thérapeutiques. L’autre partie des animaux sera placée en normoxie seule, en présence d’une mère allaitante jusqu’au sevrage puis en condition d’hébergement classique jusqu’à l’âge de 60, 180 ou 365 jours pour le rat et la souris. Durant cette période de « vieillissement », les animaux seront pesés 2 fois/semaine et tous les animaux auront une échocardiographie sous anesthésie générale aux différents temps d’évaluation, y compris ceux qui poursuivent le protocole de « vieillissement » à J60, 180 ou 365. Ainsi, les animaux explorés à J60, J180 et J365 auront au total, respectivement 2, 3 et 4 échographies cardiaques durant le protocole. A l’issue de chaque période de « vieillissement », les animaux seront anesthésiés afin de réaliser des échographies cardiaques, des mesures de pressions cardiaques, des mesures de la fonction respiratoire et des prélèvements de sang et extraction du bloc cœur-poumons.

Impact sur les animaux

L’HTP-DBP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Nous avons une grande expérience du suivi notamment respiratoire des animaux sous des atmosphères en oxygène variées au laboratoire et nous serons particulièrement attentifs aux points limites qui constitueront un arrêt des protocoles. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la mise en place de l’HTP-DBP chez les animaux. Les points d’injection des substances et/ou solvants à tester peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés. Le risque de douleur est le principal effet indésirable des expérimentations in vivo. De ce fait, nous réaliserons systématiquement une analgésie-sédation. Avant de débuter les expérimentations in vivo, la surveillance de la profondeur de l’analgésie-sédation sera réalisée en s’assurant de l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte en réponse au pincement des orteils des membres postérieurs. Le rythme cardiaque et la fréquence respiratoire seront surveillés pour s’assurer également de la profondeur de l’anesthésie. Le changement de mère toutes les 24h peut être source de stress pour les petits.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer le cœur et le poumon pour faire diverses analyses.

Remplacement

Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’HTP-DBP mais des études pourront être réalisées sur des cellules de poumons humains fœtaux en culture, exposées ou non à l’hyperoxie. Ce remplacement du modèle animal par un modèle in vitro permettra d’élucider certains mécanismes intracellulaires sans utiliser d’animaux. Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in/ex vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. Par ailleurs, cette pathologie implique plusieurs organes et plusieurs types cellulaires pulmonaires qui interagissent entre eux et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes et cellules.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux : (1) une partie des utilisateurs utilisera le poumon droit et l’autre partie des utilisateurs utilisera le poumon gauche, (2) une planification des expériences sera établie au long de chaque année d’expérimentation pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal avec utilisation de cellules en culture et enfin, (3) parallèlement à ce protocole, des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines fœtales exposées à l’hyperoxie in vitro pour simuler l’HTP-DBP. Quatre statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur ce projet donc l’utilisation des animaux sera optimisée en concertation avec tous les utilisateurs lors de nos réunions d’équipe hebdomadaires. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (randomisation, travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire, en accord avec les données de la bibliographie, compte tenu des quantités de tissu nécessaires et de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche. Le nombre d’animaux sera également réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs avant la fin de la totalité des séries prévues.

Raffinement

Selon la condition, 12-13 ratons ou 10 souriceaux et 1 mère allaitante seront placés soit dans l’enceinte à hyperoxie soit dans une cage classique. L’enceinte à hyperoxie et la cage classique contiendront une couche de litière suffisante pour absorber l’humidité, des éléments de nidification (coton, papier kraft) et du matériel d’enrichissement (un tunnel rouge et buchettes de bois). L’accès à l’eau et la nourriture sera ad libitum. Les paramètres ambiants (hygrométrie, température) seront contrôlés quotidiennement et conserver sur un registre. Un cycle jour/nuit de 12h sera également appliqué. L’échange quotidien des mères sera réalisé par le même opérateur en utilisant le tunnel mis à disposition dans la cage ou l’enceinte. Les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement. L’enceinte d’hyperoxie sera ouverte tous les jours pour l’échange des mères. A cette occasion, les animaux seront observés et pesés. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. En cas de souffrance ou de détresse persistante au-delà d’une période de 2 h post-administration d’antalgique, une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre. Une grille de scoring pour le suivi des animaux sera mise en place pour chaque animal L’ensemble des expérimentations in vivo sera réalisé sous anesthésie générale. Pour les mesures hémodynamiques un tapis chauffant sera utilisé pour préserver la température corporelle constante durant toute la procédure. Le degré d’anesthésie sera vérifié par l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte au pincement. Des modifications des paramètres physiologiques et notamment la fréquence cardiaque indiquant une souffrance ou une détresse de l’animal conduirait à une procédure d’euthanasie.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces classiquement utilisées pour le développement de modèles d’HTP-DBP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. L’utilisation de la souris permet d’envisager l’utilisation de modèles transgéniques qui sont quasiment absents chez le rat et qui sont nécessaires à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires. De plus, le rat et la souris sont particulièrement adaptés pour modéliser la DBP car au moment de la naissance leurs poumons sont au stade de développement pulmonaire qui correspond au stade de maturation des poumons de nouveau-nés grands prématurés humains et les expérimentations pourront être menées chez des rats/souriceaux nés à terme et ne nécessiteront pas d’induire une naissance prématurée de ces animaux. La première partie de l’étude vise à reproduire une pathologie concernant uniquement les nouveau-nés grands prématurés, les expérimentations concerneront des rats/souris nouveau-nés pendant leurs 14 premiers jours de vie. La deuxième partie du projet portant sur l’évolution longitudinale des anciens nouveau-nés grands prématurés ayant eu une dysplasie broncho-pulmonaire, les expérimentations porteront sur des ratons/souriceaux ayant été exposés pendant 14 jours à l’hyperoxie ou à la normoxie en période néonatale puis laissés en normoxie seule jusqu’à l’âge de 60, 180 ou 365 jours (adolescent, jeune adulte et adulte chez l’homme respectivement).

Une fibrose est provoquée dans les poumons de 1 024 souris par l'administration sous anesthésie d'un produit inducteur. S'ensuivent, selon les lots, un gavage quotidien de J8 à J20 ou sept injections intraveineuses, puis des séances d'imagerie sous anesthésie pouvant durer quarante minutes par souris, cathéter posé. Toutes ces souris, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, sont tuées à la fin pour mesurer la fibrose de leurs poumons par histologie. Le porteur décrit une inflammation des voies respiratoires et une perte de poids dans les jours qui suivent l'induction, puis écrit dans la même rubrique n'anticiper aucun effet indésirable au moment des traitements ou de l'imagerie.

Objectifs

La fibrose pulmonaire est une maladie pour laquelle il n’existe pas de traitements curatifs. Une des limites de la fibrose pulmonaire est le manque de marqueur permettant d’évaluer la réponse aux traitements. Nous avons démontré la possibilité de suivre l’évolution de la fibrose pulmonaire avec une méthode d’imagerie du métabolisme des lipides. Nous devons maintenant valider son utilisation comme outil pour vérifier l’efficacité des traitements actuels ou en développement de la fibrose pulmonaire. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer une nouvelle technique d’imagerie du métabolisme lipidique: 1/ pour le suivi de l’efficacité des traitements approuvés de la fibrose pulmonaire 2/ pour le suivi de l’efficacité des traitements en cours de développement 3/ pour la possibilité de prédire l’efficacité des traitements testés Ce projet permettra de proposer un outil pour prédire et monitorer l’efficacité des traitements de la fibrose pulmonaire afin d’améliorer la prise en charge des patients avec cette maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet seront multiples grâce à une approche complète et robuste basée sur plusieurs modèles expérimentaux. Ce projet vise à améliorer la prise en charge des patients atteints de fibrose pulmonaire. A court terme, nous pensons que l’imagerie du métabolisme lipidique pourra être testée chez des patients avec fibrose pulmonaire pour valider son utilisation dans l’évaluation de l’efficacité des thérapies actuellement en clinique. A plus long terme, notre méthode d’imagerie permettra de faciliter le développement de nouvelles thérapies de la fibrose pulmonaire, au niveau préclinique et aussi des essais cliniques.

Procédures

Les souris recevront une administration d’un inducteur de fibrose. Cette intervention sous anesthésie générale dure 30 secondes maximum. Ce même type d’injection sera également utilisé, de façon répétée, pour l’administration des agents thérapeutiques dans la procédure 2. Aucune nuisance supplémentaire n’est anticipée du fait de la répétition. Une partie des animaux recevra des traitements par gavage oral (100µl, quotidiennement de J8 à J20). Ce geste sera réalisé sur animaux vigiles, après contention, et ne durera pas plus de 10 secondes. Une partie des animaux recevra des traitements par injection intraveineuse (100µl, tous les deux jours de J8 à J20, 7 injections au total). Ce geste sera réalisé après contention, et ne durera pas plus de 20 secondes. Tous les animaux seront suivis par imagerie. L'ensemble de cette procédure s'effectue sous anesthésie. Chaque animal aura un cathéter afin de permettre l’injection intraveineuse du marqueur (100 µl). Ceci n’excède pas 2 minutes par animal. Les animaux seront placés dans le système d’imagerie équipé d’un lit chauffant préchauffé et d’un système d’anesthésie gazeuse.La durée totale de la procédure n’excède pas 40 min par souris. A la fin du protocole, les animaux sont analgésiés puis anesthésiés profondément, avant que soit réalisé un prélèvement sanguin puis leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Entre 2 et 7 jours après l’induction du modèle, une inflammation des voies aériennes peut avoir lieu et elle peut être associée à une perte de poids des animaux. Le modèle de fibrose est associé aussi à une inflammation des voies respiratoires au cours des 6 premiers jours après l’induction. Elle peut être associée à une perte de poids des animaux. Les administrations intraveineuses peuvent induire un stress lié à la contention ainsi qu’une douleur brève (1 sec) au moment de l’insertion de l’aiguille. Lors des réveils de l’anesthésie, les animaux connaissent quelques minutes de désorientation, rapidement résolues par la reconnaissance de leur environnement. Nous n’anticipons aucun effet indésirable après administrations des traitements anti-fibrotiques, ou à l’étape d’imagerie.

Devenir

Les animaux sont mis à mort afin de mesurer et quantifier la fibrose pulmonaire par des méthodes ex vivo classiques (histologie, dosage de protéines)

Remplacement

Le poumon est un organe complexe composé de plus de 40 types cellulaires différents et le phénomène de fibrose fait lui intervenir plusieurs processus (inflammation, remodelage tissulaire etc). Aucun modèle in vitro ne pourrait se substituer à une étude sur un animal entier. L’étude de la fibrose pulmonaire chez le rongeur est de ce fait le modèle d’étude de référence dans la littérature.

Réduction

Le nombre d’animaux indiqué correspond au nombre minimal requis pour remplir les conditions des tests statistiques. Ces chiffres ont été déterminé par test statistique, sur la base de données antérieures issues de l’équipe, pour valider la puissance des résultats attendus.

Raffinement

Le personnel impliqué dans ce projet, au-delà de la formation légale à l’expérimentation animal, aura une formation et l’habitude de l’application des procédures et du suivi des animaux spécifique des modèles murins de fibrose pulmonaire. Les transports des animaux seront réalisés dans des boites d’hébergement avec couvercle, entourées d’un sac opaque pour protéger les animaux des changements de luminosité et de température. Après exposition aux facteurs déclenchants de la fibrose, les animaux auront accès à un supplémentation d’alimentation (aliments gélifiés, morceaux de pommes, céréales) afin de limiter la perte de poids. Après chaque étape d’anesthésie à l’isoflurane, les souris seront placées sous lampe chauffante ou tapis chauffant pour favoriser le retour de l’anesthésie. Une attention particulière sera apportée à la reprise d’une activité normale des animaux après anesthésie. Avant la mise à mort, les animaux sont analgésiés et anesthésiés profondément et ne reprennent pas conscience.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car le processus de fibrose pulmonaire est bien documenté dans la littérature chez cette espèce, ce qui en fait un modèle d’étude validé par la communauté scientifique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et avec un poids minimum de 21g. Ces critères correspondent à un stade de développement adulte de l’animal (développement des poumons, système immunitaire mature). D’après notre expérience des modèles, nous utiliserons des souris de poids supérieur à 21g afin de limiter la toxicité générale des produits inducteurs de fibrose.

1 024 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose pulmonaire leur est induite par une administration sous anesthésie, suivie d'un gavage quotidien de J8 à J20 ou de sept injections intraveineuses, puis de séances d'imagerie sous anesthésie de quarante minutes avec pose d'un cathéter. Le porteur annonce une inflammation des voies aériennes et une perte de poids dans les jours suivant l'induction, et n'anticipe aucun effet indésirable des traitements ni de l'imagerie. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne pourrait se substituer à une étude sur un "animal entier", le poumon comptant plus de quarante types cellulaires.

Objectifs

La fibrose pulmonaire est une maladie pour laquelle il n’existe pas de traitements curatifs. Une des limites de la fibrose pulmonaire est le manque de marqueur permettant d’évaluer la réponse aux traitements. Nous avons démontré la possibilité de suivre l’évolution de la fibrose pulmonaire avec une méthode d’imagerie du métabolisme des lipides. Nous devons maintenant valider son utilisation comme outil pour vérifier l’efficacité des traitements actuels ou en développement de la fibrose pulmonaire. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer une nouvelle technique d’imagerie du métabolisme lipidique: 1/ pour le suivi de l’efficacité des traitements approuvés de la fibrose pulmonaire 2/ pour le suivi de l’efficacité des traitements en cours de développement 3/ pour la possibilité de prédire l’efficacité des traitements testés Ce projet permettra de proposer un outil pour prédire et monitorer l’efficacité des traitements de la fibrose pulmonaire afin d’améliorer la prise en charge des patients avec cette maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet seront multiples grâce à une approche complète et robuste basée sur plusieurs modèles expérimentaux. Ce projet vise à améliorer la prise en charge des patients atteints de fibrose pulmonaire. A court terme, nous pensons que l’imagerie du métabolisme lipidique pourra être testée chez des patients avec fibrose pulmonaire pour valider son utilisation dans l’évaluation de l’efficacité des thérapies actuellement en clinique. A plus long terme, notre méthode d’imagerie permettra de faciliter le développement de nouvelles thérapies de la fibrose pulmonaire, au niveau préclinique et aussi des essais cliniques.

Procédures

Les souris recevront une administration d’un inducteur de fibroseCette intervention sous anesthésie générale dure 30 secondes maximum. Ce même type d’injection sera également utilisé, de façon répétée, pour l’administration des agents thérapeutiques dans la procédure 2. Aucune nuisance supplémentaire n’est anticipée du fait de la répétition. Une partie des animaux recevra des traitements par gavage oral (100µl, quotidiennement de J8 à J20). Ce geste sera réalisé sur animaux vigiles, après contention, et ne durera pas plus de 10 secondes. Une partie des animaux recevra des traitements par injection intraveineuse (100µl, tous les deux jours de J8 à J20, 7 injections au total). Ce geste sera réalisé après contention, et ne durera pas plus de 20 secondes. Tous les animaux seront suivis par imagerie. L'ensemble de cette procédure s'effectue sous anesthésie. Chaque animal aura un cathéter afin de permettre l’injection intraveineuse du marqueur (100 µl). Ceci n’excède pas 2 minutes par animal. Les animaux seront placés dans le système d’imagerie équipé d’un lit chauffant préchauffé et d’un système d’anesthésie gazeuse.La durée totale de la procédure n’excède pas 40 min par souris. A la fin du protocole, les animaux sont analgésiés puis anesthésiés profondément, avant que soit réalisé un prélèvement sanguin puis leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Entre 2 et 7 jours après l’induction du modèle, une inflammation des voies aériennes peut avoir lieu et elle peut être associée à une perte de poids des animaux. Le modèle de fibrose est associé aussi à une inflammation des voies respiratoires au cours des 6 premiers jours après l’induction. Elle peut être associée à une perte de poids des animaux. Les administrations intraveineuses peuvent induire un stress lié à la contention ainsi qu’une douleur brève (1 sec) au moment de l’insertion de l’aiguille. Lors des réveils de l’anesthésie, les animaux connaissent quelques minutes de désorientation, rapidement résolues par la reconnaissance de leur environnement. Nous n’anticipons aucun effet indésirable après administrations des traitements anti-fibrotiques, ou à l’étape d’imagerie..

Devenir

Les animaux sont mis à mort afin de mesurer et quantifier la fibrose pulmonaire par des méthodes ex vivo classiques (histologie, dosage de protéines)

Remplacement

Le poumon est un organe complexe composé de plus de 40 types cellulaires différents et le phénomène de fibrose fait lui intervenir plusieurs processus (inflammation, remodelage tissulaire etc). Aucun modèle in vitro ne pourrait se substituer à une étude sur un animal entier. L’étude de la fibrose pulmonaire chez le rongeur est de ce fait le modèle d’étude de référence dans la littérature.

Réduction

Le nombre d’animaux indiqué correspond au nombre minimal requis pour remplir les conditions des tests statistiques. Ces chiffres ont été déterminé par test statistique, sur la base de données antérieures issues de l’équipe, pour valider la puissance des résultats attendus.

Raffinement

Le personnel impliqué dans ce projet, au-delà de la formation légale à l’expérimentation animal, aura une formation et l’habitude de l’application des procédures et du suivi des animaux spécifique des modèles murins de fibrose pulmonaire. Les transports des animaux seront réalisés dans des boites d’hébergement avec couvercle, entourées d’un sac opaque pour protéger les animaux des changements de luminosité et de température. Après exposition aux facteurs déclenchants de la fibrose, les animaux auront accès à un supplémentation d’alimentation (aliments gélifiés, morceaux de pommes, céréales) afin de limiter la perte de poids. Après chaque étape d’anesthésie à l’isoflurane, les souris seront placées sous lampe chauffante ou tapis chauffant pour favoriser le retour de l’anesthésie. Une attention particulière sera apportée à la reprise d’une activité normale des animaux après anesthésie. Avant la mise à mort, les animaux sont analgésiés et anesthésiés profondément et ne reprennent pas conscience.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car le processus de fibrose pulmonaire est bien documenté dans la littérature chez cette espèce, ce qui en fait un modèle d’étude validé par la communauté scientifique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et avec un poids minimum de 21g. Ces critères correspondent à un stade de développement adulte de l’animal (développement des poumons, système immunitaire mature). D’après notre expérience des modèles, nous utiliserons des souris de poids supérieur à 21g afin de limiter la toxicité générale des produits inducteurs de fibrose.

1 500 rats et 1 000 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre eux passant trois semaines enfermés dans un caisson à atmosphère appauvrie en oxygène. Les autres reçoivent une injection destinée à déclencher une hypertension pulmonaire en quatre semaines. Viennent ensuite une échographie, une thermodilution, une mesure de pression artérielle pulmonaire et un prélèvement sanguin, tous sous anesthésie, avant le prélèvement du cœur et des poumons. Le porteur indique que les animaux deviennent essoufflés et inactifs mais estime la souffrance modérée puisqu'ils ne seront pas soumis à l'effort, et renvoie les éventuels essais cliniques à un horizon "plus long terme".

Objectifs

L’hypertension pulmonaire (HTP) est une maladie grave, caractérisée par une élévation de la pression artérielle pulmonaire qui conduit à une hypertrophie cardiaque droite, puis à une insuffisance cardiaque droite, à l’origine du décès des patients. Les traitements disponibles actuellement ne sont pas curatifs. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques à visée curative. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. L’objectif de ce projet est donc d’utiliser des modèles animaux (rats, souris) d’HTP expérimentale classiquement utilisés dans la littérature et au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Il existe différents type d’HTP chez l’Homme et nous allons donc utiliser deux modèles animaux pour étudier d’une part l’HTP associée à une hypoxie chronique (HC) similaire aux HTP associées aux maladies respiratoires hypoxémiantes (asthme, bronchite chronique, fibrose…) et d’autre part, l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) induite par une injection d'une substance pharmacologique pour étudier l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) idiopathique (de cause inconnue). A ce jour aucune lignée cellulaire ne rassemble toutes les caractéristiques pathophysiologiques de l’HTP donc nous avons besoin d’utiliser des animaux notamment pour mieux connaitre les mécanismes de cette pathologie ce qui permettra ensuite de tester de potentiels nouveaux traitements et d’évaluer leurs potentiels effets bénéfiques et/ou effets secondaires.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra à court terme de mieux comprendre les mécanismes associés à la pathologie de l’HTP/HTAP. Cette étude permettra également de mettre en évidence l’effet thérapeutique de substances pharmacologiques sur ces divers mécanismes mis en jeu. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs seront mis en évidence ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme sur les substances bénéfiques identifiées de façon à mettre en place un traitement plus efficace avec un rapport bénéfice-risque minimum pour les patients et adapté au type d’hypertension pulmonaire HTP et/ou HTAP.

Procédures

Pour obtenir le modèle de rat ou souris hypoxiques chroniques, les animaux sont maintenus dans un environnement où l’air contient moins d’oxygène pour une durée de 3 semaines. Pour le modèle d’HTAP idiopathique chez le rat, une seule injection d’une substance pharmacologique appropriée sur animal vigile va induire au bout de 4 semaines de l’HTAP idiopathique. Le potentiel thérapeutique de substances pharmacologiques sera testé sur animal vigile. La fréquence d’injection et donc le nombre d’injections sera ajustée en fonction de la substance considérée. Lorsque l’HTP/HTAP est installée, des mesures in vivo sont effectuées sur chaque animal : -des mesures échographiques sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 10 minutes) -des mesures de thermodilution sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 15 minutes) -des mesures de pressions artérielles pulmonaires sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 20 minutes) -un prélèvement de sang sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 5 minutes) -après euthanasie, prélèvement du cœur et des poumons (1 fois sur chaque animal, durée 5 minutes)

Impact sur les animaux

Chez l’homme, l’HTP/HTAP n’induisent pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Chez l’animal il a été noté une légère dyspnée et les rats/souris sont généralement assez inactifs. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la mise en place de l’HTP/HTAP chez les animaux. Les points d’injection des substances et solvants peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer le cœur et le poumon pour faire diverses analyses.

Remplacement

Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’hypertension pulmonaire. De plus, étant donné qu’il existe de nombreux types d’HTP associées à diverses maladies (respiratoires hypoxémiantes notamment), il est très difficile d’obtenir des résultats reproductibles sur ce type de tissu (provenant de patients ayant subis une greffe de poumon). Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. De plus, cette pathologie implique plusieurs organes et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux : (1) les rats contrôles utilisés seront les mêmes pour les deux type d’HTP, (2) une partie des utilisateurs utiliseront le poumon droit et l’autre partie des utilisateurs utilisera le poumon gauche (dans tous les cas les deux poumons seront utilisés), (3) une planification des expériences sera établie au long de chaque année d’expérimentation pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal avec utilisation de cellules en culture et enfin, (4) parallèlement à ce protocole, des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines exposées à l’hypoxie et étirées in vitro pour simuler l’HTP hypoxique. Quatre statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur ce projet donc l’utilisation des animaux sera optimisée et en concertation avec tous les utilisateurs. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire, en accord avec les données de la bibliographie, compte tenu des quantités de tissu nécessaires et de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche.

Raffinement

Des points limites ont été mis en place et seront appliqués. Le caisson hypobare sera ouvert 3 fois par semaine afin de renouveler l’eau et la nourriture, et d’effectuer le change de la litière une fois par semaine. Un système automatisé permet de modifier la pression atmosphérique progressivement et automatiquement pendant 45 minutes pour le retour à la pression atmosphérique normale ou la mise en hypobarie. Le caisson et les cages sont transparents ce qui permet de surveiller les animaux. Les animaux contrôles seront juste placés dans leurs cages habituelles. A l’occasion de l’ouverture du caisson (3 fois par semaine), tous les animaux seront pesés. Si le décès survenait avant la fin du protocole, le protocole serait également modifié ou arrêté. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. Lors de l’anesthésie un tapis chauffant sera utilisé pour le bien-être de l’animal. Le degré d’anesthésie sera surveillé en permanence.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces classiquement utilisées pour le développement de modèles d’HTP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. Le choix du rat est également justifié par le fait que le modèle d’HTAP fonctionne difficilement chez la souris. Néanmoins, l’utilisation de la souris permet d’envisager l’utilisation de modèles transgéniques qui sont moins nombreux chez le rat et qui sont nécessaires à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires. L’HTP/HTAP sont des pathologies de l’adulte donc nous utilisons des animaux adultes en fin de protocole.

690 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever organes et échantillons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux à quatre immunisations par voie nasale ou intramusculaire sous anesthésie, jusqu'à cinq prélèvements sanguins, des lavages vaginaux, des lavages nasaux et un prélèvement de salive obtenu grâce à un médicament qui force la salivation, les femelles voyant leur cycle hormonal synchronisé avant inoculation du virus. Le projet teste des formulations d'ARN encapsulé censées déclencher une réponse immunitaire dans les muqueuses génitales contre le VIH. Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids sont mises à mort, et le porteur précise qu'aucun analgésique ni anti-inflammatoire ne sera administré, ces produits risquant d'interférer avec la réponse immunitaire mesurée.

Objectifs

L'objectif est de développer un vaccin intranasal à ARN contre le VIH. Le VIH est un virus ciblant le système immunitaire, rendant les patients plus vulnérables à d’autres infections et maladies. Le virus se propage pendant les rapports sexuels non protégés (sans préservatif ou sans médicament spécifiques), ou lors du partage d’équipement d’injection de drogues. Si non traité, le VIH peut mener au SIDA (syndrome de l’immunodéficience acquis). Malgré de nombreuses années de recherche, le développement d’un vaccin efficace contre le VIH reste un défi. Le point critique est d'induire une réponse immunitaire efficace et durable aux sites de l'infection. Notre but est de tester l’efficacité de formulations vaccinales administrées par voie intranasale afin d'induire une réponse génitale étant donné que les sites muqueux communiquent entre eux. De nouvelles technologies vaccinales comme celles de l’ARN (utilisé avec succès contre le COVID-19) est une solution prometteuse. Cependant, administrés par des méthodes traditionnelles comme une injection, ces vaccins ne déclenchent pas une forte réponse au niveau génital. Dans cette étude, nous utiliserons des vaccins ARN encapsulés dans des lipides qui permettront le passage muqueux et amélioreront la réponse immunitaire. Nous testerons différentes formulations vaccinales contenant des ARN. Nous testerons différentes voies d'administration. Nous mesurerons les réponses immunitaires dans le sang et dans les parties génitales, en s’intéressant notamment à la durabilité de la réponses immunitaire. Enfin, nous étudierons l'efficacité de notre stratégie vaccinale en infectant les souris. Le VIH n’infecte pas naturellement la souris, donc nous utiliserons un virus non pathogène qui a certaines caractéristiques du VIH et qui sera administré par voie génitale.

Bénéfices attendus

Le développement de vaccins ciblant les antigènes du VIH reste compliqué et a échoué dans la plupart des essais cliniques. Le problème principal est la difficulté d'induire des anticorps neutralisants à large spectre et la haute variabilité génétique du virus. Il est donc nécessaire de développer une stratégie efficace et robuste contre le VIH. Ce projet a pour objectif de développer de nouvelles formulations vaccinales, administrées par voie intranasale qui induisent une forte réponse immunitaire dans les muqueuse vaginales, rectales et orales. Nous évaluerons la réponse anticorps, qui se développe dans la muqueuse et au niveau systémique. Les données générées dans ce projet seront essentielles pour tester par la suite la protection induite par la formulation la plus prometteuse. De plus, ce projet apportera de nouvelles connaissances dans le développement des réponses immunitaires durables dans le contexte du VIH. Ce projet permettra de déterminer la meilleure stratégie pour améliorer la réponse immunitaire au niveau génital. La voie intranasale qui est sans aiguille permettrait aussi de rendre la vaccination plus accessible et confortable.

Procédures

1) Les souris seront identifiées à leur arrivée 2) Vaccination par voie nasale ou dans le muscle sous anesthésie. Il y aura entre 2 et 4 immunisations par souris. Les prélèvements suivants seront effectués avant chaque immunisation et avant la mise à mort (5 fois maximum) 3) prélèvement d'un petit volume de sang: c’est un geste qui dure 30 secondes. 4) Lavages vaginaux avec une solution saline : geste qui dure 5 minutes. 5) Prélévement des fèces: les souris selon isolées dans des boîtes qui n’entravent pas leurs mouvements jusqu’à la collecte d’un nombre suffisant de fèces (20 minutes). 6) Lavage nasal (sous anesthésie) : En utilisant une pipette, un petit volume de solution saline sera doucement déposée au goutte à goutte sur une narine, permettant au fluide de sortir par l’autre narine pour le prélèvement. 7) Prélevement de la salive : Ce prélèvement sera fait lors de la même anesthésie que pour le lavage nasal (4) ). La sécrétion de salive sera stimulée avec un médicament qui fait saliver utilisé chez l'humain pour collecter une quantité suffisante de salive pour les analyses. La procédure sera réalisée sur un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle des souris. 8) pour les souris femelles, le cycle hormonal sera synchronisé avant l'infection virale pour faciliter l’accès du virus au tissu génital. 1 seule fois, pour les expériences d'infection. 9) Administration virale sous anesthésie: une seule fois pour les expériences d'infection 10) un anticorps sera injecté en intra-veineux quelques minutes avant la mise à mort. Ce geste sera fait une seule fois avant la mise à mort. 94% des souris (n=620) subiront ces gestes sur un intervalle de 9 semaines. Seulement 40 souris (6%) participeront à l’étude longitudinale pour évaluer la durabilité de l'immunité et subiront ces techniques sur une durée de 18 mois.

Impact sur les animaux

Un inconfort léger et transitoire peut arriver pendant l’administration du vaccin, en particulier lors de l’injection intramusculaire qui peut causer une douleur ou une inflammation locale au site d’injection. L’administration intranasale peut induire une légère irritation. Certains animaux peuvent avoir un comportement modifié pendant un petit moment. Des réactions physiologiques peuvent survenir comme une augmentation de la température corporelle ou une perte de poids temporaire, ceci rentre dans l'ordre dans les 24-48 heures. Une manipulation répétée pour les rappels vaccinaux peuvent induire un stress léger, cependant toutes les procédures seront faites par des personnes qualifiées.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour préléver des échantillons et des organes. Ces échantillons seront utilisés pour analyser les réponses immunitaires pour établir l’immunogénicité des formulations vaccinales testées

Remplacement

Avant de tester les formulations chez les souris, nous étudierons in vitro la passage des ARN dans les capsules lipidiques sur des modèles cellulaires. Cependant, aucun modèle animal ne permet de tester la réponse vaccinale, en particulier la durabilité des réponses immunitaires. Cela peut seulement être étudié dans un animal vivant récapitulant tous les systèmes biologiques.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous inclurons autant de groupes test que possible pour un groupe contrôle, tout en gardant les expériences réalisables et les données robustes. Nous utiliserons des tests statistiques standards pour s’assurer de la validité des résultats. Si un ou plusieurs groupes démontrent une réponse immunitaire plus forte que les souris contrôles, nous répèteront l’expérience trois fois pour confirmer les résultats.

Raffinement

Après chaque vaccination et anesthésie, les souris seront surveillées pendant 30 à 60 minutes, puis 3, 24, 48 et 72 heures après vaccination. Nous surveillerons l’apparition de douleur ou d'inconfort comme une difficulté à bouger, une boîterie ou une sensibilité accrue au site d’injection. Pour la vaccination intranasale, nous vérifierons l’absence d'une forte irritation nasale ou de problèmes respiratoires. La température corporelle et le poids seront vérifiés aux temps mentionnés. Si une souris présente un signe de souffrance comme une extrême fatigue, absence de mouvement, un gonflement, des problèmes de respiration ou perd plus de 20% de son poids initial, elle sera immédiatement mise à mort. Étant donné que nous étudions une réponse immunitaires après une vaccination, nous ne pouvons pas donner d’analgésiques ou d’anti-inflammatoires car ils pourraient interférer avec les réponses immunitaires.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus adapté pour étudier les réponses immunitaires spécifiques à un vaccin. La plupart des expériences d’immunogénicité seront réalisées avec des souris âgées de 7 semaines à 6 mois car avant 7 semaines les souris n’ont pas un système immunitaire mature et après 6 mois la réponse immunitaire peut être altérée. Étant donné qu’il a été démontré que l’âge peut modifier les réponses vaccinales, certaines expériences avec la formulation vaccinale la plus prometteuse chez les souris jeunes seront répétées chez des souris âgées de plus de un an.

Tester des molécules maison contre la fibrose pulmonaire suppose d'abord de provoquer la maladie : un inducteur est déposé au fond de la gorge de 576 souris anesthésiées, puis les traitements sont administrés par la même voie, de façon répétée. Ces souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées pour quantifier la fibrose par histologie et dosage du collagène. Le texte signale une perte de poids entre le deuxième et le septième jour suivant l'induction et n'anticipe aucun effet indésirable des traitements. Les souris pèsent au moins 21 grammes, seuil choisi pour limiter la toxicité de l'inducteur, et le porteur conclut qu'aucun modèle in vitro ne pourrait se substituer à une étude sur un "animal entier".

Objectifs

La fibrose pulmonaire est une maladie sans traitement efficace. Il est donc important de comprendre les mécanismes de cette maladie pour développer de nouveaux médicaments capables de s’y opposer. Le contenu en lipides des tissus pulmonaires de patients malades est différent de celui des patients non malades et a été mise en évidence une surproduction d’une famille de lipides. Nous développons des médicaments capables d’inhiber la synthèse de ces lipides. L’objectif de ce travail est de tester l’efficacité de ces composés à limiter la fibrose pulmonaire dans des modèles chez la souris.

Bénéfices attendus

Dans un contexte de manque de thérapies de la fibrose pulmonaire le test de nouvelles molécules est crucial. Si les inhibiteurs testés dans ce projet montrent des effets protecteurs contre le développement de la fibrose pulmonaire chez la souris, ces données serviront de base à la poursuite du développement de ces composés chez les patients. Ce projet permettra aussi d’affiner la connaissance des doses efficaces de ces composés et de mettre en évidence la voie d’administration la plus appropriée pour assurer leur efficacité.

Procédures

Les souris recevront une administration d’un inducteur de fibrose par aspiration oropharyngée. Cette intervention sous anesthésie générale dure 30 secondes maximum. Ce même type d’injection sera également utilisé, de façon répétée, pour l’administration des agents thérapeutiques dans la procédure 2. Aucune nuisance supplémentaire n’est anticipée du fait de la répétition. Les administrations intraveineuses des agents thérapeutiques sont également courtes (environ 20 secondes) et ne nécessitent pas l’anesthésie de l’animal.

Impact sur les animaux

Le modèle expérimental décrit dans ce projet est couramment utilisé en recherche dans le domaine de la fibrose pulmonaire. Entre 2 et 7 jours après l’induction du modèle, les souris peuvent perdre du poids. Les administrations intraveineuses peuvent induire une douleur brève (1 sec) au moment de l’insertion de l’aiguille. Lors des réveils de l’anesthésie, les animaux connaissent quelques minutes de désorientation, rapidement résolues par la reconnaissance de leur environnement. Nous n’anticipons aucun effet indésirable après administrations des traitements anti-fibrotiques.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de mesurer et quantifier la fibrose pulmonaire par des méthodes ex vivo classiques (histologie, dosage de protéines)

Remplacement

Le poumon est un organe complexe composé de plus de 40 types cellulaires différents et le phénomène de fibrose fait lui intervenir plusieurs processus (inflammation, remodelage tissulaire etc). Aucun modèle in vitro ne pourrait se substituer à une étude sur un animal entier. L’étude de la fibrose pulmonaire chez le rongeur est de ce fait le modèle d’étude de référence dans la littérature.

Réduction

Nous réduirons le nombre d’animaux au minimum requis pour remplir les conditions des tests statistiques. Des tests statistiques d’analyse de variance seront réalisés pour toutes les données d’analyses (histologie, dosage de collagène etc). Après avoir déterminé la distribution normale ou non des données (test Kolmogorov-Smirnov), nous utiliserons des tests paramétriques ou non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (lumière, température, bruit). Leur surveillance et l’entretien des cages seront réalisés par un personnel expérimenté. Ils bénéficieront d’un enrichissement du milieu de vie par des éléments creux plastiques (tunnels), et des bandelettes de papiers (permettant leur isolement dans la cage). Ils bénéficieront d’un environnement enrichi avec accès ad libitum à des suppléments alimentaires (aliments gélifiés, morceaux de pommes), afin de limiter la perte de poids. Un suivi quotidien par du personnel qualifié et ayant l’habitude du modèle sera réalisé pour repérer au plus vite les éventuels signes de détresse. Les administrations oro-pharyngées seront réalisées sous anesthésie générale de l’animal. Après l’injection, les souris seront placées sous lampe chauffante pour favoriser le retour de l’anesthésie. Une attention particulière sera apportée à la reprise d’une activité normale de l’animal à son réveil de l’anesthésie.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car le processus de fibrose pulmonaire est bien documenté dans la littérature chez cette espèce, ce qui en fait un modèle d’étude validé par la communauté scientifique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et avec un poids minimum de 21g. Ces critères correspondent à un stade de développement adulte de l’animal (développement des poumons, système immunitaire mature). D’après notre expérience du modèle, l’utilisation de souris de plus de 21g permet de minimiser la toxicité des produits inducteurs de fibrose.