Système respiratoire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
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- Oncologie
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- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système urogénital
Comprendre les causes de l’arrêt respiratoire dans le syndrome d’Ondine (maladie génétique qui touche le contrôle de la respiration) grâce à des souris génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
- Système respiratoire
Les souriceaux de ce projet naissent avec une mutation qui les empêche de respirer normalement, apnées, respiration faible et absence de réaction à l'excès de gaz carbonique dans le sang. 464 souris vont être utilisées, 180 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 264 modéré et 20 léger, toutes tuées à l'issue. Chaque nouveau-né est séparé de sa mère jusqu'à une heure pour les mesures cardio-respiratoires, subit le prélèvement de deux à trois millimètres de queue avant son quatrième jour de vie pour le génotypage, et est manipulé toutes les deux heures le jour de sa naissance pour vérifier sa vitalité. Les souriceaux sont tués par décapitation au quatrième jour, ou plus tôt si un point limite est atteint, le porteur ayant retenu comme critères le score d'adaptation à la vie extra-utérine et le comportement de la mère envers sa portée.
Objectifs
Nous voulons comprendre comment et pouquoi des mutations aboutissent au syndrome d'Ondine. Cette maladie se manifeste à la naissance par une apnée, une respiration faible et une absence de rélfexe respiratoire (pas d'augmentation de la respiration à une élévation de la teneur en gaz carbonique dans le sang). Ces problèmes se manifestent pendant le sommeil ce qui est dangeureux pour le nouveau-né. Il s'agit d'identifier les structures qui ne se forment pas et/ou les structures qui sont malformées à l'expression de la mutation et leurs conséquences sur la respiration.
Bénéfices attendus
Le projet pourrait avoir un impact fondamental par l’identification des circuits neuronaux impliqués dans les déficits respiratoires du syndrome d'Ondine. Le projet pourrait également apporter de nouvelles connaissances sur les structures du cerveau impliquées dans le maintien de la respiration pendant le sommeil, informations critiques à la compréhension du développement du syndrome d'Ondine et plus largement des pathologies respiratoires du sommeil comme les apnées obstructives.
Procédures
1/ Séparation maternelle d'une heure pour la mesure cardio-respiratoire 2/ Le prèlèvement d'un morceau de queue de 2-3 mm et d'une durée de 3 secondes pour l'identification du statut génétique est réalisée avant quatre jours de vie (souriceau sans poils) 3/ vérification de la vitalité du souriceaux (durée : 1 min par souriceau) le jour de naissance toutes les deux heures sur 6h d'observations puis deux fois par jour. Aucune necessité de recourir à de l'anesthésie.
Impact sur les animaux
1/ angoisse à la séparation maternelle d'une heure pour les mesures respiratoires 2/ Douleur au prèlèvement de 2-3mm de queue pour l'identification du statut génétique 3/ détresse respiratoire liée à la mutation 4/ angoisse à la vérification de la vitalité du souriceau (1 min par souriceau) 3 fois en 6h (le jour de naissance et 2 fois par jour juqu'à P4. 5/Stress lié à la detresse respiratoire engendrée par mutation.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Les souriceaux sont euthanasiés par décapitation à la fin de la procédure (4 jours de vie) ou en cas d'atteinte de point limite. S'il y a un besoin de prélèvement d'organes notamment du cerveau sur les souriceaux nouveau-nés, ça sera en postmortem.
Remplacement
Dans le cas du syndrome d’Ondine, il n’y a actuellement pas de prise en charge pharmacologique. Cependant, les modèles génétiques murins sont disponibles pour élaborer et/ou affiner les stratégies thérapeutiques. Si les avancées obtenues par les recherches sur les cultures cellulaires permettent d'éclaircir les mécanismes et les conséquences de la mutation à l'échelle moléculaire et cellulaire, une validation sur des animaux en développement est nécessaire pour comprendre la maladie et les conséquences fonctionnelles sur un organisme entier. L’utilisation de l’animal ne peut alors être évitée.
Réduction
Nous utilisons l'effectif qui permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour tester nos hypothèses. Compte tenu de la grande variabilité inter-individuelle et d'une éventuelle mortalité à la naissance, nous avons déterminé un lot expérimental de 30 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Les études publiées sur les variables respiratoires valident l’effectif de 30 animaux par groupe pour obtenir une puissance statistique satisfaisante. Cet effectif sera réduit si au cours des analyses intermédiaires, un effectif plus faible permet de tester les hypothèses.
Raffinement
Des points limites adaptés à l’âge des souriceaux sont décrits et comportent le score d’adaptation à la vie extra-utérine pour le souriceau et le comportement de la mère envers sa portée. Pour les mesures, nous utilisons une technique non invasive (animal non anesthésié) et contrôlée (durée de la mesure, température constante dans les chambres de mesure) pour minimiser une possible angoisse des animaux. La durée de séparation maternelle le temps d’une mesure est d’une heure au maximum. Les cages avec les portées sont enrichies en cellulose douce pour le nid. De plus, l’équipe de l’animalerie effectue une surveillance réglementaire quotidienne des espaces d'hébergement et de toutes les cages.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle pour l'étude du développement du cerveau humain. Plus largement, la souris génétiquement modifée contribue à la compréhension d'une maladie génétique. Dans le cas du syndrome d'Ondine, les modèles animaux existants sont murins. C’est une maladie qui se manifeste dès la naissance. Nous avons des outils adaptés pouvant prendre en charge les modèles murins dès la naissance permettant ainsi de tester et d’évaluer des stratégies thérapeutiques. De plus, le recours aux modèles animaux en développement constitue une des recommandations de l'Agence Européenne du médicament pour évaluer les médicaments à visée pédiatrique. Les souriceaux sont étudiés dans la période juste avant et après leur naissance, jusqu'à leurs 4 premiers jours de vie.
Étude de remplacement cellulaire pour restaurer la fonction multiciliaire des voies respiratoires chez le minipig, dans le cadre de la recherche sur la dyskinésie ciliaire primaire.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Greffer dans les bronches des cellules souches humaines corrigées génétiquement conduit ici à utiliser 10 mini-porcs, tous tués à l'issue pour analyses histologiques, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie sous anesthésie pouvant durer deux heures trente, deux séances d'imagerie d'une heure trente et huit prélèvements sanguins sous anesthésie de trente minutes. Le porteur liste les risques attendus, bronchite, pneumonie, saignement, détresse respiratoire aiguë, pneumothorax, pleurésie et signes de sepsis, puis les juge "extrêmement réduits" grâce aux traitements préventifs. Le bénéfice qu'il avance, fournir les données d'un futur essai clinique sur la dyskinésie ciliaire primitive, dépend entièrement de résultats "favorables" encore à obtenir.
Objectifs
La majorité des maladies pulmonaires d’origine génétique, comme certaines formes de mucoviscidose, n’ont pas encore de traitement curatif. Les tentatives de traitement par inhalation de virus modifiés n’ayant pas donné les résultats espérés, une nouvelle approche combinant thérapie cellulaire et thérapie génique a vu le jour. Nous avons mis au point une méthode simplifiée pour créer des cellules souches à partir du sang du patient, les corriger génétiquement, puis les transformer en cellules capables de régénérer les voies respiratoires. Cette technologie ouvre la voie à des traitements innovants pour les maladies pulmonaires génétiques. Pour valider cette approche, nous l’appliquons actuellement à une maladie rare appelée dyskinésie ciliaire primitive (PCD).
Bénéfices attendus
Les bénéfices concernent le traitement de la dyskinésie ciliaire primitive (PCD). Si les résultats sont favorables, notre travail pourrait permettre à conduire un futur essai clinique, en fournissant des données qui seront nécessaires à la mise en place d'un essai clinique.
Procédures
Les animaux sont soumis à : -Procédures chirurgicales : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 2h30, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux; - Imagerie (2 fois) : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 1h30; - Prélèvements sanguins (8 fois) : sous anesthésie rapide de 30 minutes maximum.
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendue chez les animaux est relative à la greffe des cellules, plus précisément au conditionnement excessif (risque de dommage des bronches) ou bien insuffisant, lesquelles pourront induire la mort des cellules greffées. Une mort cellulaire excessive pourrait être la conséquence d'une dissociation unicellulaire des progéniteurs bronchiques humains dérivés des iPSC dans le contexte d'une stase intra bronchique, d'un piégeage du mucus ou, à l'inverse, d'une toux et d'expectorations après administration. Les risques principaux sont également : bronchites, pneumonie, saignement, détresse respiratoire aigue, pneumothorax, pleurésie, signes de sepsis. Ces risques à priori paraissent extrêmement réduits étant donnés les prémédications prophylactiques périprocédures (antibiothérapies, corticothérapie, anti tussifs). La simple mesure des constantes, et la réalisation d’une tomodensitométrie visant à évaluer ces risques sont ainsi prévues. Entre autres, des complications liées à la chirurgie ou à l'anesthésie ou les effets indésirables du traitement immunosuppression peut être également observées. De plus, une adaptation du protocole en termes de médicament anesthésique, de choix de traitement, etc. sera éventuellement proposée pour la deuxième série d'animaux (8 mini-pigs).
Devenir
A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative de remplacement, car l’objectif de cette étude est d’évaluer la toxicité ainsi que l’efficacité sur un modèle animal avant passage chez l’homme.
Réduction
Au total, 10 animaux seront utilisés (2 et 8). Un nombre d'animaux se trouve réduit au minimum nécessaire pour l'obtention de données suffisamment fiables, la toxicité et efficacité de xénogreffe de progéniteurs d'épithélium bronchique dérivés d'iPSC en "conditions réelles".
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. De plus, la température de la salle d’hébergement sera augmentée après chaque anesthésie. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec des porcs. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. En cas de troubles liés au dispositif, des traitements pourront être mis en place, similaires à ceux pratiqués en médecine humaine. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). Si nécessaire, la douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés : anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et/ou morphiniques. Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique. Des examens d'imagerie (une bronchoscopie et le scanner) et sanguins viendront compléter cette évaluation.Concernant l'immunosuppression, le traitement par ciclosporine sera administré avec l’alimentation, afin de limiter le stress et de ne pas perturber les animaux. De plus, compte tenu de l’immunosuppression, des mesures de biosécurité seront renforcées : un équipement de protection individuelle propre sera utilisé pour réduire le risque infectieux. Enfin, un suivi biologique régulier (formule sanguine complète et biochimie) permettra d’adapter rapidement la posologie en fonction des effets observés, limitant ainsi les effets secondaires.
Choix des espèces
Nous utiliserons des mini-porcs qui ont une anatomie pulmonaire proche de celle de l'humain et peuvent facilement être immunosupprimés pendant plusieurs semaines grâce à la ciclosporine permettant une xénogreffe. De plus, seul un grand modèle comme le porc peut fournir une situation clinique similaire à celle rencontrée chez l'homme, notamment en ce qui concerne l'accès par fibroscopie lobaire et la grande surface à traiter. Les mini-pigs à l'âge adulte (8 à 10 mois) ont une anatomie pulmonaire proche de celle de l'humain (5 lobes, accès facile à l'endoscope humain).
Développement de l’imagerie couleur (K-edge) des processus fonctionnels des maladies pulmonaires en combinaison avec des agents de contraste dédiés dans les modèles animaux rats, lapins et porcs. (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Lapins : 220
Cochons : 84
Une chirurgie sous anesthésie de quarante-cinq minutes à une heure trente, puis cinq à huit administrations de produit de contraste, puis quatre à neuf séances d'imagerie de deux heures trente chacune. 336 rats, lapins et porcs vont être utilisés dans ces protocoles, dans des procédures allant du sans réveil au niveau de souffrance sévère. Deux des modèles se déroulent entièrement sous anesthésie sur quatre heures, sans reprise de conscience, pour mettre au point l'imagerie couleur K-edge de l'embolie et de la fibrose pulmonaires, le porteur indiquant que la création de ces modèles pathologiques se fait sans ajout d'animaux. Tous sont tués pour que leurs organes passent en microscopie et en histologie.
Objectifs
Certaines maladies pulmonaires, comme l'embolie pulmonaire et la fibrose pulmonaire, altèrent la respiration et peuvent mettre en danger la vie des patients. Pour mieux comprendre ces maladies et améliorer leur diagnostic, ce projet utilise un scanner médical avancé capable d’analyser la composition des tissus pulmonaires avec une grande précision. Cette nouvelle technologie nécessite la mise au point de nouveaux agents de contraste innovants. Pour cela, des études seront menées sur des modèles animaux dont l’anatomie pulmonaire est proche de celle des humains. La création des modèles animaux de pathologies pulmonaires nécessite une modification du projet initial sans ajout d’animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer les techniques d’imagerie médicale pour mieux détecter certaines maladies pulmonaires. Grâce à l’utilisation de nouveaux produits de contraste, il pourrait permettre d’identifier plus précisément les zones touchées et d’obtenir des informations plus détaillées sur l’évolution de ces maladies. En apportant une meilleure visibilité des atteintes pulmonaires, cette avancée pourrait améliorer le diagnostic et le suivi des patients à l’avenir.
Procédures
Rats : 32 animaux ont subi 1 administration de produit sous anesthésie et 9 séances d’imagerie sous anesthésie (MODIFICATION 1h à J0 et 15 minutes à J1 et J7 ). Lapin : Modèle 1 (4h sans réveil) 101 animaux ont subi 1 intervention chirurgicale sous anesthésie (durée 1h30), 5 administrations de produit sous anesthésie, et (MODIFICATION) 7 séances d’imagerie sous anesthésie (2h30). Modèle 2 J0 (3h) 119 animaux ont subi 1 intervention chirurgicale sous anesthésie (45 minutes), 5 administrations de produit sous anesthésie, et (MODIFICATION) 6 séances d’imagerie sous anesthésie (2h30). Modèle 2 J21 (3h) : 119 animaux ont subi 1 intervention chirurgicale sous anesthésie (45 minutes) 8 administrations de produit sous anesthésie, et (MODIFICATION) 5 séances d’imagerie sous anesthésie (2h30). Porcs : Modèle (MODIFICATION 4h sans réveil) 33 animaux ont subi 1 intervention chirurgicale sous anesthésie (durée 1h30) 5 administrations de produit sous anesthésie, et 7 séances d’imagerie sous anesthésie (2h30). (MODIFICATION) Modèle 2 J0 (3h) 51 animaux ont subi 1 intervention chirurgicale sous anesthésie (45 minutes), 8 administrations de produit sous anesthésie, et 5 séances d’imagerie sous anesthésie (2h30). (MODIFICATION) Modèle 2 J21 (3h) : 51 animaux ont subi 1 intervention chirurgicale sous anesthésie (45 minutes) 5 administrations de produit sous anesthésie, et 4 séances d’imagerie sous anesthésie (2h30).
Impact sur les animaux
Certaines étapes du projet peuvent entraîner un inconfort temporaire pour les animaux. Les injections et prises de sang peuvent provoquer une légère douleur passagère. La préparation de la peau pour la tonte peut générer un stress léger de courte durée. L’anesthésie et la chirurgie peuvent causer un stress modéré, parfois accompagné d’effets secondaires légers, comme une gêne respiratoire passagère. L'administration de certains traitements peut aussi entraîner une fatigue ou une diminution temporaire de l’appétit. 5.7. Quelles espèces est-il prévu d’utiliser? Quels sont le degré
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés car des organes doivent être prélevés pour analyse en microscopie, histologie.
Remplacement
Le projet se fonde sur l'imagerie du poumon grâce à de nouveaux agents de contraste. La faisabilité de ces agents de contraste à interagir avec l'organisme in vivo ainsi que de marquer les processus recherchés du projet (ventilation, perfusion, inflammation) est à ce jour inconnue. Avant d'utiliser des animaux vivants, des tests sont faits sur des poumons provenant de l'industrie alimentaire (lapins, cochons). Cela permet d'améliorer la précision des tests sur les animaux vivants et de réduire leur nombre nécessaire pour l’étude.
Réduction
Ce projet implique l'utilisation de 336 animaux dont une phase pilote sur la biodistribution et la biotolérances de 8 agents de contraste chez les rats. Pour les lapins, le nombre d'animaux a été calculé pour s'assurer qu'on puisse détecter des différences significatives dans les images, comme celles entre un animal malade et un animal en bonne santé. Cela permet de garantir que les résultats soient fiables. Pour les porcs un effort de réduction est entrepris puisque un certain nombre seront utilisés pour les 4 agents de contrastes et les 2 voies d’administration. Le nombre d’animaux a été déterminé en tenant compte de deux contraintes : la quantité d’agent de contraste nécessaire et les différences naturelles entre chaque individu observées dans les études précédentes. Les techniques d’imagerie non invasive, permettent de suivre les mêmes animaux dans le temps, réduisant le besoin de grands effectifs pour des études distinctes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en collectivité, au sol dans des boxes (lapins et porcs) et des cages (rats) dédiés avec alimentation et eau ad libitum. Les animaux seront suivis de manière quotidienne, manipulés par le personnel de zootechnie pour réduire toute forme de stress. Ils seront pesés pour un suivi de gain de poids qui permettra le bon calcul des doses à administrées le jour de l’expérimentation. Les paramètres environnementaux de la pièce seront également relevés quotidiennement. Le raffinement est appliqué, par l’utilisation de boxes/cages enrichis : foin, abris, bâton et bloc de cellulose à ronger pour les lapins. Foin et jouets de différentes textures pour les cochons. Tunnel, abri, nid et bloc de bois à ronger pour les rats. Ceux-ci leur permettent d’exprimer au mieux leur comportement naturel. La règle de raffinement est aussi mise en place au cours de la procédure via des traitements analgésiques, anti-inflammatoires et une grille de suivi adaptés.
Choix des espèces
• Rat : stade adultes, 300 à 450 g, Choisi dans un premier temps pour les tests initiaux de faisabilité et pour sa taille qui est adaptée à la résolution du scanner. Ils permettent d’obtenir des données préliminaires avant de passer à des espèces plus proches de l'Homme. • Lapin : stade jeunes adultes, d’environ 3 à 6 mois, de 3-4 kg Choisi pour sa physiologie pulmonaire proche de celle de l'Homme, ce qui permet de simuler des conditions humaines avec des volumes respiratoires et sanguins comparables à ceux d'un enfant de 4kg. • Porc : stade jeunes adultes, d’environ 3 mois, ayant un poids entre 30 et 40 kg. Le porc est un modèle adapté pour la recherche clinique, car sa taille, son poids et son anatomie, notamment le système respiratoire, sont proches de ceux de l’Homme. C’est une espèce clé pour les tests précliniques qui visent à transposer les résultats chez l'Homme.
Etude du développement et de la plasticité de l’unité gliovasculaire (1/2)
- Recherche fondamentale
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- Système respiratoire
Une chirurgie d'amincissement du crâne ouvre la voie à l'imagerie du cerveau au microscope biphotonique à travers l'os, pendant quatre-vingt-dix à cent quatre-vingts minutes. 984 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées ensuite pour prélever leur cerveau. Il s'agit de suivre les contacts entre astrocytes et vaisseaux sanguins corticaux à cinq stades, de 7 à 60 jours après la naissance, une des lignées présentant un retard de développement pouvant aller jusqu'à des calcifications cérébrales et des troubles moteurs. Le RNT chiffre à 864 les souriceaux d'un ou quatre jours recevant une injection sous-cutanée et à 864 les souris subissant l'amincissement du crâne, pour un effectif total déclaré de 984.
Objectifs
Le système nerveux central, dont fait partie le cerveau, est composé de plusieurs types cellulaires : les neurones, mais également les cellules gliales dont les astrocytes. Ces derniers sont reconnus comme des acteurs essentiels à la physiologie cérébrale et impactés dans de nombreuses pathologies. Ils interagissent notamment avec les vaisseaux sanguins où ils participent à la régulation des fonctions vasculaires, comme l’intégrité de la barrière hématoencéphalique (BHE). Ils forment ainsi avec les vaisseaux l’unité gliovasculaire (UGV), qui est perturbée dans l’ensemble des maladies touchant le cerveau. Parmi les déficits actuels en santé publique, les pathologies liées au développement du cerveau et à l’établissement de ses capacités plastiques, comme les troubles du spectre autistiques, les maladies neurodéveloppementales ou psychiatriques, ont une place importante. Cependant les étiologies de ces maladies sont encore largement méconnues. En particulier, un possible rôle des astrocytes reste à démontrer. Une des raisons pour cela est le manque de connaissance sur les dynamiques de l’unité gliovasculaire au cours de la vie et les interactions entre les astrocytes et le système vasculaire cérébral. Cette étude permettra de caractériser les mécanismes de plasticité des contacts astrocytaires sur les vaisseaux sanguins corticaux dans de multiples conditions de développement physiologiques et pathologiques à l’aide d’analyses histologiques et d’enregistrements dynamiques en temps réel par vidéomicroscopie. Cela permettra une meilleure compréhension des dynamiques de l’unité gliovasculaire et du rôle des astrocytes au cours de la vie. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs. Cette étude nécessite l’utilisation de 984animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur les dynamiques et les fonctions de l’unité gliovasculaire, dont les défauts sont un facteur important des pathologies neurodéveloppementales et neuropsychiatriques.
Procédures
2 types d’interventions sont prévues dans ce projet : 1. Injection en stade périnatal : un réactif est injecté en voie sous-cutanée chez des souriceaux nouveau-nés de 1 ou 4 jours. Cette intervention n’est réalisée qu’une seule fois. Elle est sans douleur et ne nécessite pas d’anesthésie. Elle est effectuée dans l'EU1.Nombre d’animaux concernés : 864 (durée : 1min). 2. Procédure d’amincissement du crâne et imagerie in vivo au microscope biphotonique : Les souris subiront une intervention chirurgicale d’amincissement du crâne pour permettre l’enregistrement du signal fluorescent par microscopie biphotonique à travers l’os. L’intégralité de la procédure est faite sous anesthésie et analgésie. Elle est effectuée dans l'EU2. Nombre d’animaux concernés : 864. (durée : 90 à 180 min).
Impact sur les animaux
Une des lignées de souris présente des caractéristiques dommageables pouvant entrainer des nuisances, notamment un léger retard de développement pouvant aboutir sur des altérations du système visuel et cardiovasculaire ainsi que l’apparition de calcifications cérébrales pouvant engendrer des problèmes moteurs chez certains individus. Certains lots de souris subiront des interventions chirurgicales qui peuvent entrainer des effets modérés (douleurs post-opératoires) qui seront minorées par l'administration d'analgésiques.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés après chaque procédure afin de récupérer leur cerveaux pour faire les analyses.
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux par expérimentation : 5) a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible.
Raffinement
Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les nouveau-nés subissant une injection feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure et les jours suivants . Dans le cas des pups remis en cage avec leur mère, les manipulations des animaux seront limitées autant que possible afin d’éviter leur rejet par la mère. Pour chaque intervention pouvant générer de l’inconfort ou de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. En particulier, des points limites intermédiaires permettant la mise en place de soin aux animaux sera mise en place évitant la mise à mort des animaux. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront coadministrés pour limiter toute souffrance chez l’animal. Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, actes de chirurgie ou d’injection intrapéritonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie, analyse des points limites).
Choix des espèces
La souris partage 98% de son génome et permet ainsi dans la majorité des cas de pouvoir mimer une pathologie humaine via des modèles génétiquement modifiés. De plus cette espèce de petite taille présente une courte durée de gestation et génère un grand nombre de petits dans ses portées, ce qui en fait un modèle mammifère idéal. Les différentes étapes du développement cérébral et sa plasticité chez la souris étant bien décrites et similaires à l’humain, ce modèle est approprié à la recherche neurodéveloppementale. Les animaux seront utilisés à 5 stades développementaux postnataux : 7, 15, 21, 30 et 60 jours après la naissance. Ces stades correspondent à des moment clés du développement cérébral et en particulier des astrocytes et de leurs interactions avec les vaisseaux sanguins.
Exposition à la silice et induction d’autoimmunité systémique : modèle de sclérodermie systémique « Modification »
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
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- Recherche fondamentale
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- Système respiratoire
Jusqu'à cinquante injections intradermiques d'acide hypochloreux à raison de cinq par semaine pendant dix semaines, ou vingt-six injections intrapéritonéales à raison de trois par semaine : 615 souris vont être utilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 120 d'entre elles, modéré pour 205 et sévère pour 290. Elles développent une fibrose de la peau au point d'injection et une fibrose pulmonaire, deux expositions respiratoires à de la silice cristalline ou à de la poussière de pierre artificielle leur étant imposées sous anesthésie, et 114 subissent une biopsie cutanée au poinçon de 5 mm. L'objet déclaré est d'obtenir un modèle murin de sclérodermie plus proche de la maladie humaine et de mesurer ce que fait la poussière des plans de travail aux personnes qui la respirent au travail. Toutes sont tuées pour prélever sang, poumons, peau, rate, rein et cœur.
Objectifs
Ce projet a 2 grands objectifs qui sont les suivants: 1) optimiser le modèle de souris sclérodermique, qui à ce jour ne reflète pas entièrement la physiopathologie observée chez l’homme (inflammation, autoimmunité et fibrose cutanée et pulmonaire). Nous évaluerons ces paramètres physiopathologiques dans le nouveau modèle que nous proposons et qui sera induit dans des souris génétiquement susceptibles de développer une autoimmunité en présence de la protéine recombinante contre laquelle les auto-anticorps sont dirigés et de silice cristalline utilisée comme adjuvant pour stimuler la réponse immunitaire. En effet, les modèles murins actuels sont soit génétiques soit induits par injection de substances chimiques tels que l’acide hypochloreux (HOCl) ou la bléomycine (BLM); 2) évaluer si une exposition à la poussière de pierre artificielle contenant de la silice cristalline (poussière émise lors de la fabrication et la taille de plans de travail) favorise le développement d'une autoimmunité systémique (production d'anticorps auto-immuns) et si oui, évaluer si cette exposition favorise le développement de la sclérodermie systémique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet seront : 1) de disposer d’un nouveau modèle de souris sclérodermiques dans lequel seront retrouvés les grands paramètres qui définissent cette maladie : l'inflammation, l’autoimmunité et fibrose cutanée/pulmonaire ; cela permettra d’une part d’apporter de nouvelles connaissances sur la physiopathologie de cette maladie et d’autres part de disposer d’un modèle pertinent pour tester de nouvelles thérapies; 2) d'évaluer l'importance du fond génétique des souris sur l'induction de la maladie; 3) d’évaluer les risques sur la santé d’une exposition à la poussière de pierre reconstituée à laquelle les travailleurs peuvent être exposés dans leur cadre professionnel et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets (autoimmunité, inflammation et fibrose). Ces informations pourraient à terme permettre de mieux informer les utilisateurs des risques encourus, de contribuer à mieux protéger les personnes exposées et à limiter l’utilisation de cette pierre artificielle.
Procédures
Des souris vigiles (n=100) seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 10 semaines maximum. Des souris anesthésiées (n=467) seront soumises à 2 expositions par voie respiratoire de NaCl ou de particules minérales à 15 jours d'intervalle). Des souris vigiles (n=290) seront soumises à 4 injections sous-cutanées (tous les 15 jours). Des souris vigiles (n=16) seront soumises à 2 injections intra-veineuse d'anticorps (une par mois). Des souris vigiles (n=258) seront soumises à 26 injections intra-péritonéales soit 3 fois/semaine. Des souris anesthésiées (n=114) auront une biopsie cutanée (punch de 5 mm).
Impact sur les animaux
L'injection intra-dermique d'acide hypochloreux (HOCl) peut entrainer une gêne (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois une plaie cutanée (au niveau du bas du dos). Les souris exposées à l'acide hypochloreux (HOCl) développent une fibrose cutanée au point d'injections (bas du dos) et une fibrose pulmonaire légère à modérée qui se développe à partir de la 3ième semaine. La fibrose induite est localisée dans la région sous-pleurale et s'étend peu à l'ensemble du parenchyme pulmonaire. Les souris exposées par instillations oropharyngées de silice cristalline (SiO2) développent une fibrose pulmonaire modérée qui s'étend à l'ensemble du parenchyme pulmonaire. Il n'a pas été décrit dans la littérature et nous n'avons pas non plus observé dans nos études antérieures de signes de difficulté ou de souffrances respiratoires dans ces deux modèles. Même si nous ne nous attendons pas à avoir d’inconfort ou de souffrance animale avec une exposition à la poussière de pierre artificielle (PA) nécessitant le recourt à des antalgiques, nous serons attentifs sur ce point. D'après la littérature, des injections sous-cutanées répétées à 15 jours d'intervalles n'ont pas non plus montré d'effets indésirables chez les souris.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de trissus et d'organes (sang, poumons, peau, rate, rein et coeur).
Remplacement
La sclérodermie systémique est une maladie autoimmune (présence d’autoanticorps dans la circulation sanguine), complexe avec des manifestations dans plusieurs organes (peau et poumons majoritairement) qu’il est impossible de reproduire in vitro. Il est important d’avoir un modèle de souris sclérodermique qui se rapproche le plus possible de ce qui est observé chez l’homme (fibrose cutanée et pulmonaire, autoimmunité et inflammation) pour tester de nouvelles molécules thérapeutiques.
Réduction
Le choix des conditions expérimentales est fixé en lien avec les questions scientifiques du projet et les principes de réduction. Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n’utiliser que le nombre d’animaux strictement nécessaire mais suffisant pour obtenir des résultats statistiquement exploitables et obtenir assez d'échantillons biologiques (tissus/organes) permettant de réaliser toutes les analyses biologiques et biochimiques nécessaire pour répondre à nos objectifs. Notre expertise et nos précédents projets sur ces modèles murins nous ont permis de dimensionner nos groupes d’animaux à 8-10 individus afin de garantir l’obtention de données exploitables et de réaliser toutes les analyses nécessaires sur les différents tissus qui permettront de caractériser l’effet thérapeutique obtenu et d’investiguer les mécanismes d’action du traitement testé. Pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, un nombre de 615 souris sera utilisé. Les statistiques seront réalisées à l'aide de tests non paramétriques de Mann et Whitney pour comparer des échantillons deux à deux et de Kruskal-Wallis pour comparer un nombre quelconque d'échantillons.
Raffinement
La mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel permettront de limiter le stress et la souffrance des animaux. Ils bénéficieront également d'un enrichissement constitué de coton et/ou « maisons » en carton afin de les stimuler, diminuer le stress et de leur permettre de se construire un « nid ». Selon les procédures, un suivi comprenant une évaluation de leur posture et locomotion et de leur comportement (expression faciale) sera réalisée soit au minimum 3 fois/semaine (procédures N° 2, 3 et N°4) soit 5 fois/semaine (Procédures N°1 et N°5) et permettra de contrôler leur état de santé. Le suivi du poids sera également réalisé une fois par semaine. Ces informations sont consignées dans un tableau ou grille de score, et ce suivi hebdomadaire des signes cliniques permettra d’avoir recours à des anti-douleurs adaptés si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux et à l’euthanasie dès que nécessaire.
Choix des espèces
Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre les effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Les souris seront adultes car la sclérodermie systémique est une pathologie qui affecte des adultes.
Modification du projet : Impact de l’hypoxie intermittente sur l’activation du système sympathique et ses répercussions sur le métabolisme et la fonction cardiaque 2/3
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
Huit heures de privation d'oxygène par jour, de 8 h à 16 h, pendant seize semaines. 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 70 d'entre elles recevant en plus un implant de télémétrie posé au cours d'une chirurgie de trente minutes. Elles subissent des injections d'insuline, de glucagon, d'adrénaline et de dexaméthasone, des mesures de pression artérielle en tube de contention, des échographies cardiaques sous anesthésie et des transferts entre trois établissements. Toutes sont tuées après les seize semaines pour prélever des organes, une partie de ces prélèvements étant redistribuée à d'autres chercheurs du laboratoire pour des mises au point techniques.
Objectifs
Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.
Bénéfices attendus
L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.
Procédures
Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).
Impact sur les animaux
Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.
Remplacement
Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.
Réduction
Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).
Raffinement
Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.
Vaccin pour Induire une Immunité Mucosale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une injection unique de vaccin, puis une prise de sang par semaine pendant cinq semaines, puis, entre cinq et douze semaines plus tard, une infection par un virus ou une bactérie : 2 160 souris suivent ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection provoque une perte de poids et une variation de la température corporelle, et l'animal dont la grille de score atteint sa valeur maximale est tué. Le projet vise des vaccins qui déclenchent une immunité au niveau des muqueuses, que les vaccins actuels induisent peu, et le porteur affirme que ce modèle doit être évalué à l'échelle de l'"organisme entier". Toutes les souris sont tuées le jour de l'expérience, pour prélever les poumons et les autres organes où sont analysées les cellules immunitaires.
Objectifs
La vaccination est parfois la seule option clinique pour lutter contre les maladies infectieuses face à une évolution rapide et croissante de la résistance aux médicaments (antibiotiques, antiparasitaires par exemple) ou le faible nombre de médicaments anti-viraux sur le marché. Ainsi, les vaccins ont permis d'éliminer des infections telles que la variole ou la poliomyélite, et atténuer les effets d'autres infections comme la grippe ou le COVID-19. Il est clair que l’objectif de la vaccination est de permettre à un individu de développer une protection active spécifique vis-à-vis d’un microbe, en utilisant les ressources naturelles de l’immunité afin de générer une immunité dite « mémoire ». Toutefois, les vaccins induisent très peu l’immunité dite « mucosale », qui protège les muqueuses des organes tel que les poumons. Ceci peut donc expliquer la recrudescence de certaines pathologies respiratoires comme la coqueluche contre laquelle 86% de la population mondiale est vaccinée (40 millions de cas et 300000 décès d’enfants par an dans le monde). Ainsi, l'amélioration des vaccins et l'optimisation des stratégies de vaccination sont donc aujourd’hui plus que nécessaires, afin de mettre en place une immunité « mucosale » vis-à-vis de n’importe quel microbe pour prévenir une infection quelles qu’en soient la porte d’entrée ou les manifestations cliniques. Ce projet de recherche ambitionne d’aider au développement de stratégies vaccinales innovantes en améliorant les vaccins existant afin de mettre en place une immunité mucosale protectrice à long terme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité d’une protection à long terme de cellules immunitaires générées par la vaccination. En effet, la majorité des vaccins disponibles sur le marché ne permettent pas de mettre en place une immunité mucosale favorisant la recrudescence de plusieurs infections.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress (anesthésie -d'une durée de 20 minutes comptant la phase d'endormissement, du geste technique et de reveil-, pesées - d'une durée de 30 secondes-, administration de vaccin - d'une durée de 30 secondes- , injections de virus ou bactérie - d'une durée de 30 secondes- et prise de sang - d'une durée de 30 secondes-). Les animaux recevront une seule injection de vaccin pour mettre en place une immunité protectrice. Nous verifierons si le vaccin a un effet protecteur en analysant les cellules du système immunitaire présentes dans le sang des souris, 1 fois par semaine pendant 5 semaines. Puis, 5 à 12 semaines plus tard, les animaux seront infectés une seule fois par un virus ou une bactérie afin de vérifier l’effet protecteur des cellules immunitaires mises en place par le vaccin sur le court et long terme. A l’issue de l’exprimentation, les animaux seront mis à mort pour une analyse précise des cellules immunitaires au sein des tissus tel que les poumons.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à plusieurs gestes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress tels que : l’anesthésie, pesées, administration de vaccin, injections de pathogène, transfert adoptif et prise de sang. De plus, l’infection peut provoquer une perte de poids et une variation de la température corporelle.
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’expérience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire.
Remplacement
Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse. Le modèle de souris est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles.
Réduction
Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Ainsi, le nombre utilisé pour ces expériences est de 5 animaux par groupe expérimental, les deux sexes confondus, afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expériences. Dans la mesure du possible, les expériences sont regroupées afin d’utiliser un seul groupe contrôle pour plusieurs groupes tests.
Raffinement
Les souris seront hébergées, en zone d’expérimentation A2L2 (dans un laboratoire de biosécurité car nous utilisons des organismes pathogènes pour lesquels il y a un traitement curatif et/ou préventif), par groupe de 5 au maximum par cage et de même sexe afin d’éviter le stress de l’isolement. L’accès à l’eau et à la nourriture sera à volonté. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de plusieurs éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid, durant leur hébergement. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début des procédures . Les souris seront observées quotidiennement et une grille de score sera utilisée prenant en compte le comportement naturel et provoqué de l’animal, la variation pondérale et la caractérisation expérimentale . Si un des points limite est atteint (valeur maximale de la grille de score) cela entrainera la mise à mort de l’animal . Pour pallier toute perte de poids et/ou déshydratation des animaux affaiblis par l’infection, de la nourriture hydratée et du lait en poudre appétant seront aussi fournis directement dans la cage. Suivant les cas, des mesures complémentaires seront prises en concertation avec le SBEA (structure du bien-être animal) et le vétérinaire référent. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’anti-inflammatoire entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésiques qui pourraient interférer avec nos résultats et masquer l’expression des marqueurs d’intérêt. Toutefois, l'utilisation d'anesthesie pourra être utilisée pour certaines procédures comme les injections intra-nasales.
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont similaires à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Nous utiliserons uniquement des animaux adultes, de plus de 6 semaines, avec un poids supérieur ou égal à 20g. Les animaux doivent en effet avoir un système immunitaire mature et un poids suffisant en début du protocole et éviter les variations physiologiques non dues au protocole.
Réaction de sevrage, métabolites microbiens et régulation du système immunitaire
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, présentent du sang dans les selles ou restent voûtées en permanence sont mises à mort. 5 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines reçoivent une injection intrapéritonéale tous les deux jours pendant quatorze jours, d'autres un gavage à l'âge de deux semaines, une instillation intranasale sous anesthésie ou des prises de sang hebdomadaires, et une partie est rendue immunodéprimée avant une greffe de moelle osseuse. Le porteur cherche à comprendre comment le microbiote intestinal du nouveau-né éduque son système immunitaire, sans expliquer ce qui fixe l'effectif à 5 400 animaux au-delà de la variabilité du microbiote et des effets de portée et de cage.
Objectifs
L’objectif global de ce projet est de comprendre comment le microbiote intestinal, par la production de métabolites, éduque le système immunitaire pendant la période néonatale et permet de maintenir un état symbiotique. Pour se faire, le projet visera à : (i) comprendre quelles cellules, bactéries, produits bactériens et molécules immunitaires sont impliqués pendant la réaction de sevrage pour diminuer la susceptibilité de développer des pathologies inflammatoires ; (ii) comprendre par quels mécanismes les métabolites microbiens participent à la persistance des effets bénéfiques de la période néonatale jusqu’à l’âge adulte. Répondre à ces deux objectifs permettrait d’identifier de nouveaux traitements comme des pro/pre/post-biotiques, ainsi que de nouveaux biomarqueurs au début de la vie afin de diminuer la prévalence aux maladies inflammatoires.
Bénéfices attendus
Le projet devrait faire progresser les connaissances scientifiques et profiter à la santé humaine. On sait peu de choses sur la façon dont le microbiote intestinal au début de la vie forme l'immunité à l'infection tout au long de la vie. Ce projet a le potentiel d'ajouter des données importantes au domaine scientifique en fusionnant l'immunologie et la recherche sur le développement précoce de la vie. Ce projet vise à identifier à la fois les biomarqueurs d'une formation immunitaire saine ou perturbée, ainsi que les composés potentiels qui peuvent restaurer une empreinte immunitaire saine. En recherchant et en testant différentes bactéries, métabolites et composés immunitaires, ce projet a le potentiel d'identifier des agents thérapeutiques qui pourraient être utilisés en médecine humaine comme de nouvelles thérapies de prévention de la dysrégulation immunitaire.
Procédures
- Prélèvement sanguin 1 ou 2 fois maximum par procédure ou 1 fois par semaine pendant trois semaines et terminal sous anesthésie. Quelques secondes à chaque fois - Injection par voie intrapéritonéale une fois tous les deux jours, par animal, pendant 14 jours ou 1 ou 6 fois maximum par procédure. Durée : quelques secondes - une instillation intranasale. Durée : 2 min sur souris anesthésiée - Gavage 1 fois à l’âge de 2 semaines. Durée : quelques secondes - Injection intraveineuse 1 fois à l’âge adulte. Durée : quelques secondes sur souris anesthésiées
Impact sur les animaux
L’introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires pour les administrations et les prélèvements induisent une douleur et un inconfort de courte durée. Le gavage de substances, effectué conformément aux bonnes pratiques de gestion des animaux, peut causer inconfort de courte durée. Certains traitements entraînent une pathologie intestinale avec diarrhée transitoire et une perte de poids qui peut varier de 10 à 20%. Un traitement peut entraîner une perte de poids au jour 4 chez certains individus (
Devenir
Toutes les expériences nécessitent l'analyse des cellules dans les tissus intestinaux et d'autres organes. La seule façon d'évaluer cela est de mettre les animaux à mort à la fin de chaque expérience.
Remplacement
Aucune alternative non-animale n’est disponible pour accomplir ce projet. L’interaction complexe que représentent les milliards de bactéries du microbiote intestinal et son hôte ne peut être reproduite in vitro. Les nouveaux modèles organoïdes tridimensionnels ne peuvent pas représenter la grande variété de cellules immunitaires dans l’intestin ainsi que le recrutement de ces dernières, ou encore mimer les différents signaux produits par notre système nerveux central, qui joue un rôle prépondérant dans l’éducation du système immunitaire. De ce fait, pour répondre aux questions de ce projet, il est toujours essentiel et nécessaire d’utiliser des modèles animaux.
Réduction
D'après la littérature et nos résultats antérieurs, les effectifs par groupe prévus permettent d'atteindre des tailles d'effet compatibles avec la question biologique, en prenant en compte la forte variabilité des données (microbiote) et étant donné que le projet inclut des effets portée et cage. Le calcul de ce nombre tient compte d'un minimum de sang, de cellules et d'organes à prélever pour analyse et inclut pour chaque série d'expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il prend également en compte la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure les artefacts expérimentaux et donc les erreurs d'interprétation. De plus, les expériences ont été conçues afin d’utiliser un maximum d’organes de la même souris afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons utilisé une aide statistique pour déterminer le nombre minimum de souris à utiliser par groupe pour obtenir des résultats significatifs, en tenant compte de la variabilité inhérente à l'expérience. Ces tests ont été développés à partir d'outils référencés. Les données seront analysées grâce à des modèles ajustés sur plusieurs facteurs (âge, sexe de l’animal, traitement). Plusieurs facteurs de variabilité indésirable seront à prendre en compte tels que l’effet portée, cage et répétition de l'expérience.
Raffinement
Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles les animaux sont inclus est léger ou modéré. Le degré de souffrance modéré concerne les expériences entrainant une maladie inflammatoire, dont la sévérité peut être précisément suivie par une perte de poids, l’aspect général et un marqueur d’inflammation présents dans les fèces. De cette façon, l’expérimentateur peut estimer la douleur. Au cours de procédures comportant des maladies inflammatoires l’état des souris sera monitoré chaque jour visuellement et tous les 2 jours par une pesée, un contrôle de l’aspect général et l’inspection des selles. Lors de procédures comportant des maladies inflammatoires, l'utilisation de gel hydrique ou/et une réhydratation sous-cutanée sera pratiquée en cas de besoin. Si la perte de poids excède 20%, si la souris présente des signes de détresse clinique grave (léthargie, posture voûtée permanente, piloérection marquée, absence de toilettage), ou qu’une présence de sang dans les selles est observée, l’expérience sera interrompue et les souris présentant un ou plusieurs de ces symptômes seront mises à mort. Pour certains gestes, l’anesthésie sera aussi utilisée.
Choix des espèces
Ce projet vise à explorer et comprendre les interactions complexes, dans le temps, entre les cellules du système immunitaire et le microbiote. Il est donc impossible de modéliser de telles interactions in vitro ou in silico, d’autant plus que relativement peu de choses sont connues dans ces interactions. De plus, les traitements antibiotiques ont déjà été validés dans cette espèce. Le modèle de choix est la souris, qui se prête idéalement aux expériences sur le système immunitaire et le microbiote intestinal, bien connus dans cette espèce. Les souris que nous utiliserons seront des jeunes souris entre la période postnatale et le péri-sevrage (0-4 semaines), des souris adultes (8-15 semaines) et des souris âgées (plus de 6 mois). Ce projet étudie l'influence du microbiote au début de la vie sur les résultats de l’inflammation de différents organes à l'âge adulte. Il est donc nécessaire d'utiliser des souris gestantes et de tester leur progéniture tout au long de la vie jusqu'à l'âge de 15 semaines et à un âge avancé.
Manipulation pharmacologique d’agents anti-agrégats chez un modèle murin du syndrome d’Ondine (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
1 182 souris porteuses de la mutation du syndrome d'Ondine vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures allant de la mise à mort sous anesthésie sans réveil à un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nées et les juvéniles sont anesthésiées puis tuées pour prélever une partie de leur système nerveux central. Les autres reçoivent des solutions dans le nez sous anesthésie et dans l'abdomen en vigile, avant soixante minutes enfermées dans une enceinte de mesure respiratoire, jusqu'à trois fois. Le porteur note que ces souris supportent mal l'anesthésie et risquent alors une défaillance respiratoire, tout en pratiquant sous anesthésie les administrations intranasales qui peuvent obstruer leurs voies aériennes.
Objectifs
Les syndromes d’hypoventilation alvéolaire centrale (SHAC) sont des pathologies associées à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux autonome. Ces SHAC sont associées à une altération de la respiration et surviennent dès la naissance. Ces pathologies s’accompagnent d’une réduction voire d’une absence de réponse respiratoire à l’hypercapnie (trop de CO2 dans l’air inspiré) Cette réponse est vitale et nécessaire pour éliminer le CO2 de l’organisme. Elle est produite par les neurones du cerveau qui composent la commande respiratoire. L’endormissement et le sommeil s’accompagnent d’irrégularités respiratoires pouvant conduire à une situation d’hypercapnie. Ainsi, les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide ventilatoire dès qu’elles s’endorment. Le bon fonctionnement des cellules de la commande respiratoire, sensibles aux variations de CO2, dépend de l’expression d’un gène codant pour une protéine spécifique. Si le gène est muté, la protéine a une mauvaise structure et forme des assemblages protéiques anormaux (les agrégats) non fonctionnels. Les expérimentations seront réalisées chez des souris mutantes modèle d’un SHAC. Des approches utilisées chez des souris nouveau-nées et juvéniles permettront d’étudier la commande centrale respiratoire, d’identifier l’agent anti-agrégats le plus efficace et d’enregistrer l’activité des neurones respiratoires avec ou sans agents anti-agrégats, qui participent à la détection du CO2 dans l’organisme et à la mise en place de la réponse respiratoire à l’hypercapnie. Chez des mêmes souris juvéniles puis adultes, l’approche utilisée est non invasive. Elle permettra de déterminer l’effet bénéfique d’agents anti-agrégats sur la respiration. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment les agrégats impactent la respiration. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) permettront le développement de nouvelles pistes thérapeutiques dans le cadre des SHAC. MODIFICATION : l'ajout d'administration de molécule et de test physiologique nécessite une modification du projet initial sans ajout d'animaux.
Bénéfices attendus
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur un gène dont la protéine est exprimée dans une population de neurones indispensables à la réponse respiratoire à l’hypercapnie. A la naissance, ces souris ne présentent pas de réponse respiratoire à l’hypercapnie. Cette dernière est partiellement restaurée chez les souris adultes. L’inhibition de la formation d’agrégats protéiques pourrait potentiellement : 1/améliorer la respiration des souris nouveau-nées, juvéniles ou adultes. 2/restaurer une réponse respiratoire à l’hypercapnie chez les souris nouveau-nées ou juvéniles. 3/restaurer ou potentialiser la réponse respiratoire à l’hypercapnie des souris adultes. De plus, nous souhaitons 1/identifier les cibles cellulaires et moléculaires des agents anti-agrégats au niveau de la commande respiratoire et 2/déterminer si ces cibles évoluent selon l’âge des souris mutantes dont certaines récupèrent naturellement une faible réponse respiratoire à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre comment les agrégats impactent la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques chez les patients.
Procédures
Les souris mutantes et contrôles, nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées (quelques minutes) puis euthanasiées afin d’isoler rapidement une partie du système nerveux central. D’autres souris juvéniles (1 fois entre 12 et 15 jours) puis adultes (3 fois entre 1-6 mois) recevront une administration de deux solutions (48 heures séparent les 2 administrations) selon deux techniques : une sur animal sous anesthésie générale (10 minutes maximum) et l’autre sur animal vigile (moins de 10 secondes). Une mesure non invasive de la ventilation sera réalisée 1 fois chez les souris juvéniles puis 3 fois chez ces souris adultes pendant 60 min à chaque fois (1 fois par jour pendant 2 jours) dans une enceinte hermétiquement fermée et alimentée par un flux d’air en continu. L’acclimatation des animaux à ces enceintes a lieu pendant 1 heure par jour pendant les 5 jours qui précèdent l’enregistrement (hors week end). L’hébergement individuel des animaux est limité au maximum.
Impact sur les animaux
Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité exacerbée à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. L’administration intranasale des deux solutions peut entraîner une altération de la ventilation par obstruction des voies aériennes supérieures, sous anesthésie générale. L’administration intrapéritonéale (au niveau de l’abdomen) des deux solutions apparaît comme une source de douleur/un stress de courte durée. L'acclimatation aux enceintes de pléthysmographie et les mesures de ventilation pourront entrainer un stress social de courte durée chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des actes en vue des prélèvements et analyses nécessaires.
Remplacement
L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèles murins ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire et aux neurones qui élaborent cette commande, dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail réalisé à partir de souris vivantes. L’étude de l’influence d’agents anti-agrégats sur la commande centrale respiratoire nécessite de conserver ex vivo un réseau vivant et fonctionnel de neurones et donc l’utilisation de souriceaux. L’étude des corrections des variables respiratoires par le(s) agent(s) anti-agrégats ne peut être réalisée que sur des souris vigiles, non contraintes et non anesthésiées.
Réduction
Nous utilisons aussi bien les souris mâles que les femelles (1182 animaux au total) dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux mutants et sauvages (contrôles). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et permet de mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Des tests statistiques seront réalisés a posteriori pour procéder à une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes. L'isolement est évité au maximum. Le milieu des animaux est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’habituation aux enceintes de pléthysmographie (technique permettant de mesurer de manière non invasive la ventilation de la souris in vivo) se traduit par la disparition des épisodes d’augmentation anormale de la fréquence respiratoire et de toilettages des souris lorsqu’elles sont dans un nouvel environnement. Après 5 jours d’habituation, les souris sont calmes et leur respiration est régulière dès le placement dans l’enceinte. Les souris mutantes présentent une sensibilité exacerbée à l’anesthésie ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des administrations intranasales sous anesthésie. Lors des administrations intranasales d’agents pharmacologiques, sous anesthésie gazeuse, avant l’enregistrement de leur ventilation, les souris sont sous surveillances accrue, jusqu’à leur réveil complet pour ainsi éviter l’arrivée de points limites (irrégularités respiratoires, obstruction des voies aériennes, arythmie cardiaques) et prévenir le décès non souhaité des animaux.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude de la respiration et de son contrôle nerveux. Le modèle animal de la pathologie sur laquelle nous travaillons, n’existe, de nos jours, que sur modèle de souris mutées pour le gène responsable de la maladie. Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès, chez ces souris mutées, au réseau de neurones qui contrôle la respiration à différents âges (stade nouveau-né et juvénile) pour l’étude de l’influence des agents anti-agrégats sur l’activité de ce réseau ; et d’étudier la respiration des souris (juvéniles et adultes) vigiles et de l’effet des agents anti-agrégats sur celle-ci, appliqués de deux façons différentes aux souris.
Modification du projet : Impact de l’hypoxie intermittente sur l’activation du système sympathique et ses répercussions sur le métabolisme et la fonction cardiaque 1/3
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
Quand l'injection d'insuline fait tomber leur glycémie sous 40 mg/dL, les souris reçoivent du glucose pour les remonter. 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après seize semaines d'exposition à une privation intermittente d'oxygène pour prélever leurs organes. Elles sont habituées progressivement au tube de contention servant aux mesures de pression artérielle, transportées entre trois établissements distincts, et certaines portent un implant de télémétrie posé au cours d'une chirurgie de trente minutes. Le porteur écrit que dix animaux par groupe suffisent pour ses analyses métaboliques et que cinq suffisent pour la télémétrie, sans détailler comment ces effectifs aboutissent aux 390 souris déclarées pour ce volet.
Objectifs
Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.
Bénéfices attendus
L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.
Procédures
Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).
Impact sur les animaux
Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.
Remplacement
Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.
Réduction
Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).
Raffinement
Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.
Modification du projet : Impact de l’hypoxie intermittente sur l’activation du système sympathique et ses répercussions sur le métabolisme et la fonction cardiaque 3/3
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
Huit heures de privation d'oxygène par jour, de 8 h à 16 h, pendant seize semaines : 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles subissent trois séries de tests de stimulation à l'insuline, au glucagon, à l'adrénaline ou à la dexaméthasone, trois électrocardiogrammes et trois échographies sous anesthésie, quarante-huit heures en cage de mesure des échanges gazeux, et des mesures de pression artérielle en tube de contention. Le protocole, réparti sur trois établissements voisins entre lesquels les animaux sont transportés, prévoit aussi soixante-dix chirurgies de trente minutes pour implanter un émetteur de télémétrie, suivies de quatorze jours de surveillance. La thérapie espérée contre les dérèglements métaboliques de l'apnée du sommeil reste énoncée au conditionnel, quand la privation d'oxygène, elle, court sur quatre mois.
Objectifs
Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.
Bénéfices attendus
L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.
Procédures
Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).
Impact sur les animaux
Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.
Remplacement
Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.
Réduction
Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).
Raffinement
Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.
Etude de l’efficacité d’une nouvelle formulation vaccinale BCG chez le furet
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Douze furets reçoivent un vaccin BCG par voie orale puis une administration intratrachéale de BCG recombinant, avec huit prises de sang et un lavage broncho-alvéolaire répartis sur dix-huit semaines, la plupart de ces actes sous anesthésie générale de quinze à trente minutes. Ces douze individus, six vaccinés et six témoins, subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le fournisseur est chargé de castrer les mâles avant livraison. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit la complexité du tissu pulmonaire, et présente le furet comme un bon modèle pour "remplacer" le blaireau, espèce sauvage réellement visée par ce vaccin vétérinaire mais dont l'expérimentation est plus lourdement encadrée. Tous seront mis à mort pour prélever trachée, poumons, ganglions et rate.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans un projet scientifique visant à étudier la vaccination contre la tuberculose dans la faune sauvage. Le champ d’application du vaccin est donc vétérinaire. Le furet et le blaireau sont deux espèces sensibles à Mycobacterium bovis. Le blaireau étant une espèce sauvage, l’expérimentation est soumise à une réglementation complémentaire contrairement au furet qui est une espèce domestique. Notre partenaire pour ce projet, a validé la pertinence du furet comme modèle du blaireau pour l’infection à Mycobacterium bovis. Les objectifs sont d’analyser l’influence de la voie de vaccination orale sur la mise en place d’une réponse immunitaire contre les mycobactéries. Les protocoles précédents ont permis : 1/ de prendre en main le modèle furets et de développer des outils afin d’analyser la réponse immunitaire induite chez le furet. 2/ de valider les outils développés dans le protocole 1 et l'efficacité de l’administration du vaccin par voie orale. Le protocole 3 (proposé dans cette DAP) a pour objectif de tester l’efficacité de la réponse vaccinale induite par l’administration, par voie orale, du vaccin BCG formulé . L’intérêt de la formulation est de potentialiser la mise en place de la réponse vaccinale par rapport à du BCG non formulé (c’est-à-dire augmenter l’intensité des réponses immunitaires et/ou leur durée sans augmenter la dose d’antigène). La formulation améliore aussi la stabilité du vaccin. Le choix de la formulation vaccinale a été réalisé par notre partenaire qui a testé 4 formulations. L’innocuité de la formulation a été validée in vivo sur modèle furet par notre partenaire. Dans ce protocole, nous allons analyser les réponses immunitaires des animaux et valider ou non l’efficacité de ce nouveau vaccin. Le présent projet est prévu pour au maximum 12 furets : un lot de 6 animaux vaccinés (BCG formulé) administré par voie orale et un lot de 6 animaux témoins non vaccinés recevant un placebo par voie orale. Les 2 lots sont ensuite challengés par administration de BCG recombinant (fluorescent) par voie intratracheale. Ce projet a pour but de vérifier à l’aide d’un challenge avec un BCG recombinant (fluorescent) l’efficacité de la réponse vaccinale induite par la vaccination BCG par voie orale. L’intégralité du protocole (vaccination et épreuve) est réalisée avec la souche vaccinale BCG utilisée en médecine humaine. Nous restons donc sur un modèle d’infection non virulente.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de valider l’efficacité de la réponse vaccinale induite par la vaccination BCG par voie orale permettant la mise en place d’une protection optimale contre les mycobactéries. Ce projet nous permettra de definir les corrélats de la protection contre une exposition mycobacterienne qui sont induits dans le poumon et dans le sang par la vaccination orale au BCG.
Procédures
Au cours des 18 semaines du projet, chaque furet sera soumis au maximum à : 1/ Un traitement anti-parasitaire et son rappel si besoin (1 à 2 min) 2/ 1 pose de puces télémétriques qui durent quelques secondes 3/ 8 prises de sang : au maximum 1 prélèvement par semaine. Une prise de sang dure quelques secondes 4/1 LBA (lavage-broncho-alvéolaire) qui dure 2 à 5 min 5/ 1 administration par voie orale d’un vaccin BCG qui dure quelques secondes 6/ 1 administration en intra-trachéale d’un vaccin BCG recombinant, qui dure quelques secondes Tous ces actes, hormis la vermifugation et l’administration par voie orale se feront sous anesthésie générale pendant 15 à 30 minutes selon la nature et le nombre d’actes effectués
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pourraient être liés à une mauvaise réaction des animaux à l’anesthésie générale ou à un des gestes techniques qui induirait une réaction inflammatoire locale, un hématome ou une infection. Les injections et prises de sang peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection/prélèvement. Les administrations par voie orale et par voie intra-trachéale peuvent engendrer une légère irritation de la trachée. L’ensemble de ces interventions peuvent générer du stress pour les furets.
Devenir
La totalité des animaux sera mis à mort à l’issue du projet. Des prélévements de tissus seront réalisés par les concepteurs : trachée, poumons, ganglions, rate... pour des analyses.
Remplacement
A ce jour, il n’existe aucun système in vitro ou méthode alternative permettant de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le blaireau est l’espèce cible pour l’étude de la tuberculose mais les expériences sur cette espèce sauvage sont difficiles à mettre en œuvre. Cependant, il a été démontré par la communauté scientifique que le furet est un bon modèle pour remplacer le blaireau.
Réduction
Pour ce projet, le nombre minimal d’animaux a été fixé à 6 par lot pour favoriser d’une part le lien social entre les animaux (hébergement en couple) et pour avoir suffisamment d’échantillons biologiques qui soient statistiquement pertinents pour la suite du projet. En fonction de ce que le fournisseur sera en mesure de nous fournir au moment de la commande, le sexe ratio de chaque lot pourra être adapté. L’expérimentation contient 2 lots d’animaux : un lot de 6 animaux vaccinés au BCG par voie orale puis challengés par administration de BCG recombinant (fluorescent) par voie intratracheale et un lot de 6 animaux témoins non vaccinés recevant un placebo (du PBS par voie orale) puis challengés par administration de BCG recombinant (fluorescent) par voie intratracheale. Le nombre d’animaux utilisés pour fournir des échantillons a été déterminé grâce à un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge vaccinale).
Raffinement
A l’arrivée des animaux, une période d’acclimatation de 4 semaines sera respectée pour habituer les animaux aux interventions du personnel (manipulations, jeux, friandises). Ils seront uniquement vermifugés et un test de formulation sans BCG avec du Chitosan sera proposé (200µL par voie orale) pour vérifier la prise par les animaux. Pour leur bien-être, la pose d’implants hormonaux et de puces télémétriques se fera donc après la phase d’acclimatation au cours de la même anesthésie générale. Pour limiter les blessures infligées par les mâles sur les femelles, nous demanderons une castration des mâles par le fournisseur. Les animaux seront hébergés dans des cages conçues pour le furet. Chaque furet disposera de sa propre cage connectée par 2 avec un tunnel pour se regrouper. Un hamac en tissu sera suspendu permettant aux furets d’avoir un coin de repos. Différents jouets seront utilisés (balle, jouets en plastique dur, tissus…). Des récompenses alimentaires (saumon, jus de thon, pâte appétente) seront données après les interventions sans anesthésies et dès l’acclimatation pour habituer les animaux à l’administration orale du vaccin. Pour certaines interventions, les furets seront maintenus sous anesthésie générale gazeuse avec monitoring (fréquence respiratoire, fréquence cardiaque, température), sous lampe et tapis chauffant et sous la supervision du personnel en charge des anesthésies. Lors de l’intubation intra-trachéale, du gel anesthésiant sera mis sur la sonde d’intubation pour anesthésier la gorge. Pour détendre la mâchoire des furets et faciliter l’intubation ils recevront une injection d’anesthésiques. Lors de la phase de réveil, une surveillance rapprochée de l’animal sera effectuée. Des molécules seront disponibles, pour faciliter le réveil et gérer la douleur. En cas d'infection, un traitement antibiotique de 1ère intention sera mis en place en accord avec la vétérinaire de l’unité. Deux visites quotidiennes seront réalisées pour assurer les soins et surveiller l’état de santé des furets. Des point limites ont été définis. Si un animal présente des signes cliniques (atteinte de l’état général, perte d’appétit, isolement, prostration…), la vétérinaire d’unité sera consultée et un vétérinaire praticien pourra être contacté (espèce furet).
Choix des espèces
Le furet est un modèle validé pour l’étude d’espèces de la faune sauvage (blaireau) qui constitue l’espèce ciblée par le projet de vaccination contre la tuberculose animale. Le furet et le blaireau sont deux espèces de Mustélidés qui sont sensibles à Mycobacterium bovis. Le blaireau étant une espèce sauvage, l’expérimentation sur cette espèce est soumise à une réglementation complémentaire contrairement au furet qui est une espèce domestique. Animaux adultes âgés d’environ 12 mois (poids d’environ 1000 g pour les mâles et 800 g pour les femelles). Le choix d’animaux adultes agés de 12 mois est conditionné d’une part par le fait que la vaccination est plus pertinente sur animaux adultes que chez des jeunes dont le système immunitaire est en cours de développement et d’autre part pour avoir des animaux d’un poids suffisant (notamment les femelles) pour faciliter les procédures d’anesthésies et de prélèvements sur les animaux et réduire au maximum l’impact sur leur état de santé.