Système musculosquelettique

50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une pastille immunosuppressive implantée sous la peau sous anesthésie, puis une injection intraveineuse de thérapie génique et plusieurs prélèvements sanguins, avant d'être tués pour prélever leurs organes. Le projet cherche à savoir si la toxicité cardiaque observée à forte dose de vecteur est liée à une réponse immunitaire contre le transgène. Le porteur passe en revue les méthodes in silico et in vitro puis affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'étudier les liens entre système immunitaire et système cardiaque.

Objectifs

Les dystrophies musculaires sont un ensemble de pathologies invalidantes sans traitements présentant des signes histologiques et fonctionnels avec une réduction de la force musculaire, et parfois une atteinte cardiaque, respiratoire et cérébral. La thérapie génique est une stratégie envisagée dans ces pathologies d’origine génétique et des approches utilisant des vecteurs dérivés du virus associé à l’adénovirus sont déjà à l’étape clinique. Lors des injections des produits de thérapie génique chez l’homme, Il a été observé des réactions immunitaires contre le vecteur et contre le transgène (produit protéique exprimé à partir du gène apporté par le vecteur), ainsi qu’un certain nombre de réactions adverses. Dans ces cas, des traitements à base de produits immunosuppresseurs sont donnés aux patients et permettent une résolution des problèmes la plupart du temps. Dans nos études précliniques de transfert de gène dans un groupe de pathologies musculaires, les sarcoglycanopathies, nous avons également observé une toxicité cardiaque à des doses élevées de vecteur chez le rat. Nous avons observé de façon concomitante une réponse immune contre le transgène-médicament, sans qu’il soit possible de déterminer si cette réaction immune était en parallèle ou à l’origine de la cardiotoxicité. L’objectif de ce projet est de répondre à cette question en utilisant un régime immunosuppresseur qui va prévenir la réponse contre le transgène et de quantifier une potentielle diminution de la cardiotoxicité.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous définirons si la cardiotoxicité observée à de forte doses de vecteurs est liée ou non à une réponse anti-transgène. La réponse à cette question nous orientera vers la génération de vecteur ayant un profil de sécurité plus élevé car nous saurons si nous devons privilégier des vecteurs ne conduisant pas à une réponse anti-transgène ou au contraire rechercher l’origine de la cardiotoxicité pour définir comment générer des vecteurs.

Procédures

Le traitement immunosuppresseur se fait par injection sous-cutanée de pastilles à l’aide d’une canule une seule fois au cours du protocole sur des animaux sous anesthésie gazeuse. Le transfert de gène se fait par injection intraveineuse en une seule fois sur animaux vigiles avec injection dans la veine caudale. Les prélèvements de sang se feront un jour avant l’injection de la thérapie génique, à 14 jours post-injection et à la fin (J21) du protocole. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées à la nature des actes réalisés : - Douleur de piqûres pour injection du traitement par transfert de gène. Certains actes qui sont susceptibles d’entrainer des douleurs sont réalisés sous anesthésie gazeuse, la nuisance sera donc liée à l’acte d’anesthésie. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. Effets immunosuppresseurs des drogues et l’effet toxique des doses élevées des injections de thérapie génique peuvent également entrainer des nuisances, comme une atteinte cardiaque et un dérèglement du système immunitaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes.

Remplacement

Aucun modèle alternatif à des modèles animaux ne nous permet d’étudier les relations entre la réponse immunitaire et la toxicité cardiaque pour répondre aux questions posées. Théoriquement, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale peuvent être de différentes natures : méthodes in silico ou in vitro. Les approches in silico utilisées en alternative à l’expérimentation animale à ce jour permettent uniquement des modélisations physico-chimiques comme la relation entre structure et activité biologique d’une molécule ou des modélisations toxico-cinétiques d’élimination de molécules. Des modèles in silico qui pourraient permettre de modéliser numériquement les expériences proposées dans ce projet à partir d’un ensemble de données n’existent donc pas à ce jour. Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, il n’existe à ce jour aucun modèle permettant d’étudier les relations entre le système immunitaire et les système cardiaque..

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le découpage en 2 lots va permettre de définir le meilleure traitement immunosuppresseur dans le premier lot et de ne faire que le meilleur dans le deuxième lot. Le groupe contrôle injecté avec placebo sera mutualisé entre les 2 lots. Nos données suggérant que les observations de toxicité et de réponse immune sont globalement les mêmes entre les deux sexes, nous n’évaluerons la question que sur un seul sexe, ce qui nous permet une réduction d’animaux.

Raffinement

Nous avons choisi d’administrer les molécules à l’aide de pastilles sous-cutanées qui permettent la délivrance de la molécule pendant une période de 21 jours. Cette méthode permet un contrôle de la quantité de produit administré en assurant une distribution continue et une stabilité du produit et donc une meilleure reproductibilité. Cette méthode permet de limiter la manipulation des animaux avec une seule manipulation au lieu de manipulations quotidiennes, évitant par la même du stress aux animaux. L’administration systémique des vecteurs se fera 2 à 3 jours après de l’implantation de la pastille évitant un stress supplémentaire l’animal. Les animaux sont anesthésiés lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Les prélèvements de sang sont effectués sous anesthésie de courte durée. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasies appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telle que l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.

Choix des espèces

Pour ce projet, nous utiliserons l’espèce rat car c’est sur cette espèce que nous avons observé la plus grande sensibilité à la toxicité cardiaque induite par l’injection des AAV à forte doses. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte à un âge permettant le montage d’une réponse immune.

20 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie générale la création d'un défaut osseux de 15 mm à la mâchoire, comblé ou non par un greffon prélevé sur d'autres lapins issus d'un élevage de production d'anticorps, avant une mise à mort à un, trois ou six mois. Le porteur décrit de nombreuses atteintes possibles, dont des douleurs neuropathiques, des lésions de morsure de la lèvre, des troubles de la mastication et des hémorragies, un animal atteignant le point limite étant tué plus tôt. Il affirme que l'expérimentation est "irréalisable chez l'homme" et que le recours à une espèce mammifère est "obligatoire".

Objectifs

Les pertes de substance mandibulaires sont majoritairement d’origine traumatique ou tumorale (lésions bénignes mais agressives ou tumeurs malignes). Elles peuvent aussi faire suite à une infection, un traitement par radiothérapie ou chimiothérapie. Lorsque ces pertes de substance sont de taille supérieure à 15 mm, l’os ne peut se régénérer seul et nécessite d’être reconstruit. Cette reconstruction est un challenge sur le plan fonctionnel et esthétique. Le traitement de référence pour les pertes de substance pluritissulaires complexes repose actuellement sur le transfert d’un lambeau libre micro-anastomosé, c’est-à-dire le prélèvement d’os et de tissus mou à partir d’un site donneur qui est ensuite transféré avec les vaisseaux qui le vascularisent sur le site à reconstruire. Cette technique présente un taux de réussite compris entre 95% et 98% selon les études. Cette intervention ne peut se justifier que chez des patients dont l’état général est compatible avec une chirurgie longue et complexe, qui implique une morbidité importante au niveau du site donneur et des complications parfois graves au niveau du site receveur. En cas d’échec, cette technique peut mettre en péril la vie du patient. L’objectif de ce projet est donc de mettre au point une solution alternative pour la reconstruction des pertes de substance mandibulaires, plus sûre et moins complexe d’un point de vue technique. L’étude vise à montrer la faisabilité de la génération in vivo de tissu mandibulaire au sein d’une matrice aortique.

Bénéfices attendus

Tous les ans en France, 11 610 nouveaux cancers de la cavité buccale sont diagnostiqués. Ils sont classés au 8ème rang de tous les cancers en termes de fréquence. Leur pronostique est sombre avec une survie à 5 ans entre 44 et 68%. Cette étude vise à améliorer la prise en charge de la reconstruction chirurgicale de ces patients en mettant au point une technique moins complexe, plus rapide et plus sûre que le traitement actuel de référence.

Procédures

Une intervention chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée sur l’ensemble des lapins. Elle consistera en la réalisation d’un défect osseux de 15 mm au niveau de la mandibule en avant des prémolaires de manière unilatérale. Selon le groupe d’appartenance de l’animal, la région sera comblée ou non avec un greffon de matrice aortique préalablement prélevé sur des lapins destinés à la production d’anticorps et cryoconservée. La mandibule sera ensuite stabilisée par plaque transvissée. La fermeture sera réalisée par suture avec fil résorbable. La durée prévue est de 30 minutes par intervention. Les lapins recevront dans les suites post opératoires un traitement antibiotique en prise unique et des traitements antalgiques en intra musculaire afin de sécuriser leur prise en charge. Ils pourront être nourris à la seringue pendant les premiers jours si leur prise alimentaire s’avère insuffisante. A la fin de l’échéance : 1 mois, 3 mois ou 6 mois en fonction des groupes, les lapins seront mis à mort. La mandibule sera prélevée. Des coupes fines seront réalisées sur la région d’intérêt puis envoyer en analyse radiologique et anatomopathologique

Impact sur les animaux

En per opératoire : • Stress aigu durant le temps péri opératoire, douleur à l’injection intramusculaire des drogues et à la mise en place du cathéter au niveau de l’oreille • Sous dosage anesthésique pouvant entrainer douleurs, agitation, mouvements cliniques, tachycardie (bpm > 300) • Sur dosage anesthésique pouvant entrainer une bradycardie (bpm < 100), une bradypnée, des râles respiratoires, une désaturation avec hypercapnie, un arrêt cardiorespiratoire. • Une hémorragie per opératoire, contrôlable par les moyens chirurgicaux disponibles (ligature chirurgicale, compression) ou incontrôlable par rupture d’un vaisseaux cervicales type carotide ou jugulaire. • Toutes lésions accidentelles des tissus mous du site opératoire durant la chirurgie En post opératoire : • L’anesthésie du territoire innervé par le nerf intra alvéolaire inférieur sera constante. Elle pourra entrainer des douleurs neuropathiques, des difficultés à la prise du bol alimentaire, un prurit, des lésions de morsure au niveau de la lèvre inférieure. • Un trouble de l’articulé dentaire et donc de la mastication sera possible par mauvaise stabilisation per opératoire de la mandibule. • Une hémorragie post opératoire ainsi qu’une infection post opératoire (douleur, rougeur, chaleur, œdème), complications communes à toutes chirurgies, seront possibles et peuvent nous amener à réaliser un nouvel acte chirurgical en urgence. Une désunion de cicatrice ainsi qu’une exposition, un déplacement ou un défaut du matériel d’ostéosynthèse pourront aussi nous conduire à une nouvelle intervention. • La douleur à la prise alimentaire par lésion des muqueuses intrabuccales (sensibles au chaud) ainsi qu’à la mastication (sensible à la prise d’aliments durs en raison de l’ostéotomie). Cette douleur pourra être à l’origine d’un trouble de l’alimentation, d'une asthénie, d’une perte de poids, d’une agitation post opératoire, d’une insomnie, d’un retard du transit.

Devenir

Une mise à mort sera réalisée à la fin de la procédure afin de permettre le prélèvement de la mandibule et l’analyse osseuse. La mise à mort sera réalisée plus précocement pour les animaux ayant atteint le point limite douloureux.

Remplacement

Le modèle animal assure une expérimentation irréalisable chez l’homme. Notre projet vise à démontrer le potentiel de régénération osseuse à partir de cellules souches apportées par de la matrice aortique. Sa réalisation nécessite un environnement tissulaire et hormonal complexe ne pouvant être approché par des modèles numériques ou in vitro. Le choix d’un modèle animal possédant une anatomie et une physiologie proche de l’homme est essentiel. L’utilisation d’une espèce mammifère est obligatoire.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires, la première étape qui correspond au prélèvement des greffons aortiques sera réalisée sur des lapins adultes récupérés d’une autre étude (production d’anticorps) qui n'entrent pas en compte dans le nombre de sujet necessaire. Concernant le nombre de sujets nécessaires, 18 lapins semblent suffisants à l’obtention de résultats significatifs. En effet, la plupart des études expérimentales de ce type en chirurgie maxillo-faciale décrivent des protocoles expérimentaux sur des cohortes de 15 à 20 lapins. Nous ajoutons aux 18 lapins 2 lapins d’essai afin de garantir des résultats significatifs en cas de décès dans notre cohorte. Cet effectif a été abaissé au minimum afin de garantir des résultats exploitables.

Raffinement

La chirurgie et l’hébergement des animaux se feront sur le même site, ce qui limite les transports et l’angoisse que ceux-ci pourraient générer. Les règles d’asepsie chirurgicale chez l’homme seront respectées à l’identique chez le lapin. Une antalgie efficace sera administrée. La procédure chirurgicale se déroulera sous anesthésie générale. Pendant le geste, nous réaliserons une anesthésie locale complémentaire par infiltration des deux nerfs alvéolaires inférieurs. Aucune procédure invasive ne sera réalisée lors de la phase observationnelle afin de minimiser le risque de nouveau stress chez l’animal. Les animaux seront nourris de manière adaptée pendant les 10 premiers jours postopératoires, avec une alimentation humidifiée et molle sans aucune restriction. Les dents seront particulièrement surveillées et coupées si nécessaire. En cas de non reprise d’appétit spontanée, nous réaliserons une réalimentation assistée par gavage à la seringue. L’environnement post-opératoire respectera les normes en vigueur. La douleur et le comportement de l’animal seront évalués de manière pluriquotidienne. Tout animal montrant des signes de souffrance non soulagée sera mis à mort.

Choix des espèces

La population cible pour la reconstruction osseuse à partir de matrice aortique est une population adulte. Nous avons besoin d’étudier la régénération osseuse sur un os mature. Nous utiliserons donc des lapins adultes, ayant un poids compris entre 2.5 et 4.5 kg. Le choix du lapin est justifié : sa phylogénie est proche de l’homme, son anatomie et sa physiologie sont comparables, sa taille permet d’obtenir des échantillons tissulaires exploitables. Les critères comportementaux sont essentiels : le lapin est un animal facile à approcher et à soigner dans la mesure où il subira des soins. Son taux de reproduction élevé et l’intervalle de génération relativement court lui ajoute une qualité supplémentaire. Le lapin est déjà utilisé dans le domaine de la cancérologie et de la chirurgie maxillo-faciale. Notre étude implique une procédure chirurgicale. L’anatomie de sa mandibule permet d’effectuer une résection de plus de 15 millimètres. A l’inverse, la mandibule du lapin est suffisamment petite pour permettre d’obtenir une section transversale complète sur une coupe histologique. La génération osseuse est comparable chez le lapin et chez l’homme, ce qui permettra de transposer les résultats obtenus chez l’homme.

940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intramusculaire d'un composé myotoxique sous anesthésie pour léser le muscle, certaines des injections de tamoxifène et un suivi par imagerie, avant mise à mort par surdose d'anesthésique et perfusion d'un fixateur. Le porteur étudie la régénération musculaire et les dépôts fibro-adipeux des myopathies, avec des retombées thérapeutiques présentées comme potentielles. Il décrit des méthodes in vitro de réduction, cellules immortalisées et mini-muscles humains, mais conclut qu'une validation in vivo reste "indispensable".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier les mécanismes impliqués dans le processus de régénération du muscle squeletique sain ou pathologique chez la souris. Le muscle adulte est capable de régénérer suite à des lésions, grâce aux cellules souches musculaires (cellules satellites), ainsi qu’à l’action coordonnée des plusieurs autres cellules, parmi lesquels les macrophages, les vaisseaux sanguins, et des cellules que nous appelons « progéniteurs fibro-adipogéniques » (ou FAPs), composants clés du tissus-conjonctif musculaire. Chez un individu adulte sain, ce processus permet de maintenir la masse musculaire en réparant les microlésions liées à l’activité musculaire normale ou les lésions aigues induites par des blessures physiques. Le processus de régénération est dysfonctionnel dans divers pathologies du muscle, conduisant à une fonte musculaire accompagnée d'infiltrations de tissus fibreux et adipeux. Ces infiltrations résultent d’un comportement anormal des FAPs, qui prolifèrent en exces et se transforment en fibrose ou en adipocytes. Cette multiplication des FAPs et la transformation fibroadipeuse sont normalement inhibées dans un muscle sain, et cette protection est perdue dans certaines myopathies (comme la dystrophie Duchenne, ou la dystrophie facioscapulohumérale (FSHD)). Nous cherchons à identifier les molécules participant à cette protection naturelle. Partie 1 : Nous explorerons la contribution à ce processus du gène FAT1, dont nous avons précédemment identifié l’influence clé sur la croissance et la forme de sous-groupes de muscles pendant l’embryogénèse, et dont nous avons montré que le dysfonctionnement se produisait dans la FSHD. Nous examinerons comment l’inactivation du gène FAT1 dans les FAPs chez la souris perturbe la régénération musculaire induite par une lésion, et evaluerons si elle conduit à l’apparition de dépots fibro-adipeux. Partie 2 : Grace à une recherche de candidats basée sur des données publiées issues de modèles humains et murins de dystrophies musculaires, nous avons identifié des molécules caractéristiques des FAPs, produites en quantité augmentées ou réduites dans les pathologies musculaires avec infiltrations fibro-graisseuse. La liste de candidats sera complétée avec les résultats de la partie 1. Nous testerons l’implication de ces candidats dans les formations fibro-adipeuses, en etudiant leurs fonctions a) in vitro dans des cultures primaires de FAPs de souris ; puis b) in vivo chez la souris.

Bénéfices attendus

L’apparition de dépots fibro-adipeux dans les myopathies marque un stade de non-réversibilité des symptomes. Ces dépots changent les propriétés physiques du muscle, et compromettent l’efficacité du processus régénératif, non seulement spontanné, mais aussi thérapeutique, en empêchant de nouvelles fibres de s’intégrer ou même de se contracter. Ainsi, il est essentiel d’identifier les moyens de bloquer l’apparition ou la progression des dépots fibro-adipeux, afin de retarder l’évolution des symptomes chez les patients, et leur permettre de bénéficier de thérapies inovantes. Partie 1 : L’identification d’un gène tel que FAT1, régulant le développement et la régénération des muscles, et dont nous suspectons que le dysfonctionnement participe à l’apparition des symptomes de la FSHD, a fourni une nouvelle cible thérapeutique potentielle. Divers éléments permettent d’anticiper que l’inhibition de FAT1 dans les FAPs sera détrimentaire au fonctionnement normal des FAPs, pourrait empecher une bonne régénération et favoriser l’apparition de dépots fibro-adipeux dans les muscles lésés. En confirmant cette hypothèse et clarifiant les mecanismes, nos résultats feront émerger de nouvelles options thérapeutiques qui pourraient à terme, bénéficier aux patients. Partie 2 : Le projet permettra d’identifier, parmi les protéines présentes dans les FAPs et produites en quantités anormales dans les pathologies avec dépots fibro-adipeux, ceux qui sont responsables de la formation de tels dépots. Nous obtiendrons dans un premier temps la preuve de principe que reproduire un changement observé dans les pathologies est suffisant pour induire ces dépots. Dans un deuxieme temps, nous déterminerons si corriger une ou plusieurs anomalies dans les modèles de pathologies (in vitro, puis in vivo) est suffisant pour empêcher, retarder ou ralentir la formation des dépots fibro-adipeux. Pour toute molécule remplissant ces deux critères, la correction (deuxième étape) est susceptible d’améliorer les symptomes musculaires chez les patients, et de maintenir les muscles dans un état leur perméttant de bénéficier de thérapies innovantes favorisant la formation de nouvelles fibres saines et fonctionnelles.

Procédures

Le projet comporte 3 procédures, impliquant de 2 à 4 étapes. La procédure de lésion par injection intramusculaire (concerne toutes les souris) est une chirurgie faite sous anésthésie générale, et permettant une injection intramusculaire ciblée d'un composé myotoxique. Elle dure environ une heure, et ne sera effectuée qu'une seule fois pour chaque animal, sur tous les animaux impliqués dans le projet. Etapes ne concernent que des sous-groupes d'animaux. - injection en IP de Tamoxifen (modèles inductibles), une à 5 injection par animal, une fois tous les 2 jours (ou une seule injection lorsque pratiquée à P1). - suivi longitudinal par imagerie non invasive (étape sous anesthésie, procédure 3, répétée 3 à 5 fois pour chaque animal), - Mise à mort par surdose d’anesthésique suivi d’une perfusion intracardiaque de PFA : procédure sans réveil faite sous anesthésie profonde, une seule fois par animal. Gestes visant à réduire la souffrance : Anesthésie (injection IP), injection sous-cutanée d’antalgiques ou d’anesthésie locale. Ces gestes sont pratiqués en préparation de la chirurgie/Lésion, ainsi qu’avant la procédure de mise à mort par perfusion.

Impact sur les animaux

L’injection dans le muscle de composés myotoxiques induit une blessure limitée dans le temps et restreinte au seul muscle injecté. Pendant 3-4 jours, une inflammation (nécessaire pour la cicatrisation) se produit au niveau du site d’injection, puis s'estompe d'elle même. L'expérience a un impact limité sur les conditions de vie de la souris, même lorsque les modifications génétiques étudiées compromettent l'efficacité de la réparation. Dès le lendemain, les souris ont récupéré une activité/locomotion normales. Le fait d'utiliser des modèles génétiques dits « inductibles » (déclenchement par le Tamoxifen) evite que les effets des modifications étudiées commencent avant le demarrage de la procédure expérimentale. Toutes les lignées nécessaires au projet sont élevées dans notre animalerie, et les cohortes expérimentales sont produites par croisements. Les lignées utilisées ne présentent aucun phénotype dommageable lorsque maintenues séparément. Lorsque ces lignées sont combinées : 1) les lignées utilisées pour visualiser les cellules mutantes (grace à un marquage par une protéine fluorescente) ou pour rendre les cellules modifiables par les adenovirus, n’ont pas d’effets dommageables car les protéines introduites n’ont pas de cibles naturelles chez la souris. 2) L’utilisation des systemes inductibles par le Tamoxiden permet que la modification génétique désirée ne commence qu’au démarrage de l’expérience. Il n'y a donc ni douleur ni souffrance avant la procédure expérimentale. L’expérience est terminée en maximum 3 semaines (les douleurs locales étant limitées aux 3 premiers jours), et est écourtée en cas de problemes inattendus. Nous n’attendons pas d’anomalies majeures ailleurs que dans le muscle. 3) Certaines souris utilisées présentent de légères anomalies de forme de certains muscles, non-dommageables car les muscles affectés ne sont pas vitaux (le diaphragme n’est pas touché). Ces souris ont une durée de vie normale, et ne présentent aucun signe de souffrance. 4) Le modèle de souris FSHD a été choisi pour son caractère inductible, limitant la toxicité de la proteine DUX4 (agent causal de la FSHD), à la durée de l’expérience. Même le Tamoxifen devait déclencher dans ces souris des anomalies en dehors du muscle, cela se produira dans le temps de l’expérience, et nous veillerons à écouter le suivi longitudinal si nécessaire, et les expériences effectuées pourraient (de par leur objectif) identifier un moyen de diminuer ces anomalies.

Devenir

La procédure se termine par une mise à mort des animaux visant à prélever les tissus (muscle lésé, ainsi que certains organes supplémentaires). Ces tissus sont soit fixés pour de l'histologie, soit dissociés afin de mettre les cellules en culture. En conséquence tous les animaux utilisés pour ce projet sont mis à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

1) Afin d'éviter des expériences inutiles chez l'animal, nous commençons par exploiter des données publiques déjà disponibles (analyses déjà publiées de biopsies de patients ou de modèles « souris ») pour identifier des mecanismes potentiellement responsables du remplacement de la masse musculaire par des dépots fibro-adipeux dans les pathologies musculaires. 2) Le projet implique une étape basée sur des cultures de cellules isolées à partir de souris. Afin de limiter au maximum l’étape d’isolement à partir de souris, nous développons une méthode alternative utilisant des cellules « souches » humaines (lignées déja établies par d'autres laboratoires), dont le caractère « souche » permet une utilisation répétée/prolongée. En mimant in vitro les étapes du développement du muscle, nous induirons la formation de « mini-mucles » reproduisant autant que possible le contexte physiologique. Une fois optimisée, cette approche sera une alternative efficace pour remplacer les cellules de souris et pour toutes les études-pilotes concernants la compréhension des mécanismes en jeu. 3) Une fois que nous aurons identifié in vitro des molécules susceptibles d’être responsables de l’apparition des dépots fibro-adipeux dans les muscles malades, et que nous aurons montré avec succès que contrer leur action a un effet thérapeutique, il sera néanmoins nécessaire de valider ces résultats in vivo, en passant par un modèle animal. En effet, les modèles in vitro (cellules de souris ou mini-muscles humains), aussi puissants soient ils, ne reproduisent pas l’ensemble des événements mis en jeu dans la réparation musculaire normale ou pathologique. Il est difficile par exemple de reproduire le contexte de la blessure, de l’inflammation, de l’irrigation sanguine, et l’influence du métabolisme des individus malades. Ainsi, un mécanisme efficace in vitro pourrait s’avérer inefficace chez l’animal ou chez l’homme. Il est donc indispensable de déterminer, parmi les approches validées in vitro, lesquelles sont les plus susceptibles d’être efficaces chez l’homme en passant par une étape en modèle animal. Cette validation ne portera cependant que sur des cas pour lesquels nous aurons obtenu une preuve de principe in vitro, limitant largement l’ordre de grandeur des tests in vivo.

Réduction

1) La manière dont nous procédons pour l’histologie (partie 1) permet qu’un même échantillon soit réutilisé pour plusieurs analyses, réduisant ainsi le nombre d'animaux. En effet les tissus prélevés (muscles) sont divisés en plusieurs fragments congelés/stockés séparéments. Sur chaque fragment de tissus, nous réalisons des coupes alternées sur plusieurs séries de lames histologiques. Nous réalisons une base de données permettant l’optimisation de l’utilisation de ces échantillons/lames. Ainsi, un seul muscle d’un seul animal peut servir à des dizaines de tests différents. Une seule cohorte d’animaux (comprenants les souris étudiées et les controles adequats) suffit pour réaliser l’ensemble de l’étude pour un stade donné d’analyse. Les nombres d’animaux dans chaque cohorte (5-10 souris par lot (incluant males et femelles)) sont nécessaires pour l’obtention de résultats statistiquement robustes (tests statistiques considérés significatifs si p

Raffinement

1) Les souris sont hébergées en cages ventilées, avec enrichissement (dôme ou rouleau de carton + baton de papier ou carré de coton pour nidification). Elles sont suivies quotidiennement pour vérifier la nouriture et l'eau, ainsi que leur état de santé et leur bien être. 2) Pour la chirurgie, les souris sont anesthésiées par injection intra-péritonéale. Au préalable, elles recoivent des prémédications visant un effet antalgique (30 minutes avant l'anesthésie) at une anesthésie locale. La peau au niveau de la zone à opérer est rasée et aseptisée par application de solution antiseptique. 3) Nous avons défini des points limites nécessitant interruption anticipée d'une procédure: Une perte de poids dépassant 20% par rapport au poids de reference (poids à l'entrée dans la procédure) est considérée comme limite au dela de laquelle l'expérience est interrompue et l'animal est euthanasié. Par ailleurs, comme un des produits utilisés peut, dans de rares cas, liés au lot ou à la préparation, s’avérer toxique et déclencher une inflammation dans le foie, nous surveillerons le poid des animaux après injection, et fixons à 15% de perte par rapport au poids initiale la limite au dela de laquelle ces effets secondaires sont susceptibles d’interférer avec l’expérience. Dans ce cas, les animaux seront exclus de la cohorte et mis à mort. D'autres parametres d'exclusion sont: pelage hérissé; infection de la cicatrice; immobilité et indifférence à l'environnement, tremblements. 4) Nous utiliserons des tests statistiques adequats pour les comparaisons entre cohortes d’animaux (cohortes test et controles appropriés, males/femelles, differentes approches) avec 5 à 10 souris par cohorte et par stade d’analyse.

Choix des espèces

La souris est un modèle particulièrement adapté à l'étude de la regeneration du muscle. La dynamique du processus est bien connue suite à différents modèles de lésions (cardiotoxine, brulure au froid, glycerol, barium, ces modèles différant légèrement les uns des autres). La regeneration est rapide, et complete en 3 semaines, sans séquelles dans des souris sauvages. La souris permet l'utilisation de modèles génétiquement modifiés élaborés de telle sorte qu'il soit possible de definir précisément le type cellulaire dans lequel un gène est modifié et le moment à partir duquel cette modification est déclenchée. Ceci permet de limiter le dommage au seul organe/tissus considéré. L'utilisation des modèles génétiquements modifiés ainsi que des vecteurs adénoviraux permet d'explorer les mécanismes génétiques et de tester l'effet de nouvelles modifications génétiques, et d'evaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Aucun modèle cellulaire/ex-vivo humain ne reconstitue l’environnement du muscle suffisamment pour valider la pertinence in vivo d'un mécanisme ou d'une option thérapeutique. Stades d’utilisation : 1) L’Induction par le Tamoxifen (modèles inductibles) est faite soit 1 jour après la naissance (P1), soit au stade adulte, un peu avant et juste après la lésion. Pour obtenir une meilleure efficacité de recombinaison, il est justifié d'acriver la CRE au moment coincidant à un pic d'expression (nombre de cellules et intensité) de la lignée CRE utilisée, basée sur le territoire d’expression du gène PDGFRA. PDGFRA est fortement exprimé pendant la première semaine après la naissance. Chez l’adulte, PDGFRA est produit par les FAPs, mais ces derniers sont « dormants », et en faible nombre. La lésion provoque une augmentation de l’intensité d’expression, et active fortement la multiplication des FAPs. En conséquence, le meilleur moment pour activer la lignée avec le Tamoxifen est juste au moment de la lésion. 2) injection intra-musculaire (lésion/Adenovirus) : Souris Adultes (3 à 6 mois). 3) Suivi longitudinal de la lésion (par imagerie bioluminescence), à 3, 5, 7, 14 et 21 jours après lésions, pour suivre l'évolution de la régénération musculaire dans une fenetre correspondant aux résultats de la litérature, et pour évaluer l'impact des conditions expérimentales sur l'apparition d'infiltrations fibro-adipeuses. 4) mise à mort (à l’issue du suivi longitudinal ou à un stage post-lésion donné (à 3, 5, 7, 14 et 21 jours après lésions

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien de tamoxifène pendant cinq à quinze jours, dont le porteur reconnaît le risque de perforation de l'œsophage ou de passage dans les poumons, subissent un test d'effort sur tapis roulant une heure par jour et un séjour de sept jours en cage métabolique isolée. À la fin, les 650 sont tuées pour prélever leurs organes. Le projet étudie le rôle de deux facteurs de transcription dans la croissance musculaire, le porteur affirmant qu'aucun modèle cellulaire ne peut reproduire ce processus.

Objectifs

Le muscle squelettique est un tissu hautement spécialisé capable de se régénérer et de s’adapter à son environnement. La mécanotransduction se définit par la façon dont la cellule intègre le signal mécanique et le transforme en signal biochimique lui permettant de réagir, de s’adapter et même de modifier l’expression de ses gènes. Nous nous intéressons à 2 facteurs de transcription qui ont récemment été identifiés pour jouer un rôle clef dans la mécanotransduction dans divers tissus dont le muscle squelettique. De récentes données, montrent que ces 2 facteurs sont importants pour maintenir le bon fonctionnement du muscle squelettique adulte et la taille des organes car leur dérégulation peut conduire à un phénotype musculaire retrouvées dans différentes pathologies musculaires telles que les dystrophies musculaires. Notre objectif est de mettre en place pour la première fois des modèles de souris porteurs de 2 gènes non fonctionnels spécifiquement dans le muscle.

Bénéfices attendus

A terme ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à des désordres de croissance, de régénération et de respiration mitochondriale dans le muscle. Il permettra d’identifier de nouveaux biomarqueurs potentiellement impliqués dans d’autres pathologies musculaires et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Des souris seront soumises à des injections par gavage quotidiennement durant 5-15 jours pour induire l'inactivation de gènes spécifiques et seront ensuite mises à mort pour examen des tissus. Des souris seront soumises à un test d'effort musculaire à l'aide d'un tapis de course informatisé pendant 1H sur une période de 5 jours consécutifs pour évaluer les fonctions métaboliques dans le tissu musculaire. Des souris seront placées en cage métaboliques pendant 7 jours.

Impact sur les animaux

Certaines souris pourraient dévéloppées des problèmes de locomotion. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’oesophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. La mise en cages métaboliques des animaux pendant 7 jours peut générer un stress lié à l’isolement.

Devenir

A l'issue des Procédures, l'ensemble des 650 animaux seront mis à mort afin de collecter les organes postmortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

La croissance et régénération musculaire est un processus biologique complexe où de nombreux types cellulaires communiquent entre eux en 3 dimensions, aucun modèle cellulaire ne peut mimer à ce jour ces processus. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer les altérations moléculaires à la base des maladies et les interactions avec les différents organes, le système immunitaire et les régulations hormonales. Les modèles in vivo permettent d’envisager des essais précliniques. Tous les gènes concernés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction. La souris est le modèle de choix pour introduire des mutations dans le génome des mammifères. Nous remplacerons dès que possible les expériences animales par des expériences in vitro.

Réduction

L'analyse de paramètres multiples par souris et l'utilisation de tests statistiques adaptés permettront de réduire le nombre de souris utilisées à son minimum. De plus, l’expérience du laboratoire montre qu’un groupe de 50 animaux est suffisant pour le test statistique choisi. Des groupes de 50 animaux seront donc utilisés. De plus, nous utiliserons un nombre minimal d'animaux pour avoir une puissance statistique (n= 650).

Raffinement

Le raffinement des conditions d’hébergement, d’élevage et de soins sera respecté par l’emploi de points limites précoces entraînant la mise à mort des animaux. Les souris bénéficieront d'un enrichissement constitué de coton et de « maisons » en carton. Les animaux sont observés tous les jours par le personnel qualifié pour assurer leur bien-être. Pendant les procédures, les responsables du projet tiendront une fiche d’observation des points limites tous les jours. Par ailleurs, toute procédure douloureuse ressentie par les souris entrainant une douleur, une souffrance ou une angoisse entrainera la mise à mort de l'animal. Le traitement au tamoxifen est donné sous forme de gavage quotidien qui sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des gavages sera réduit au minimum possible. Selon les seuils atteints, l’interruption de la procédure et la mise à mort anticipée de l’animal sera possible.

Choix des espèces

Voici plusieurs facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) tous les gènes de la signalisation hippo jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations dans le génome des mammifères ; 3) nous disposons également de nombreux outils (anticorps, vecteurs, méthodes) adaptés à la souris ; 4) la taille des souris, leur durée de vie, leur capacité reproductive est particulièrement adaptée à un programme de recherche de 5 ans. L’âge des animaux choisis pour l’induction au tamoxifen sera de 1 à 3 mois. Il est nécessaire que l’organogenèse soit terminée. L’âge de mise à mort sera choisi en fonction de l’âge de la survenue du phénotype musculaire attendus vers 1,5-4 mois.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées au plus tard 28 jours après la lésion pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage de tamoxifène puis, sous anesthésie, des injections de chlorure de baryum dans les muscles pour provoquer une lésion et étudier la régénération musculaire. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable majeur, tout en fixant des points limites comme la paralysie ou la nécrose de la patte qui déclenchent la mise à mort. Sur le remplacement, il indique avoir mené des études préliminaires sur des lignées cellulaires mais conclut que l'étude au sein d'un "organisme dans son ensemble" reste nécessaire.

Objectifs

Parmi les tissus des organismes vertébrés, le muscle squelettique est l’un des plus remarquables : il présente un développement et une croissance prodigieuse et possède de grandes capacités régénératrices. Ces capacités de croissance et de régénération font de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, dont les plus étudiées à ce jour sont les cellules satellites qui, comme leur nom l’indique, se localisent en périphérie des fibres musculaires. Ces cellules sont mises en place au cours du développement. Le développement et le maintien de ces cellules par cet environnement est crucial à l’équilibre et à la régénération musculaire et déterminé par les gènes Hira, Pax3 et Pax7. Nous souhaitons étudier la fonction spécifique de chacun de ces gènes dans les cellules satellites pendant la régénération musculaire. Dans un but de suivre le principe des 3R et de réduire et remplacer l’utilisation excessive d’animaux impliqués dans les expériences in vivo, nous avons établi des lignées cellulaires dérivées de muscles pour les expériences préliminaires. Nous avons caractérisé et étudié ces lignées in vitro pour cibler les expériences les plus pertinentes à développer chez la souris pour la validation in vivo. Les deux procédures principales visent à analyser et caractériser les fonctions d’Hira, Pax3 et Pax7 au cours de la régénération musculaire. Pour essayer de minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après la procédure d’induction de la régénération musculaire. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux qui peuvent présenter une mobilité réduite pendant cette période. Notre étude fera appel à un maximum de 400 souris au total reparties sur 2 procédures expérimentales.

Bénéfices attendus

Il a été récemment montré que l’absence de la protéine Hira dans les cellules souches musculaires adultes (cellules progénitrices, caractérisées par expression du gène Pax7) a pour conséquence une inhibition de la régénération musculaire. De plus, il a été démontré que Hira est un facteur clé pour garder l’identité myogénique des cellules satellites pendant la régénération du muscle. Ce projet permettra de comprendre si cette cascade régulatrice est spécifique des cellules satellites ou bien à un rôle général dans le maintien de l’identité cellulaire d’autres types cellulaires composant du muscle squelettique nous proposons de développer ce projet.

Procédures

Pour la procédure 1, 240 de la totalité des animaux (400) seront soumis au gavage de tamoxifène 2 fois avec un intervalle d’une semaine. Le geste de gavage ne prend que quelques secondes. Pour la procédure 2, 300 de la totalité des animaux (400) seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%, maintien 2%) et soumises à des injections de BaCl2 dans les muscles. L’intervention sera faite une seul fois par souris et la durée de l’intervention est de 10 minutes (après endormissement des animaux). Les 100 autres animaux seront analysés en homéostasie, donc non-soumis à des injections.

Impact sur les animaux

Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur dans le contexte des génotypes utilisés, du traitement de tamoxifène par gavage ou de la lésion musculaires. Les animaux des differents génotypes sont comparables en termes de comportement/activité motrice spontanée et de poids corporel. Les génotypes des animaux utilisés ne sont pas délétères ou indésirables. Donc, à ce jour, nous ne nous attendons pas à un phénotype associé à ces procédures.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort au plus tard 28 jours post-lésion intramusculaire pour prélèvement des tissues nécessaires à l’analyse.

Remplacement

Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et l’interaction entre de nombreux types cellulaires. Pour éviter au maximum l’usage d’animaux dans l’étude et être confiant de la réussite de notre projet in vivo, nous avons fait des études préliminaires sur des lignées cellulaires musculaires avant de passer aux expériences sur les animaux. De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication est nécessaire et ne peut être substituée qu’en partie par l’in vitro. Par conséquence, la culture cellulaire restera une technique que nous utiliserons au cours de ce projet pour des tests préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.

Réduction

Dans un but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 10 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires. Ce nombre de souris n’a pas été calculé avec des méthodes de statistique mais basé sur notre expérience sur l’obtention de matériel biologique pour chaque technique.

Raffinement

Pour minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire. En préalable à l’injection, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%; maintien 2%). L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et profonde afin de permettre la réalisation de la procédure dans un temps relativement court et assurer un réveil rapide. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Pendant toute la procédure, les cages sont visuellement inspectées chaque jour donc tout animal présentant les points limites sera mis à mort (lordose, tremblements, prostration, paralysie, difficulté de locomotion, nécrose de la patte, perte de poids).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. Les approches de transgénèse et recombinaison homologue nécessaires à l’étude de mécanismes moléculaires de processus biologiques sont facilement réalisables. La recombinaison homologue permet de modifier de manière efficace et contrôlée le locus des gènes murins. Ce modèle étant couramment utilisé, de nombreuses lignées transgéniques, notamment lignages spécifiques, sont aujourd’hui disponibles à toute la communauté. Des lignées pures et génétiquement caractérisées sont disponibles pour ce modèle. La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée de nos expériences. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 8 semaines, date à laquelle le muscle adulte est complètement formé. L’administration de tamoxifène par gavage sera faite à tous les animaux de l’étude qui presente l’allèle CreErt2. La tamoxifène va permettre l’induction de la recombinase Cre dans des lignées floxées au stade d’expression du promoteur contrôlant l’expression de la recombinase dans chaque lignée. Apres l’administration de tamoxifène par gavage, les animaux seront analysés pour l’étude de la régénération musculaire.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris normales ou myopathes, elles subissent une blessure musculaire aiguë et des injections sous-cutanées, intrapéritonéales puis intramusculaires, avant le prélèvement du tissu musculaire. Le porteur reconnaît que le cumul des actes induit un stress et une douleur transitoire. Il indique tester in vivo une molécule anti-inflammatoire déjà jugée bénéfique in vitro, censée à terme accélérer la régénération du muscle.

Objectifs

Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Ce processus, habituellement efficace, peut être compromis dans certaines conditions (maladies métaboliques, vieillissement, myopathies). Les mécanismes cellulaires qui contrôlent la régénération musculaire sont bien connus, mais les effecteurs moléculaires sont encore peu nombreux à avoir été identifiés. Des travaux précédents ont montré qu'une molécule joue un rôle important au cours de la régénération musculaire en contrôlant les cellules de l'immunité (en stimulant les cellules souches musculaires qui permettent la régénération des fibres musculaires). Ces résultats ont été montrés grâce à une stratégie d'inhibition. L'objectif de l'étude est de réaliser une approche gain de fonction, en ajoutant la molécule dans le muscle au cours de la régénération musculaire. Le projet se base sur des travaux in vitro montrant un rôle bénéfique de la molécule. Le projet prévoit l'utilisation de souris normales qui subissent une blessure musculaire aigue, et des souris myopathes, qui présentent une régénération musculaire permanente. A terme, l'utilisation de cette molécule pourrait être envisagée pour un traitement permettant d'accélérer le processus de régénération musculaire.

Bénéfices attendus

Le processus de régénération musculaire, bien qu'habituellement très efficace, peut être ralenti ou empêché dans différentes conditions (maladies métaboliques, vieillissement, myopathies, etc). La connaissance des déterminants moléculaires du processus de régénération pourrait ouvrir des voies thérapeutiques afin d'aider ce processus en cas de défaillance. L'ajout de la molécule pourrait être bénéfique pour le muscle. Le projet vise à valider cette hypothèse in vivo, après que des expériences in vitro ont montré son bénéfice.

Procédures

Les souris subiront des injections de faible volume en sous cutanée (1 maximum) ; en intraperitoneal (5 au maximum), puis 3 semaines plus tard, des injections intramusculaires (4 au maximum). La durée de ces injections est d'environ 10 secondes (contention totale 30 secondes).

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections ip, injections im, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress et une douleur transitoire. Les données de la littérature ne rapportent pas d’effets indésirables des différentes substances injectées.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en vue de de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques et cellulaires.

Remplacement

Cette étude arrive à la fin d'une série d'analyses qui a montré in vitro les effets bénéfiques de la molécule anti-inflammatoire sur les cellules de l'inflammation et des vaisseaux. L'analyse finale nécessite de valider le rôle bénéfique de cette molécule au sein de l'organe, et de l'organisme entier, donc in vivo, de façon intégrée.

Réduction

L'expérience du laboratoire permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour les analyses. Le nombre de souris est diminué par deux car les deux pattes des animaux sont utilisées. Les analyses sont réalisées de manière séquentielle, sur des petits groupes d'animaux, ce qui permet d'ajuster les points d’étude et de réduire potentiellement le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Après chaque injection intramusculaire, les animaux font l'objet d'une surveillance accrue le jour même et le lendemain, afin de vérifier l'absence d'évènement indésirable au site d'injection, et plus généralement sur le comportement de l'animal. Un traitement antalgique est administré après induction de la lésion musculaire. Des points limites définis permettent d’éviter toute souffrance chez les animaux

Choix des espèces

Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme . Les animaux sont utilisés entre 10 et 12 semaines, à l'âge adulte.

168 souris âgées de 20 à 24 mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant dix-huit semaines, chaque souris reçoit deux injections sous-cutanées par semaine, des prélèvements sanguins et des mesures répétées d'électroneuromyogramme et d'impédancemétrie, pour tester une molécule contre la fonte musculaire liée à l'âge. Le porteur indique des indurations possibles aux points d'injection et une perte de poids liée à l'âge ou à des tumeurs. Il affirme que le test de force ne peut se reproduire sur modèle cellulaire et que le recours à l'animal est un "prérequis réglementaire", les retombées visant les personnes âgées.

Objectifs

Au cours du vieillissement, la masse et la fonction musculaires diminuent progressivement de façon involontaire. Lorsque la perte musculaire est excessive, elle peut conduire à une pathologie : la sarcopénie (forme d' atrophie musculaire liée au vieillissement). La sarcopénie est à l'origine d'une détérioration générale de la condition physique qui se traduit par un risque accru de chutes, des problèmes moteurs et une perte d'autonomie progressive. Elle conduit inévitablement à une augmentation du taux de morbidité et de mortalité. Il n'existe actuellement aucun traitement pharmacologique de cette pathologie. Les évènements biologiques contrôlés par le GDF5 (Growth Differentiation Factor 5) sont connus pour être activés dans certaines conditions conduisant à une atrophie musculaire (écrasement du nerf par exemple): leur activation permet de contrer les effets de la fonte musculaire. Dans le cas du vieillissement, il a été montré que l'expression de GDF5 diminue dans les muscles, et que la sur-expression locale de la protéine recombinante rGDF5 dans un muscle de souris âgée augmente la masse musculaire. Des études de preuve de concept réalisées à une concentration unique de rGDF5 ont permis de mettre en évidence une amélioration du poids et de la force musculaire chez des souris âgées, ce qui permet d'envisager une transposition clinique de cette molécule chez des patients atteints de sarcopénie. Dans cette optique, ce projet aura pour but de définir la dose minimale efficace de rGDF5 nécessaire pour améliorer le poids et la force musculaire dans un modèle murin de souris âgées.

Bénéfices attendus

A court terme, les effets bénéfiques du traitement chez les souris devraient consister en une stabilisation ou une augmentation du poids des muscles, une amélioration de la composition corporelle (ratio masse grasse/masse maigre), de la communication nerf-muscle (mesurée par un test de l'activité électrique transmise du nerf au muscle) et de la force globale et spécifique des muscles, ainsi qu'une amélioration de la survie à 24 mois. Ce projet de développement non clinique devrait permettre de déterminer la dose minimale efficace de la molécule thérapeutique rGDF5 afin d'envisager dans un second temps une transposition en clinique chez le sujet âgé. Plus de 25% des personnes âgées de plus de 70 ans étant affectées par la sarcopénie, le bénéfice en termes de santé, et par voie de conséquence en termes de financement des soins liés à cette pathologie, est potentiellement très important.

Procédures

Les souris subiront deux injections sous-cutanées par semaine pendant une durée de 18 semaines. Chaque injection dure environ 1 minute. Des prélèvements de sang seront réalisés à 4 points de temps: au moment de l’inclusion des souris, puis 15 jours et un mois après l’administration, et en fin de protocole. Chaque acte ne durera pas plus de 2 minutes. Les souris subiront 3 mesures d'électroneuromyogramme espacées chacune de 2 mois. Chaque mesure ne prendra pas plus de 20 minutes. Les souris subiront 5 mesures d'impédencemétrie, espacées chacune de 1 mois. Chaque mesure ne prendra pas plus de 20 minutes. Les souris subiront une mesure de force musculaire juste avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les souris seront euthanasiées en fin de mesure de force musculaire et les organes prélevés pour analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souris âgées de 20 à 24 mois qui peuvent présenter une perte de poids possible due à l'âge ou développer des tumeurs. L'injection de protéine rGDF5 par voie sous-cutanée deux fois par semaine pourrait entrainer la formation d'indurations aux points d'injection.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements des organes et évaluation de l'efficacité du traitement.

Remplacement

Le projet a pour but de mesurer l'effet thérapeutique de la molécule rGDF5 au niveau de la musculature dans un modèle de vieillissement, notamment par des mesures de force musculaire: le test de force ne peut pas être reproduit dans des modèles cellulaires car il n'existe pas de modèle cellulaire ou d'organoides pouvant reproduire le nerf, la jonction neuromusculaire et le muscle dans toute leur complexité. De plus, le recours à l'animal est un prérequis réglementaire pour les études d'efficacité non-cliniques. L'utilisation d'animaux ne peut donc pas être remplacée dans notre projet.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction du nombre d'animaux, nos prévisions d'effectifs sont basées sur des calculs de statistiques prédictives visant à observer une augmentation de la force musculaire de 14% minimum. Le calcul permet de conclure que 8 animaux sont nécessaires par groupe. Considérant l'expérience de nos collaborateurs, une mortalité élevée de 35% en moyenne a été observée chez les souris entre l'âge de 20 et de 24 mois: pour cette raison, l'effectif a été majoré, soit 8 animaux + 4 animaux supplémentaires = 12 animaux par groupe de souris par condition afin de permettre une analyse statistique fiable et d'éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo n'empêche la bonne exploitation des résultats.

Raffinement

Les souris étant des animaux sociaux, aucun animal ne sera isolé dans une cage, sauf si des traitements spécifiques s'avéraient nécessaires. Les animaux étant âgés, ils seront observés attentivement 2 fois par semaine. Tous les tests fonctionnels seront réalisés dans une pièce dédiée isolée du lieu d'hébergement, dans un environnement calme. Les grip tests ne sont pas source de stress pour l'animal, qui s'agrippe naturellement à la grille. Pour l'ENMG ou la mesure de la force sur le TA, afin d'éviter les douleurs éventuellement créées par la stimulation électrique, une prémédication par un antalgique fort sera administrée par voie sous-cutanée. La procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse pour l'ENMG et sous anesthésie générale pour la mesure de force sur le TA. La mesure d'impédencemétrie n'est pas douloureuse (courant de très faible intensité), mais les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse pour permettre le placement des électrodes et les mesures. Au cours des différentes procédures, les souris seront placées sur une plaque chauffante afin de maintenir la température de leurs corps A l'exception du test de mesure de force sur le TA qui est terminal, en fin de procédure, les animaux seront remis dans une cage et surveillés jusqu'à leur réveil. Après l'ENMG, ils recevront par voie sous-cutanée un antalgique fort toutes les 12h pendant 48h. Ils seront ensuite surveillés très attentivement et pesés deux fois par semaine pendant tout le protocole afin de relever le moindre signe de souffrance. Les prélèvements de sang se feront par voie sous-mandibulaire durant le protocole et par voie rétro-orbitale au moment de l’euthanasie. Dans le cas du prélèvement sous-mandibulaire, l’animal sera maintenu par contention, des lancettes à usage unique seront utilisées puis une compresse sera appliquée quelques secondes au point de prélèvement pour stopper le saignement. Les souris seront surveillées individuellement après les prélèvements pour s’assurer que le saignement ne reprend pas, et un nouveau point de compression sera réalisé le cas échéant. Dans le cas du prélèvement rétro-orbital, le sang sera prélevé à l’aide d’un capillaire sur animal anesthésié par la voie générale, puis la souris sera euthanasiée. Les actes seront rapides (moins d’une minute).

Choix des espèces

Les souris reproduisent bien les caractéristiques des maladies neuromusculaires, notamment la sarcopénie liée au vieillissement, et sont les modèles les plus couramment utilisés par la communauté scientifique du domaine pour estimer l'efficacité d'approches thérapeutiques sur ces pathologies. De plus, ce modèle permet une évaluation fonctionnelle très complète à de multiples niveaux, comme mis en évidence lors de sa caractérisation (Grip test, mesure de force sur TA in situ, impédencemétrie, ENMG). Les souris C57BL/6 seront des adultes âgées de 20 mois en début de protocole et de 24 mois en fin de protocole afin que la sarcopénie soit à un stade avancé. Ces âges ont préalablement été définis par nos collaborateurs lors de la preuve de concept de l'efficacité de rGDF5. La caractérisation du modèle à donc également été réalisée à ces âges.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, elles reçoivent une injection de chlorure de baryum dans les muscles de la patte pour provoquer une lésion, après un gavage de dioxine, afin d'étudier l'effet de ce polluant sur la régénération musculaire. Le porteur reconnaît qu'une paralysie ou une nécrose de la patte reste possible, et prévoit la mise à mort au plus tard vingt-huit jours après la lésion. Il indique que l'étude d'interactions cellulaires dans l'organisme entier ne peut être qu'en partie remplacée par la culture in vitro.

Objectifs

Parmi les tissus des organismes vertébrés, le muscle squelettique est l’un des plus remarquables parce qu’il possède de grandes capacités régénératrices, ce qui font de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, dont les plus étudiées à ce jour sont les cellules satellites qui, comme leur nom l’indique, se localisent en périphérie des fibres musculaires. La dioxine, un polluant organique et hautement toxique, a un impact sur les cellules souches du muscle squelettique et il a été démontré qu’il existe une différence de réponse face à la pollution au sein des sous-populations de cellules souches du muscle. Une partie d’entre elles semblent résistantes à la pollution et présentent un mécanisme de résistance unique, tandis que la majorité des cellules satellites y sont sensibles. Ceci interroge désormais sur le rôle respectif de ces deux sous-populations quant à la réparation du muscle squelettique dans un contexte de pollution. Comme la pollution est un facteur de risque important pour la santé humaine nous proposons avec ce projet et sur la base de nos résultats, de décrypter les réponses cellulaires et moléculaires spécifiques de chacune de ces deux souspopulations au cours de la régénération musculaire après une exposition à la pollution. Alerter sur les effets de la pollution dans un système biologique tel que le système musculaire permettra de comprendre quel stress cellulaire peut engendrer la pollution. Dans notre étude, nous utiliserons des modèles murins qui subiront une exposition à la dioxine ou à une molécule contrôle. Une partie des souris sera, dans un deuxième temps, soumise à une blessure musculaire. Nous pourrons ainsi étudier l’impact de la pollution par dioxine sur les cellules souches musculaires notamment au cours du processus de la régénération musculaire.

Bénéfices attendus

Comme notre projet s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et l’interaction entre de nombreux types cellulaires nous ne pouvons pas mettre en place une méthode alternative au vivant. Dans un but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation excessif d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 15 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires. Pour essayer de minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Notre étude fera appel à un total de 480 souris sur une procédure expérimentale.

Procédures

Pour le déroulement de ce projet les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%; maintien 2%) et soumises à des injections de BaCl2 dans les muscles TA et BCPS. L’intervention sera faite une seul fois par souris et la durée de l’intervention est de 10 minutes (après endormissement des animaux).

Impact sur les animaux

Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur dans le contexte du traitement de TCDD par gavage. Les animaux gavés avec TCDD ou contrôle nonane sont comparables en termes de comportement/activité motrice spontanée et de poids corporel. Les génotypes des animaux utilisés ne sont pas délétères ou indésirables. L’induction de la régénération musculaire peut entrainer des contraintes au niveau du mouvement de la patte pendant quelques heures. Dans notre expérience nous n’avons jamais observé de complications majeures liés à la régénération musculaire mais nous ne pouvons pas négliger la possibilité qu’une éventuelle paralysie ou nécrose de la patte puisse se manifester.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyse au plus tard 28 jours post-lésion intramusculaire.

Remplacement

Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et/ou l’interaction entre de nombreux types cellulaires/tissus. De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication est nécessaire et ne peut être substituée qu’en partie par l’in vitro. Pour éviter au maximum l’usage d’animaux dans l’étude et être confiant de la réussite de notre projet in vivo, nous avons fait des études préliminaires sur des lignées cellulaires musculaires avant de passer aux expériences sur les animaux. De plus, la culture cellulaire restera une technique que nous utiliserons au cours de ce projet pour des testes préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.

Réduction

Dans un but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 15 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires. Ce nombre de souris n’a pas été calculé avec des méthodes de statistique mais basé sur notre expérience sur l’obtention de matériel biologique pour chaque technique.

Raffinement

Pour minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire. En préalable à l’injection, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%; maintien 2%). L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et profonde afin de permettre la réalisation de la procédure dans un temps relativement court et assurer un réveil rapide. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Pendant toute la procédure, les cages sont visuellement inspectées chaque jour donc tout animal présentant les points limites sera mis à mort (lordose, tremblements, prostration, paralysie, difficulté de locomotion, nécrose de la patte, perte de poids).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. Les approches de transgénèse et recombinaison homologue nécessaires à l’étude de mécanismes moléculaires de processus biologiques sont facilement réalisables. La recombinaison homologue permet de modifier de manière efficace et contrôlée le locus des gènes murins. Ce modèle étant couramment utilisé, de nombreuses lignées transgéniques, notamment lignages spécifiques, sont aujourd’hui disponibles à toute la communauté. Des lignées pures et génétiquement caractérisées sont disponibles pour ce modèle. La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée de nos expériences. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 6 semaines, date à laquelle le muscle adulte est complètement formé et les cellules satellites sont en quiescence. L’administration de tamoxifène par gavage sera faite à tous les animaux de l’étude. La tamoxifène va permettre l’induction de la recombinase Cre dans des lignées floxées au stade d’expression du promoteur contrôlant l’expression de la recombinase dans chaque lignée. Apres l’administration de tamoxifène par gavage, les animaux seront analysés pour l’étude de l’impact de l’exposition à la TCDD et pour l’étude de la régénération musculaire.