Système immunitaire

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses d'une mutation induisant un lupus, elles sont gavées quotidiennement jusqu'à huit semaines et subissent des prélèvements sanguins réguliers, pour tester la rapamycine sur ce modèle auto-immun. Le porteur décrit un phénotype "dommageable" avec protéinurie et survie réduite à environ sept mois, et prévoit la mise à mort des animaux atteignant un score de souffrance défini. Il affirme que la complexité du système immunitaire rend son étude "impossible" par des tests in vitro.

Objectifs

Notre système immunitaire nous protège constamment vis à vis des agressions des agents pathogènes comme les virus ou les bactéries. Cependant dans certaines situations rares, le système immunitaire se dérègle et se retourne contre l’organisme, c’est ce qu’on appelle l’auto-immunité. L’hyperactivité du système immunitaire dans le lupus a vraisemblablement pour origine de multiples facteurs, même si les causes exactes restent inconnues. Toutefois, lorsqu’au sein d’une famille, plusieurs membres sont atteints, nous pouvons suspecter qu’il existe une cause génétique. Grace aux nouvelles techniques de génétiques, il est possible d'identifier des mutations dans des gènes qui codent pour des protéines, éléments essentiels au bon fonctionnement de nos cellules y compris celles du système immunitaire. Ainsi, en explorant plusieurs familles avec un lupus, une mutation prédite pathogénique a été identifiée. Mais comment savoir si c’est bien uniquement cette mutation qui est responsable du développement de la maladie et non d’autres facteurs ? Un modèle murin porteur uniquement de cette mutation a été généré et développe plusieurs symptômes d’auto-immunité. La mutation de ce gène est donc bien responsable du développement de la maladie. De plus, cette mutation altére spécifiquement un type de cellule immunitaire, les lymphocytes B. Actuellement,ce modèle murin est utilisé afin de démontrer le rôle essentiel de la protéine codée par le gène identifié dans les lymphocytes B et pour comprendre comment la mutation de ce gène peut induire le lupus. Cette étude permettra de mieux comprendre un des mécanismes qui maintient le bon fonctionnement de notre système immunitaire. L'élevage de ses animaux est necessaire afin de les conserver et pour continuer à les étudier. De plus, les lymphocytes B de notre modèle ont une activation anormalement élevée de la voie mTOR. Cette voie est primordiale pour contrôler le métabolisme cellulaire. En effet, l’inhibition de cette voie avec la rapamycine, inhibiteur de mTOR, permet de réduire la prolifération des lymphocytes B. Ce projet se propose donc de tester in vivo la rapamycine chez ces souris porteuses de la mutation identifiée développant un phénotype auto-immun et d’observer si le traitement améliore les symptômes de nos animaux.

Bénéfices attendus

Le lupus systémique est une maladie rare dont les causes sont encore mal comprises. Ce projet aidera à comprendre l’implication de variants de la voie du BCR identifiés chez des patients avec un lupus dans le développement de la maladie et leurs rôles dans la pathogénèse du lupus. Les mécanismes altérés pourront être recherchés chez d’autres patients et ciblés par des interventions pharmacologiques.

Procédures

Les animaux seront gavés quotidiennement sur une période maximale de 8 semaines. Un prélevement sanguin sera réalisé toutes les 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux présentent un phénotype auto-immun, défini comme dommageable. Entre 3-5 mois, les souris ne présentent pas de phénotype particulier malgré la détection de signes biologiques auto-immun (présence d’auto-anticorps, signature interféron). A partir de 6 mois, elles ont une protéinurie dans les urines traduisant une inflammation des reins. La survie des souris est réduite à environ 7 mois. Pour la procédure de traitement in vivo à la rapamycine, les animaux vont devoir être gavées tous les jours sur une période conséquente (maximum 8 semaines) pouvant engendrée un stress chez l'animal.

Devenir

Les animaux seront mise à mort à la fin de la procédure afin d'étudier plus précicésement d'autres symptomes liés à l'auto-immunité (rein, rate, ganglion). Nous réaliserons également une analyse précise des lymphocytes B de ces souris afin d'étudier leur niveau de prolifération, activation après le traitement.

Remplacement

Nous avons déjà évalué in vitro qu'un traitement à la rapamycine permettait de baisser le niveau d'activation de la voie mTOR sur les lymphocytes B porteurs de la mutation et permettait de réduire également leurs proliférations. Toutefois, le système immunitaire est biologiquement très complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro. La principale problématique est que l’on ne connaît pas l’ensemble des paramètres de ce système. Il est donc nécessaire d'avoir recours à un modèle animal pour étudier l'efficacité d'un traitement sur le developpement d'une maladie.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été choisi afin qu'ils soient le moins élevé possible mais pour que nous puissons toutefois avoir une force statistique suffisante afin de pouvoir répondre à notre hypothèse. . Considérant une variance hypothétique de 30%, un risque d’erreur de type I (alpha) de 0.05 ainsi qu’une puissance statistique (1- beta) de 0.9, le nombre minimal d'animaux nécessaire à l’observation d’une différence significative si elle existe est de 6 (calculé par epiR package version 0.9-030).

Raffinement

Pour ce projet, nous avons défini plusieurs points limites: - biologiques (présence d'autoanticorps, d'une signature interféron positive et d'une protéinurie sévère (supérieur à 300mg/dL)) - spécifique au modèle: Les souris présentent une survie réduite à partir de 6 mois. En conséquence, , les animaux n'iront pas jusqu'à cet âge durant ce projet. - Surveillance des animaux: Nous évaluerons l’état de bien-être ou de souffrance des animaux après chaque manipulation réalisée. Si les souris présentent ces signes (auto-anticorps, signature interféron et protéinurie élevé), les souris seront mises à mort. En parallèle, un scoring permettra d’évaluer l’état de bien-être de l’animal. Un score cumulé de 3 constitue un point limite et l’animal sera mis à mort si ce point est atteint. APPARENCE DE L'ANIMAL SCORE 0 = Normal SCORE 1 = Toilettage incomplet / Pelage terne / Dos arrondi SCORE 2 = Ecoulement nez/yeux / yeux mi-clos / Amaigrissement 20% par rapport au poids initial / Lésions sévères (automutilation...) COMPORTEMENT DE L'ANIMAL SCORE 0 = Normal SCORE 1 = Isolation du groupe / Vocalisation / Hyperactivité SCORE 2 = Prostration / Immobilité / Tremblements légers SCORE 3 = Tremblements/Dyspnée/Convulsions/Coma Si la souris est visiblement en souffrance (prostration, détresse respiratoire, perte de mobilité), elle sera mise à mort par dislocation cervicale. A la fin du protocole, l'ensemble des animaux sera mis à mort. Chaque protocole se terminera par la mise à mort des souris impliquées.

Choix des espèces

Le système immunitaire est biologiquement très complexe, faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude par des tests in vitro exclusivement. La principale problématique étant que l'on ne connait pas l'ensemble des paramètres du système. De plus, l'ensemble de notre projet porte sur l'utilisation de souris transgéniques, ayant les mêmes mutations que celles rtrouvées chez les patients. Nous avons choisi d'utiliser comme modèle la souris car elle présente plusieurs avantages notamment en immunologie. Le developpement de nombreux outils de génétique (connaissance et exploitation des génomes, génération de mutants...) a permis de faciliter la génération de nouveaux modèles et offre la possibilité de travailler sur un modèle où les connaissances sur le système immunitaire sont déjà bien définies. Nous proposons de traiter les animaux à partir de 4 mois, lorsqu’ils présentent des signes biologiques relatif à l’auto-immunité (auto-anticorps, signature interféron) mais n’ont pas encore de protéinurie positive dans les urines (relatif à une dégradation des reins). Les souris présentant une survie réduite à partir de 6 mois, la procédure s'arretera à cet âge là.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une uvéite auto-immune leur est induite par injection d'une toxine et transfert de cellules immunitaires, avec un suivi par imagerie de la rétine sous anesthésie, pour évaluer le récepteur P2X7 comme cible thérapeutique. Le porteur décrit une maladie qui n'entraînerait pas de douleur perceptible, tout en prévoyant la surveillance de signes tels que prostration, abattement ou perte de poids. Il justifie l'effectif élevé par la "grande variabilité" du développement de la pathologie entre souris et affirme que les études in vitro ne permettent pas d'étudier les signes cliniques.

Objectifs

Le projet vise à induire un modèle d'uvéite, l'Uvéite Autoimmune Expérimentale (EAU) chez des souris et d'évaluer le rôle du récepteur P2X7 comme potentielle cible thérapeutique (de manière constitutive ou induite sur certains types cellulaires spécifiquement) ou traiter en empêchant soit l'activation et/ou le recrutement du système immunitaire dans l'oeil soit en induisant la mort de ces cellules immunitaires et déterminer lesquelles sont impliquées. Nous allons donc induire une EAU chez des animaux n'exprimant pas ce récepteur de manière constitutive ou de manière induite sur certains types cellulaires spécifiquement ou traiter des animaux qui développent une uvéite avec des agonistes ou antagonistes de ce récepteur afin de déterminer l'effet potentiellement bénéfique de cette cible pour inhiber la réponse immunitaire au cours de l'uvéite.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'évaluer le rôle du récepteur P2X7 comme potentielle cible thérapeutique (de manière constitutive ou induite sur certains types cellulaires spécifiquement) ou traiter en empêchant soit l'activation et/ou le recrutement du système immunitaire dans l'oeil soit en induisant la mort de ces cellules immunitaires et déterminer lesquelles sont impliquées.

Procédures

Induction de l’Uvéite Auto-immune Expérimentale (EAU) par injection d’une toxine, transfert adoptif de cellules immunitaires par injection IV et suivi de l’évolution de la maladie (EAU) par des actes non invasifs (imagerie rétinienne (fond d’œil) et OCT (tomographie en cohérence optique). Tous les prélèvements se feront suite à l’euthanasie par méthode réglementaire de l’animal. Il n’y a pas de procédure chirurgicale engagée dans ce projet.

Impact sur les animaux

Avec ce projet les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie, il n’y a donc pas de douleur attendue). L’induction de l’EAU est un phénotype qui n’entraîne pas de douleur perceptible (pas de changement du comportement de la souris). L’évolution de la maladie est surveillée par des actes non invasifs qui n’engendrent donc pas de douleur ou de détresse. Les animaux sont anesthésiés au cours de ces explorations également pour le maintien de l’animal immobile.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Les études in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude.

Réduction

Nous devons induire plusieurs expériences en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot. Certains ne développeront pas la maladie, d’autres la développeront à un stade plus avancé ou la sévérité de l’inflammation sera différente. Nous aurons donc besoin de 10 animaux par lots pour un total de 900 souris. Le nombre de 10 animaux par groupe est basé sur les résultats de nos expériences dans notre laboratoire afin de permettre la réalisation des analyses statistiques adéquates pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

La seule anesthésie mise en oeuvre sera la gazeuse à base d'un mélange dioxygène/isoflurane. Les animaux sont hébergés en groupe avec un coton pour faire un nid dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et par le personnel de l'animalerie. Les animaux auront une période d'une semaine d'acclimatation avant expérimentation. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Tous signes d’inconfort ou de détresse avant l’apparition des signes cliniques autres que ceux de l’EAU, tels que l'apparence et la position anormale : poil ébouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, couché sur le côté; comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit, changement des périodes de sommeil, réduction de la mobilité. Les critères absolus sont: État de choc, léthargie, inconscience, immobilité. Difficultés respiratoires. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées.

Choix des espèces

Les souris C57BL/6J sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour l'EAU. En outre, il est relativement simple d'examiner le système visuel et d'autres tissus chez la souris, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développée le modèle d'invalidation génique conditionnelle et le modèle de uvéité, EAU. Les animaux seront utilisés entre 2 et 4 mois, âges auquels ils sont succeptibles de développer la pathologie. Les animaux sont identifiés par bague numérotée ou tatouage. Les animaux sont génotypés par PCR après prélèvement d’un bout de leur queue.