Système musculosquelettique
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Caractérisation de l’activité électrique du muscle squelettique dans des situations d’atrophie à l’aide d’un modèle murin de vieillissement et d’un modèle murin de dystrophie musculaire de Duchenne
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées puis des mesures d'électromyographie et de contractilité musculaire sous anesthésie gazeuse, pour mettre au point une technique de mesure de l'activité électrique du muscle sur un modèle de myopathie de Duchenne et un modèle de vieillissement. Le porteur indique que les souris âgées peuvent présenter une perte de poids massive ou des tumeurs, et les souris Duchenne des atteintes locomotrices. Il affirme que ce test ne peut pas être reproduit sur un modèle cellulaire, aucun organoïde ne reproduisant le nerf, la jonction neuromusculaire et le muscle.
Objectifs
Au cours du vieillissement et dans de nombreuses maladies neuromusculaires (myopathies), la masse et la fonction musculaires diminuent progressivement. Lorsque la perte musculaire est excessive, elle peut conduire à une pathologie : l'atrophie musculaire. L'atrophie est à l'origine d'une détérioration générale de la condition physique qui se traduit par un risque accru de chutes, des problèmes moteurs et une perte d'autonomie progressive. Elle conduit inévitablement à une augmentation du taux de morbidité et de mortalité. Il n'existe actuellement aucun traitement pharmacologique de cette pathologie. La masse musculaire squelettique dépend de l'état d'innervation des muscles. Lorsque le nerf périphérique est endommagé, la jonction neuromusculaire est altérée et le muscle squelettique subit une atrophie. La diminution d'activité électrique peut être mesurée par la technique d'ElectroNeuromyographie (ENMG) après une stimulation du nerf. Cette méthode donne des indications sur la neurotranmsission du signal électrique. Dans ce projet, nous mettrons en place cette technique au laboratoire. Après mise en place des conditions optimales de mesure, cet outil sera utilisé dans deux populations de souris présentant une atrophie importante: un modèle murin de la myopathie de Duchenne et un modèle de vieillissement. Ces deux modèles ont été choisis car ils seront utilisés par la suite dans le cadre d'un projet thérapeutique visant à corriger l'atrophie.
Bénéfices attendus
Ce projet de développement et validation technologique permettra une meilleure caractérisation de 2 modèles d'intérêt pour notre laboratoire, les modèles murins de Dystrophie de Duchenne et de vieillissement. Leur caractérisation est un prérequis à de nombreux projets thérapeutiques.
Procédures
Les souris seront soumises à des injections sous-cutanées (20 secondes) et à des mesures fonctionnelles: mesure du poids ( minutes -indolore); électromyogramme ( 20 minutes) et mesures de la contractilité musculaire (20 minutes).
Impact sur les animaux
Nous utiliserons des souris âgées qui peuvent présenter une perte de poids massive ou développer des tumeurs et des souris modèle de la pathologie de Duchenne, qui peuvent également présenter des atteintes musculaires affectant leur capacité locomotrice.
Devenir
Tous les animaux inclus dans une procédure expérimentale seront euthanasiés pour prélever et analyser les tissus à la fin de la procédure.
Remplacement
Le projet a pour but de mesurer l'activité électrique passant du nerf au muscle squelettique: ce test ne peut pas être reproduit dans des modèles cellulaires car il n'existe pas de modèle cellulaire ou d'organoides pouvant reproduire le nerf, la jonction neuromusculaire et le muscle. Notre projet nécessite donc l'utilisation d'animaux.
Réduction
Ce projet consistant en la mise en place d'une nouvelle technique, nous n'avons pas les données permettant de calculer les effectifs par statistiques prédictives. Cependant, considérant l'expérience de nos collaborateurs de l'AIM, une mortalité élevée de 20-30% chez les souris agées, des groupes de 10 souris par condition seront nécessaires pour permettre une analyse statistique fiable et éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats.
Raffinement
Les conditions d'hébergement et d'enrichissement du milieu sont gérés par l'animalerie. Les souris étant sociables, aucun animal ne sera isolé dans une cage, sauf si des traitements spécifiques s'avéraient nécessaires. Les électroneuromyogrammes, qui mesurent l'activité électrique du muscle, seront réalisés dans un environnement calme, dans une pièce isolée du lieu d'hébergement. Au cours de la procédure, afin d'éviter les douleurs éventuellement créées par la stimulation électrique, une prémédication par un antalgique fort sera administrée par voie sous-cutanée. La procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Les souris seront placées sur une plaque chauffante afin de maintenir la température de leur corps. En fin de procédure, les animaux seront remis dans une cage et surveillés jusqu'à leur réveil. Ils recevront par voie sous-cutané un antalgique fort toutes les 12h pendant 48h.
Choix des espèces
Les souris reproduisent bien les caractéristiques des maladies neuromusculaires, notamment l'atrophie, et sont les modèles les plus couramment utilisés par la communauté scientifiques du domaine pour estimer l'efficacité d'approches thérapeutiques sur des myopathies. Ce modèle est également très bien adapté aux études sur l'atrophie au cours du vieillissement. Le développement de l'ENMG sur cet animal permettra donc de mesurer l'efficacité thérapeutique de nombreux produits dans nos projets futurs. L'anatomie des souris permet d'accéder facilement au nerf sciatique et aux muscles qu'il controle, ce qui facilitera la mise en place de la méthode d'ENMG. Les souris C57Bl6 seront des adultes jeunes (12 semaines) afin que le développement du muscle soit terminé mais qu'il n'y ait aucun signe de vieillissement. Ces souris seront comparées à des souris du même fond génétique agées de 18 mois afin que l'atrophie soit à un stade avancé. Les souris C57bl10 et les mdx seront utilisées à l'âge de 3 à 6 mois (selon les disponibilités des mdx), car les différences d'activités au niveau de l'ENMG sont bien présentes à ces âges.
Étude pilote d’une stratégie de thérapie génique pour le traitement préclinique d’un modèle de rat myopathe
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
132 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Porteurs d'une dystrophie musculaire qui leur fait perdre progressivement de la masse corporelle, ils reçoivent des injections de vecteurs viraux, puis une mesure de force musculaire sous anesthésie avant d'être mis à mort par injection létale de pentobarbital, pour tester une thérapie génique de la myopathie de Duchenne. Le porteur indique que la mort des cellules musculaires peut provoquer un processus inflammatoire douloureux, anticipé par de la buprénorphine. Il affirme que le rat mime la maladie humaine "beaucoup plus fidèlement" que la souris myopathe et conclut à la nécessité d'une validation in vivo.
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) survient lorsque la mutation du gène de la dystrophine provoque un manque de protéine fonctionnelle, entraînant une faiblesse musculaire progressive profonde. La transmission de la maladie est liée au chromosome X, les garçons atteints de la maladie perdent graduellement la capacité de marcher, et la plupart deviennent dépendants du fauteuil roulant et de la ventilation artificielle au fil du temps. Cette maladie est à ce jour incurable et l’âge moyen de survie sans traitement est de 19 ans, l'insuffisance cardio-respiratoire étant la cause la plus fréquente de décès. La prise en charge symptomatique, pluridisciplinaire, vise à optimiser la qualité de vie des patients mais aussi leur espérance de vie. Les progrès thérapeutiques réalisés au cours des dernières décennies ont permis de transformer le pronostic. Plus de 90 % des enfants atteints de DMD vivent désormais jusqu’à l’âge adulte et certains atteignent aujourd’hui l’âge de 40 ans. Plusieurs nouvelles approches pour le traitement de la DMD sont en cours d'approbation et de développement. Une étape critique est d'abord de déterminer l'efficacité et la sécurité de ces traitements en utilisant un modèle animal de la maladie. La stratégie de thérapie utilisée dans ce projet vise à démontrer l'efficacité d'un vecteur viral de thérapie génique permettant de rétablie l'expression d'une dystrophine plus courte mais fonctionnelle qui pourra préserver ou restaurer la structure et la fonction des cellules musculaires touchées par la maladie.
Bénéfices attendus
Grâce à l'étude des effets de cette stratégie thérapeutique sur la structure du tissu musculaire, nous comptons déterminer le meilleur vecteur de thérapie génique et évaluer l'efficacité de ce type de thérapie sur le processus de reconstruction musculaire suite à la restauration de la dystrophine musculaire et sur l'évolution de la maladie. A court terme si une des stratégies se révèle avoir un effet thérapeutique positif, elle sera testée à l'aide d'une injection dans la circulation sanguine générale pour permettre une analyse des fonctions des muscles squelettiques et cardiaque à l'echelle de l'organisme entier. A plus long terme, on peut espérer un essai pré-clinique dans un modèle animal myopathe de plus grande taille et une transposition aux patients dans un essai clinique.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigiles, ni aucune chirurgie ne sont prévus. L'injection des vecteurs viraux (procédure test du sérotype et procédures test de thérapie génique précoce et tardive), n'est pas douloureuse en soit mais peut produire une réaction inflammatoire prise en charge par antalgique. La mesure de force des muscles traités, critère d’évaluation de l’efficacité du traitement, nécessite une immobilisation et l'utilisation d'éléctrodes musculaires est rélaisée sous anesthésie injectable, 1 fois avant la mise à mort pour les animaux inclus dans les essais de thérapie précoce et tardive. Les animaux étant anesthésié et mis à mort immédiatement après la mesure de force, ils ne ressentent pas de douleur.
Impact sur les animaux
La mort des cellules musculaires peut induire un processus transistoire douloureux d'origine inflammatoire dont nous connaissons bien les conséquences que nous anticipons par des injections de buprénorphine. Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle. Nous connaissons bien l'évolution de la maladie, ce qui permet une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Les procédures 2 et 3 de ce projet incluent des animaux chez lesquels les nuisances musculaires de l'évolution spontanée de la maladie sont limitées et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers. Les vecteurs viraux utilisés ont été choisis pour optimiser l’efficacité de la thérapie génique et minimiser la réponse immunitaire.
Devenir
A l'issue des trois procédures expérimentales, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques permettant d'évaluer l'efficacité du traitement sur les muscles prélevés. La mise à mort sera réalisée sous anesthésie par une injection létale de pentobarbital.
Remplacement
Toutes les constructions incluses dans les vecteurs viraux et utilisées dans cette saisine ont été évaluées et validées in vitro sur cellules musculaires isolées à partir de rats DMD. Elles ont donc un potentiel thérapeutique qu'il faut maintenant évaluer in vivo lorsque les cellules musculaires sont dans leur environnement en interactions avec les autres types cellulaires présents dans un muscle en conditions pathologiques ce qui n'est possible que sur un animal vivant.
Réduction
Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec d'autres candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Il apparaît que pour chacun des lots, traiter 5 à 7 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution de la maladie. Le problème majeur auquel nous avons été confrontés est la sensibilité des animaux à l'anesthésie. Malgré nos soins, nous avons déploré l'absence de réveil chez quelques animaux. Il faut donc prévoir un animal supplémentaire par groupe de sorte qu'en cas d'accident anesthésique, on puisse traiter les données de 5 à 7 animaux arrivés au terme de la procédure. Au bilan, chacun des lots a pu être réduit à 6-8 animaux en fonction des analyses faites. Dans le cas présent, 6 animaux par lot seront suffisants. A des fins de réduction et de formation, les femelles sauvages issues de nos croisements, dont nous ne nous servons pas dans nos procédures d'élevage ou expérimentales, serviront lors de leur mise à mort à l'entrainement de nos étudiants au prélèvement post-mortem d'organes .
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage au début puis ce nombre est progressivement réduit jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600 g. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft et des bâtons de bois à ronger ou des carrés de coton compacté. Dans le cadre du développement de la pathologie nous prêterons attention à l'apparatition des points limites tels que la perte de mobilité, la prostration, une lordose excessive, la dégradation du pelage, la vocalisation anormale (hors contention) ou des grimaces faciales. La cause de la douleur sera recherchée et des antalgiques pourront être prescrits, notamment sur les animaux DMD au delà de 8 mois, nous pourrons utiliser un anti-inflammatoire ou un opioïde après consultation du vétérinaire référent. La survenue de l'un des points ci-dessus associé à une perte de poids sur une semaine dépassant 20% du poids maximal atteint par l’animal et non compensée par la mise à disposition de nourriture humide et d’hydrogel en fond de cage entrainera la mise à mort compassionnelle de l'animal concerné. Lors de l'infection virale les animaux sont injectés une fois par voie sous-cutanée pour induire l'anesthésie/analgésie (au démarrage de la procédure puis en fin de procédure) et une fois dans le muscle pour l'injection des vecteurs viraux (procédure test du sérotype et procédures test de thérapie génique précoce et tardive ). Ils sont préventivement injectés 3 fois par jours pendant 2-3 jours avec une molécule qui supprime la douleur, par voie sous-cutanée, en même temps que l'examen clinique pour éviter de les déranger inutilement. La mesure de force inclue également des antalgiques en plus de l'anesthésie générale garantissant que les animaux ne souffrent pas.
Choix des espèces
Le rat, une espèce de mammifère phylogénétiquement proche de l'homme, constitue un modèle apprécié. Les récents outils de manipulation du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris myopathe, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Dans cette saisine nous utiliserons, 1) des jeunes animaux sevrés reçus dans notre EU à l'âge de 3 semaines pour une semaine d'acclimatation puis inclus dans nos cohortes d'étude à partir de 4 semaines, pour les essais de vecteurs et la thérapie précoce, parce qu'ils correspondent au stade post-sevrage le plus précoce pour initier un traitement dans la phase asymptomatique de la maladie; 2) des animaux âgés de 6 mois pour l'essai de thérapie tardive parce qu'ils sont clairement symptomatiques. Si le traitement est efficace, il est attendu une diminution voir un arrêt de l'évolution de la maladie dans le muscle traité chez les animaux jeunes, et un ralentissement ou un arrêt voir une réversion du développement de la maladie dans le muscle traité chez les animaux âgés.
Caractérisation d’un nouveau gène candidat PLCB1 impliqué dans les myopathies congénitales à spirales cylindriques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Privées d'un gène, elles développent une myopathie avec une espérance de vie d'environ trois semaines et des organes anormaux, et subissent jusqu'à 28 tests de force, d'endurance et de locomotion avant une mesure musculaire sous anesthésie suivie de la mise à mort. Les animaux ayant servi à l'élevage de la lignée sont eux aussi tués une fois l'effectif atteint. Le porteur cherche à valider le rôle de ce gène dans une myopathie humaine et affirme qu'une étude sur cellules ne suffirait pas à évaluer l'atteinte de l'organisme entier.
Objectifs
Après avoir identifié une mutation candidate dans un gène engendrant une protéine impliquée dans la production de lipides chez une famille avec deux enfants atteints de myopathie à spirales cylindriques, nous souhaitons valider l'impact de cette mutation dans la maladie avec un modèle souris afin de valider un nouveau gène de myopathie et le diagnostic de cette famille. Cette mutation est présente sur les 2 copies présentes du gène chez les enfants et correspond à une perte de fonction, c'est-à-dire que nous avons démontré qu'elle entrainait une diminution de la lecture du gène dans les cellules entrainant donc une diminution de la production de protéine. Ce projet vise donc à caractériser un modèle souris ne possédant pas cette protéine dans le but de valider le rôle de la perte de fonction du gène dans la maladie grâce à des études du tonus et de la force musculaires et de la forme, de l'aspect et du fonctionnement moléculaire du muscle chez la souris.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude permettront tout d'abord de valider l'implication de ce gène dans les myopathies congénitales, et d'identifier une nouvelle cause génétique possible. De plus, ils permettront de mieux comprendre les protéines impliquées dans ces pathologies, dans le muscle sain et dans le développement de la maladie. Valider un nouveau gène dans les myopathies congénitales permet tout d'abord d'avoir de nouveaux diagnostics pour les familles de patients et aussi d'avoir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le développement de traitements de la maladie.
Procédures
Les souris sont marquées afin d'être identifiées et un suivi journalier sera assuré. Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques entre 3 semaines et 8 mois d'âge maximum : - La mesure de la force du corps : les souris sont suspendues sur le couvercle de la cage durant 3 min maximum et elle sera mesurée 1 fois par mois. - La mesure de la force des pattes : le test sera effectué pendant 30 sec maximum et sera réalisé une fois par mois. - L'évaluation de la capacité de l'animal à se mouvoir : les animaux sont placés dans une enceinte contenant des cages individualisées pour le suivi de l'activité locomotrice pendant 24h. Ce test se fera 1 fois par mois. - La mesure de l'endurance et de la résistance à la fatigue : le test dure 5 jours et les souris marcheront sur un cylindre rotatif pendant 5 à 15 min par jour. Ce test ne sera réalisé qu'une seule fois durant l'étude. - La mesure des propriétés contractiles musculaires in situ : il s'agit d'un test qui ne sera réalisée qu'une seule fois par souris et la durée totale, de l'anethésie jusqu'à la fin des mesures, sera de maximum 1h. Au maximum, 28 tests de phénotypages seront effectués sur les souris vivant jusqu'à 8 mois.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, un seul gène est muté générant chez la souris un phénotype sévère et dommageable entrainant une faible espérance de vie, de 3 semaines d'après la littérature existante. A ce jour, seul le modèle ne portant qu'une seule copie fonctionnelle du gène a été observé , les animaux ne portant pas le gène fonctionnel mourant pour la plupart au moment du sevrage, c'est-à-dire à trois semaines de vie. Les souris observées ont été décrites comme présentant une morphologie anormale des ovaires, un foie plus grand, une rate plus grande, des noeuds lympahtiques plus grands, une morphologie anormale des reins et des yeux. Les animaux ne présentent pas d'infertilité contrairement aux animaux ne portant pas le gène fonctionnel. Les caractéristiques musculaires de ce modèle n'ont encore jamais été évaluées, à notre connaissance. Les différents tests phénotypiques permettant de suivre et mesurer la force, la résistance à l'exercice et la capacité à se mouvoir de la souris pourront induire du stress pendant une durée pouvant aller de 1 min à 15 min maximum et pourront induire de la fatigue à la fin des tests.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie et replacés dans leur cage jusqu'à la procédure suivante pour tous les tests jusqu'au test de la mesure des propriétés contractiles des muscles. A l'issu de ce test qui est réalisé sous anesthésie, les animaux sont mis à mort sous anesthésie et les organes seront prélevés pour des études moléculaires des muscles. Cela concerne l'ensemble des animaux d'expérience, soit 60. Pour ce qui est des animaux permettant le maintien de la lignée durant l'étude, une fois que le nombre souhaité d'animaux d'expérience sera atteint, les animaux ayant permis leur naissance seront mis à mort afin d'éviter la multiplication d'animaux alors que l'étude sera terminée.
Remplacement
Pour caractériser la myopathie à spirales cylindriques et identifier l'impact de la mutation du gène d'intérêt, nous souhaitons étudier la souris. Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l'Homme, il nous permet de valider la pathogénécité de cette mutation. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation de l'atteinte musculaire seraient impossible à évaluer.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante pour les études réalisées. De plus, l'étude sera longitudinale afin de travailler sur les mêmes animaux sans en multiplier leur nombre. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d'accouplements avec deux femelles pour un mâle. L'observation des souris permettra d'optimiser au mieux leur nombre. Nous prévoyons cependant 185 animaux pour cette étude. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisée avec un test maximum par jour.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d'améliorer le bien-être de l'animal. Si des difficutés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l'animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupes de 2 à 4 par cage et la qualité de l'air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d'accouplements seront constitutées de deux femelles par cage facilitant l'élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance, il seront donc surveillés tous les jours et pesés 3 fois par semaines. Si une perte d'état rapide est observée chez les animaux, l'étude sera alors stoppée. De même, en cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l'étude sera prématurément stoppée.
Choix des espèces
Afin d'évaluer et de comprendre l'impact de la perte de fonction de la protéine d'intérêt dans la myopathie en spirales cylindriques, une pathologie humaine, nous avons besoin d'étudier son effet sur les fibres musculaires, de préférence chez les mammifères. La protéine que nous étudions est très bien concervée chez la souris avec 97% d'homologie. Ceci suggère une fonction très similaire chez l'humain et la souris. De plus, la structure des muscles est similaire chez la souris et l'humain. Les myopathies causant des défauts structuraux du muscle, la souris nous permettra de reproduire le plus fidèlement possible les défauts observés chez l'humain et ainsi de modéliser au plus près la maladie humaine. D'autre part, les souris ont des caractéristiques biologiques très utiles pour la recherche comme leur petite taille, une durée de vie plutôt courte et une durée de gestation courte. De plus, les souris sont couramment utilisées dans un grand nombre de recherche dans ce domaine, ainsi que dans notre équipe. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées in vitro car nous souhaitons étudier l'impact de la mutation sur le phénotype d'un individu entier ainsi que sur la structure de la fibre musculaire. Le modèle utilisé étant déjà décrit comme ayant une faible espérance de vie, les études phénotypiques seront faites à 3 semaines de vie. Les souris seront néanmoins obervées et suivies attentivement de la naissance jusqu'à la mise à mort.
Evaluation de l’efficacité de nouveaux anti-inflammatoires dérivés du naproxène dans le modèle murin d’arthrose induit par injection de monoiodoacétate (modèle MIA)
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent dans l'articulation une injection de monoiodoacétate qui provoque une arthrose douloureuse, avec douleurs spontanées, allodynie et boiterie, puis un traitement quotidien pendant 28 jours et des tests de douleur. Le porteur évalue cinq dérivés d'un anti-inflammatoire, le naproxène, censés cibler le cartilage en réduisant les effets indésirables, une évaluation sur modèle chirurgical étant envisagée si un composé se révèle prometteur. Il affirme que la culture cellulaire ne reproduit pas le microenvironnement inflammatoire et que le passage in vivo est inévitable.
Objectifs
Avec 10 millions de personnes atteintes en France, l’arthrose est une pathologie qui représente un réel enjeu socio-économique. En l’absence de traitement curatif, les Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens (AINS) sont largement prescrits, pour enrayer le phénomène inflammatoire responsable du cercle vicieux entrainant la destruction du cartilage, et ce malgré leurs effets secondaires importants (cardiovasculaires et gastrointestinaux). Ce projet d’expérimentation animale, s’inscrit dans un projet plus large dont l’objectif est de concevoir de nouveaux AINS ciblant spécifiquement le site arthrosique afin de diminuer les effets indésirables associés couramment à l’utilisation des AINS. Ainsi, 30 dérivés du naproxène, un anti-inflammatoire non stéroïdien, ont déjà été synthétisés et caractérisés par les chimistes de notre unité. Ces dérivés exploitent une stratégie développée au laboratoire et qui permet de cibler le cartilage en diminuant les effets indésirables. L’ensemble de ces composés a déjà été évalué in vitro et les composés les plus intéressants ont été évalués in vivo dans un modèle inflammatoire d’arthrite. Les résultats obtenus nous ont permis de sélectionner 5 composés plus intéressant que la molécule parent, le naproxène. Nous souhaitons désormais valider la pertinence de notre stratégie et évluer ces 5 dérivés du naproxène dans un modèle d’arthrose. Le modèle d’arthrose selectionné pour cette étude est le modèle induit par injection en intraarticulaire de monoiodoacétate (MIA) chez la souris. Ce modèle, facile à mettre en place et très inflammatoire, est très exploité pour évaluer des molécules ou des extraits végétaux ayant un impact sur la douleur arthrosique et l’inflammation.
Bénéfices attendus
Les résultats non permettrons d’évaluer l’intérêt de notre stratégie pour contrôler localement l’inflammation dans l’arthrose tout en diminuant les effets indésirables. Ces résultats apporteront également quelques informations précieuses qui guideront la pharmacomodulation des prochaines molécules. De plus, si l’un des composés se révèle être très prometteur, nous envisagerons alors son évaluation sur un modèle chirurgical
Procédures
Injection en intraarticulaire pour la mise en place du modèle (sous anesthésie, 5 minutes). Traitement par voie sous-cutanée sur animaux vigiles : 1 fois par jour pendant 28 jours, durée quelques secondes. Test d'allodynie ou de locomotion : 1 à 2 fois par semaine
Impact sur les animaux
Le modèle MIA est un modèle qui induit une douleur arthrosique. L’injection de MIA en intra-articulaire entraine une augmentation de la sensibilité nerveuse avec douleur spontanées, allodynies, hyperalgies de façon dose dépendantes. Les effets indésirables sont donc de la douleur ainsi que des problèmes de locomotion (boiterie, difficultés d’appuis, …). Une légère perte de poids peut être observée les premiers jours post induction. Concernant, les injections quotidiennes des traitements à la dose définie en sous-cutanée, ils ne génèrent ni douleur, ni effets indésirables.
Devenir
Du fait de l'injection en IA du MIA qui induit une arthrose inflammatoire, les animaux ne peuvent pas être réutilisés
Remplacement
La culture cellulaire ne représente pas la complexité du micro-environnement et notamment de sa composante inflammatoire. Les études in vitro et in tubo nous permettent de réaliser une première sélection des molécules mais doivent être complétées par des études in vivo, d’autant plus lorsqu’il s’agit de vectorisation, comme c’est le cas ici. Le passage sur un modèle in vivo est donc inévitable pour juger de façon optimale notre stratégie thérapeutique.
Réduction
Dans un but de réduction du nombre d’animaux, nous avons choisi d’effectuer dans un premier temps la procédure 1 qui consiste à définir la dose optimale de MIA injectée en intra-articulaire et valider le modèle avant de passer à la procédure 2. Lors de la procédure 1, nous évaluerons progressivement les doses en commençant par la plus faible de 30 mg/ml et nous nous arrêterons lorsque l’effet attendu souhaité (arthrose inflammatoire) sera atteinte. Le nombre d’animaux pour cette procédure est donc surexprimé et il est possible que les doses les plus importantes ne soient pas nécessaires. Dans ce cas, nous réduirons le nombre d’animaux. De plus, nous avons constitué des groupes de 10 souris ce qui correspond au nombre de souris minimal nécessaire à la réalisation des analyses de caractérisation souhaitées avec une bonne significativité (5 souris pour de l’histologie et 5 souris pour des western-blot). En ce qui concerne la procédure 2, ici aussi les groupes sont de 10 souris. Ce nombre correspond au nombre minimal de souris qui nous permettra d’obtenir les données suffisantes attendues et de façon significatif pour avoir une réponse définitive sur l’efficacité du traitement sans avoir besoin de recommencer le protocole.
Raffinement
Le modèle MIA étant un modèle de douleur, une surveillance accrue sera mise en place notamment par le suivi du score clinique. Une attention particulière sera effectuée quant à la locomotion et un suivi du poids tous les deux jours sera réalisé. En effet, un problème de locomotion pourrait gêner les déplacements et l’accès à la nourriture. Dans ce cas là des dispositions seront prises telles que la nourriture directement dans la cage.
Choix des espèces
Le modèle d’inflammation MIA que nous avons choisi dans ce projet est très couramment utilisés et caractérisés chez le rongeur (rats ou souris). Nous avons choisi ici le modèle souris. Les souris seront utilisées à 8 semaines, un stade pour lequel leur articulation est suffisamment développée pour l’injection en intra-articulaire.
Développement d’un modèle d’arthrite chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
990 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent dans l'articulation de la cheville une ou deux injections de cristaux d'urate ou de carraghénine pour déclencher une crise de goutte, puis le composé à tester, la douleur étant mesurée par le test de von Frey, pour évaluer de nouveaux candidats médicaments d'un partenaire industriel. Le porteur indique que l'arthrite induite peut provoquer une inflammation locale douloureuse, un défaut de toilettage et une baisse de la prise alimentaire. Il affirme que la culture cellulaire ne peut pas explorer ces mécanismes et que la preuve d'efficacité exige un "organisme entier", et revendique le rat comme le plus petit animal permettant une injection articulaire fiable.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de développer un modèle d’arthrite chez le rat afin de tester de futurs candidats médicaments dans la prise en charge de cette pathologie. Dans cette étude, nous évaluerons la pharmacocinétique d’un nouveau traitement dans un modèle d’inflammation aiguë de l'articulation de la cheville. Ce travail cherche à améliorer le traitement des arthrites, en particulier de la crise de goutte, une maladie inflammatoire touchant les articulations. Les crises, souvent très douloureuses, se caractérisent par un échauffement et un gonflement de l'articulation et peuvent durer plusieurs jours. La complexité de ces maladies, dont la composante est multicellulaire, nécessite de pouvoir faire la preuve de concept et d’efficacité dans un organisme entier comme l’animal. Cette étude se fosalise sur le développement de nouvelles formes d’administration d’un principe actif en utilisant des techniques de délivrance locale prolongée du médicament. Nous utiliserons un modèle d’inflammation goutteuse induite par des cristaux d’urate (Monosodium Urate MSU) ou de la carraghénine chez le rat. Un seul inducteur de l'inflammation (MSU ou carraghénine) sera utilisé par étude mais ces 2 agents inflammatoires pourront être testés lors d'études indépendantes. La pharmacocinétique du traitement administré sera déterminée de manière locale (niveau articulaire) mais également de manière systémique (sang). La douleur sera évaluée grâce au test de von Frey. L’utilisation du rat est tout indiquée dans cette étude, et se fera en accord avec la règle des 3R. Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum afin de permettre des analyses statistiques solides. Des points limites destinés à limiter l'inconfort des rats seront mis en place dans chaque expérience et tous les animaux seront pesés et leur comportement surveillé afin de veiller à leur bien-être. Ce projet de recherche nécessitera l'utilisation de 99 rats par étude (15 rats pour l’étude pilote et 84 rats pour l’étude principale). A raison de deux études par an, nous utiliserons 990 rats pour la durée totale du projet. Les procédures expérimentales décrites dans ce protocole étant classées à un grade sévère, elles feront l'objet d'une évaluation rétrospective.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est d'évaluer de nouveaux candidats médicament dans le processus inflammatoire de l'arthrite afin d'améliorer la prise en charge des patients et de les traiter de manière durable.
Procédures
Les animaux recevront une ou deux (selon la demande du partenaire industriel) injections intra-articulaire dans l'articulation de la cheville pour induire l'arthrite et une injection intra-articulaire avec le composé à tester. Les injections intra-articulaires durent 30 secondes et se font sous anesthésie isoflurane. Pour évaluer la douleur, les animaux seront soumis à un test qui consiste à appliquer de manière successive des filaments au niveau de la patte de l’animal. Les animaux sont acclimatés au set-up durant 30 minutes suivi par le test de Von Frey pendant 15 minutes. Enfin, sur animal euthanasié, un prélèvement en point final de sang sera effectué au niveau caudal. Un lavage intra-articulaire, et un prélèvement d'organes auront lieu après euthanasie de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex-vivo. L'ensemble de ces prélèvement se feront dans les 5 minutes suivant la mise à mort de l'animal.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables induits par un modèle d'arthrite chez le rat sont le développement d'une réaction inflammatoire au niveau local, une douleur locale pouvant entraîner un manque de toilette (poils ébouriffés), un comportement altéré (vivacité réduite) et une diminution de la prise alimentaire si l'animal a des difficultés à se redresser sur ses pattes. C'est pourquoi les rats seront surveillés quotidiennement post-induction pendant toute la durée de l'étude. L'aspect général et le poids des rats seront évalués post-induction sous la forme d’un score prédictif de la douleur. Des granulés seront déposés dans la cage pour faciliter la prise alimentaire des animaux.
Devenir
A l'issue de l'ensemble du projet les animaux seront mis à mort dans le but d'étudier l'effet et la pharmacocinétique du composé testé sur l'inflammation et la résolution de l'inflammation.
Remplacement
Le remplacement de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible dans ce modèle. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.
Réduction
Nous avons une approche en deux temps pour bien définir les meilleures conditions d’expérimentation. Une expérience préliminaire permettra de valider le modèle d’arthrite induite. L’étude principale ne sera conduite seulement si les résultats de cette étude pilote confirment la robustesse du modèle permettant ainsi de réduire le nombre de groupes et donc le nombre d’animaux. Le nombre de rats nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience. Le nombre de 8 animaux par condition test correspond à la quantité minimale nécessaire pour cet objectif.
Raffinement
Les rats seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, à raison de 3 animaux par cage maximum, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (tunnel, buchette) afin d'éveiller leurs sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera l'euthanasie de l'animal. Des granulés seront déposés dans la cage pour faciliter la prise alimentaire des animaux. Enfin, l'ensemble des injections intra-articulaires se feront sous anesthésie isoflurane 3%.
Choix des espèces
Le rat a été choisi car c’est le plus petit animal chez qui il est fiable d’injecter des volumes bien définis et ceux à deux reprises dans un site anatomique aussi précis qu’une articulation. Des rats de 250 à 300g seront utilisés, soit environ 6 à 7 semaines afin d'avoir des sujets adultes avec un système immunitaire mature pour se conformer à l’objectif de l’étude visant à appliquer ces futurs composés sur une population adulte.
Caractérisation des fonctions musculaires, cardiaques et cognitive de modèles murins de dystrophies musculaires : évolution avec l’âge et effet du traitement, par transfert de gène à l’aide de vecteurs viraux
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Rats : 300
1 272 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent une injection de thérapie génique par voie intraveineuse, des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie, une échocardiographie et une évaluation de la fonction musculaire sous anesthésie profonde, et courent sur un tapis stimulé par un léger courant électrique. Le porteur affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro ne reproduit la biodistribution d'un virus dans un "organisme entier" ni l'évolution sur plusieurs mois, et conclut au recours aux rongeurs. Les retombées annoncées pour les patients atteints de dystrophie musculaire restent renvoyées à de futures applications chez l'homme.
Objectifs
L'objectif de ce projet s’inscrit dans l’évaluation d’approches thérapeutiques pour des maladies génétiques rares, les dystrophies musculaires, pour lesquelles il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement. Les dystrophies musculaires sont des maladies dégénératives du muscle qui conduisent à une perte progressive des fonctions motrices telle que la marche. L’évaluation de l’efficacité d’un traitement va nécessiter de pouvoir suivre l’effet de l’administration sur des modèles reproduisant le plus précisément la pathologie humaine. Aujourd’hui, la plupart de ces modèles sont des modèles de rongeurs, rat ou souris. Un prérequis avant toute évaluation thérapeutique est donc de bien connaitre les modèles. L’objectif de ce projet est de réaliser des études visant à mesurer différents paramètres aux niveaux musculaire, cardiaque et cérébral dans des modèles animaux de dystrophie et d’observer l’évolution de ces paramètres dans le temps et suite à un traitement de thérapie génique.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous proposons de mieux caractériser des modèles murins de dystrophies musculaires afin de définir précisément des critères spécifiques à la pathologie et en particulier en condition d’exercice physique. L’identification de ces critères et les résultats liés à l’exercice permettront l’évaluation de l’effet thérapeutique de traitements pour de futures applications chez l'homme, et de proposer éventuellement une stratégie de physiothérapie pour améliorer la prise en charge des patients. Nous attendons que des résultats positifs sortent de ce projet sur au moins certains critères ou sur certaines évolutions. Les résultats négatifs permettront de mieux souligner les critères positifs spécifiques de la maladie et de comprendre de façon plus pertinente les conséquences des défauts génétiques entre les modèles animaux et l’homme.
Procédures
Le traitement par transfert de gène se fait par injection intraveineuse en une seule fois en moins de 5 minutes, soit sur animaux vigiles avec injection dans la veine caudale, soit sur animaux anesthésiés pour l’injection au sinus (cette technique n’est appliquée que chez la souris). Dans ce cas l’anesthésie est une anesthésie gazeuse de courte durée de moins de 5 minutes. Les prélèvements de sang se font au maximum une fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse de courte durée moins de 5 minutes. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire. Pour certaines procédures permettant l’évaluation de la fonction du muscle en semi-isolé, les animaux sont analgésiés et anesthésiés. C’est une anesthésie par voie intrapéritonéale profonde de 15 à 30 minutes sans réveil de l’animal. Pour l’évaluation de la fonction cardiaque, les animaux sont soumis à une échocardiographie en fin de protocole. Les animaux sont anesthésiés et maintenus dans cet état tout au long de l’examen d'une durée de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : douleur de piqûres pour administration d’anesthésique ou d’intraveineuse pour injection du traitement par transfert de gène. Certains actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs sont réalisés sous anesthésie gazeuse, la nuisance sera donc liée à l’acte d’anesthésie. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. Lors de l’’exercice de course sur tapis, un stimulus électrique de faible intensité est nécessaire pour stimuler l’animal En ce qui concerne les modèles utilisés, même s’ils portent une anomalie génétique correspondant à une dystrophie musculaire progressive chez l’homme, ils présentent un phénotype moins important que les patients. Ils ne présentent donc pas de phénotype délétère à l’exception des modèles les plus sévères au stade avancé de la pathologie où l’on peut observer une scoliose ou une atrophie musculaire. Cependant, dans ce projet, nous utiliserons des animaux à des âges où aucune conséquence sur le comportement n’est observée. L’ensemble des animaux ne présentent donc pas de phénotype délétère. Il n’y a pas de nuisances attendues dans ce projet par rapport à l’effet des traitements, qui sont tous de nature bénéfique et sont utilisés à des doses correspondant à la fenêtre thérapeutique.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes.
Remplacement
Aucun modèle alternatif ne nous permet d’étudier les symptômes de perte de la locomotion typiques des dystrophies musculaires, ni les conséquences de l’exercice, ou encore les fonctions cardiaque ou cérébrale. Théoriquement, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale peuvent être de différentes natures : méthodes in silico ou in vitro. Les approches in silico utilisées en alternative à l’expérimentation animale à ce jour permettent uniquement des modélisations physico-chimiques comme la relation entre structure et activité biologique d’une molécule ou des modélisations toxico-cinétiques d’élimination de molécules. Des modèles in silico qui pourraient permettre de modéliser numériquement les expériences proposées dans ce projet à partir d’un ensemble de données n’existent donc pas à ce jour. Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’aborder les questions posées dans ce projet qui doivent prendre en compte des paramètres tels que les interactions avec le système immunitaire, l’évolution sur des périodes de plusieurs mois, la distribution du flux sanguin, la biodistribution d’un virus dans un organisme, les processus cognitifs, etc…
Réduction
Nous utiliserons les mêmes animaux contrôles pour des expériences différentes chaque fois que possible. Tous les modèles sont sur le même fond génétique, nous pouvons donc utiliser les mêmes souris de type sauvage comme contrôles pour tous les modèles. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs selon un critère défini pour chaque modèle.
Raffinement
Le format de cage pour les rats et le nombre d’animaux par cage sont adaptés en fonction du poids des animaux. Les tests d’évaluation fonctionnelle non invasifs sont réalisés dans une salle différente de celle de l’hébergement. Afin de diminuer l’angoisse de l’animal, une phase d’entrainement sur tapis de course est réalisée pendant plusieurs jours. Les animaux sont anesthésiés lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux reçoivent au préalable un traitement analgésique si nécessaire. Les prélèvements de sang sont effectués sous anesthésie de courte durée. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasies appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir la température corporelle stable lors de la phase de réveil, ou l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.
Choix des espèces
Pour ce projet, nous utiliserons les espèces souris et rat car les modèles existants des pathologies étudiées sont sur ces espèces. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte. Après le sevrage, les animaux présentent une taille de muscle et des conditions physiques suffisantes pour évaluer les fonctions musculaire, cardiaque ou cérébrale et présentent déjà des signes histologiques pour les modèles les plus sévères.
Evaluer le rôle de la protéine TIF2 dans le fonctionnement métabolique du muscle squelettique dans un modèle d’ischémie de l’artère fémorale
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
32 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Un garrot placé à la racine d'une patte interrompt la circulation pendant deux heures, suivies de deux heures de reperfusion, pour étudier le rôle métabolique de la protéine TIF2 dans le muscle. Le porteur indique s'attendre à une réaction douloureuse au serrage du garrot, atténuée par un antalgique, et que les tissus sont prélevés avant le réveil des animaux. Il affirme ne disposer d'aucune autre possibilité que la souris pour étudier cette protéine dans un organisme vivant.
Objectifs
Le but de ce projet est d'étudier d'une manière très approfondie le rôle métabolique de la protéine TIF2 (co-régulateur transcriptionnel) dans le fonctionnement du muscle squelettique, stress oxydant et la mort cellulaire. Afin d’analyser les fonctions cellulaires-autonomes de TIF2 dans le muscle squelettique, des souris invalidés d'une manière sélective en TIF2 dans les myofibres des muscles squelettiques sont générés. TIF2 semble liée notamment à certains désordres métaboliques survenant lors d’une diminution du flux sanguin et donc de privation des organes en oxygène, sang et métabolites notamment le muscle squelettique un autre organe majeur du métabolisme mais également lors d’un afflux massif. Pour cela nous mettrons en place un modèle d'ischémie/reperfusion en utilisant la méthode du tourniquet au niveau de l'artère fémorale pour interrompre la circulation artérioveineuse dans la région située en aval et cela pendant 2h suivies de deux heures de reperfusion. Cela entrainera une privation limitée dans le temps du muscle squelettique, en sang et donc en oxygène, suivi d’un apport de sang qui augmente brusquement durant la reperfusion. De manière intéressante, lorsque des souris contrôles sont soumises au stress de l’ischémie/reperfusion, les niveaux de transcrits TIF2 et SRC-3 sont fortement augmentés. Des résultats préliminaires indiquent que les souris invalidées du gène TIF2 sont protégées contre les effets délétères de l’ischémie/reperfusion, cette étude nous permettra d'étudier en détails les voies de signalisation conduisant à ce phénotype de protection.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous analysons dans un modèle d'ischémie/reperfusion les fonctions cellulaires-autonomes d'une protéine TIF2 dans le muscle squelettique. Le bénéfice sera l'accessibilité de ce muscle pour pouvoir transposer les résultats obtenus dans les muscles squelettiques striés des jambes aux muscles striés du cœur avec moins de souffrance pour l'animale et moins de difficulté chirurgicale et plus de bien- être pour l'animale qu'une ischémie myocardique. Ces travaux sont une étape nécessaire dans la compréhension des mécanismes sous-jacents et dans le développement de traitements potentiels de ce type de dysfonctionnements métaboliques qui va améliorer la prise en charge cliniques de l'ischémie myocardiaques.
Procédures
Les animaux subiront une ischémie unilatérale de la patte postérieure droite par la méthode du tourniquet (garrot placé à la racine du membre) pendant 2h suivie d'une reperfusion pendant 2h par desserrement du garrot sous anesthésie générale et l'intervention se terminera par la mise à mort de l’animal pour prélèvement de tissus analysés en extemporané ou congelés pour analyse ultérieure (immuno-histologique RT- PCR …).
Impact sur les animaux
Les animaux seront surveillés tout le temps de la procédure qui se déroulera sous anesthésie gazeuse. On peut s'attendre à une réaction motrice à la stimulation douloureuse d'une patte lors du serrage du garrot mais qui sera estompé par l'utilisation d'un antalgique antinflammatoire avant la procédure.
Devenir
Après la procédure d'ischémie et reperfusion et avant leur réveil, les animaux seront euthanasiés pour prélever les tissus et réaliser des études immunohistopathologiques et moléculaires.
Remplacement
Nous ne disposons pas d'une autre possibilité d'étudier la fonction d'une protéine dans un organisme vivant et dans le cadre d'atteintes de la fonction du muscle squelettique, le modèle Souris constitue la meilleure approche disponible à ce jour pour cela.
Réduction
Des analyses de puissance ont permis de définir les effectifs utilisés dans ce projet, afin d'obtenir des conclusions scientifiquement exploitables pour les procédures expérimentales retenues. Pour les analyses histologiques, nous utilisons une seule patte qui a subi l'ischémie et nous analysons la significativité des résultats pour comparer les 3 groupes. Par ailleurs, nous avons déjà utilisé cette approche avec d'autres lignées génétiquement modifiées et avons pu constater que ces effectifs étaient nécessaires et suffisants pour conclure sur les résultats observés.
Raffinement
La procédure expérimentale implique un soin et une surveillance constants des animaux, afin de s'assurer qu'elle n'entraîne pas de souffrance chez les souris. Des points limites spécifiques sont décrits, et suivis avec application pour répondre aux exigences du protocole du bien-être animal de notre institut. Ainsi, nous injectons 30 minutes avant la réalisation de l'ischémie par voie intrapéritonéale un analgésique. L’ensemble de la procédure se déroule sous anesthésie générale avec maintien de la ventilation spontanée au travers d’un masque délivrant un mélange gazeux qui assurera une sédation profonde. Un tapis chauffant permettra aux animaux de maintenir leur température corporelle durant l'anesthésie. Du gel ophtalmique sera appliqué pour éviter le dessèchement de la cornée. Par ailleurs, la douleur sera prise en charge au moment de serrer le garrot élastique puis pendant le déroulement du protocole expérimental.
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle souris car il nous offre un accès à de nombreuses lignées génétiquement modifiées et que le système vasculaire peut être étudié et est suffisamment proche de l'humain pour offrir une valeur prédictive dans notre approche translationnelle. Les souris seront utilisées à l'âge adulte afin de d'effectuer le modèle d'ischémie/reperfusion sur des fibres musculaires squelettiques bien développé.
Caractérisation d’une thérapie génique sur modèle murin de myopathie liée au gène Bin1.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une myopathie génétique liée au gène Bin1, elles subissent des injections dans le muscle ou l'abdomen, des mesures répétées de force musculaire sous anesthésie et des tests de suspension, pour tester une thérapie génique. Le porteur affirme n'attendre aucune douleur liée au phénotype et décrit une atrophie musculaire légère, tout en précisant que les souris sont tuées à la fin pour prélever leurs organes et que la maladie deviendrait sévère si elles étaient gardées vivantes. Il conclut que les cultures cellulaires ne reproduisent pas un "organisme entier" et juge le modèle murin "essentiel".
Objectifs
Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.
Bénéfices attendus
Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.
Procédures
Les 100 souris de la cohorte « Injections intra-musculaires » seront soumises aux procédures suivantes : - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, non-invasive, hebdomadaire de 6 à 12 semaines d’âge, 20min par animal. - Injections intra-musculaires sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 8 semaines d’âge, 5min par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 12 semaines d’âge. Les 120 souris de la cohorte « Injections Intra-péritonéale » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intra-péritonéale, animal vigile, unique au premier jour post-natal, 1min par animal. - Test de suspension, animal vigile, non-invasif, hebdomadaire de 3 à 10 semaines d’âge, 5min par animal. - Test d’actimétrie, animal vigile, non-invasif, unique à 10 semaine d’âge, 24h par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 10 semaines d’âge.
Impact sur les animaux
Les animaux présentent une légère atrophie et faiblesse musculaire mais qui n’affecte pas leur qualité de vie de manière significative aux âges analysés. Les animaux interagissent, se déplacent et s’alimentent normalement (poids normal). A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. La pose des électrodes sous-cutanée et l’injection intra-musculaire peux causer une inflammation dans le muscle tibial antérieur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. La myopathie étudiée est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.
Remplacement
Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Afin de limiter le nombre d’animaux de la cohorte d’injections intra-musculaires nous injecterons les deux pattes (muscle tibial antérieur) de chaque animal, l’une avec la solution contrôle et l’autre avec un des traitements. L’utilisation d’un contrôle interne à chaque souris plutôt qu’un groupe de souris contrôles permet de renforcer la puissance statistique en s’affranchissant de la variation inter-groupes et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus. La mesure de la force musculaire in vivo par la procédure non-invasive hebdomadaire nous permet de faire le suivi de chaque animal, ce qui renforce la puissance statistique et nous affranchit de créer une cohorte d’animaux pour chaque semaine d’âge analysée.
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire hebdomadaire, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir tout stress causé par la procédure. Un gel protecteur oculaire sera appliqué pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les souris seront observées jusqu’à leur réveil (~5min) pour s’assurer qu’elles sont capables de se déplacer après le test. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale , les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.
Choix des espèces
Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. Nous utiliserons ces animaux à des stades très précoces pour étudier l’effet de notre traitement avant l’apparition des symptômes mais également des animaux adultes pour étudier cet effet après l’apparition des symptômes.
Etude du couplage excitation-contraction musculaire normal et pathologique dans le muscle squelettique de souris adulte, après modification transitoire et localisée de l’expression de protéines d’intérêt.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit sous anesthésie un transfert de gène par électroporation dans les muscles de la patte arrière, puis est tué pour prélever ces muscles, afin d’étudier le fonctionnement de canaux ioniques normaux ou porteurs de mutations humaines. Le porteur décrit une douleur légère après l’intervention, un léchage de la patte se résorbant en une douzaine d’heures. Il affirme que le couplage étudié reste trop immature dans les cellules en culture et que le muscle de souris adulte est requis.
Objectifs
La stimulation du muscle squelettique par le nerf moteur fait intervenir un ensemble de petits courants électriques qui se propagent à la surface du nerf puis du muscle. Ces courants électriques sont dus au passage d'ions dans des protéines poreuses appelées canaux ioniques qui sont situés dans la membrane de surface entourant les cellules. Ces courants électriques sont détectés à la surface du muscle par un type de canal ionique sensible aux variations de potentiel électrique, le canal calcique Cav1.1. Celui-ci est alors stimulé et active en retour un autre canal calcique appelé récepteur de la ryanodine de type 1 ou RyR1. Il en résulte une augmentation massive et soudaine de la quantité d’ions calcium (Ca2+) dans la cellule musculaire qui déclenche aussitôt le raccourcissement de la cellule musculaire : c'est la contraction musculaire. Ces mécanismes responsables de ce qui est appelé le couplage "excitation-contraction" jouent évidemment un rôle clé dans le déploiement de force musculaire et sont fréquemment affectés lors de pathologies musculaires. Ce projet vise à caractériser les mécanismes fondamentaux de fonctionnement des canaux ioniques impliqués dans l’excitation et dans le couplage excitation-contraction. Notre but est aussi d’évaluer comment ces mécanismes sont altérées dans des conditions pathologiques. Comme décrit ci-dessous, l’exploration du couplage excitation-contraction nécessite l'utilisation de muscle squelettique mature et à ces fins, nous utiliserons une technique de transfert local et transitoire d’ADN exogène chez la souris adulte.
Bénéfices attendus
De très nombreuses pathologies musculaires sont des maladies génétiques dues à des mutations dans les gènes codant pour les canaux ioniques impliqués dans le couplage excitation-contraction. Cependant les conséquences de ces mutations sur l’excitabilité et le couplage dans le muscle squelettique restent mal connues. Dans ce contexte, le but de ce projet est d’étudier les effets de mutations de ces canaux, mises en évidence par des médecins chez des patients, sur le fonctionnement de la cellule musculaire différenciée. Pour cela, il est nécessaire de mettre au point des modèles d’étude de canaux ioniques soit normaux soit comportant des mutations pathologiques en utilisant les cellules musculaires de souris adulte comme modèle. Ce projet a pour ambition de conduire à une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux et pathologiques et ainsi de permettre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et l’émergence de nouveaux traitements.
Procédures
L’intervention consistera à réaliser un transfert de gène par électroporation intramusculaire, procédure précédemment utilisée au laboratoire. Le transfert est transitoire et est réalisé uniquement sur un territoire restreint de muscles présents dans la paume des membres postérieurs de souris adulte (c’est-à-dire la face ventrale du pied). Ce transfert de gène permet à quelques cellules du muscle de souris d’exprimer des protéines particulières, des canaux ioniques, en particulier les formes pathologiques de ces canaux ioniques précédemment identifiés chez des malades. Le transfert de gène par électroporation est réalisé après analgésie et anesthésie de l’animal et consisté à injecter l’ADN correspondant aux gènes des canaux ioniques et à appliquer pendant quelques dizaines de secondes un courant électrique au niveau de la face ventrale du pied des membres postérieurs. Afin d’éviter des dommages tissulaires ou une réaction inflammatoire pouvant altérer les muscles de ce territoire et nuire au bien-être animal, les conditions utilisées sont les plus modérées possibles, en termes de durée (20 s par membre postérieur) et d’intensité du champ électrique (80 à 100 V). L’électro-transfert a pour but l’expression transitoire dans le muscle des canaux ioniques d’intérêts sans que d’autres paramètres comme la maturité cellulaire, la structure tissulaire ou le fonctionnement musculaire ne soient modifiés. Une fois la procédure réalisée, l’animal est hébergé pendant 1 à 10 semaines, notre expérience montrant que cette durée est suffisante pour permettre l’expression optimale des différentes protéines par électro-transfert de gènes. Le prélèvement des muscles est alors réalisé après mise à mort des animaux et les analyses sont réalisées sur muscles frais. En moyenne 15% des cellules expriment ainsi les canaux ioniques qui ont tous la propriété de fluorescer, ce qui facilite le repérage des cellules positives par microscopie à fluorescence. Les analyses des différents paramètres de physiologie cellulaire sont ensuite le plus souvent menées sur une cellule à la fois et s’accommodent bien de ce nombre de cellules relativement peu important.
Impact sur les animaux
Sur la base de la bibliographie, de nos études préliminaires et des avis de membres de la SBEA, des grilles d'évaluation ont été mises en place et les points limites seront appliqués en fonction des scores obtenus. Comme indiqué précédemment, le risque de score élevé est minime mais il existe toujours un risque lié soit à une erreur technique (injection mal réalisée...), soit à la possibilité que l’expression d’une des protéines d’intérêt ait des effets délétères imprévisibles. Les études préalables menées sur différentes protéines d’intérêt n’ont pas révélé d’effets indésirables graves ou de signes importants de douleur : l’animal montrait des signes de douleur légère (léchage de la patte) juste après la procédure, douleur spontanément résorbable dans les 12h post-électroporation. Malgré tout, un suivi clinique accru des animaux sera réalisé le jour même et le lendemain de la procédure, en accord avec le responsable du bien-être animal de l’établissement et en utilisant des grilles de score. Un suivi quotidien sera ensuite réalisé et un examen clinique sera alors réalisé si jugé necessaire.
Devenir
Tous les animaux ayant été soumis à la procédure d’expérimentation seront mis à mort afin de pouvoir prélever les muscles correspondants et conduire ex vivo les différents caractérisations du couplage excitation-contraction envisagées.
Remplacement
L’expression adéquate des protéines d’intérêt à l’aide des plasmides mis en œuvre est vérifiée en utilisant des modèles d’études en remplacement du modèle souris (cultures cellulaires). Cependant le couplage excitation-contraction est très immature dans les cellules musculaires en culture et sa caractérisation ne peut donc se faire que sur des cellules adultes, prélevées chez l’animal. Le muscle squelettique de souris adulte est un modèle pertinent, ses caractéristiques étant suffisamment similaires à celles du muscle squelettique humain adulte pour en constituer un modèle approprié.
Réduction
Au total, un maximum de 150 souris seront nécessaires pour les 5 ans du projet. Le nombre d’animaux sera le minimum raisonnable pour démontrer ou infirmer statistiquement les hypothèses. L’analyse du couplage excitation-contraction se fera avec une ou deux souris par semaine. Il est possible qu’au cours de l’étude des résultats significatifs soient obtenus avec un nombre plus faible d’animaux : dans ce cas le nombre d’animaux utilisé sera revu à la baisse. Contrairement par exemple à une lignée transgénique, tous les animaux soumis au transfert transitoire d’ADN intramusculaire constitueront des animaux expérimentaux.
Raffinement
L’électroporation est réalisée sur l’animal anesthésié et sous analgésie. La procédure a pour but l’expression transitoire in vivo des protéines d’intérêts sans que d’autres paramètres comme le degré de maturité cellulaire, la structure tissulaire ou le fonctionnement musculaire ne soient modifiés. Les conditions utilisées lors de l’électroporation ont été raffinées en réduisant au maximum la durée et l’intensité du champ électrique, dans le but d’éviter des dommages tissulaires ou une réaction inflammatoire néfastes pour le muscle et le bien-être animal. Le risque estimé que l’expression des canaux ioniques altère sévèrement la motricité ou la physiologie générale de l’animal est faible pour différentes raisons: 1/ l’expression sera restreinte temporellement (durée d’expression au maximum de 10 semaines) 2/ l’expression sera restreinte spatialement, puisque seuls les muscles de la paume de la patte arrière seront ciblés ; Cette restriction spatiale est d’autant plus importante que toutes les cellules des muscles ciblés n’exprimeront pas les canaux : d’après des résultats préalables, seules 15% des fibres musculaires expriment en moyenne les protéines exogènes. Un suivi post-opératoire minutieux sera mis en place le jour et le lendemain de la procédure et un suivi des animaux sera également réalisé pendant toute la durée de l’hébergement. Le suivi sera fait sur la base de grilles de scores sur des paramètres comme la douleur, l'état général et la locomotion et des points limites seront appliqués en fonction des scores. Le score maximal total est de 20 et les animaux qui présenteraient un score total ≥ 10 recevront des soins adaptés et seront mis à mort si ce score persiste au delà de 24h.
Choix des espèces
La souris est un modèle mammifère bien adapté à l’étude du couplage excitation-contraction et l’excitabilité musculaire. Son génome ainsi que les caractéristiques de son couplage excitation-contraction musculaire présente des homologies importantes avec celui de l’Homme. En outre ce modèle se prête bien à l’électrotransfert d’ADN et la procédure sur ce modèle est aujourd’hui standardisée; Des animaux adultes, agès de 8 à 24 semaines, seront utilisés, afin que les processus de différenciation des structures et protéines cellulaires impliqués dans l’excitabilité musculaire soient terminés, et afin de garantir un couplage excitation-contraction le plus mature possible. Les animaux sont généralement réceptionnés à l'age de 7 à 9 semaines et subissent une periode d'acclimatation d'au minimum 2 semaines avant d'être soumis à la procédure.
transgenese aviaire
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
18 cailles japonaises vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour générer une lignée transgénique. Des embryons reçoivent une injection de particules virales, puis les animaux sont croisés sur deux générations, les femelles de deuxième génération étant tuées dès l'apparition du dimorphisme sexuel pour ne garder que des mâles. Le porteur indique que les cailles seront euthanasiées lorsqu'elles ne seront plus aptes à la reproduction. Il affirme que l'étude de la formation de l'embryon exige des embryons vivants et ne peut être remplacée par des méthodes sans animaux.
Objectifs
L'embryon de poulet a connu une longue et illustre carrière en sciences. De nombreux aspects cellulaires et moléculaires de son développement embryonnaire sont virtuellement identiques aux mammifères. Sa facilité d'observation (y compris en temps réel) et de manipulation a permis l'étude d'un large éventail de sujets, établissant une grande partie des concepts de base de la biologie du développement. Un domaine où les souris avaient toutefois un avantage crucial sur les oiseaux, est la possibilité de modifier leur génome, une technologie qui a été largement utilisée, conduisant ainsi à de nombreuses percées dans le domaine biomédical. L'embryon de souris est néanmoins inaccessible à l'imagerie intra-vitale, limitant de facto l'étude dynamique de processus développementaux. Bien que la transgenèse du poulet soit techniquement possible, le cycle de vie extrêmement long de cet organisme (maturité sexuelle à 6 mois) rend ces approches fastidieuses. La caille japonaise (Coturnix coturnix japonica), à l'inverse, atteint la maturité sexuelle à environ 6 semaines, ce qui est beaucoup plus rapide que le poulet et comparable à la souris. Nous avons développé une technologie originale, utilisant une méthode de transfection directe des cellules primordiales germinales (PGCs) , pour générer des lignées de cailles transgéniques. Nous avons obtenu plusieurs lignées de caille transgéniques, décrites dans plusieurs publications de haut impact. Une technique différente, utilisant des lentivirus pour transduire les PGCs d'embryons précoces de cailles, est également utilisée pour générer des lignées de cailles transgéniques. Le projet consiste en l'élaboration d'une plateforme de transgenèse caille dans laquelle des lignées seront créées non seulement pour notre propre recherche, mais aussi à façon pour la communauté de chercheurs français et européens.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mettre en place une animalerie oiseaux destinée à générer, maintenir et amplifier des lignées de cailles transgéniques. Les constructions utilisées pour générer ces lignées serviront à analyser différents aspects du développement embryonnaire précoce des oiseaux. Ceux-ci montrent un développement embryonnaire en tous points semblables au développement des mammifères et ils représentent donc un modèle expérimental parfaitement adapté pour l'étude du développement de l'embryon humain. Le but de ce projet est donc la recherche fondamentale. Il y a beaucoup de choses que l'on ne sait pas sur les maladies humaines et il n'est pas possible de répondre à toutes les questions que les scientifiques doivent se poser en étudiant des patients humains. Il peut y avoir des raisons éthiques, pratiques ou scientifiques pour lesquelles un objectif scientifique ne peut être atteint en utilisant des sujets humains, et dans ces situations, un modèle animal peut être approprié. Il existe de nombreux types de modèles animaux utilisés dans la recherche. Ils ne reflètent pas nécessairement la condition humaine, mais peuvent néanmoins fournir des informations importantes sur la biologie. Par exemple, un modèle animal peut être utilisé pour prédire l'efficacité probable d'un nouveau traitement avant qu'il ne soit étudié sur des patients. En biologie fondamentale, un modèle animal peut être utilisé pour mieux comprendre les mécanismes à l'origine de la maladie afin d'identifier de nouveaux moyens de la traiter à l'avenir. Toutefois, il est important de reconnaître que tous les modèles animaux ont certaines limites.
Procédures
pas d'intervention autre que l'injection d'un plasmique avant le dernier tiers de developpement pour la genération de colonnie ogm.
Impact sur les animaux
La generation d'aniamux exprimant une ou plusieurs protéines fluorescentes ne génère pas au vu de la litterature de phenotype dommageable. neanmoins la transgénèse pourrait avoir des nuisances comme la perte de poids, un comportement agressif envers les congénères etc. Si une perte de poids de plus de 20% est observée, si l'animal perd son plumage ou presente des alterations de la peau l'animal sera euthanasié. De la même manière si le comportement alimentaire est altéré (ne cherche plus de nourriture) ou si l'animale est aggressif il sera euthanasie.
Devenir
Lorsque les aniamux ne seront plus aptes à la reproduction ils seront euthanasiés.
Remplacement
En raison de la nature des questions biologiques soulevées dans les études proposées, visant à comprendre les événements cellulaires et moléculaires associés à la formation d’un embryon, l'utilisation d'embryons vivants (par exemple pour réaliser de l'imagerie in vivo) est une exigence absolue et ne peut donc pas être remplacée par d'autres méthodes non-animales
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires pour la génération d’une ligné transgénique est le suivant: il faut 6 cailles (5 femelles et 1 male) pour générer des animaux dont le patrimoine génétique est modifié à au moins 50% (génération numero 1). Ces aniamux sont alors croisés entre eux pour obtenir des aimaux transgénique à 75% (génération numero 2). il en faut au moins 12 dans le but d’obtenir 6 males (les femelles étant mises à mort, dès l’apparition du dimorphisme sexuel). Les 6 males, arborant chacun une insertion lentivirale différente, seront croisés chacun avec 4 femelles normale. Une seule lignée montrant l’expression la plus forte sera gardée et utilisée pour la génération d’individus en troisième génération. Les animaux des générations 1 et 2 seront suivis pour vérifier que l’insertion du vecteur lentiviral dans le génome n’ a pas créé de phénotype dommageable, évènement hautement improbable mais pas impossible. Si les animaux ne montrent aucun phénotype dommageable, la procédure est terminée, puisque le simple élevage de caille génétiquement modifiées, une fois passée la 2eme génération ne constitue pas une procédure en soi. Soit Nombre d’animaux= 6+12= 18 animaux par lignée dans une procédure.
Raffinement
Afin de réduire le stress et douleur lors de la mise à mort, l’euthanasie est réalisée dans une autre pièce à l’aide d’une chambre à CO2. Pour le bien-être des animaux, des enrichissements seront réalisés : de la litière dans les cages afin que les animaux puissent gratter, du sable pour qu’ils puissent se laver, la nourriture (graines et légumes) sera également disséminée afin que les animaux la cherchent comme ils le feraient dans la nature, des abris seront également disposés dans les cages afin que les animaux puissent se reposer. La répartition des animaux dans les cages se fera de la manière suivante : un mâle pour 4-5 femelles. La température, la nourriture et la lumière seront monitorées selon les directives nationale et européenne. En ce qui concerne la gestion des déchets biologiques, nous suivrons les directives nationale et européenne. L’utilisation des lignées transgéniques se fera uniquement dans le cadre de la recherche scientifique. Les cailles transgéniques générées ne seront en aucun cas utilisées dans l’agriculture ou en tant qu’animal de compagnie
Choix des espèces
La caille japonaise (Coturnix japonica). Les embryons d’oiseaux par leur accessibilité et leur développement externe, se prêtent remarquablement aux études dynamiques (par vidéo-microscopie) et aux perturbations mécaniques contrairement aux mammifères dont le développement intra-utérin limite la réalisation de telles approches. Sa petite taille et son temps de génération très court font de la caille un modèle génétique idéal parmi les oiseaux. -la procédure d’injection de particule lentivirale s’effectue sur des oeufs fécondés mais non incubés, donc avant le 1ier tiers de gestation. A ce stade il est possible de cibler de manière efficace les cellules précurseurs des gamètes et donc d’obtenir une transmission germinale. -La procédure génération de lignée (évaluation de la présence de phénotype dommageable) s’étend sur 2 générations de l’éclosion jusqu’à la transmission germinale. Les adultes sont uniquement utilisés pour générer les oeufs embryonnés nécessaires à la recherche. les oeufs embryonnés sont utilisés pour la recherche avant le dernier tiers de developpement.
Caractérisation par Résonance Magnétique Nucléaire du remodelage du tissu musculaire après lésion dans des modèles murins
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
165 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris, porteuses de lésions musculaires induites lors de projets antérieurs, sont soumises à des examens d'imagerie par résonance magnétique sous sédation répétée, puis tuées pour confronter les images à l'analyse des tissus, afin de chercher des marqueurs non invasifs de la fibrose musculaire. Le porteur décrit l'imagerie elle-même comme atraumatique et sans douleur. Il affirme qu'aucun protocole in vitro n'atteint le niveau d'organisation du muscle et conclut que les études in vivo sont "indispensables".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’exploiter des outils IRM (imagerie par résonnance magnétique) et SRM (spectroscopie par résonnance magnétique) pour caractériser certains modèles murins de pathologies musculaires et de les confronter à l’histologie, dans le but de trouver des marqueurs RMN permettant d’évaluer la fibrose musculaire de manière non-invasive.
Bénéfices attendus
les bénéfices attendus de notre recherche visent au développement de nouvelles connaisances portant sur les lésions musculaires observées au cours de diverses pathologies musculaires. A terme ces connaissnaces doivent permettre le développement de nouveaux biomarqueurs pour ces pathologies. L'avantage évident d'une approche RMN réside dans le caractère non invasif de l'examen et dans sa capacité à réaliser des examens 'corps entier' et non seulement localisés à une région. L'aspect translationnel de notre recherche est renfocé par la modélisation chez le mammifère non humain (souris) de pathologies humaine.
Procédures
durant les examens RMN les aniamux ne sont soumis à aucune intervention nuisible pour leur état de santé, dans la mesure où les examens se limitent à les évaluations par imagerie ou spectroscopie. Le stress des animaux est limité dans la mesure où tout examen RMN se fait sous sédation, avec un monitorage continu de la respiratoire.
Impact sur les animaux
Les examens RMN appliqués à l'animal nesont pas différents dans leur nature de ceux utilisé chez l'homme et restent donc parfaitement non invasifs. Les modèles murins mis à notre disposition ont pour certains subis une intervention visant à créer un modèle de lésion et régénération. Au stade où ils seront utilisés en RMN les lésions seront cicatrisées et on n'observe pas d'invalidité chez ces animaux. Le degré de récupération fait partie intégrant du projet de recherche.
Devenir
les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pourvoir réaliser une confrontation anatomo-pathologiques avec les images obtenues par RMN.
Remplacement
Le muscle est un ensemble organisé de fibres musculaires, cellules hautement différenciées et spécialisées, et du tissu interstitiel. La fonction musculaire est dépendante du fonctionnement des cellules musculaires, mais aussi d’une combinaison des fonctions vasculaire et nerveuse de l’individu. A l’heure actuelle, il n’existe aucun protocole in vitro permettant d’atteindre ce niveau de différenciation et d’organisation, ce qui rend les études in vivo indispensables pour les études sur la structure et le fonctionnement du muscle.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux est assurée par la minimalisation de la variabilité entre individus : un fond génétique Rag2-/-Ilr2b-/- pour l’étude de la dégénérescence/régénération et de la fibrose musculaire et un fond génétique C57Bl/6J Rj pour la mise au point des outils méthodologiques, et tous les animaux d’une même lignée proviennent d’un même fournisseur pour minimiser les variations sanitaires.
Raffinement
Le raffinement avant l’expérimentation sera fait par enrichissement de l’environnement avec du papier absorbant ou des tubes en carton et par élevage des souris en groupes (maximum 5 individus par groupe) dans des portoirs ventilés munis de cages jetables contenant de la litière de contact. La température est maintenue à 23 ± 1 °C avec une hygrométrie entre 40% et 70% et le cycle d’éclairage est de 10h/14h. Les animaux seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bonne santé et une prise de poids sera effectuée avant chaque examen RMN. Toute perte majeure de poids, modification importante du comportement ou de l’état général pouvant laisser supposer une douleur sera considéré comme point limite. Enfin toutes les expérimentations RMN se feront sous anesthésie gazeuse afin de maintenir les animaux immobiles tout le long des acquisitions. L’imagerie et la spectroscopie RMN étant atraumatiques par définition et les animaux sédatés tout au long de l’acquisition, aucune analgésie n’est nécessaire.
Choix des espèces
Du fait de leur petite taille et de la facilité pour les héberger, les souris sont un ordre animal facile à manipuler. De plus, de nombreux modèles de pathologies neuromusculaires ont été développés chez la souris. Par sa petite taille, la souris est aussi un candidat idéal pour une étude histologique du muscle entier, ce qui est particulièrement intéressant, voire fondamental, pour une étude comparative entre l’IRM et l’histologie. Les espèces de l’ordre des souris sont donc appropriées pour la recherche dans le domaine des maladies neuromusculaires. Au laboratoire, un grand nombre d’outils ont été développés pour la recherche en imagerie et en spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour étudier le muscle squelettique des rongeurs, en particulier des souris. Tous les animaux auront atteint l’âge adulte, les greffes musculaires étant effectuées au minimum à 2 mois. Tous les animaux auront donc atteint leur taille adulte au moment de la greffe et des expérimentations RMN. Le génotypage par tatouage des phalanges sera effectué par l’équipe UMRS 974 dans les projets antérieurs à l’actuel projet (réutilisation des animaux). Les animaux de génotype différent seront maintenus dans des cages différentes afin de s’affranchir de toute erreur de génotype lors des expérimentations.
Etude des mécanismes d’ossification ectopique par biomatériaux cellularisés
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
339 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation sous la peau de biomatériaux ensemencés de cellules musculaires humaines, puis est tué pour prélever ces implants, afin d'étudier une ossification anormale des muscles observée chez des patients paralysés. Le porteur indique qu'une perte de poids peut suivre l'anesthésie et l'intervention. Il affirme que les cultures in vitro ne rendent pas compte de la complexité de la pathologie et justifie le recours au modèle murin.
Objectifs
Les patients polytraumatisés paralysés présentent de nombreuses complications qui impactent leur récupération et leur qualité de vie. Parmi ces complications, les paraostéoarthropathies neurogènes (POAN) sont un développement anormal de tissu osseux au sein du muscle, à proximité des articulations (hanche, coude, genou et épaule). Ces ossifications entraînent des douleurs, des raideurs articulaires et des compressions des nerfs et des vaisseaux qui ont des conséquences majeures chez ces patients déjà lourdement handicapés. A ce jour, il n’existe aucun traitement médical efficace et la seule option thérapeutique est de retirer chirurgicalement le tissu osseux anormal. Ce traitement tardif et palliatif expose ces patients fragiles à de nombreux risques anesthésiques et opératoires. Du fait de son mécanisme d’apparition inconnu, il est impossible actuellement de proposer des thérapeutiques préventives.
Bénéfices attendus
Nos travaux de recherche ont permis de caractériser une population cellulaire du muscle à l’origine de ce développement osseux. Grâce à nos modèles de culture in vitro, nous avons identifié de petites molécules exprimées par ces cellules, des micro-ARN, qui sont susceptibles de contribuer au développement de POAN. Ce projet vise à étudier le rôle des micro-ARN identifiés dans le développement de tissu osseux. Pour cela nous étudierons notre modèle murin d’ossification ectopique par biomatériaux cellularisés. Ces biomatériaux sont ensemencés avec les cellules musculaires humaines isolées à partir de résidus opératoires de muscle de patients. Ils sont ensuite implantés en sous-cutané chez des souris immunodéficientes « Nude » (pour éviter le rejet des cellules humaines) puis prélevés afin d’analyser le processus d’ossification.
Procédures
Procédure chirurgicale d'implantation sous-cutanée de biomatériaux d’une durée de 10-15 minutes et réalisée sous anesthésie et analgésie contrôlée.
Impact sur les animaux
Suite à l'anesthésie et à l'intervention, une perte de poids peut être observée.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour procéder au prélèvement des biomatériaux.
Remplacement
Depuis la première description de cette complication, toutes les recherches sur patients humains n’ont pas permis de comprendre les mécanismes de développement des POAN ni de trouver un traitement préventif. Le diagnostic des POAN est retardé car les symptômes initiaux sont peu spécifiques et passent inaperçus. De plus, la limitation articulaire est tardive (6ème semaine post-traumatique) et ces complications ne sont pas systématiques. En conséquence, les facteurs de risques publiés chez l’humain sont rétrospectifs et confondants. Si l’étude in vitro de cellules issues de résidus opératoires de patients POAN nous a permis d’identifier les populations cellulaires et signaux moléculaires possiblement impliqués dans la genèse des POAN, cette approche ne peut pas rendre compte de la complexité de la pathologie. L’utilisation de ce modèle d’ossification ectopique in vivo par biomatériaux permet de caractériser et d’étudier le devenir de notre population cellulaire humaine d’intérêt en modélisant un système biologique.
Réduction
Ce projet nécessite un nombre maximal de 339 souris. Les protocoles expérimentaux seront réalisés de manière séquentielle dans le but d’optimiser les temps de prélèvement des biomatériaux, identifier les micro-ARN les plus intéressants et ainsi appliquer le principe de réduction et limiter le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Afin de raffiner nos procédures et réduire au maximum le stress et la douleur, nous utiliserons des protocoles établis d’anesthésie et de prise en charge de la douleur (analgésie) en respectant les points limites d’arrêt du protocole. Le suivi post-opératoire associé à une surveillance clinique rapprochée sont strictement réalisés. Enfin, les conditions d’hébergement des animaux sont contrôlées avec le respect d’une période d’acclimatation et la mise à disposition d’un enrichissement adéquat.
Choix des espèces
La souris est un modèle in vivo communément utilisé dans l’étude du métabolisme osseux et de la physiologie musculaire. Les gestes chirurgicaux sur ces animaux sont parfaitement maîtrisés par les personnels impliqués qui sont par ailleurs formés pour évaluer et prendre en charge la douleur chez ces animaux. Les souris seront utilisées au stade jeune adulte pour un âge compris entre 6 et 8 semaines. Il s’agit du stade le plus largement décrit et validé dans les publications. A cet âge, nous limitons les biais liés à l’utilisation de souris vieillissantes. De plus, leur taille est suffisante pour une manipulation aisée lors de l’implantation des biomatériaux.