Système musculosquelettique

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une obésité et un diabète leur sont induits par un régime gras et des injections de streptozotocine, avec tests de tolérance au glucose, prises de sang répétées et densitométrie, avant l'euthanasie pour prélever leurs os et d'autres organes. Le porteur indique que la streptozotocine peut provoquer douleur transitoire et hypoglycémie, et que l'excès de poids peut gêner la mobilité des souris obèses. Il affirme qu'un modèle cellulaire isolé ne peut rendre compte des interactions entre tissus recherchées ici.

Objectifs

Ce projet a pour objectif principal de mettre en place un modèle animal atteint d’obésité et de diabète de type 2 (DT2), afin d’étudier in vivo les altérations de fragilité osseuse liées à l’obésité et au diabète. En France 56 % des hommes et 40 % des femmes souffrent de surpoids ou d'obésité, un problème de santé publique qui favorise l’apparition de diabète et d’hypertension artérielle, responsables de complications rénales et cardiovasculaires. Selon des études cliniques et fondamentales, l’obésité et sa complication en diabète (hyperglycémie), sont aussi associées à une fragilité exacerbée des os et un risque de fracture augmenté. Ces anomalies osseuses s’accompagnent d’une augmentation de graisses qui s’acumulent dans la moelle osseuse, ainsi que d’altérations inflammatoires dans la moelle osseuse et dans les tissus périphériques. Cela suggère des effets délétères de l’accumulation de graisses sur le renouvellement de l’os et sa résistance. Cependant, les mécanismes par lesquels l’obésité et le diabète amplifient l’accumulation de graisses dans la moelle osseuse n’ont pas été identifiés. De plus, le rôle de ces graisses dans la fragilisation des os chez les individus obèses/diabétiques, reste à élucider. Le présent projet vise à évaluer chez la souris obèse diabétique : 1) l’accumulation et la distribution des graisses de la moelle osseuse, 2) l’impact de ces graisses sur la masse et la qualité du tissu osseux, 3) l’effet de l’obésité et du diabète sur la capacité de transformation des cellules stromales/précurseurs de la moelle osseuse en cellules graisseuses, et 4) à analyser la production de molécules immunoinflammatoires et leur rôle dans la formation de graisses et dans la fragilisation de l’os. Le modèle d’obésité induit chez les rongeurs à l’aide d’un régime alimentaire riche en graisses, est décrit comme un modèle de choix pour l’étude des conséquences de l’obésité sur la santé.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre la relation physiopathologique entre les désordres métaboliques liés à l’obésité et au diabète, et les maladies de fragilité osseuse. Il vise à générer des données à fort potentiel translationnel pouvant conduire au développement d’outils novateurs pour la prédiction, la prévention et la prise en charge des pathologies osseuses chez l’Homme. A court terme, ce projet permettra de valider la mise en place d’un modèle animal d’obésité et de diabète, représentatif de la pathologie humaine. Les études proposées apporteront des informations précieuses quant aux conséquences de l’obésité et du diabète sur la fragilisation des os. Elles pourraient éclairer le rôle précis de l’élévation de la graisse médullaire et de ses facteurs sécrétés, dans l’apparition d’altérations de la structure et de la microarchitecture des os. Les analyses prévues portent sur différents sites osseux afin d’apprécier la sensibilité spécifique de chaque site aux effets de l’obésité et du diabète. Le suivi longitudinal non invasif par densitométrie in vivo, permettra de corréler l’apparition des atteintes de masse osseuse avec la sévérité de l’obésité et du diabète. Des molécules liées à l’immuno-inflammation seront également mesurées dans les tissus et dans le sang circulant prélevés sur les animaux. Les résultats attendus pourraient permettre l’identification de biomarqueurs circulants et/ou tissulaires pour une évaluation précose et prédictive des atteintes ostéomédullaires et osseuses dans le contexte de l’obésité et du diabète. Si les résultats s’avèrent concluants, cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles études translationnelles et cliniques, pour évaluer l’intérêt de l’adiposité médullaire et de molécules immuno-inflammatoires séléctionnées dans des stratégies de prise en charge des pathologies de fragilité osseuse. De plus, compte tenu de la prévalence croissante de l’obésité et du diabète et leurs conséquences multiples sur la santé humaine, la validation du modèle animal peut à terme, ouvrir la voie vers de nouvelles collaborations avec des partenaires qui s’intéressent à d’autres complications du diabète.

Procédures

La procédure proposée dans le présent projet implique plusieurs gestes expérimentaux appliqués aux groupes d’animaux utilisés. Dans un premier temps, les souris seront mises sous régime alimentaire contrôle (LFD) ou riche en graisses (HFD) pour induire une obésité. Après 4 semaines de régime alimentaire contrôle ou gras, les souris maintenues vigiles recevront 3 injections intrapéritonéales de solution de streptozotocine (STZ) (groupes HFD/STZ) ou de tampon (groupes HFD et contrôle LFD) ; une injection par jour pendant 3 jours consécutifs. Pour vérifier la mise en place de la pathologie du diabète (hyperglycémie) dans les groupes HFD/STZ, des mesures de glycémie à jeun et des tests de tolérance au glucose (IPGTT) et à l’insuline (IPITT) seront réalisés sur tous les groupes d’animaux maintenus vigiles. La glycémie sera mesurée sur une goutte de sang prélevée dans la veine de la queue après ponction à l’aide d’une aiguille. Elle sera mesurée au début du protocole puis toutes les 4 semaines. Les tests IPGTT et IPITT sont prévus à deux temps, aux semaines 7 et 15 du protocole. Après une injection intrapéritonéale d’une solution de glucose (pour IPGTT) ou d’insuline (pour IPITT), une série de 5 mesures de glycémie seront réalisées à des intervalles de 15-30 minutes. Un temps de récupération de 3-4 jours est prévu entre le test IPGTT et le test IPITT. Les animaux de la cohorte 3 (60 souris) recevront aussi 3 injections intrapéritonéales de marqueurs fluorescents dont la sécurité est validée. Les 3 injections sont prévues sur les animaux maintenus vigiles aux semaines 12, 14 et 16 (la veille de la mise à mort). Enfin, tous les groupes d’animaux du projet (180 souris/3 cohortes) subiront des mesures par densitométrie (scanner) pour évaluer la composition corporelle en fonction du régime appliqué. Trois mesures de densitométrie (semaines : 0, 8 et 16) seront réalisées sur les souris sous anésthésie générale au gaz d’isoflurane ; chaque mesure dure 4-6 minutes d’acquisition. Deux prises de sang sont également prévues (aux semaines 8 et 16) sur tous les animaux. La première sur les souris vigiles, est prévue par ponction de la veine latérale de la queue et à l’aide d’un capillaire après application locale d’un gel anesthésique. Le second prélèvement est prévu par ponction cardiaque sur les souris sous anesthésie générale terminale à l’isoflurane, juste avant mise à mort (semaine 16) pour prélèvement d’organes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront utilisés comme modèle pathologique d’obésité et de diabète, induit par un régime alimentaire gras avec ou sans injections de streptozotocine (STZ). Le modèle est largement décrit dans la littérature, les principales nuisances / effets indésirables inhérents aux procédures expérimentales prévues sont les suivants : - Pendant les injections IP de solution de STZ ciblant les cellules du pancréas, comme déjà obsevé dans un protocole du laboratoire (n°2021060316221938), les animaux peuvent manifester un stress limité dans le temps voire une douleur transitoire (12-24 heures) dus au pH acide de la solution de STZ. Un risque de prostration de l’animal peut être aussi observé pendant 30 à 60 minutes post-injection en raison d’un risque d’hypoglycémie consécutive à l’injection de STZ. Une surveillance renforcée sera mise en place jusqu’à rétablissement complet de l’animal puis 2 surveillances par jour au minimum. - Lors des injections IP de solutions de marqueurs fluorescents, ou de solution de glucose/insuline pour les tests de tolérance au glucose/insuline, les animaux pourraient subir un stress limité dans le temps. Lors des prises de sang pour les mesures de glycémie, la ponction de la veine caudale pour le prélèvement sanguin peut induire une douleur localisée et ponsctuelle. Pour la prise de sang prévue à la 8ème semaine du protocole, un gel de pramocaïne 1% (anesthésique local) sera appliqué préalablement à la ponction. - Une prise de poids qui pourrait provoquer une gêne limitée à la mobilité des animaux obèses (HFD) à partir de la semaine 12 du protocole. Après installation d’une hyperglycémie diabétique chez les animaux traités avec la STZ (groupes HFD/STZ), la prise de poids peut s’inverser par comparaison aux animaux des groupes HFD. Le poids des animaux sera donc contrôlé de manière hebdomadaire et son impact sur le bien-être des animaux sera pris en compte dans la surveillance des points limites.

Devenir

Le présent projet vise à étudier l’impact de l’obésité et du diabète de type 2 (DT2) sur l’accumulation de graisses dans la moelle osseuse, et les conséquences de ces graisses sur le tissu osseux qui augmenteraient la fragilisation des os et le risque de fracture. Ainsi, à la fin de la procédure expérimentale proposée, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyse.

Remplacement

Le projet proposé vise à étudier in vivo les mécanismes physiopathologiques qui expliqueraient les relations observées entre accumulation d’adiposité médullaire (graisse de la moelle osseuse) et développement de fragilités osseuses dans le contexte d’obésité et de diabète. Ce contexte de pathologies métaboliques, complexes et multifactorielles, et ses conséquences systémiques nécessitent une approche d’étude intégrée, qui tient compte des interactions multiples entre tissus et entre tissus et facteurs moléculaires circulants. Ainsi, le modèle de souris obèse/diabétique constitue un modèle de choix et bien établi pour mimer la pathologie humaine. De plus, ce projet s'intéresse à l’implication de facteurs métaboliques et des molécules immuno-inflammatoires circulantes dans le sang, dont l’étude requiert un modèle d'étude chez l’animal vivant. L’utilisation d’alternatives basées sur des modèles cellulaires isolés in vitro ne pourra répondre à ces objectifs. Les hypothèses et les objectifs de ce projet s’appuient sur des études complémentaires déjà réalisées in vitro sur des modèles de cellules souches de la moelle osseuse, exposées à des stimulations métaboliques et immuno-inflammatoires. Ces études in vitro ont permis d’identifier des molécules qui pourraient impacter le tissu osseux et dont l’évaluation nécessite un modèle in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux sera limité à un maximum de 20 par groupe pour assurer des résultats statistiquement comparables. Ce nombre tient compte des données de la littérature, et des analyses prévues devant faire l’objet de tests statistiques. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans le présent projet, plusieurs analyses sur plusieurs sites osseux seront regroupées dans la même étude et sur les mêmes groupes d’animaux. Les mêmes prélèvements osseux (e.g. le même tibia) serviront à la fois pour des analyses par histologie et par immunohistochimie. Le deuxième tibia de chaque animal servira pour des analyses par microtomographie (microCT). Ce même tibia (comme tous les autres prélèvements osseux) sera scanné par microCT, une première fois pour analyser la microarchitecture osseuse, et une seconde fois pour évaluer la graisse de la moelle osseuse après un traitement spécifique de l’échantillon. Pour réaliser un suivi de l’apparition des atteintes osseuses et de la composition corporelle au cours du temps, et en conformité avec le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, plusieurs mesures (scans) à l’aide d’un densitomètre sont prévues sur les mêmes souris in vivo. Outre la réduction du nombre de groupes d’animaux utilisés à différents temps de suivi, cette approche permettra aussi de réduire les biais expérimentaux liés à la variabilité interindividus des mesures réalisées. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour les projets du laboratoire, d’autres organes seront récupérés et utilisés dans un autre projet collaboratif qui s’intéresse à l’étude des dysfonctions vasculaires et rénales liées au diabète.

Raffinement

Les animaux, hébergés par groupes de ~4-6 souris/cage, seront inclus dans le protocole après 1-2 semaines d’acclimatation dans l’établissement d’expérimentation. Avant injection intra-péritonéale de la solution de streptozotocine (STZ), les souris seront prélablement habituées à des injections de sérum physiologique afin de prévenir/réduire le risque de stress. Après injection de la STZ, une surveillance renforcée sera mise en place pendant au moins une heure puis au minimum 2 fois par jour. La surveillance portera sur des signes relatifs au bien-être et l’état général de l’animal, son comportement et son alimentation. En cas de mal-être persistant, une eau de boisson à 10% de sucrose sera fournie à l'animal pendant 24 heures, et des aliments hydratés seront déposés au fond de la cage. Le poids corporel sera également mesuré une fois par semaine. Une perte de poids excessive (>15% du poids initial avant injection STZ) et persistente pendant 3 jours consécutifs, entraine une sortie du protocole et la mise à mort de l’animal. Pour préserver la qualité de l’alimentation, les aliments sont entièrement remplacés 2 fois par semaine. Lors de la ponction de la veine caudale pour prélèvement sanguin, un gel anesthésique sera préalablement appliqué localement. Les mesures in vivo de la composition corporelle à l’aide d’un scanner (densitomètre ou microCT) seront réalisées sur les animaux sous anesthésie gazeuse, ce qui garantit une sédation rapide et un réveil rapide des animaux. Enfin, après développement d’une hyperglycémie, la litière sera changée plus fréquement (~2 fois/semaine) en raison d’un risque d’augmentation de la fréquence/volume d’urines.

Choix des espèces

La souris et particulièrement la souche C57BL6J est largement reconnue pour sa sensibilité à la prise de poids sous régime gras, et à l’action de la streptozotocine-STZ ciblant les cellules du pancréas pour induire une défcience de sécrétion d’insuline à l’origine d’hyperglycémie. La souris C57BL6J présente aussi un fond génétique largement exploité en recherche sur des modèles génétiquement modifiés des pathologies d’intérêt (maladies osseuses et métaboliques). Ainsi, l’utilisation de cette souche de souris présente un intérêt pour permettre des analyses comparatives et complémentaires des données expérimentales obtenues sur des modèles pathologiques induits par des méthodes différentes sur la même souche Des souris jeunes adultes (âgées de 6 à 7 semaines) pour pouvoir les suivre durant un protocole expérimental relativement long (16 semaines après inclusion). Le protocole s’appuie également sur des données de la littérature issues de protocoles ayant validé des modèles similaires (obèses et/ou diabétiques) avec des souris C57BL6J dont l’âge d’inclusion varie de 6 à 12 semaines.

48 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont réparties entre sédentarité et accès à une roue, suivies par IRM et mesure de la respiration en cage individuelle, avant une prise de sang sous anesthésie puis l'euthanasie pour prélever leurs articulations. Le projet vise à décrire l'effet de l'hygiène de vie sur le vieillissement des articulations, un champ que le porteur présente comme peu étudié. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne peut répondre à la question car il faut maintenir la communication entre organes au cours du vieillissement.

Objectifs

Nous savons peu de choses sur la façon dont les tissus articulaires réagissent au vieillissement naturel. Or la réduction de mobilité est sans aucun doute l'une des conséquences les plus débilitantes du vieillissement. Cette réduction de mobilité devient également un problème croissant avec l’augmentation de l’inactivité physique et de la sédentarité des enfants et adolescents, souvent associés à des risques de surpoids et d'obésité. Il y a actuellement une littérature abondante sur l’impact bénéfique de l’exercice physique (et délétère de la sédentarité) sur la qualité de l’os chez les sujets jeunes ou âgés (humains et murins). Il est par exemple reconnu que la pratique régulière de l’exercice physique pendant la croissance permet d’optimiser le capital osseux pour toute la vie. En revanche, on ne sait rien quant à son impact sur l’articulation et sur la façon dont les différents types cellulaires composant les 3 tissus de l’articulation (membrane synoviale, cartilage et os sous-chondral) sont modifiés chez le sujet jeune et âgé en fonction de son hygiène de vie. Nous faisons donc l’hypothèse que 1) le vieillissement normal modifie l'écosystème ostéoarticulaire, 2) la sédentarité du jeune adulte induit un vieillissement accéléré des articulations et 3) l’exercice physique a un effet bénéfique sur le vieillissement des articulations.

Bénéfices attendus

- Impact scientifique et technologique : Identification de nouveaux gènes jouant un rôle clé dans la longévité et la bonne santé des articulations, acquisition de nouvelles connaissances dans le domaine de la biologie ostéoarticulaire qui seront mises à disposition de la communauté scientifique internationale et pouvant servir à d’autres disciplines de la biologie. - Impact sociétal et économique : ce projet peut déboucher sur l’identification de gènes candidats qui pourraient représenter des cibles thérapeutiques intéressantes pour développer des traitements agissant contre le vieillissement des articulations et/ou des marqueurs de la qualité de la membrane synoviale, du cartilage et de l’os sous-chondral utilisables en cliniques.

Procédures

Aucun prélèvement ne sera effectué sur animal vigile. Les tests que nous réaliserons sont non invasifs : activité physique si l’animal le souhaite ; mesure de la composition corporelle par IRM (2 minutes 1 fois semaine); mesure du métabolisme par analyse de la respiration (animal placé en cage individuelle, deux fois 48h) . En fonction des lots, les animaux pourront être placés en cage avec des roues leur permettant de retrouver une activité physique spontanée pendant 8 semaines ou tout au long du test. En fin de protocole, les animaux recevront une injection intra-péritonéale d'anesthésique. Nous effectuerons alors un prèlèvement de sang sur l'animal endormi et il sera euthanasié.

Impact sur les animaux

Les 2 effets indésirables majeurs attendus sont le stress lié à l’hébergement ponctuel en cage individuelle et à la sédentarité. Afin de limiter ces effets, nous proposons de réaliser un enrichissement avec un tunnel en plexi rouge pour toute la durée de l’expérimentation, d’héberger les animaux par cage de 4, et de n’isoler que les animaux inclus dans les groupes « activité physique volontaire » uniquement pendant la période où ils sont dans les cages avec roue connectée. Par ailleurs, la température d'élevage ayant un impact sur le métabolisme, celle-ci sera de 22 à 23°C pour améliorer le confort des animaux.

Devenir

Euthanasie pour réaliser les prélèvements nécessaires aux analyses moléculaires.

Remplacement

Il est actuellement impossible de répondre à notre question scientifique par le biais d’approches in vitro car il est nécessaire de maintenir la communication entre tous les organes au cours du vieillissement pour vérifier l’impact de l’activité physique sur le cartilage et l’os.

Réduction

Nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment dans notre laboratoire et dans des publications utilisant des modèles expérimentaux similaires pour estimer le nombre d’animaux nécessaire. Compte tenu des données de la littérature montrant un dimorphisme sexuel de l’activité physique sur le remodelage osseux et une moindre variabilité inter-individuelle chez les femelles, nous n’utiliserons que des femelles. Compte tenu de l’expérience que nous avons sur les variabilités individuelles et le nombre de genoux requis pour obtenir une quantité suffisante de cellules pour les analyses transcriptomiques, nous réaliserons donc des expériences avec des lots de 8 souris. Ces expériences ne seront pas répétées. Nous nous sommes rapprochés des équipes qui étudient l’impact de l’âge et de l’exercice physique sur le métabolisme musculaire pour optimiser l’utilisation de ces animaux. Leur expertise nous a permis de choisir convenablement les paramètres du protocole expérimental. De plus, ils prélèveront lors de l’euthanasie finale les muscles squeletiques afin de compléter une étude en cours (analyses histologiques et tri cellulaire) et de constituer une banque de données.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours y compris le weekend et les jours fériés et les signes de souffrance (perte excessive de poids, hyperactivité ou au contraire isolement, hérissement des poils, dos voûté) seront recherchés. En cas d’apparition, ces manifestations cliniques seront scorées suivant une échelle prenant en compte plusieurs de ces paramètres, avec établissement de points limites entrainant euthanasie des animaux si nécessaire en accord avec la SBEA. Un enrichissement des cages sera réalisé en utilisant des tunnels de plexiglass rouge de façon à diminuer le stress des animaux et à les habituer aux mesures de composition corporelle qui sont réalisées dans un tube de contention similaire. La température de thermoneutralité pour les souris est proche de 30°C et il est bien documenté qu’il y a un impact de la température sur le métabolisme des tissus musculaires et adipeux. Nous maintiendrons les animaux pendant toute la durée de l’expérience entre 22-23°C pour nous approcher de cette température idéale tout en permettant de recouper nos résultats avec les données existantes.

Choix des espèces

La fonction musculaire chez la souris est similaire à celle de l'homme et nous permettra de transposer facilement nos résultats précédemment obtenus sur le modèle souris. De plus, l'utilisation de la souris nous permet également d’avoir accès à une bibliographie riche et d'utiliser un large panel de réactifs de biochimie et de biologie moléculaire. Dans cette étude nous utiliserons des souris standard (non génétiquement modifiées). Pour étudier l’effet de l’activité physique et du vieillissement, nous prévoyons de comparer des animaux jeunes adultes (âgés de 4 mois) et des animaux de 15 mois (« âgés »). Les animaux seront sédentaires ou auront la possibilité de courir sur des roues s’ils le souhaitent.

750 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une mutation reproduisant la dystrophie musculaire de Duchenne, ils subissent des tests répétés de force et de locomotion sur animal vigile, puis un prélèvement sanguin à la jugulaire sous anesthésie, avant d'être tués pour l'analyse musculaire. Le projet teste des composés pharmacologiques et vise à remplacer le modèle chien, jugé plus lourd et coûteux. Le porteur affirme qu'aucun modèle non animal ne permet cette évaluation préclinique.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la plus fréquente des maladies musculaires (environ 1/3500 naissances males). Elle est causée par un défaut dans le gène de la dystrophine (sur chromosome X) à l’origine d’une dégénérescence progressive du tissu musculaire. La maladie touche tous les muscles de l’organisme, y compris le muscle cardiaque et le diaphragme. Chez les patients DMD, la marche est définitivement perdue avant l’âge de 15 ans et le décès survient généralement avant 30 ans. Il n’existe pas de traitement curatif à ce jour sur le marché. En attendant la validation et mise en place de thérapies curatives visant à ré-exprimer la dystrophine, la thérapie pharmacologique est une des approches envisageables pour pallier les processus physiopathologiques liés à l’absence de dystrophine. Avant le passage chez l’homme, l’efficacité thérapeutique des approches de thérapie est validée en préclinique sur des modèles animaux de la pathologie. Deux modèles animaux DMD, la souris mdx et le chien GRMD, sont couramment utilisés pour l’évaluation d’approches thérapeutiques mais présentent des limites : - La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires retrouvées chez les patients DMD et présente un phénotype peu marqué. - Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles retrouvées chez les patients DMD et un phénotype sévère, mais reste un modèle de gros animal qui est coûteux et lourd à manipuler. Le modèle de rat DMDmdx, générée par un consortium de laboratoires en 2014, est un modèle intermédiaire : c’est un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations d’utilisation que le modèle canin., cette lignée de rat DMDmdx peut donc être utilisée pour réaliser les 1ères phases d’évaluation de l’efficacité de nouveaux produits thérapeutiques. Notre équipe développe un ensemble d’approches expérimentales afin d’évaluer l’efficacité de produits pharmacologiques pour le maintien ou l’amélioration de la fonction musculaire. Ainsi, sur ce modèle de rat DMDmdx, nous envisageons de tester 10 produits en 5 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence au niveau pré-clinique les effets musculaires de composés d’intérêt sur le modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne. Aussi, ce projet conduit chez le rat DMDmdx permettra également de valider l'évaluation préclinique d'approches thérapeutiques de la DMD dans un modèle animal adapté. Ainsi, l'objectif est de réduire voire remplacer le chien GRMD, autre modèle de la pathologie humaine également utilisé, plus lourd et plus couteux à manipuler, pour cette évaluation préclinique.

Procédures

Au cours de la période de traitement les animaux seront soumis à des tests d'exploration fonctionnelle (force, locomotion, anxiété) non invasifs via la réalisation de différents exercices. Chacun de ces exercices durent entre 5 et 10 minutes maximum. Ces tests seront effectués 3 fois au cours de ce projet : avant la mise en place du traitement, (soit 4 semaines d'âge), au milieux (soit 3.5 mois d'âge) et à la fin de la période de traitement (soit 6 mois d'âge). En fin de période de traitement un prélèvement sanguin à la jugulaire sera effectué sur des animaux anesthésiés (durée: environ 30 min, de l'induction à la sédation à la remise de l'animal dans sa cage d'hébergement).

Impact sur les animaux

L'évolution de la maladie en elle-même peut entrainer un déclin de l'état de santé (difficultés locomotrices, d'alimentation voire respiratoires). Aussi, l’ensemble des tests d’évaluation de la fonction neuromotrice sera effectué sur animal vigile. Bien que validés, non invasifs, et précédés d'une période d'habituation, ces tests peuvent induire un stress chez les animaux.

Devenir

Ce projet vise à évaluer les effets de composés pharmacologiques sur la fonction musculaire de rats DMDmdx, modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne, via la réalisation de tests moteurs sur des animaux vigiles associés à des tests in vitro visant spécifiquement l'étude du tissu musculaire. A la fin de la procédure d'analyse des composés sur la fonction neuromotrice, réalisée à différents stades de développement des animaux et du traitement, l'ensemble des rats sera donc euthanasié afin de conduire cette analyse de la masse et fonction musculaire, afin de corréler les effets physiologiques et cellulaires (identification du lien entre effet et cible d’action)

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle alternatif non animal modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne pour évaluer au niveau pré-clinique les effets de traitement pharmacologiques sur la progression de la pathologie.

Réduction

Le nombre d’animaux estimés dans ce protocole est suffisant pour justifier d’une pertinence scientifique, et est réduit au maximum tout en tenant compte de la validité statistique, des contraintes du modèles et des approches expérimentales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. L'évolution de la maladie en elle-même pouvant entrainer un déclin de l'état de santé (difficultés locomotrices, d'alimentation voire respiratoires), l'état général des animaux sera surveillé de façon quotidienne par le personnel animalier et responsable du projet pour estimer une éventuelle gêne ou douleur liées à l'expression clinique de la maladie. Si un seul signe clinique spécifique ou 3 signes notables sont détectés, alors le responsable du la structure chargée du bien être des animaux et le responsable de l’étude seront prévenus et l'animal sera sacrifié sans délais. Un prélèvement sanguin sera réalisé en fin de traitement. L’ensemble des tests d’évaluation, validés et non invasifs, sera effectué sur animal vigile. Afin de limiter au maximum le stress engendré par la manipulation, les mesures seront précédées par une période d’habituation à la salle d’expérimentation, aux dispositifs expérimentaux ainsi qu’à l’expérimentateur et un renforcement positif (récompense des animaux suite réalisation des essais) sera mise en place.

Choix des espèces

La lignée de rats DMDmdx possède, comme chez les patients atteints de dystophie musculaire de Duchenne (DMD) une mutation à l'origine d'une déficience en une protéine, la Dystrophine. Le phénotype sévère implique une atteinte des muscles squelettiques et cardiaque. Deux modèles animaux de la Dystrophie musculaire de Duchenne , la souris mdx et le chien GRMD, sont couramment utilisés pour l’évaluation d’approches thérapeutiques mais présentent des limites : - La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires retrouvées chez les patients DMD et présente un phénotype peu marqué. - Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles retrouvées chez les patients DMD et un phénotype sévère, mais reste un modèle de gros animal qui est coûteux et lourd à manipuler. Le modèle de rat DMDmdx est un modèle intermédiaire : c’est un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations d’utilisation que le modèle canin. Rats d’âge compris entre 1 et 6 mois afin : - d’évaluer l’efficacité du traitement à différents stades de l’évolution de la maladie dont les premiers symptômes sont visibles chez le rat dès l’âge de 4 semaines. L'exploration des fonctions motrices sera effectuée à 3 stades : avant le traitement (environ 4 semaine d'âge), au milieux (environ 3.5 mois d'âge) et à la fin de la période de traitement (environ 6 mois d'âge). La procédure d'analayse des composés sur la masse et fonction musculaire in vitro des rats DMDmdx sera réaliser en fin de traitement soit à 6 mois d'age.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intramusculaires et intrapéritonéales, des mesures de force musculaire sous anesthésie, un test de suspension et un test d'actimétrie, pour mettre au point une thérapie génique contre une myopathie liée au gène Bin1. Le porteur décrit une atteinte musculaire qu'il juge légère et sans douleur, mais tue les souris pour prélever leurs organes et parce que la maladie deviendrait sévère si elles restaient en vie. Sur le remplacement, il affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas un "organisme entier" et conclut que seul le modèle animal permet d'étudier la maladie.

Objectifs

Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.

Bénéfices attendus

Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.

Procédures

Les 100 souris de la cohorte « Injections intra-musculaires » seront soumises aux procédures suivantes : - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, non-invasive, hebdomadaire de 6 à 12 semaines d’âge, 20min par animal. - Injections intra-musculaires sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 8 semaines d’âge, 5min par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 12 semaines d’âge. Les 120 souris de la cohorte « Injections Intra-péritonéale » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intra-péritonéale, animal vigile, unique au premier jour post-natal, 1min par animal. - Test de suspension, animal vigile, non-invasif, hebdomadaire de 3 à 10 semaines d’âge, 5min par animal. - Test d’actimétrie, animal vigile, non-invasif, unique à 10 semaine d’âge, 24h par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 10 semaines d’âge.

Impact sur les animaux

Les animaux présentent une légère atrophie et faiblesse musculaire mais qui n’affecte pas leur qualité de vie de manière significative aux âges analysés. Les animaux interagissent, se déplacent et s’alimentent normalement (poids normal). A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. La pose des électrodes sous-cutanée et l’injection intra-musculaire peux causer une inflammation dans le muscle tibial antérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. La myopathie étudiée est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Afin de limiter le nombre d’animaux de la cohorte d’injections intra-musculaires nous injecterons les deux pattes (muscle tibial antérieur) de chaque animal, l’une avec la solution contrôle et l’autre avec un des traitements. L’utilisation d’un contrôle interne à chaque souris plutôt qu’un groupe de souris contrôles permet de renforcer la puissance statistique en s’affranchissant de la variation inter-groupes et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus. La mesure de la force musculaire in vivo par la procédure non-invasive hebdomadaire nous permet de faire le suivi de chaque animal, ce qui renforce la puissance statistique et nous affranchit de créer une cohorte d’animaux pour chaque semaine d’âge analysée.

Raffinement

Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire hebdomadaire, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir tout stress causé par la procédure. Un gel protecteur oculaire sera appliqué pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les souris seront observées jusqu’à leur réveil (~5min) pour s’assurer qu’elles sont capables de se déplacer après le test. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale , les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.

Choix des espèces

Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. Nous utiliserons ces animaux à des stades très précoces pour étudier l’effet de notre traitement avant l’apparition des symptômes mais également des animaux adultes pour étudier cet effet après l’apparition des symptômes.

1 376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent des prises de sang sur animal vigile et des injections, 880 sont placées en cage métabolique jusqu'à 18 heures dont une période sans eau, et d'autres portent un modèle de drépanocytose provoquant des crises douloureuses. Le porteur indique anesthésier les gestes les plus invasifs et surveiller la douleur par une grille de score. Il affirme que la souris est "le seul modèle" permettant d'étudier à la fois les atteintes rénales et musculaires de la maladie.

Objectifs

La drépanocytose est la maladie génétique du sang la plus fréquente au monde. Cette maladie se manifeste par une déformation et une rigidification des globules rouges. Ces globules rouges déformés sont plus fragiles et sont la source de l’anémie hémolytique décrite chez les patients drépanocytaires. La forme en faucille de ces globules rouges favorise leur agglomération, l’interruption du flux sanguin et par conséquent, des crises vaso-occlusives, très douloureuses, au niveau de tous les organes du corps. La répétition de ces ischémies (un arrêt ou insuffisance de la circulation sanguine dans une partie du corps ou un organe, qui prive les cellules d'apport d'oxygène) induit des lésions sévères, notamment des organes les plus vascularisés et donc une réduction de la qualité et de l’espérance de vie des patients.Notre projet se concentre sur deux complications chroniques majeures de la drépanocytose : la maladie rénale et la fonte musculaire en s'intéressant aussi le point sur d’autres atteintes tel que la cardiomyopathie et la rétinopathie associée a la drépanocytose. Ainsi, les objectifs de notre projet sont de comprendre : 1- comment telles altérations multi-organes se produisent 2- si le muscle altéré peut avoir des effets déletèrent sur le rein ou vice-versa 3- comment pourrait on les prévenir ou les traiter

Bénéfices attendus

Cette étude pourra révéler une voie commune jusqu'alors non reconnue affectant à la fois le rein et les muscles dans la drépanocytose et éventuellement d'autres maladies hématologiques hypoxémiques. Elle pourra apporter une stratégie thérapeutique puissante pour la progression de la maladie rénale chronique et la fonte musculaire chez les patients atteints de cette maladie. En outre, l'exploration d'une interférence potentielle entre le néphropathie et la sarcopénie associées à la drépanocytose ouvre un nouveau domaine de recherche.

Procédures

Tous les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang de 20 microlitres a sur souris vigile maintenue en contention manuelle. 160 souris subiront une injection deux fois par semaine pour six semaines sur souris vigile. 160 souris subiront une injection pour 5 jours consécutifs sur souris vigile. 160 souris subiront une injections de la patte postérieure aprés anésthésie gazeuse. 160 souris subiront deux injections séparées de 56 jours, de la patte, postérieure aprés anésthésie à l'isoflurane. 80 souris subiront une injection aprés anésthésie gazeuse. Tout les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang aprés anésthésie à l'isoflurane et avant mis à mort. 880 souris seront mises en cages metaboliques, pour deux fois, séparées de 24 heures. La premier confinement en cages metaboliques sera pour 18 heures, le second sera pour 6 heures. 880 souris subiront deux mesures de pressions de 20 minutes non ivasives sur souris vigiles sur deux jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Les souris subiront le stress d'être isolées pendant 20 minutes pour les mesures de pressions. Elles subiront aussi le stress d'être isolées pendant 6 heures allant jusqu'à 18 heures en cages metaboliques. Elles resteront sans eau pour 18 heures lors du confinement en cage metabolique. Elles subiront une douleur minime lors de certains prélèvements et injections. Cependant, lors des procédures plus invasives les souris seront anésthésiées à l'isoflurane et analgésiées.

Devenir

Etant donné que les organes de ses animaux seront analysés, les animaux de ce projet seront mis à mort.

Remplacement

Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas relevantes en ce qui concernent l'étude des maladies glomérulaires et musculaire car il existe beaucoup de paramètres physiologiques qui entrent en jeu.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux requis afin de permettre une analyse statistiquement pertinente des résultats en prenant compte de la variabilité inter et intra expérience. Les résultats seront analysés par des tests statistiques adaptés à la taille de nos échantillons. Pour chaque animal, un maximum d'organes et de prélèvement biologique sera fait afin de ne pas avoir à refaire des experiences sur de nouveaux animaux.

Raffinement

Afin de réduire l'angoisse et la souffrance des animaux des mesures seront prises : 1) Une surveillance des animaux, quotidienne par les zootechniciens et bihebdomadaire par l'expérimentateur, sera réalisée. Une grille de score d'évaluation de la douleur a été établie permettant d'évaluer la souffrance des animaux et de déterminer des points limites. 2) La procédure terminale sera réalisée sous anesthésie. 3)Les procédures invasives tel que certaines injections seront réalisées aussi sous anesthésie et les souris recevront un traitement analgésique qui sera renouvelé et poursuivie si les animaux présentent des signes de souffrance. 4)Les souris seront hébergées en groupe et l’enrichissement de leur environnement sera à base de coton déchiquetable, préservant ainsi une activité et un exercice naturel.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère et d'utiliser la recombinaison homologue ou l'excision allélique dirigée afin de connaitre la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. A partir de 4 semaines, une fois que le sevrage physiologique est effectif et jusqu'à 6 mois pour ne pas observer une potentielle fibrose rénale liée au vieillissement. En effet, l'âge est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop âgées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime riche en graisses et en sucres, elles subissent sept prélèvements sanguins à la queue, un test de tolérance à l'insuline et des mesures répétées en tube de contention, pour évaluer l'effet de lipides bioactifs sur l'obésité. Le porteur indique que les tests peuvent stresser les animaux et qu'un isolement de quarante-huit heures est imposé pour l'analyse du métabolisme. Il justifie l'usage de la souris par le fait que ces lipides sont destinés à l'alimentation humaine et qu'il est donc "judicieux" de les tester dans l'alimentation d'un modèle animal.

Objectifs

Les lipides bioactifs sont présents en faible quantité dans les plantes, chez certains microorganismes et chez les animaux, en particulier le poisson. Les trois effets biologiques majeurs des lipides bioactifs sont : antioxydant, antimicrobien et anti-inflammatoire. Des études plus spécifiques sur les effets santé ont été menées ces dernières années et montrent qu'ils pourraient aussi impacter le métabolisme des lipides, l’insulinorésistance et le diabète, les maladies cardiovasculaires, voire certaines maladies neurodégénératives. Ces composés bioactifs de notre alimentation pourraient donc avoir des effets bénéfiques potentiels contre les problèmes métaboliques associés à une alimentation de type occidental. Ce projet concerne l'étude des effets curatifs d'une forme particulière de lipides bioactifs sur des souris obèses et fait suite à notre projet précédent qui a permis de mettre en évidence des effets bénéfiques lors d'un traitement préventif.

Bénéfices attendus

Les travaux de la littérature suggèrent que les lipides bioactifs possèdent un fort potentiel pour la santé dans le domaine de l’obésité et des désordres métaboliques associés. La forme que nous allons utiliser n'a pas encore été testée en dehors de notre laboratoire. Nous avons déjà pu mettre en évidence des effets bénéfiques dans le cadre d'un traitement préventif de l'obésité et nous souhaitons vérifier ces effets dans le cadre d'un traitement curatif. Notre hypothèse est que ces lipides bioactifs peuvent réduire l’obésité des souris sous régime enrichie en gras et en sucres et peuvent réduire la résistance à l’insuline et améliorer les troubles métaboliques associés. Ils pourraient être utilisés en alimentation humaine.

Procédures

Nous pratiquerons au total 7 prélèvements sanguins sur animaux vigiles par ponction à la queue (30 secondes par prélèvement). Nous respecterons les recommandations en terme de volumes et de temps de récupération car nous prélèverons moins de 7.5% du volume sanguin total en une semaine. Les animaux recevront deux injections intrapéritonéales (5 secondes par injection), une de solution d’insuline pour le test de tolérance à l’insuline, l’autre d’anesthésique au moment de l’euthanasie. Pour la mesure de composition corporelle hebdomadaire par IRM, l’animal sera mis en tube de contention 2 min, en tout 5 fois. Pour la mesure de motricité, l’animal sera déposé sur un cylindre en rotation 3 fois 5 minutes avec 20 minutes de repos entre chaque séance.

Impact sur les animaux

Les souris obèses recevront un régime riche en graisse et en sucre (type fast-food). Cet état est comparable aux personnes souffrant d'obésité. Les animaux pourront être stressés pendant les différents test non invasifs. Ils seront isolés pendant 48 heures pour l'analyse du métabolisme respiratoire.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements de sang et de tissus qui nous permettront de caractériser les effets métabolique et musculaire de notre lipide bioactif.

Remplacement

Les lipides bioactifs que nous allons étudier sont destinés à devenir un complément ou additif alimentaire pour prévenir, ralentir ou soigner le développement de l'obésité et des dommages associés chez l'Homme. Il est donc judicieux de les tester dans l'alimentation plus particulièrement chez un modèle animal.

Réduction

Pour chacune des procédures, le nombre d’animaux par groupe a été estimé sur la base de résultats obtenus par notre laboratoire et d’analyses statistiques pour définir le nombre minimal nécessaire. L'objectif étant d'utiliser ces lipides bio-actifs en alimentation humaine, nous les allons tester chez des mâles et des femelles.

Raffinement

Les souris seront hébergées par 2 pour mieux contrôler tout comportement d’agressivité et de bagarres chez les mâles. La nourriture sera changée tous les 2 à 3 jours afin d'éviter une perte d'appétence (rance). Les animaux seront manipulés avec un tunnel afin d'éviter la préhension par la queue et pour les habituer au test de composition corporelle qui est aussi réalisé dans un tunnel de contention. Pour les différents tests les animaux seront habitués au prélable au nouvel environnement et nous aplliquerons des points limites préalablement définis pour chaque procédure.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère pertinent pour les études du métabolisme. Nous pouvons obtenir des animaux mimant le syndrome métabolique humain. Les animaux seront âgés de 21 semaines à réception et de 6 mois pour l'euthanasie. D'après les données de notre fournisseur, ces adultes seront "obèses". Nous pourrons ainsi vérifier un effet curatif de nos traitements.

185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une transplantation de microbiote de patients par gavages répétés ou une induction d'arthrite par injection d'anticorps, l'implantation chirurgicale d'un capteur de télémétrie, puis un test de sensibilité tactile de von Frey, pour étudier le rôle du microbiote intestinal dans la douleur de la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur indique que l'induction d'arthrite peut provoquer diarrhée et déshydratation et que les mesures cardiaques imposent un isolement en cage individuelle. Il affirme qu'aucun modèle de substitution ou in silico ne convient, la perception de la douleur étant selon lui propre à "l'organisme conscient".

Objectifs

Il existe actuellement de très nombreux traitements pour les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR). Bien que ces traitements soient très efficaces sur l’inflammation, on observe chez 20 à 30 % des patients la persistance de douleurs chroniques diminuant grandement leur qualité de vie au quotidien. Ces patients présentent une sensation douleureuse déclenchée plus facilement que ches des personnes non atteintes. C'est la sensibilisation des voies nerveuses de la douleur. Ce mécanisme pathologique est responsable de la douleur chronique. De plus en plus de travaux montrent que le microbiote intestinal agit sur le contrôle de la douleur. On parle de l’axe intestin-cerveau. Cet axe repose entre autres sur les voies d'entrée de la douleur via le nerf vague parasympathique. Nous émettons l’hypothèse que le microbiote intestinal des patients atteints de PR est à l’origine de la sensibilisation de la douleur en modulant les neurones parasympathiques. Une fois altérés, ces neurones vont entrainer des douleurs pathologiques chroniques, malgré le contrôle l’inflammation articulaire. Notre objectif est d'évaluer in vivo l’impact du microbiote intestinal sur la sensibilisation à la douleur et sur la fonction du système nerveux parasympathique dans un contexte de polyarthrite rhumatoide. Nous voulons identifier quels facteurs issus du microbiote intestinal est/sont impliqué(s).

Bénéfices attendus

Une fois la preuve de concept apportée, l'analyse et la comparaison des souches bactériennes et métabolites du microbiote des différentes conditions (polyarthrite douloureuse, non douloureuse et de différents groupes contrôles), en fonction du stade clinique et de la sensibilisation obtenue in vivo permettront d’identifier quels facteurs du microbiote pourraient être impliqués dans ce mécanisme allodynique. Ceci ouvrira de nouvelles voies de recherche sur ce phénomène pathologique. De plus, une fois le facteur identifié, nous pourrons continuer d'explorer ce mécanisme in cellulo (neurones de ganglions jugulaires et noueux murins contenant les corps neuronaux des afférences du parasympathiques).

Procédures

Selon le groupe de souris, les animaux auront soit un transfert de microbiote intestinal de patients (4 gavages (durée 2 à 4 minutes) sur 4 semaines, précédés d'une semaine d'antibiotique par voie orale), soit une induction de polyarthrite rhumatoïde (injection d'anticorps anti-collagènes). Tous les animaux auront une implantation de capteurs de télémétrie sous-cutanée pour enregistrement de l'électrocardiogramme (2 mesures). L'implantation chirurgicale en sous cutanée dure environ 20 minutes. D'une manière hebdomadaire, des recueils de selles seront effectués et une pesée sera réalisée. Un test de détermination de la sensibilité tactile sera effectué à 2 temps du protocole (avant/après). La durée du test de Von Frey est d'environ 20 minutes par animal. Plusieurs prélèvements seront effectués en post-mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés à des fins d'enregistrement de l'electrocardiogramme devront être mis en cage unique. Concernant l'execution du test de sensibilité tactile (Von Frey), ce dernier sera mené de manière éthique et consiste à ne pas faire durer l'inconfort/la douleur d'un animal au cours du test. L’étude de la douleur se fera donc dans la recherche des seuils de douleur avec un cut off pour ne pas faire souffrir en excès les animaux. Concernant l'induction d'arthrite, l’injection de LPS peut entraîner des diarrhées et une déshydratation.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour éffectuer des prélèvements, soit pour récupérer le télétransmettteur de télémétrie.

Remplacement

Ce projet s'interressant aux mécanismes de régulation de la douleur par le microbiote intestinal, il n'existe pas de modèle de substitution ou in silico permettant d'étudier les mécanismes mis en jeu. Par ailleurs, la perception de douleur est un phénomène appréhendé par l’organisme conscient, et lui seul. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.

Réduction

Pour réduire la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris nécessaires pour démontrer un effet, nous utiliserons des lots d’animaux du même âge et du même genre au moment de l’initiation du protocole. Nous avons fait le choix de méthodes (télémétrie, von Frey), permettant le suivi des animaux dans le temps pour réduire le nombre de groupes utilisés et obtenir le maximum d'information sur chaque animal. AInsi nous étudierons les paramètres avant/après intervention sur le même animal. De plus, nous effectuerons les mesures d'ECG, de pharmacologie, les tests d'allodynie, les analyses de microbiote chez le même animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et augmenter la puissance statistiques des tests (tests appariés). Les tissus d'intéret (tissu nerveux, cardiaque, digestif) seront prélevés sur tous les animaux en vue de leur étude ultérieure.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans l’EU, régulée à 22-24°C avec un cycle jour/nuit 12h/12h, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau de boisson et un bruit de fond d’ambiance. Les conditions de stabulation sont effectuées en ambiance EOPS (pas de pathogène, pas d'opportuniste, pas de parasite) avec maintien en groupe dans des cages de taille appropriée avant inclusion dans le protocole. Les animaux sont stabulés en condition d'enrichissement intermédiaire (copeaux de différentes origine et texture, cotons et substrat de nichage, aliment accessible sur le substrat au besoin). Une visite quotidienne par un zootechnicien ou investigateur principal des animaux pour le suivi journalier est effectuée. L'ensemble des procédures sera réalisé avec l'objectif de réduire /limiter l'angoisse tout au long du projet, de limiter la douleur au seul besoin du projet (test d'allodynie de von Frey) en utilisant les méthodes appropriées d'analgésie et d'anesthésie lors de l'implantation des capteurs de télémétrie., et dans le respect de l'animal. Une grille d'évaluation clinique et des actions à mener en conséquences est mise en annexe. En particulier, le jour de l’implantation ECG, les animaux sont surveillés une fois par heure. Puis, les animaux sont surveillés une fois par jour. En cas de présence de douleur (échelons décrits dans la grille), un renforcement des visites sera conduit : Echelons 1 & 2 : 2 à 3 visites/jour; Echelon 3 : 4 visites/jour et 1 visite/heure en échelon 4. Si l’animal est inactif, incapable de se déplacer, avec les poils très hérissés, le dos courbé (possibilité de décubitus latéral) et des difficultés respiratoires ou bien avec les yeux fermés, et une perte de poids (>15% du poids initial), la mise à mort de l’animal est décidée.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de transfert de microbiote chez l’animal in vivo, permettent d’évaluer les conséquences fonctionnelles intégrées d’un microbiote précis. La régulation autonomique (afférences/éfférences) est largement similaire entra l'Homme et la souris, tout comme les mécanismes de l'allodynie. L'expérience du laboratoire dans le transfert de microbiote chez la souris, dans les investigations cardiaques et autonomique (HRV) permet d'éviter une mise au point/validation du protocole et la consommation d'animaux pour cela. Par ailleurs, un projet connexe sur le modèle murin est déjà en cours sur cette thématique au laboratoire. L’arthrite sera induite chez des animaux de 10 à 12 semaines d'âge comme cela est conseillé dans la littérature. Le protocole d’humanisation nécessitera 4 semaines et donc l’utilisation de souris âgées de 8 semaines pour qu’elles atteignent les 12 semaines au moment de l’induction de l’arthrite.