Système musculosquelettique

690 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection unique de vecteurs viraux AAV par voie intraveineuse ou intramusculaire, des prises de sang et une mesure de bioluminescence sous anesthésie, pour identifier des vecteurs de thérapie génique ciblant mieux le muscle dans les dystrophies musculaires. Le porteur indique que la stratégie d'évolution dirigée permet de tester de nombreux variants en même temps, et que les organes sont prélevés après la mort. Il affirme qu'un vecteur doit être évalué dans un "organisme entier" que les cultures cellulaires ne permettent pas d'aborder.

Objectifs

L'objectif de ce projet s’inscrit dans l’évaluation d’approches thérapeutiques pour des maladies génétiques rares du muscle, les dystrophies musculaires, pour lesquelles il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement. Les dystrophies musculaires sont des maladies dégénératives du muscle qui conduisent à une perte progressive des fonctions motrices telle que la marche. Une option thérapeutique possible est la thérapie génique, stratégie qui consiste à introduire du matériel génétique dans des cellules pour soigner une maladie. Le transport du gène thérapeutique dans les tissus cibles peut se faire grâce à l’utilisation de virus modifiés, appelés vecteurs, en raison de leur propriété naturelle de transférer leur propre matériel génétique dans les cellules humaines. Pour produire des vecteurs viraux, on utilise des virus modifiés génétiquement, dits sécurisés. Dans le cas des maladies musculaires, le fait qu’il soit nécessaire de pouvoir cibler l’ensemble de la masse musculaire impose d’injecter des niveaux très élevés de vecteurs, ce qui peut conduire à des effets adverses allant jusqu’à des effets graves, voire le décès. Il est donc souhaitable d’améliorer les vecteurs. La question scientifique posée dans ce projet est de donc de rechercher des vecteurs ayant des propriétés améliorées pour le transfert de gène en utilisant l’espèce souris comme support de l’identification de ces vecteurs.

Bénéfices attendus

Malgré des succès encourageants, le domaine de la thérapie génique pour les maladies neuromusculaires est toujours confronté à un certain nombre de défis en termes de sécurité et d'efficacité tels que la nécessité de doses élevées pour apporter le gène médicament dans toutes les cellules musculaires ou la présence de réaction immunitaire contre le vecteur ou le transgène. Dans ce projet, nous proposons de développer de nouveaux vecteurs afin d'augmenter l'efficacité du transfert de gène dans les tissus d’intérêt tels que le muscle pour de futures applications chez l'homme. Les bénéfices attendus du projet sont de permettre de proposer une stratégie thérapeutique plus efficace et donc une meilleure correction de la pathologie chez les patients. De plus, une meilleure efficacité devrait permettre une réduction des doses à administrer, permettant de minimiser les risques d’effet adverse chez le patient. Les données obtenues devraient également permettre de mieux comprendre les éléments biologiques gouvernant l’entrée des vecteurs dans les différents organes.

Procédures

Les vecteurs sont injectés une seule fois soit par administration intraveineuse sur animaux vigiles, soit par voie intramusculaire sur animaux anesthésiés. Les prélèvements de sang se feront en début et en fin de protocole. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire. En fin de protocole, les animaux sont examinés sous un capteur qui permet de recueillir de la lumière dont l’intensité va dépendre du niveau de transfert de gène. Cette analyse se fait sur animaux anesthésiés. Il s’agit d’une anesthésie gazeuse. Cette mesure dure 10 minutes et est faite une seule fois, avant l’euthanasie.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : - Piqûre IP pour administration d’anesthésique avant injection en intramusculaire (une seule fois au cours du protocole) ; - Piqûres intraveineuse caudale pour injection AAV (une fois au cours du protocole) ; - Intraveineuse sinus pour injection AAV (une fois au cours du protocole) sous anesthésie gazeuse ; - Prélèvements de sang au sinus soit sous anesthésie gazeuse, soit sous anesthésie fixe en début et fin de protocole ; - Injections intrapéritonéales de luciférine pour la mesure de la bioluminescence ; - Possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies (utilisation de gel pour réduire cette nuisance le cas échéant).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes.

Remplacement

Afin d’évaluer ou de sélectionner de nouveaux vecteurs, il est nécessaire de les administrer dans un organisme entier où il va se distribuer et rentrer dans certains organes en fonction de possibilités d’interaction. Des vecteurs identifiés sur des cellules en culture n’auront pas forcément les caractéristiques voulues pour un transfert efficace dans un organisme. Théoriquement, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale peuvent être de différentes natures : méthodes in silico (avec un programme informatique) ou in vitro (sur des cellules). Les approches in silico utilisées en alternative à l’expérimentation animale à ce jour permettent uniquement des modélisations physico-chimiques comme la relation entre la structure et l’activité biologique d’une molécule ou des modélisations d’élimination de molécules. Des modèles in silico qui pourraient permettre de modéliser numériquement les expériences proposées dans ce projet à partir d’un ensemble de données n’existent donc pas à ce jour. Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Cependant, ces cultures ne permettent pas d’aborder les questions posées dans ce projet qui doivent prendre en compte des paramètres tels que les interactions des vecteurs avec le système sanguin, le système immunitaire et l’ensemble des éléments qui guide comment se distribue un virus dans un organisme.

Réduction

La stratégie de l’évolution dirigée (méthode utilisée en biologie et qui imite le processus de séléction naturelle) pour la sélection de nouveaux vecteurs utilisé dans ce projet permet de réaliser l’évaluation de très nombreux variants en même temps, ce qui permet une réduction extrêmement importante du nombre d’animaux nécessaires. Nous utiliserons un seul modèle de maladies musculaires, choisi pour sa représentativité. Nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes chaque fois que possible. Quand cela est possible, les groupes contrôles seront communs entre les différents vecteurs évalués. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs selon un critère défini par le type d’analyse réalisée.

Raffinement

Les souris sont anesthésiées lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux auront reçu au préalable un traitement analgésique si nécessaire. Les prélèvements de sang seront effectués sous anesthésie de courte durée. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasie appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telles que l’utilisation de la chaleur pour maintenir la température corporelle stable lors de la phase de réveil, ou l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.

Choix des espèces

Pour ce projet, nous utiliserons les espèces souris car les modèles existants des pathologies étudiées sont sur ces espèces. Dans cette étude, les animaux seront utilisés à partir de leur sevrage au stade jeune adulte. Ces animaux présentent une taille et une maturation des organes adéquates pour l’évaluation moyenne du transfert des vecteurs.

2 900 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les adultes sont génotypés jusqu'à deux fois par prélèvement d'un morceau de nageoire sous anesthésie, et des alevins subissent une ablation d'un nerf moteur au laser suivie d'une observation par fluorescence, pour étudier la régénération nerveuse. Les adultes sont tués par surdose d'anesthésiant une fois la génération suivante obtenue, les alevins par anesthésie puis commotion cérébrale pour l'histologie. Le porteur affirme à plusieurs reprises que la douleur est "minimisée", en s'appuyant sur le stade précoce des alevins et la rapidité de régénération de l'espèce.

Objectifs

Les motoneurones qui résident dans la moelle épinière constituent le relai final entre le système nerveux central et le muscle squelettique, responsable du mouvement. Au cours de leur différenciation, les motoneurones émettent des axones qui sortent de la moelle épinière pour suivre une trajectoire stéréotypée pour atteindre leur cible musculaire. Ce processus est orchestré par tout un répertoire de molécules présentes dans l’environnement des axones. Après lésion des nerfs moteurs, l’environnement va à nouveau servir pour le guidage des nerfs afin qu’ils puissent retourner vers leur cible musculaire initiale. L'importance de l'environnement au cours de la régénération des nerfs moteurs sera étudié chez des jeunes alevins de poissons zèbres dont deux gènes de molécules de guidage ont été mutés. Les mutations ne devraientt pas induire de phénotype dommageable permettant l’élevage des poissons. Afin de visualiser les nerfs moteurs et les cellules impliquées dans le processus de régénération, ces poissons auront préalablement été croisés avec 5 lignées transgéniques fluorescentes. Les nerfs sont lésés par ablation laser chez les jeunes alevinsde 4 jours post-fécondation (stade non couvert par la loi sur l'expérimentation animale). Le processus de régénération sera ensuite suivi in vivo par fluorescence, de manière non invasive pendant 2 jours.

Bénéfices attendus

Depuis plus de 40 ans, le poisson zèbre a été un modèle très utilisé pour comprendre la fonction des gènes. Il a même permis de corréler entre un locus donné et une pathologie humaine. Notre étude permettra de comprendre l’importance des deux protéines de l'environnement dans le développement et la régénération des nerfs moteurs et pourra apporter des arguments supplémentaires sur leur implication potentielle dans les maladies neuro-musculaires. En effet ll'une d'entre elle a déjà été mentionné comme candidat potentiel pour des neuropathies bien qu’aucune maladie humaine n’ait été associée avec une mutation dans ce gène pour l’instant. Chez l'homme, les nerfs périphériques sont aisément lésés et leur régénération est lente et souvent incomplète. En fait, moins de la moitié des patients qui subissent une réparation après lésion récupèrent de bonnes fonctions motrices et sensorielles. L’amélioration des connaissances fondamentales dans les molécules impliquées dans la régénération des nerfs moteurs est donc essentielle et ces données auront une application dans la médecine régénérative

Procédures

Les poissons seront génotypés au maximum 2 fois durant leur vie à partir de 3 mois (âge adulte) par prélevement d'un petit échantillon de la nageoire caudale afin de déterminer les poissons homozygotes à l'aide de ciseaux stérilisés à l'alcool 70% puis rincés à l'eau stérile. Le prélèvement se fait sous anesthésie et la procédure totale dure trois minutes. L'animal est immédiatement transféré dans le bac de réveil dont l'eau est correctement aérée jusqu'à la reprise totale de ses capacités soit 1 à 2 min. La nageoire régénère naturellement en 10 jours sans que cela n'impacte sur la nage du poisson.

Impact sur les animaux

Compte tenu des données obtenues chez les souris invalidées pour les deux gènes et du fait de leur faible fonction chez l'organisme adulte, les poissons adultes homozygotes ne devraient pas présenter de phénotype dommageable. En revanche, les poissons doublement mutants pourraient être plus sensibles aux conditions d'élevage avec un vieillissement plus précoce consistant en une baisse de la reproduction et des animaux amaigris. Concernant les alevins subissant une ablation du nerf moteur, la douleur devrait être minime compte tenu du stade auquel l'expérimentation est effectué : 4 jour post-fécondation alors que le poisson est hors cadre de la législation. A ce stade, le système nerveux central n'est pas encore mature et les comportements complèxes ne sont pas encore présents. De plus la lésion d'un seul nerf moteur dans le tronc correspond à 1,7% des nerfs totaux. Des études ont aussi montré que chez des alevins de 5 jours post-fécondation (stade couvert par la législation), les marqueurs de la douleur revenaient rapidement à la normale en 24 h suivant le stimulus nociceptif. Aussi, les alevins agés de 5 jours-post fécondation ne devraient pas non plus ressentir de douleur puisque cela correspond à 24 h suivant l'ablation. Enfin, le poisson zèbre est un modèle animal qui a une forte capacité de régénération de nombreux organes comme le coeur et le cerveau. Une complète régénération du nerf moteur est observé 48 h après ablation chez le jeune alevin wt.

Devenir

Les animaux d’environ 1 an et 4 mois sont mis à mort par surdose d'anesthésiant quand ceux de la génération suivante atteignent la maturité sexuelle et sont capables de se reproduire afin de donner de nouveaux embryons, et donc alevins qui serviront à l’étude de la régénération. Tous les alevins pour l’étude de la régénération seront mis à mort par anesthésie suivie d'une commotion cérébrale afin de pouvoir réaliser des études histologiques.

Remplacement

Le processus de régénération des nerfs intervient dans un environnement complexe qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro. Nous utiliserons le poisson zèbre plutôt que le modèle de la souris déjà établi car il permet de visualiser in vivo le processus de régénération par fluorescence de manière non invasive.

Réduction

La capacité de fécondation externe du poisson zèbre permet d'obtenir facilement des embryons sans mise à mort des parents et donc de réduire le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre de poissons a été réduit au minimum de deux lots de 20 pour chaque lignée. Ce nombre est nécessaire à la fois pour assurer la pérénité de chaque lignée et pour permettre aux poissons de se développer correctement et d'avoir correctement accès à la nourriture. Contrairement à la souris, chez le poisson zèbre il est nécessaire d'effectuer un brassage génétique en utilisant suffisamment de couples pour obtenir une nouvelle génération. De plus, il n'y a pas de chromosome sexuel, aussi il est difficile de contrôler le ratio mâles/femelles. Enfin ce nombre de 20 poissons par bac est important pour le bien être de l'animal puisque le poisson zèbre est un animal grégaire il est nécessaire de l'élever en un nombre suffisamment important pour permettre les interactions sociales.

Raffinement

Des points limites adaptées à la procédure et suffisament prédictifs et précoces ont été établis pour éviter tout mal être de l'animal. Au cours de l'élevage, le bien être des poissons sera vérifié de manière hebdomadaire tout au long de la vie des animaux. Les animaux qui présentent des phénotypes tels que animaux ne se nourrissant pas, animaux amaigris, animaux présentant des défauts musculo-squelettique (scoliose, lordose, ...), animaux présentant un comportement indicatif d'un stress chronique (animaux isolés au fond d'un bac, décolorés, ...) seront mis à mort afin d'éviter toute souffrance. Après ablation d’un nerf moteur, le réveil des alevins sera surveillé. Un retour à l'activité motrice en absence d'anesthésiant apparait en quelques minutes. Puis l’état des alevins sera suivi quotidiennement sous stéréoscope (soit à 5 et 6 jours post-fécondation). Tout alevin présentant un défaut de flotabilité, restant au fond du puit dans la boîte 12 puits sera mis à mort.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un bon modèle pour l'étude du développement des nerfs moteurs. Le développement du système nerveux périphérique moteur est relativement simple. Concernant l’étude de la régénération des nerfs périphériques, grâce à l'utilisation de lignées transgéniques fluorescentes la régénération des nerfs peut être suivie in vivo en temps réel par fluorescence donc de manière non invasive chez les alevins. Les embryons sont obtenus sans souffrance après accouplement naturel de poissons adultes puisque la fécondation se fait ex utero. De plus chez les alevins de type sauvage, les nerfs régénèrent rapidement, en 48 h après ablation. Enfin, lorsque le nerf est sectionné par ablation laser, l'alevin est âgé de 4 jours post-fécondation, il peut encore se nourrir à partir de son sac vitellin et est ainsi indépendant. Il ne devient sous la dépendance de la loi qu’à partir de 5 jours post-fécondation alors que le phénomène de régénération a déjà commencé, ce qui signifie que la condition de souffrance est minimisé Des poissons adultes de 4 à 16 mois homozygotes et hétérozygotes adultes seront utilisés pour obtenir des embryons homozygotes ou hétérozygotes par accouplement naturel puisqu'à ce stade, ils sont pleinement fertiles. Des alevins de 4 à 6 jours post-fécondation seront utilisés pour étudier le processus de régénération. Tandis que les organes se développent rapidement chez les embryons et alevins de poisson zèbre; le système nerveux central reste encore primitif jusqu'à 5 jours post-fécondation. De plus il a déjà été montré que la régénération s'effectuait de manière rapide : en 2 jours il y a régénération complète ce qui signifie que la douleur ressentie est minimisée.

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Hébergés seuls puis placés en cage métabolique, ils subissent des gavages de glucose suivis de six prélèvements sanguins à la queue, des tests de force et de locomotion et une injection sous-cutanée juste avant la mise à mort, pour évaluer l'effet de farines de blé et de lentilles germées sur le muscle vieillissant. Arrivés à 14 mois, ils sont tués à 24 mois pour prélever muscles, tissus adipeux, cœur et foie. Le porteur affirme que le recours à des rats âgés est "absolument nécessaire" et ne peut être remplacé par de la culture cellulaire.

Objectifs

Le maintien d’un apport protéique suffisant et de bonne qualité nutritionnelle apparaît nécessaire pour lutter efficacement contre la perte de masse et de fonction musculaires, appelée sarcopénie. Les protéines animales, pourtant digestibles et de bonne qualité sont délaissées par la population âgée, nécessitant ainsi la recherche de nouvelles stratégies alternatives. Du fait de leur complémentarité en acides aminés indispensables (AAi), l’association de céréales et de légumineuses permet un apport protéique journalier de qualité et durable, pouvant répondre aux besoins nutritionnels des séniors. Cependant, ces protéines végétales restent moins digestibles que les protéines animales et la consommation des légumineuses est souvent limitée en raison de leur contenu en facteurs antinutritionnels (FAN). Il devient alors nécessaire de développer de nouveaux procédés de transformation pour la production d’aliments destinés à l’alimentation humaine. Aussi, l’utilisation de bioprocédés tels que la germination permettrait de lever ce verrou tout en respectant le concept de « Naturalité » inscrit dans la transition alimentaire à laquelle nous faisons face actuellement. De nombreux travaux montrent que la germination (processus biologique commençant à l’imbibition d’une graine quiescente non-dormante et s’achevant au moment de l’émergence de l’embryon) diminue le contenu en FAN et améliore l’accessibilité aux protéines stockées dans la graine, la teneur en microconstituants et les capacités anti-oxydantes des graines ainsi que des farines qui en résultent. Ces graines germées apportent également des fibres et des bioactifs végétaux qui pourraient prévenir les dysbioses du microbiote intestinal observées au cours du vieillissement. La dysbiose ou modification de la composition du microbiote intestinal et de ses fonctions, conduit notamment à une perméabilisation de la barrière intestinale provoquant une augmentation de la translocation bactérienne et une sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et probablement d’autres métabolites bactériens qui participeraient au développement de la sarcopénie. Jusqu’à présent, peu de travaux se sont intéressés à l’impact de la consommation de ces produits germés sur l’axe intestin-muscle lors du vieillissement. Dans ce contexte, le projet présenté ici vise à étudier l’impact de farines germées blé/lentilles sur le métabolisme et la fonction musculaires, le statut inflammatoire ainsi que sur le microbiote intestinal du rat âgé.

Bénéfices attendus

Le vieillissement est associé à une perte de masse et de fonction musculaires, appelée sarcopénie fortement liée à l’alimentation. Les personnes âgées sont confrontées à des problèmes de mastication, à une perte d’appétence pour les produits carnés et à l’apparition d’une moindre réponse aux effecteurs anaboliques du repas pouvant conduire à un état de dénutrition. Il est donc important de maintenir chez la personne âgée un apport protéique suffisant, varié et de bonne qualité. La composition en acides aminés indispensables (AAi) des protéines végétales est moins bien équilibrée que celle des protéines animales mais une complémentarité entre 2 espèces végétales différentes peut permettre d’obtenir un apport adéquat en AAi. C’est notamment le cas lorsque l’on associe céréales et légumineuses. Toutefois, la présence de facteurs antinutritionnels (FAN) dans les aliments végétaux ainsi qu’une réticulation importante des protéines végétales les rendent moins digestibles pour l’Homme. L’utilisation de la germination pourrait permettre de lever ce verrou. La germination est un processus de développement de la plante contenue dans sa graine qui débute par une étape de reprise de l’activité métabolique après une période de dormance, ces graines sont alors dites « germées ». Ce bioprocédé est à la fois respectueux de l’environnement mais également simple à mettre en place, et peu coûteux. Il diminue le contenu en FAN, augmente l’accessibilité et la teneur en protéines et en micronutriments (sodium, magnésium, fer, zinc) ainsi que les capacités anti-oxydantes des graines (polyphenols). La modification du comportement alimentaire des sujets âgés affecte également l’écosystème intestinal. En effet, il apparait avec l’âge une dysbiose du microbiote intestinal, c’est-à-dire une modification de sa composition et de ses fonctions, qui participerait au développement de la sarcopénie. Les teneurs en fibres, en microconstituants et en protéines des aliments d’origine végétale, pourraient prévenir ces dysbioses liées à l’âge. La consommation de produits à base de céréales et de légumineuses germées pourrait présenter un intérêt chez la personne âgée à la fois en terme d’homéostasie protéique mais aussi en augmentant la densité nutritionnelle et la digestibilité des protéines d’origine végétale. Ce projet pourrait donc conduire à la formulation de nouveaux aliments particulièrement pertinents pour les personnes âgées dont la proportion dans la population ne cesse d’augmenter.

Procédures

Les rats seront hébergés en cage individuelle pour contrôler précisément leur consommation. Les rats auront des contacts acoustiques et olfactifs avec leurs congénères. Les cages seront adaptées aux poids des rats et contiendront des objets d’enrichissement. Les rats subiront diverses interventions au début, au milieu et/ou à la fin du protocole. Elles auront pour but de : -mesurer la composition corporelle sur animal vigile via une technique non invasive peu stressante réalisée 3 fois et d’une durée de 1 minute 30 à chaque fois. -mesurer la fonctionnalité musculaire de façon non invasive et sur animal vigile. Cette mesure fait intervenir 4 appareils. Ces mesures seront réalisées sur la base du « volontariat » car il est impossible d’obliger les animaux à réaliser les exercices. L’appareil 1 servira à mesurer la force et sera utilisé 3 fois pour une durée de manipulation de l’animal de 30 secondes à chaque fois. L’appareil 2 permettra d’évaluer l’équilibre et la coordination motrice et sera utilisé 3 fois. La durée dépendra de l’endurance et de la volonté du rat à réaliser l’exercice (5 minutes au maximum). L’appareil 3 permettra d’évaluer des paramètres statiques (surface des empreintes…) et dynamiques (temps de contact de chaque patte…) de la locomotion. Il sera utilisé 3 fois et l’exercice durera moins de 7 secondes à chaque fois. Enfin, l’appareil 4 permettra d’appréhender l’activité ambulatoire totale et ne sera utilisé qu’à la fin du protocole. L’expérience dure 10 minutes et est non stressante pour les animaux. -mesurer la tolérance au glucose. Les animaux subiront un gavage avec une solution de glucose puis 6 prélèvements de sang de 300µl chacun seront réalisés au niveau de la queue. Ces prises de sang interviendront à T0 (juste avant le gavage) puis 15, 30, 60, 90 et 120 minutes après. Ce test sera réalisé 2 fois: au milieu et à la fin du protocole. -mesurer la rétention azotée (azote ingérée – azote excrétée) au niveau corps entier. Cette mesure nécessite la récupération de la totalité des fèces et de l’urine produits. Les rats seront hébergés dans une cage métabolique conçue pour permettre cette récupération. La durée du passage sera réduite au maximum (4 jours au total) sans compromettre les résultats du projet. -mesurer la synthèse protéique musculaire qui nécessitera l’injection d’une molécule non toxique et n’induisant pas de douleur en soi diluée dans du sérum physiologique, par voie sous cutanée 50 minutes avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

A leur arrivée, les animaux seront âgés de 14 mois. A la fin du protocole, ils seront mis à mort à l’âge de 24 mois. Au cours de cette période de 10 mois et en raison de l’avancée en âge, les rats auront pris du poids et de la masse grasse et perdu de la masse maigre et de la mobilité. Les différents régimes devraient moduler toutes ces modifications. L’hébergement des rats leur occasionnera un léger stress. En effet, les rats seront hébergés en cage individuelle afin de contrôler précisément leur consommation. De plus, la moitié des rats sera hébergée les 4 derniers jours du protocole dans une cage métabolique afin de récupérer l’ensemble des excréments. Durant le protocole, les animaliers observeront quotidiennement le comportement général de chaque rat, son apparence et contrôleront la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum. Plusieurs mesures de composition corporelle et de fonctionnalité musculaire seront réalisées. Ces mesures seront effectuées sur animal vigile mais sont peu stressantes. Deux mesures de tolérance au glucose seront réalisées et nécessiteront à chaque fois un gavage (solution de glucose) à l’aide d’une sonde et 6 prélèvements sanguins au niveau de la queue de l’animal. Pour réduire le stress des animaux induit par la contention et le gavage, et la douleur liée aux prélèvements sanguins, les gestes seront réalisés par des manipulateurs expérimentés. A la fin de ces tests, une attention particulière sera portée aux animaux de retour dans leur lieu d’hébergement notamment au niveau de leur posture et de leur alimentation. Enfin, une mesure de synthèse protéique musculaire sera réalisée chez les rats. Cette mesure nécessite l’injection d’une molécule non toxique et n’induisant pas de douleur en soi diluée dans du sérum physiologique, par voie sous cutanée 50 minutes avant la mise à mort. Les injections seront réalisées sur le dos de l’animal. Pour limiter le stress et la douleur induits par l’injection, il ne sera jamais injecté plus de 10ml de la solution à un animal et il ne sera jamais injecté plus de 2ml de solution en un même point. La première injection sera effectuée entre les omoplates.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser les analyses qui permettront de répondre aux objectifs du projet. Ainsi, juste avant la mise à mort des rats, sera prélevé la totalité du sang puis juste après la mise à mort, seront prélevés les muscles squelettiques des pattes arrière (plantaris, soleus, tibialis anterior, gastrocnémius et quadriceps), les tissus adipeux sous cutané et rétro-abdominal, le coeur et le foie.

Remplacement

Le projet vise à étudier l’impact de la consommation de mélanges de farines de blé et de lentilles germées sur le métabolisme musculaire, le statut inflammatoire et sur le microbiote intestinal dans un contexte de vieillissement. L’utilisation d’animaux, et qui plus est âgé,s dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacer par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire ne permettant pas de mesurer simultanément : - La digestibilité des différentes sources de protéines - L’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité des animaux - Le métabolisme protéique musculaire - L’évolution du métabolisme glucidique - Le statut inflammatoire circulant de l’animal - L’évolution du microbiote intestinal. En l’état, ce projet ne peut pas non plus être mené directement chez l’Homme. En effet, actuellement, la production de graines germées reste très limitée en France à cause des contraintes sanitaires extrêmement strictes afin de limiter les contaminations bactériennes. En effet, les graines peuvent contenir des micro-organismes pathogènes qui sont principalement des bactéries Escherichia coli pathogènes, et Salmonella. Aussi, depuis 2013, la réglementation européenne à renforcer la traçabilité et les garanties sanitaires des graines germées (règlement d’exécution (UE) no 208/2013) et les opérateurs produisant ces graines doivent donc désormais s’efforcer de mettre en place des mesures additionnelles de gestion de sécurité des denrées alimentaires. Ainsi, à cause de ces contraintes sanitaires lourdes, peu de produits germés sont présents sur le marché national. Mais par contre, ce projet pourrait promouvoir auprès des entreprises agro-alimentaires la production ainsi que l’utilisation de graines germées pour la confection de différents produits de panification et de pâtisserie par exemple.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Le nombre de rats nécessaires à l’étude est calculé pour une différence attendue de 25% pour la synthèse protéique musculaire entre les rats nourris avec les régimes à base de protéines laitières et ceux nourris avec le régime à base de farines issues de graines germées. Des études antérieures ont montré que la variabilité du paramètre choisi est de 14%. L’effectif est calculé pour un risque de 1ère espèce alpha de 5% et un risque de 2ème espèce béta de 5%. Ainsi, le nombre de rats nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée à la durée totale du protocole (9 mois) et surtout à l’âge des animaux à la fin de l’expérimentation (24 mois), nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 12 rats. Le nombre total de rats nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 96.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les rats seront hébergés individuellement. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque rat, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.

Choix des espèces

Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi le rat comme modèle animal et plus particulièrement le rat Wistar car ces animaux présentent différents avantages pour les études de vieillissement, notamment au niveau des modifications métaboliques et nutritionnelles. Le rat Wistar a une prévalence de développement tumorale et d’insuffisance d’organe (rein, foie, cœur) plus faible que les autres souches de rat, le rendant plus adapté à l’étude du vieillissement. De plus, ces vieux animaux présentent des modifications anthropomorphiques et morphologiques proches de celles observées chez l’Homme avec l’avancée en âge (augmentation de la masse grasse, diminution de la minéralisation osseuse et réduction de la masse musculaire squelettique). Le projet a pour objectif d’étudier l’impact de farines germées blé/lentilles sur le métabolisme musculaire, le statut inflammatoire ainsi que sur le microbiote intestinal dans un contexte de vieillissement. Les animaux seront livrés à l’animalerie à l'âge de 14 mois. Après 2 à 4 semaines d'acclimatation, ils seront soumis à différents régimes pendant 9 mois et auront donc 24 mois à la fin du protocole.