Système immunitaire
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- Biologie du développement
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- Système urogénital
Rôle des cellules régulatrices du système immunitaire dans la maladie du greffon contre l’hôte
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
360 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont irradiées puis reçoivent par voie intraveineuse des cellules sanguines humaines déclenchant une maladie du greffon contre l'hôte, avec des injections répétées et des gavages d'antibiotiques sur trente-cinq jours. Le porteur indique que les animaux développent une perte de poids et une atteinte cutanée avec perte de poils, et qualifie de "non douloureux" les injections et les prélèvements. Il affirme que l'accès aux organes cibles est très limité chez les patients et qu'il est "indispensable" de recourir à un modèle animal.
Objectifs
La greffe de cellules souches hématopoïétiques (= cellules permettant la production de toutes les cellules sanguines) est l'une des approches thérapeutiques dans le traitement de cancer du sang après une chimiothérapie. Dans le cas d'une allogreffe (les cellules souches hématopoïétiques d'un donneur compatible), une complication majeure peut apparaître: la maladie du greffon contre l’hôte (GVH). Cette maladie est due à la réaction des cellules du donneur contre les cellules du receveur, entrainant leur destruction, les organes cibles étant essentiellement, la peau, le tube digestif et le foie. Les avancées technologiques récentes ouvrent de nouvelles perspectives pour la compréhension du rôle du système immunitaire (système de défense contre les infections) dans le développement de la GVH humaine. Ce projet a pour but de caractériser le rôle d’une population particulière de cellules du système immunitaire en étudiant leur action régulatrice potentielle sur la survenue de la GVH.
Bénéfices attendus
La détermination du rôle régulateur potentiel de cette population de cellules d'intérêt contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes pouvant freiner le développement de la GVH humaine. Les approches thérapeutiques actuelles pour prévenir la survenue d’une GVH demeurant limitées par leurs effets indésirables, nos résultats permettront d’élargir le champ thérapeutique de cette maladie.
Procédures
Afin de comprendre comment la population de cellules particulière agit sur le développement de la GVH, nous allons utiliser un modèle parfaitement décrit dans la littérature scientifique du domaine. Des souris immunodéficientes (dépourvues de système immunitaire) seront soumises à une irradiation, étape d'une durée de 5 minutes non douloureuse permettant de "faire de la place" avant l'injection des cellules sanguines humaines qui seront à l'origine du développement de la GVH. En effet, un jour après l'irradiation, les souris recevront par voie intra-veineuse (injection non douloureuse dans la veine de la queue réalisée sur souris éveillées, durant moins d'une minute par souris) les cellules sanguines humaines avec ou sans notre population cellulaire d'intérêt. Pour identifier les mécanismes par lesquels notre population cellulaire d'intérêt agit sur le contrôle de l'apparition de la GVH, nous administrerons (par injection dans l'abdomen de souris éveillées, durant moins d'une minute par souris) une molécule connue pour bloquer l'action de nos cellules d'intérêt. Cette injection non douloureuse sera répétée trois fois par semaine pendant 21 jours. Des prélèvements sanguins (au niveau de la joue, geste non douloureux réalisé sur souris éveillées durant une minute par souris) seront effectués chaque semaine sur toute la durée (35 jours) de la procédure expérimentale. Le volume sanguin prélevé est faible et compatible avec une répétition hebdomadaire. Nous évaluerons également le rôle de la flore intestinale sur l'activation de notre population d'intérêt et donc sur son rôle protecteur de la GVH. Pour cela, nous administrerons soit dans l'eau de boisson, soit par gavage (une fois par jour pendant 3 semaines, intervention durant une minute par souris) à l'aide d'une sonde adaptée, un mélange d'antibiotiques. Nous suivrons le développement de la GVH par l'apparition des signes cliniques mais également grâce à des prélèvements sanguins hebdomadaires.
Impact sur les animaux
Les souris développant une GVH vont présenter une perte de poids dans les 30 jours après le début de la procédure. Une atteinte cutanée sera également observable (poils hérissé puis perte de poils). La mise en place du modèle implique une étape d'irradiation à une dose qui ne devrait pas avoir d’effet néfaste sur le bien-être de l’animal. Nous y serons tout particulièrement vigilants avec une surveillance accrue de l’aspect des souris au courant de la première semaine. Les administrations répétées (dans l'abdomen ou gavage) pourront également avoir un impact sur le bien-être de l’animal, auquel nous serons tout particulièrement attentifs. De plus lors de l’administration (dans l’eau de boisson) d’antibiotiques, nous nous assurerons que les souris s’hydratent correctement.
Devenir
Tous les animaux de ces procédures seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure et les différents organes liés au système immunitaire ou connus pour être des organes cibles de la GVH seront prélevés pour analyse.
Remplacement
L’accessibilité aux principaux organes cibles de la GVH demeure très limitée chez les patients. L’étude des mécanismes de développement de la maladie ainsi que les évènements pouvant la réguler est très difficile chez l’homme et requiert donc l’utilisation d’un modèle animal. Nous avons néanmoins réalisé au préalable le maximum d’expériences in vitro pour démontrer qu'une population de cellules du système immunitaire très particulière est capable de réguler la prolifération et la fonction des cellules responsables de la GVH. A ce stade du projet, il est indispensable d'utiliser un modèle animal pour caractériser leur mécanisme d'action en vue d'une utilisation possible dans des essais thérapeutiques.
Réduction
Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisés au minimum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures.)
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger). Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé. Les animaux seront euthanasiés si leur état se dégrade soudainement ou si le score déterminé à partir d'une fiche d'évaluation des signes cliniques indique des signes de souffrance.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinant, car un modèle reproduisant de nombreux signes de la GVH humaine est parfaitement décrit dans la littérature. De plus nous avons une bonne connaissance des signes de souffrance chez la souris et la possibilité de les prendre en charge facilement et rapidement. Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront des souris immunodéficientes (dépourvues de système immunitaires) adultes conformément aux modalités de mise en place de ce modèle expérimental.
Tests précliniques sur des modèles de maladie du greffon contre l’hôte (GvHD)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur provoque chez des souris immunodéficientes ou au système immunitaire humanisé une réaction du greffon contre l'hôte, puis administre des composés par injection ou par gavage, pour tester des traitements au fil de cinquante études précliniques en cinq ans. Il indique que la maladie provoque une atteinte de la peau, une perte de poids, une prostration et des difficultés à se déplacer. Il affirme qu'aucun environnement in vitro ne reproduit cette pathologie et juge le modèle murin "indispensable".
Objectifs
La réaction du greffon contre l’hôte ou GvHD (Graft versus Host Disease) est un syndrome qui se développe à la suite d’une transplantation chez un patient (eg : moelle osseuse, cellules souches, organes, tissus). Les cellules immunitaires présentes dans le greffon du donneur identifient le receveur comme étranger et essayent de l’éliminer. Cela peut se manifester par des dommages au niveau de la peau, des muqueuses, du foie, du système digestif ou des poumons. La GvHD est fréquente dans les cas de transplantation allogénique (le patient receveur et le donneur diffèrent sur le plan génétique) et est associée à une forte morbidité, ainsi qu'à une forte mortalité. Le traitement standard de la GvHD est constitué de glucocorticoïdes (prednisone). Ces traitements ont des effets immunosuppresseurs pouvant être accompagnés d’importants effets secondaires. Par exemple, ils augmentent les risques d’infections et de cancers. Pour ce projet, la GvHD sera induite chez des souris immunodéficientes ou ayant un système immunitaire humanisé afin de mettre à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier cette pathologie et de développer des traitements potentiels.
Bénéfices attendus
En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier cette pathologie et de conduire des tests précliniques davantage prédictifs des effets qu'auront les candidats médicaments sur son utilisateur final : l'Homme.
Procédures
Injection intraveineuse ou intrapéritonéale des cellules mononucléaires d'une durée de 10 à 15 secondes. Prélèvements sanguins: la fréquence et les volumes d'administration seront déterminés sur base du poids de la souris. A titre d’exemple, le volume maximum prélevé sera de 100 μL par semaine pour une souris de 25 gr. La durée des prélèvements est de 10 à 15 secondes. L’administration de composés de recherche : réalisée par voie entérale (gavage, incorporation dans l’alimentation) ou parentérale (veineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intra-musculaire). Les volumes à administrer seront préétablis par le vétérinaire d’établissement et le comité de bien-être. A titre d’exemple, pour une souris de 20 g, la limite d’administration sera de 400 μL per os; 200 μL par voie sous-cutanée; 200 μL par voie intrapéritonéale; 50 μL par voie intramusculaire et 200 μL par voie intraveineuse. La durée des administrations est de 10 à 15 secondes.
Impact sur les animaux
Une fois développée, la GvHD induit un syndrome inflammatoire potentiellement douloureux, se manifestant notamment par une atteinte de l'intégrité de la peau, une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer. et des effets potentiellement toxiques de composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique. Ces effets indésirables peuvent se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les souris auront subi deux procédures modérées, une réutilisation n'est donc pas envisagée.
Remplacement
Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un environnement complexe permettant de mimer les différents composants du système immunitaire impliqués dans cette pathologie. Le modèle murin constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement de thérapies innovantes permettant de soigner la GvHD.
Réduction
Chaque étude préclinique visant a tester l'efficacité d'un candidat medicament doit comprendre un minimum de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif et au minimum deux doses des traitements à comparer) comprenant chacun de 5 à 10 animaux afin d’obtenir des résultats fiables. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus des molécules à visées thérapeutiques. Un total de 1500 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 50 études précliniques.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cage ventilée, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Un morceau de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposés. Les souris recevront une période d’acclimatation de 7 jours, minimum, avant l’entrée en projet, et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h - 12h), d’une température (20 - 24°C) et d’une hygrométrie (45 - 65%) contrôlés en permanence. Les souris seront monitorées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance. Cette dernière sera objectivée par un score clinique permettant de prendre en compte les effets de la GvHD sur la souris.
Choix des espèces
Nous maitrisons l'humanisation du système immunitaire sur les souris NXG, NCG et NOG. En se basant sur cette expertise, il est essentiel de poursuivre sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 6 et 8 semaines pour les animaux non humanisés et à partir de 16 semaines pour les animaux humanisés. Leur suivi pourra durer jusqu’à l’âge de 40 semaines pour permettre le développement de la pathologie.
Caractérisation d’une nouvelle lignée de souris comme modèle dans les expériences de transfert adoptif de cellules
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur irradie une partie des souris, greffe des cellules souches, en infecte d'autres par le virus de la vaccine, pour valider une nouvelle lignée destinée aux expériences de transfert de cellules immunitaires. Il indique attendre peu de douleur, les manipulations étant faites sous anesthésie, et n'avoir jusqu'ici associé aucun signe clinique à l'infection virale. Il présente cette lignée comme supprimant un biais des lignées existantes, avant une mise à mort pour prélever les organes.
Objectifs
Le transfert adoptif de cellules donneuses dans un animal hôte est fréquemment utilisé pour l’étude du système immunitaire. Une expérience classique consiste à transférer des cellules issues d’animaux sauvages ou mutés pour un gène donné dans un animal hôte et de suivre le devenir de ces cellules (circulation, fonction …). Ceci nécessite l’expression par les animaux donneurs et receveurs de marqueurs permettant de les distinguer. L’un des marqueurs les plus classiquement utilisé est le CD45. CD45 est une protéine exprimée à la surface de toutes les cellules immunitaires existant sous deux formes : CD45.1 et CD45.2. Des outils ont été développés permettant la distinction de ces deux formes par cytométrie de flux. Les cellules donneuses sont ainsi issues de souris de lignées B6.SJL ou B6 exprimant respectivement les formes CD45.1 et CD45.2. Or de récentes études ont montré que plusieurs gènes sont exprimés différemment entre ces deux lignées, indépendemment de toute expérimentation ou modification génétique. Notamment, les cellules souches issues de souris de lignées B6.SJL ont une capacité de greffe réduite en comparaison à celles issues de souris B6. De plus, ces deux lignées n’ont pas la même capacité de réponse à une infection par un virus, ce qui introduit un biais expérimental. Pour pallier à ça, nous avons créer une nouvelle lignée de souris B6 exprimant le CD45.1, appelée B6-CD45.1. Cette lignée souris vise à remplacer la lignée B6.SJL et est supposée strictement identique à la souris B6 sur le plan génétique à l’exception de la forme de CD45 exprimée. L’objectif de cette procédure est de démontrer que cette nouvelle lignée ne présente pas de différence en termes de greffe de cellules souches et de réponse immunitaire antivirale comparé à la B6, et qu'elle peut ainsi être utilisée comme modèle dans les expériences de transfert adoptif.
Bénéfices attendus
Le modèle actuel de transfert adoptif de cellules utilisant les lignées B6.SJL et B6 présente un biais puisque plusieurs gènes sont exprimés différemment entre ces deux lignées, indépendemment de toute expérimentation ou modification génétique. Ceci entraîne notamment des différences au niveau de la réponse immunitaire et de la capacité de greffe des CSH de ces deux lignées. La nouvelle lignée B6-CD45.1 qui nous avons générée et que nous souhaitons caractériser dans ce projet, est supposée génétiquement identique à la B6 à l’exception de la forme de CD45 exprimée. Ainsi, on s’attend à une réponse immunitaire et une capacité de greffe de cellules souches hématopoietique strictement identique entre ces deux lignées. Cette nouvelle lignée permet d’abroger les biais précédemment cités et représente une réelle plus-value en comparaison à la lignée B6.SJL pour tous les scientifiques pratiquant le transfert adoptif de cellules.
Procédures
L’irradiation par rayon X (10 minutes) et l’infection intranasale par VV sont réalisés sous anesthésie générale profonde injection intra-péritonéale de Ketamine/Xylazine (respectivement 70 mg/kg et 9 mg/kg ). Les transfert de cellules par voie intraveineuse et les prélèvements de sang au sinus retro-orbital sont réalisés sous brève anesthésie à l’isofluorane (4% dans une chambre à oxygène). Fréquence : x irradiation : une seule fois/animal x infection : une seule fois/animal x transfert de cellules : une seule fois/animal x prélèvement de sang : une (procédure 2) ou deux fois (procédure 1)/animal
Impact sur les animaux
Peu de douleur est attendue au cours de la procédure d’irradiation qui est réalisée sur animaux anesthésiés. Peu de douleur également attendue au cours de l’injection de cellules par voie intraveineuse et des prélèvements de sang au sinus retro-orbital, réalisés sur animaux anesthésiés Infection par le virus de la Vaccine (VV-NP68) : Le laboratoire bénéficie d’une longue expérience de manipulation du virus VV-NP68 in vivo (10 ans). Nous infectons avec un titre viral modéré suffisant pour induire une réponse CD8 sans causer de pathologie détectable. En effet, aucun signe clinique (fièvre, perte de poids…) n’a jusque-là pu être associé à l’infection par VV-NP68.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements des organes.
Remplacement
La procédure 1 consiste à étudier la capacité de greffe de CSH chez un hôte irradié. Les cellules souches greffées vont se différencier en différentes cellules de la lignée hématopoïétique (erythrocytes, lymphocytes …) qui vont coloniser les différents organes de l’hôte. La réponse immunitaire antivirale (procédure 2) est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires dans différentes localisations (poumons, ganglions drainants, rate …). Ces deux procédures ne peuvent être reproduites in vitro.
Réduction
Nous utiliserons 5 animaux par groupe expérimental, analysés individuellement. Un test de Mann-Whitney sera réalisé́ car la comparaison porte sur 2 groupes avec un faible nombre d’échantillons, et aucune hypothèse n'est présupposée. En considérant des différences de moyenne d'au moins 20% avec une déviation standard inférieure à 5% et un seuil minimal du risque alpha à 5%, un groupe de 5 animaux permet d’obtenir une puissance de test d'environ 0.8. Les expériences seront répétées une fois pour vérifier la reproductibilité́ et la validité des résultats. La procédure 1 sera réalisée avec des mâles et des femelles car un effect sexe dans les expériences de transfert de CSH a été rapportée par différentes études.
Raffinement
Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque procédure. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Tous les traitements/prélèvements sont administrés sous PSM II afin de prévenir tout risque d’infection opportuniste. Précautions particulières : x Irradiation : réalisée sur des animaux anesthésiés (Ketamine/xylazine), avec peu de douleur attendue. Le déssèchement des yeux lié à l’anesthésie sera prévenu par application d'ocrygel. Après irradiation, les souris seront placées en armoire chauffante jusqu'à leur réveil. Une surveillance sera réalisée dans les minutes qui suivent la greffe, le lendemain, puis chaque semaine afin de s’assurer qu’aucun signe de souffrance ne soit observé. x Injection de cellules et prélèvements de sang : un collyre anesthésique (tetracaine) est appliqué à l’œil avant la procédure pour réduire toute douleur. L’injection et le prélèvement de sang sont réalisés sous brève anesthésie à l’isofluorane. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l’injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroïde et un antibiotique (Fradexam). x Infection par le virus de la Vaccine (VV-NP68) : Les infections intranasales sont réalisées sur animaux anesthésiés (Ketamine/xylazine). Durant la phase de réveil, les 5 souris de la cage sont positionnées les unes à côté des autres afin de réduire les risques d’hypothermie. Le laboratoire bénéficie d’une longue expérience de manipulation du virus VV-NP68 in vivo (10 ans). Nous infectons avec un titre viral modéré suffisant pour induire une réponse CD8 sans causer de pathologie détectable. Aucun signe clinique (fièvre, perte de poids…) n’a jusque-là pu être associé à l’infection. Les animaux feront néanmoins l’objet d’une surveillance dans les minutes qui suivent l’infection, le lendemain, puis chaque semaine afin de s’assurer qu’aucun signe de souffrance ne soit observé. Si une souris présente des signes de souffrance tel que le pelage hérissé, la prostration ou l'absence de réponse aux stimuli extérieurs, elle sera exclue de la procédure et immédiatement mise à mort par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Le projet vise à caractériser une lignée de souris, seul ce modèle sera utilisé dans ce projet. Les souris receveuses de la procédure 1 qui vont subir l’irradiation seront âgées de plus de 9 semaines. En effet, les souris plus jeunes supportent moins bien l’irradiation. Les souris donneuses de moelle osseuse de la procédure 1 et les souris de la procédure 2 seront âgées de 8-12 semaines, le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.
Création d’une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiée
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 700 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, destinées à d'autres protocoles selon leur phénotype, celles n'ayant pas le profil recherché étant tuées. Le porteur croise deux lignées génétiquement modifiées pour obtenir des souris exprimant une molécule d'étude sur leurs lymphocytes T. Chaque petit est identifié par une boucle d'oreille sous anesthésie, puis phénotypé par prise de sang à la mâchoire ou au sinus rétro-orbitaire. Il affirme que ce passage in vivo est une étape "indispensable" avant le recours aux gros animaux puis à l'homme.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer le rôle d'une molécule spécifique sur la biologie des Lymphocytes T in vivo. CEtte molécule n’est pas exprimée chez les rongeurs, nous avons donc fait modifier génétiquement des souris de fond C56BL/6 afin que l’expression son expression soit sous le control du promoteur du CD3e, ainsi tous les Lymphocytes T exprimeront la molécule d'étude. Son ligand, est une molécule ubiquitaire, présent chez la souris mais la protéine étant légèrement différente, nous avons choisi de faire développer des souris hybrides exprimant la portion extracellulaire de la version humain du ligand tout en gardant la portion intracellulaire de la version murine de cette molécule. Cette souris « hybride » a également été créée sur un fond C56BL/6. Nous souhaitons désormais croiser ces 2 lignées pour obtenir des souris Hybrid pour le ligand exprimant également la molécule d'étude.
Bénéfices attendus
Une fois obtenues, ces souris seront incluses dans des projets ou le système immunitaire sera chalengé et le rôle de notre molécule d'intérêt sera évalué grâce au développement d’Ac bloquant spécifiquement l’interaction de la molécule à son ligand (version extra cellulaire humaine et intracellulaire murine) et déjà validés in vitro.
Procédures
Lors du sevrage, les souriceaux seront identifiés par la mise en place d'une boucle d'oreille numérotée. Pour cette mise en place l'animal reçoit une dose de charge d’Isoflurane. En fonction du caractère récessif ou dominant des modifications génétiques, et du génotype des parents les petits seront ou non phénotypés par analyse des cellules sanguine. Cette prise de sang sera réalisée soit, sur des animaux vigiles au niveau mandibulaire ou sur des animaux anesthésiés au niveau du sinus rétro-orbitaire sur animal anesthésié et ayant reçu une goutte de Tétracaine 1% .
Impact sur les animaux
Ce nouveau phénotype ne devrait pas engendrer d’effet nuisible pour les souris
Devenir
Les souris issues de l’élevage seront incluses dans des expériences en fonction de leur phénotype ou bien sacrifiées si le phénotype escompté n’est pas obtenu.
Remplacement
Des données préliminaires in vitro ont été obtenues mais le rôle exact de la molécule que nous étudions n’a pas encore été totalement clarifié. Un passage à l’in vivo dans des souris génétiquement modifiées pour exprimer les molécules d’intérêts permettra de mieux comprendre le rôle de ces molécules et les conséquences de leur blocage spécifique. Il s’agit d’une étape indispensable avant le passage aux gros animaux puis à l’homme.
Réduction
L’élevage sera dimensionné en fonction des expérimentations prévues.
Raffinement
Les couples seront hébergés dans des cages contenant des frisottis papiers et du coton leur permettant la nidification. Une fois sevrées, les souris seront hébergées dans des cages contenant des frisottis papiers. Une surveillance journalière par les animaliers nous permettra de surveiller que les souris n’ont pas de phénotype dommageable. La prise de sang pour phénotyper les souris sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 4%/air comprimé) en ayant préalablement déposé une goutte de Tétracaïne 1% collyre.
Choix des espèces
Les souris issues de cette nouvelle lignée seront ensuite incluses dans des protocoles que nous maitrisons pour questionner le système immunitaire. La molécule d’intérêt pourra ou non être bloquée à l’aide d’Ac spécifiques pour questionner son rôle dans différentes situations expérimentales mettant en jeux le système immunitaire. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5-6 semaines pour maintenir l’élevage
Programme d’immunisation de souris en vue du développement d’anticorps monoclonaux.
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit quatre injections d'antigène avec adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund, suivies de prélèvements sanguins et de la mise à mort pour prélever la rate et produire des anticorps monoclonaux. Il indique que ces immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Sur le remplacement, il affirme que l'immunisation animale reste la "méthode de référence" et présente le recours in vivo comme "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.
Objectifs
Le but du projet est d’assurer la production d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Pour répondre à ce besoin, il est pertinent de mettre en œuvre la méthode de référence, qui consiste à réaliser une fusion cellulaire entre un lymphocyte B et un myélome de souris.
Bénéfices attendus
Les anticorps monoclonaux (AcM) ont permis le développement de remarquables outils de recherche fondamentale, de diagnostic et plus récemment d’agents thérapeutiques. En recherche fondamentale, les AcM représentent des outils essentiels, en biochimie et en histologie pour la réalisation d’immunomarquages (immunohistochimie/ immunofluorescence) permettant la mise en évidence d’antigènes d’intérêts au sein d’un tissu, en biochimie dans des applications de type ELISA ou immunoprécipitation, et en biologie moléculaire pour la révélation de Western Blot. Dans le cadre du diagnostic, les tests de grossesse reposent classiquement sur la capacité d’AcM à détecter la présence de l’hormone Gonadotrophine Chorionique humaine (hCG), une glycoprotéine produite par le placenta. Les AcM sont également essentiels pour le diagnostic de différentes pathologies oncologiques et infectieuses. Les AcM demeurent aujourd’hui les outils de diagnostic tissulaire les plus performants. En parallèle de leur utilisation diagnostique, les développements menés depuis une quarantaine d’années ont abouti à la production de plus d’une vingtaine d’AcM à visée thérapeutique disposant d’une autorisation de mise sur le marché pour diverses applications, dont le domaine de l’oncologie et des maladies inflammatoires. L’ensemble de ces éléments permettent de justifier la pertinence de pouvoir assurer le développement d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées, travaillant sur des approches fondamentales ou appliquées (diagnostic/ thérapeutique).
Procédures
4 injections seront réalisées : J00 (IP ou SC en ACF), J07 (AIF en SC ou IP), J14 (AIF en IM ou IP) et J21 une injection en intraveineuse sans adjuvant. Des prélèvements seront effectuée sur animaux vigiles : un pré-immun (qui sera le témoin négatif), un à J14 (suivi immunitaire) et J24 (jour de sacrifice de la souris). Injection IP/ SC ou IM, 30 sec pour la contention qui change à chaque point d’injection effectué + 30 secondes d’injection par point d’injection + 30 secondes de massage de la zone injectée, avec injections en 1, 2 ou 4 points suivant le type d’injection (IP, IM ou SC). Injection intraveineuse : 2 à 3 minutes de contention pour la dilation des veines caudales et 1 minute pour l’IV (l’injection en tant que telle ne prend que quelques secondes), mais la réalisation du geste technique (mise en place, maintien de la queue à demande de maintenir l’animal calme pendant 1 minute environ) Prélèvements, maintien de la souris et prélèvement 5 minutes
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles au niveau de la veine sous-mandibulaire afin de remplacer le prélèvement en rétro-orbitaire.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, les souris ne peuvent pas être réutilisées pour d’autres protocoles, elles sont donc toutes euthanasiées en fin de protocole.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcM reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. Toutefois l’isolement de la rate des souris immunisées, afin d’en isoler les plasmocytes sécrétant les anticorps et de les fusionner à des cellules immortalisées, aboutira à l’obtention d’hybridomes permettant la production d’anticorps in vitro sans avoir de nouveau à immuniser un animal.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux (3 souris par protéine immunisée) est adapté au plus juste par rapport à la faible quantité d’antigène. Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d’éviter la variabilité interindividuelle
Raffinement
Raffiner : Les souris sont hébergées dans des cages adaptées, proposant des objets d’enrichissement (abri, coton pour fabrication de nid) permettant de stimuler l’activité des animaux et de maintenir leur sociabilisation. Un contrôle des animaux et des sites d’injection est réalisé chaque jour. Cette observation quotidienne par un personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.
Choix des espèces
La souris est l'animal référent pour l'obtention d'AcM. Les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques des souris immunisées contiennent des cellules lymphocytaires sécrétant des anticorps contre l'antigène d'intérêt. Ces lymphocytes fusionnés avec des cellules de myélome issues de souris, permettent d'obtenir des AcM dirigés contre l'antigène d'intérêt. Le protocole nécessite des jeunes adultes immunocompétents de 6 à 8 semaines au moment de la première injection, afin d'obtenir une bonne réponse immunitaire. Par conséquent, les souris sont reçues à l’âge de cinq semaines. Elles sont mises pendant une semaine en quarantaine dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation avant le début du protocole
Comprendre la pathophysiologie de la malnutrition sévère aigüe
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Le porteur décrit un modèle de dénutrition sévère chez des souris juvéniles sevrées, avec suivi de poids, prélèvements sanguins et de fèces, puis une phase d'infection par Salmonella provoquant pelage hirsute, prostration et amaigrissement. Les animaux sont euthanasiés à chaque point de la cinétique pour prélever sang, cerveau et intestin. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ni le poisson zèbre ou la drosophile ne conviennent et présente la souris comme un "modèle incontournable" pour transposer à l'enfant dénutri.
Objectifs
Développer de manière durable des thérapies nutritionnelles pour contrer la dénutrition est une priorité sanitaire mondiale. Actuellement les campagnes de re-nutrition n’ont qu’un effet bénéfique transitoire sur la santé des enfants souffrant de dénutrition sévère (Severe Acute Malnutrition, SAM). La rémission nécessite la prise en compte simultanée des paramètres anthropométriques, physiologiques, immunitaires et microbiologiques. Or l'interaction entre la physiologie, le microbiote et l'immunité mucosale reste peu étudiée. En effet, déchiffrer l'interaction des principaux acteurs de l'écosystème intestinal chez les enfants SAM nécessite d'utiliser des méthodes invasives, telles que des biopsies intestinales, chez des enfants déjà affaiblis par la malnutrition. De par sa complexité, le modèle animal reste incontournable. Actuellement, un obstacle majeur qui limite l’investigation de la SAM, est l'absence d'un modèle animal approprié. Cependant, nous avons réfléchi au développement d’un modèle de souris juvénile qui présenterait de fortes similitudes physiologiques, microbiennes et immunitaires avec les enfants atteints de SAM. Grâce au modèle murin de dénutrition que nous développerons, nous déterminerons comment améliorer les interventions nutritionnelles en 1) identifiant les signatures physiologiques, microbiennes et immunologiques précoces associées à la dénutrition sévère et au régime thérapeutique proposé, et 2) en utilisant ces signatures afin de créer une combinaison de candidats associé au régime thérapeutique (nutriment et ou métabolite bactérien/bactérie bénéfique) qui simultanément améliorerait chaque paramètre. Chez les enfants, les conséquences de la SAM semblent persister au-delà de la première année après la sortie d’hôpital, et une mortalité élevée est toujours associée à de nombreuses infections et entéropathies. Une fois, le modèle de dénutrition et le régime thérapeutique amélioré, nous voudrions tester la susceptibilité des souris dénutries et ou en phase de rétablissement à développer une infection de type entéropathie avec Salmonella enterica Typhimurium.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme: La SAM est une maladie multi-factorielle où la physiologie (reprise de poids, croissance, maturation intestinale pour une absorption des nutriments optimale), l’immunité mucosale et le microbiote intestinal jouent un rôle important dans son développement mais aussi au cours des traitements de re-nutrition avec le RUTF. Chez des enfants déjà affaiblis par la dénutrition, il n’est pas concevable de prélever des échantillons invasifs comme il serait nécessaire de la faire pour étudier la maturation intestinale ou encore le système immunitaire mucosal. Développer un modèle animal approprié est donc nécessaire afin de déchiffrer les principales caractéristiques de la SAM, et de proposer des stratégies thérapeutiques durables. L'importance de l'intégration de méthodologies multidisciplinaires comme nouvelle façon d'aborder la complexité de la physiopathologie de la SAM fait de ce projet un projet phare pour faire avancer les connaissances dans les domaines de la nutrition, l'immunité, l'infection et le microbiote intestinal. Bénéfices à long terme: Les résultats de cette étude permettront de fournir de nouvelles approches nutritionnelles qui pourraient être envisagées chez les enfants atteints de SAM. Des stratégies multifactorielles comprenant un RUTF optimisé avec des métabolites bactériens et/ou des bactéries bénéfiques devraient fournir des approches thérapeutiques durables en favorisant aussi bien la reprise de poids et la croissance, que la maturation du système immunitaire et du microbiote intestinal.
Procédures
Prise de poids sur animaux vigiles, hebdomadaire. Prélèvements sur animaux vigiles: prélèvement de feces (1 fois à la fin de l'expérience), prélèvements sanguins pour glycémie (procédures 3 et 5), 1 fois à 0, 30, 60 et 90 minutes après administration de la solution de glucose, un prélèvement sanguin de l’ordre de 0,3 μl sera effectué au niveau de la queue). Prélèvements sur animaux endormis: prélèvement sanguin rétro-orbital pour le FITC dextran ( procédures 2 et 6) et 1 fois à la fin de l'expérience.
Impact sur les animaux
Le but de ce projet qui est de suivre l’impact d’une alimentation qui entraine une dénutrition et un régime thérapeutique pouvant contrer cette dénutrition sur la physiologie, l’immunité et le microbiote intestinal des individus, implique de facto l’utilisation d’animaux. Ce projet occasionnera des modifications physiologiques sur les animaux. Selon le régime alimentaire apporté, les animaux subiront un ralentissement de croissance ou des hausses de poids. Selon le régime alimentaire apporté, les animaux subiront un ralentissement de croissance ou des hausses de poids. Une fois, le modèle de dénutrition et le régime thérapeutique amélioré, nous voudrions tester la susceptibilité des souris dénutries et ou en phase de rétablissement à développer une infection de type entéropathie avec Salmonella enterica Typhimurium. Pour la procédure impliquant une infection par Salmonella, les symptômes de la maladie seront observés chaque jour dès le début de l’infection (signes extérieurs: pelage hirsute , yeux tirés larmoyants, miclos, posture anormale, dos rond, prostration).
Devenir
Tous les animaux de toutes les procédures sont concernés par la mise à mort. A chaque point de cinétique déterminé, les animaux seront euthanasiés afin d’effectuer les prélèvements en vue d’analyses.
Remplacement
L’étude de la physiologie, de l’immunité et du microbiote intestinal des individus, implique de facto l’utilisation d’animaux. Nous développerons notre modèle sur des souris mâles C57BL/6J âgées de 21 jours. L’épithélium intestinal murin est anatomiquement et physiologiquement proche de celui de l’Homme. Aucun autre organisme modèle de petite taille (danio zébré, drosophile) ne possède une telle structure aussi similaire.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, tout au long des expériences, les souris seront hébergées dans des cages appropriées à raison de 5 souris/cage maximum. Des groupes de 5 souris seront donc étudiés. Les expériences seront répétées de manières indépendantes 3 fois. Cette répartition des groupes a été choisie pour permettre une analyse statistiquement significative des résultats tout en limitant au minimum le nombre de souris. Un maximum de 820 souris seront utilisées sur 5 ans.
Raffinement
La nourriture et l’eau seront à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Nos visites quotidiennes ou hebdomadaires pour le suivi du poids et la consommation des régimes sera réalisés plutôt en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. La table de souffrance animale (Cf. Annexe 3) indique que lorsque le score est compris entre 0 et 4, aucune procédure spéciale n’est à appliquer considérant normal l’état de « souffrance » des animaux ; un score compris entre 5 et 12, nécessite un renforcement de notre surveillance à 2 fois par jour, et l’administration éventuelle d’un analgésique (buprénorphine voie s.c. 0.1mg/kg) ; enfin un score compris entre 13 et 30 indique une souffrance animale avérée ou sévère et entrainera l’euthanasie de l'animal considéré. Ce score final sera calculé suivant 4 points limites : l’apparence générale, la prise alimentaire et le poids corporel, la détection de signes cliniques et le comportement général. Dans chaque catégorie, un score allant de 0 (RAS) à 4 (état critique ultime) sera établi, générant un score intermédiaire qui sera modifié ou non suivant le critère suivant : si le score est égal à 3 plus d'une fois, ajouter un point. Après dénutrition ou infection, si le score de la table de souffrance animale (Cf. Annexe 3) indique un score compris entre 5 et 12, nous renforcerons notre surveillance à 2 fois par jour, et administrerons un analgésique si besoin (buprénorphine voie s.c. 0.1mg/kg) ; si le score est compris entre 13 et 30 la souffrance animale avérée ou sévère entrainera l’euthanasie de l'animal considéré.
Choix des espèces
Le but de ce projet est de caractériser l'impact d'une dénutrition sévère sur la physiologie, le système immunitaire et le microbiote intestinal afin de proposer un régime thérapeutique durable aux enfants souffrant de SAM. Il est maintenant bien reconnu que le système immunitaire et le microbiote intestinal sont suffisamment proches de celui de l’Homme afin d’utiliser la souris comme modèle fiable avant qu’une transposition ne soit faite chez l’Homme. De plus, l’épithélium intestinal murin est anatomiquement et physiologiquement proche de celui de l’Homme. Aucun autre organisme modèle de petite taille (danio zébré, drosophile) ne possède une telle structure aussi similaire. Par ailleurs, le modèle murin est celui pour lequel les LysoDC ont été les mieux caractérisées. Enfin, le modèle infectieux que nous souhaitons utiliser est très bien décrit et étudié chez la souris. L’ensemble de ces critères fait de la souris l’espèce animale la plus appropriée pour effectuer notre étude. Les animaux utilisés seront des souris males âgées de 21 jours. L’épithélium intestinal des rongeurs est immature à la naissance. L’intestin grêle de la souris continue à se développer après la naissance et sa maturation est fortement associée à la période de sevrage. Le sevrage est donc une étape clef dans la structuration de l’épithélium intestinal, le développement immunitaire et la maturation du microbiote intestinal des rongeurs. C'est donc lors de cette fenêtre particulièrement sensible que se joue le développement en bonne santé de la souris mais également de l'Homme. Les souris sevrées à 21 jours seront alors utilisées afin d’être au plus proche des conditions de développement de la SAM observée chez l’Homme entre trois et 24 mois lors du sevrage. A cet âge la maturité du système immunitaire, la physiologie et la maturation du microbiote intestinal sont en cours de développement chez la souris, tout comme ça l’est chez l’enfant à bas âge.
Preuve de concept du rôle d’un facteur de transcription dans la régénération musculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
16 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation, une greffe de moelle osseuse, un prélèvement sanguin et une blessure musculaire provoquée par un agent chimique injecté dans la patte. Le porteur indique que l'irradiation entraîne une immunodépression, une fatigue et une perte allant jusqu'à 15 % du poids pendant quelques jours. Il présente cette étude comme une preuve de concept du rôle d'une protéine des macrophages dans la régénération du muscle.
Objectifs
Le muscle adulte a la capacité de régénérer complètement après une lésion, grâce aux cellules souches musculaires. Ces cellules doivent développer des interactions avec leur environnement pour assurer la réparation du muscle. Certaines cellules de l'immunité jouent un rôle important dans ce processus. Une protéine a été identifiée comme un candidat important impliqué dans le contrôle des fonctions de ces cellules au cours de la régénération musculaire, ce qui a été validé par des expériences réalisées sur des cellules in vitro. La validation du rôle de cette molécule dans les macrophages au cours de la régénération musculaire in vivo nécessite l’utilisation d’un modèle de souris présentant une inactivation du gène à l’origine de cette molécule. Une approche réductrice en nombre d'animaux qui permet de faire la preuve de concept du rôle de cette molécule au cours de la régénération musculaire consiste à transplanter les cellules de la moelle osseuse d’un animal déficient pour la molécule dans des souris receveuses normales. De cette manière, seules les cellules du sang sont inactivées pour la molécule dans les animaux transplantés. Ensuite, une blessure musculaire avec un agent chimique est réalisée afin de pouvoir analyser les muscles de ces souris. L’objectif de cette étude est de valider la preuve de concept de la pertinence de l’inactivation spécifique de la molécule dans les cellules immunitaires au cours de la régénération musculaire en réalisant des expériences de transplantation de moelle et de lésion musculaire sur un petit nombre d’animaux.
Bénéfices attendus
Cette étude preuve de concept permettra d'identifier si la molécule est nécessaire dans les macrophages pour la régénération musculaire. Le cas échéant, des études plus complètes seront mises en place ultérieurement afin d'en analyser le fonctionnement moléculaire. A terme, la compréhension des mécanismes permettant la régulation de l'inflammation au cours de la réparation tissulaire sera bénéfique pour améliorer les conditions d'inflammation chronique en général, et les dystrophies musculaires en particulier.
Procédures
- irradiation (1 fois 10 minute) - injection intraveineuse de moelle osseuse (1 fois 10 minutes sous anesthésie) - prélèvement sanguin (1 fois 10 minutes sous anesthésie) - induction de blessure musculaire : injection d’un agent chimique dans le muscle situé le long du tibia (1 fois 10 minutes sous anesthésie)
Impact sur les animaux
L'irradiation puis la transplantation provoquent une immunodépression transitoire. Ceci induit une fatigue générale chez les animaux et entraine une perte de mobilité pendant environ 4 jours, conduisant à une perte jusqu'à 15% de poids de corps 5 jours après l'irradiation, et qui est récupérée à partir du 7ème jour. L'irradiation peut également, dans de très rares cas, induire une pousse des dents. L'induction de la blessure musculaire engendre un inconfort passager, au maximum de quelques heures, chez les animaux, qui recouvrent leur mobilité et leur comportement dans les 2-3heures suivant la lésion.
Devenir
Mise à mort pour des prélèvements tissulaires et cellulaires en vue d'analyses.
Remplacement
Les alternatives non animales ont déjà été utilisées en amont de ce projet. Il s'agit d’ expériences de culture cellulaire in vitro, qui montrent un rôle de la molécule dans la fonction des macrophages dans des modèles qui miment la régénération musculaire in vitro.
Réduction
Le modèle mis en œuvre dans ce projet a été choisi car il permet de répondre à la question et car c’est celui qui permet de réduire le plus possible le nombre d’animaux. Les études précédentes ont montré que 4 individus par point d’analyse est suffisant pour réaliser des statistiques. De plus, l'établissement d'une lésion au deux pattes de chaque souris permet de réduire par deux le nombre d'animaux.
Raffinement
Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d’élevage et de bien-être afin d’enrichir l’environnement des souris. Le raffinement inclut l'anesthésie lors de l'injection de la moelle osseuse, de l'induction de la blessure musculaire et lors de la mise à mort des animaux. Le raffinement inclut le maintien des animaux dans des conditions prophylactiques strictes et une surveillance quotidienne des animaux après l'irradiation comprenant le dépôt de nourriture hydratée et de gel nourrissant directement dans la cage, une pesée trihebdomadaire, la surveillance d’une pousse des dents en plus de la surveillance de l'état général des individus. Ces mesures de raffinement sont issues de recommandations publiées issues de travaux de la communauté scientifique.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'Homme dans sa structure et son fonctionnement. Les mêmes séquences de l'inflammation chez la souris et chez l'homme sont observées au cours de la régénération musculaire. Le modèle murin permet des explorations moléculaires, cellulaires, tissulaires et fonctionnelles (évaluation de la fonction contractile du muscle). L'existence de lignées murines génétiquement modifiées et permettant le traçage des populations de macrophages est un argument supplémentaire pour l'utilisation de cette espèce. Les souris sont utilisées à l'âge adulte, soit entre 8 et 12 semaines car le projet concerne la régénération musculaire chez l'individu adulte.
Protocole de production d’anticorps polyclonaux chez le cobaye
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
150 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections sous-cutanées d'antigène associé à un adjuvant et trois prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus comme réactifs à des équipes de recherche. Le porteur indique que les immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et que le recours à l'animal vivant reste "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces immunoglobulines constituent des ressources largement utilisées dans des applications analytiques et thérapeutiques. Les AcP sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ils trouvent des applications en biologie et en biochimie, en tant que ligand de colonne d’immunoaffinité. Ils possèdent également de nombreux emplois en recherche tel que la détection de molécules dans les essais du type enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), les révélations de Western Blot, les procédures immunohistochimiques et d'immunoprécipitation, en immunofluoromicroscopie et en immunoélectromicroscopie. Notre processus de production assure la production d’AcP pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les antisérums sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps ; lorsque le titre est suffisamment élevé, on prépare un antisérum en effectuant une prise de sang suivie de l'isolement du sérum puis, si nécessaire, de la purification des anticorps à partir du sérum
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux (AcP) seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. Les anticorps développés de cobaye dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe. L’utilisation du cobaye interviendra dans des projets particuliers pour lesquels, cette espèce présente un avantage par rapport à d’autres. En effet, les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Le cobaye étant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, il permet l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où les cobayes ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins.
Procédures
Six injections aux cobayes en sous-cutané de l’antigène associé à un adjuvant. Trois prélèvements sanguins seront réalisés, au niveau de la veine saphène sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné). Injection sous-cutanée : 8 minutes dont 4 minutes pour prendre avec délicatesse l’animal, le rassurer et le préparer, 30 secondes par injection et 30 secondes pour masser la zone injectée (4 injections), c’est-à-dire 4 min. Prélèvement : l’endormissement sous anesthésie gazeuse prend 10 minutes pour être effective. Le prélèvement sous anesthésie au masque est réalisé pendant 3 à 4 minutes. Le réveil de l’animal prend 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie.
Devenir
Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux (3 cobayes par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.
Raffinement
Raffiner : L’environnement des cobayes est enrichi pour améliorer leur bien-être (tunnel de jeu, friandises, foin, jouets,…). Les animaux seront particulièrement suivis pendant les 24h suivant les injections, puis quotidiennement pour examiner leur état de santé. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Les prélèvements réalisés, sous anesthésie, concerneront de faibles volumes afin de ne pas induire de souffrance chez l’animal. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.
Choix des espèces
Les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Etant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, ils permettent l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où ils ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins. Ils permettent également l’obtention d’anticorps ayant une forte capacité à fixer le système du complément. Ils permettent en comparaison des souris de Réduire le nombre d’animaux engagés dans chaque protocole à 3 individus. La production d’anticorps chez le cobaye nécessite de faibles doses d’antigène. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les cobayes entreront en protocole à l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine d’une semaine, sans incident durant ce temps, ils seront aptes à rentrer en protocole.
Evaluation de candidats médicaments sur la récupération physique et mentale après un modèle d’inflammation du péritoine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une septicémie leur est provoquée par injection intrapéritonéale de matière fécale, puis un candidat médicament est testé, avec cinq batteries de tests comportementaux mesurant force musculaire, équilibre, résistance à l'effort, exploration, dépression et mémoire. Le porteur indique une perte de poids et une chute de température attendues, une variation de deux degrés ou de 15 % du poids déclenchant la mise à mort. Il affirme qu'aucun essai sur culture cellulaire ne peut remplacer ce modèle pour évaluer l'efficacité des molécules.
Objectifs
L'objectif scientifique de l'étude est d'évaluer l'amélioration (ou l'absence d'amélioration) des capacités de récupération physiques, mentales et comportementales des souris suite à une septicémie grâce à un traitement pharmaceutique. La septicémie sera induite par injection intra-péritonéale de matière fécale. Nous pourrons également étudier, à différents temps, l'infiltration des cellules (quantification et identification des sous-populations leucocytaires) dans le péritoine après lavage de la cavité. Le sang et d'autres organes seront également prélevés en fonction des demandes du sponsor pour quantifier la synthèse de médiateurs cytokiniques ou lipidiques, telles que les lipoxines ou les résolvines. Le poids, le comportement et les capacités physiques des animaux seront évalués en fonction de la demande du sponsor tout au long de l’étude. Les résultats obtenus vont permettre d’étayer les mécanismes cellulaires et moléculaires fins controlant l’inflammation et sa résolution. L’étude de ces différents paramètres va également fournir des indications sur l’efficacité d’un composé pharmaceutique à mieux induire ou au contraire inhiber la résolution.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus vont permettre d’étayer les mécanismes cellulaires et moléculaires fins controlant l’inflammation et sa résolution. L’étude de ces différents paramètres va également fournir des indications sur l’efficacité d’un médicament à mieux induire ou au contraire inhiber la résolution en association avec les capacitées physiques, mentales et comportementales des animaux.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéales et sous-cutanées sur animaux vigiles pour l'induction de la septicémie (1) et le traitement de celle-ci (1 injection intra-péritonéale à 24h, 48, 72h post-induction et 1 injection sous-cutanée à 24h, 48h, 72h post-induction). Les animaux pourront être soumis selon la demande du sponsor à une procédure de gavage journalière pour l'administration du composé si besoin lors de l'étude principale. L'évaluation physique, mentale et comportementale des animaux sera réalisée à l'aide de 5 procédures de tests comportementaux standardisées selon les recommandations de la plateforme partenaire. Ces tests permettront d'évaluer la récupération physique des souris grâce aux 3 tests comportementaux physiques mesurant respectivement la force musculaire des 4 pattes, l'équilibre des souris et la résistance à l'effort. Et la récupération mentale grâce aux tests cognitifs et comportementaux, mesurant respectivement, entre autre, la capacité d'exploration des souris, la dépression et la mémoire. L'ensemble de la procédure durera 14 semaines, 7 pour l'étude pilote et 7 pour l'étude principale.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sont une perte de poids et une baisse de la température corporelle. C'est pourquoi les souris seront surveillées toutes les 2 heures pendant 8h post induction, puis 2 fois par jour les jours suivants. La température corporelle ainsi que le poids des souris seront évalués quotidiennement. Une variation de 2 degrés de la température initiale et de 15% du poids de la souris entrainera la mise à mort des animaux concernés. Durant la septisémie induite par injection de matière fécale, les animaux seront traités 24h, 48h et 72h après injection par un antibiotique injecté en intrapéritonéal et une réhydratation par voie sous cutanée sera réalisée. De plus, on reportera l'aspect général de l'animal sous la forme d’un score prédictif de la douleur.
Devenir
A l'issue de l'ensemble du projet les animaux seront mis à mort dans le but d'étudier les composés de l'inflammation et de la résolution de l'inflammation présent dans la plasma des animaux.
Remplacement
Le remplacement de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible dans ce modèle. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche subsitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.
Réduction
Au sein de cette étude, nous avons réduis le nombre d'animaux utilisés en utilisant un nombre très proche du nombre minimal de 15 nécessaire à une étude statistique.
Raffinement
Des soins et une observation accrue aux animaux suite à l'induction des maladies seront apportés, ceux ci comprennent une aide à l'alimentation et à la réhydratation. Ces pathologies étant basées sur l'inflammation, un traitement pharmacologique visant à réduire la souffrance de l'animal ne pourra être envisagé sans compromettre les résultats de l'étude. L'état de santé des animaux sera évalué quotidiennement selon des critères d'apparence physique et comportementaux selon le tableau détaillé dans le paragraphe 3.4. L'enrichissement pourra être augmenté si nécessaire par l'ajout surnuméraire d'enrichissment.
Choix des espèces
La souris est largement décrite pour être une espèce de choix dans ce modèle compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. La majorité des expériences seront réalisées chez la souris C57BL/6 fonction des souhaits des sponsors. Ce modèle a déjà été utilisé dans des publications similaires étudiant la récupération physique et le comportement des animaux suite à une septicémie. Ce modèle répond parfaitement au besoin scientifique du projet qui est d'évaluer l'effet de la molécule du sponsor sur la récupération physique et comportementale des animaux suite à une septicémie. Les animaux utilisés seront adultes (7-12 semaines) car il est nécessaire que leur système de défense immunitaire soit mature. Selon demande du sponsor, nous utiliserons des animaux plus agés (10-14 semaines).
Rôle de GPS2 dans la polarisation des macrophages sur la fibrose hépatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles subissent des régimes gras, des injections d'un composé toxique pour le foie ou une chirurgie de ligature des voies biliaires, pour étudier une protéine impliquée dans la fibrose du foie liée au diabète. Le porteur reconnaît que la ligature des voies biliaires "entraîne des douleurs" et que certains régimes font perdre du poids aux animaux, suivis jusqu'à un point limite. Il affirme que l'usage de souris génétiquement modifiées est "nécessaire" et ne peut être remplacé par des méthodes sans animaux vivants.
Objectifs
Des études épidémiologiques ont établi un lien entre l’accumulation de tissu adipeux dans la région intra-abdominale (obésité viscérale), la stéatose et la fribro-inflammation du foie avec le risque de développer un diabète de type-2. L’accumulation anormale de lipides dans le foie va induire un stress inflammatoire provoquant le développement d'une fibrose hépatique. L’état d’inflammation chronique, est considéré comme un facteur important de la détérioration de l’homéostasie glucidique. Il est bien établi aujourd'hui que les macrophages hépatiques (cellules de kupffer) jouent un rôle important dans la mise en place de cette fibrose. Récemment la protéine GPS2 (G-protein pathway suppressor 2) a été identifiée comme un modulateur de l'activation des macrophages dans le contexte du diabèté et de l'obésité́. Son rôle dans l'inflammation hépatique reste cependant énigmatique. Ce projet a pour but de démontrer le rôle de cette protéine dans les processus cellulaires impliqués dans le développement de la fibrose hépatique. Pour ceci, des souris invalidées pour GPS2 spécifiquement dans les macrophages et des souris contrôles subirront différents modéles d’induction de fibrose hépatique (régimes, traitement pharmacologique et chirurgie).
Bénéfices attendus
Nous devrions démontrer l’importance de GPS2 dans un programme transcriptionnel orchestrant les altérations cellulaires et structurales du foie qui favorisent la fibrose hépatique et le développement du diabète de type-2. Ce projet de recherche fondamental a pour objet de définir et d’identifier l’implication du facteur de transcription GPS2 dans les altérations du foie associées au diabète de type-2. A terme, réduire l’activité de GPS2 pourrait être proposé comme une nouvelle approche thérapeutique pour contrôler l’inflammation afin d'atténuer le risque de diabète de type-2.
Procédures
Les animaux seront soumis à différents régimes (régime riche en graisse HFD, régime déficient en méthionine et en choline MCD, régime gras déficient en choline CD-HFD), à des injections de CCL4, à une procédure chirurgicale de ligature des voies biliaires et enfin à des tests métaboliques. 30 min avant la chirurgie, les souris reçoivent une injection de buprénorphine (0,09mg/mL) en SC. Puis elles sont anesthésiées par isoflurane (5% d’isoflurane et 2L/min d’air) dans une chambre d’induction, puis maintenues sous anesthésie sur une plaque chauffante munie d’un masque d’anesthésie (2,5% d’isoflurane, 0,5L/min d’air et 0,2L/min d’oxygène). Une injection de buprénorphine est réalisée 2 fois par jour le lendemain et le surlendemain de l’opération.
Impact sur les animaux
Les animaux placés sous régimes enrichis en lipides (HFD et CD-HFD) vont prendre du poids tout au long des semaines de régime et vont devenir un peu moins active. Les souris placés sous régime MCD vont perdre du poids, elles seront surveillées de près pour ne pas qu'elles dépassent une perte de poids de 20%. La chirurgie de la ligature des voies biliaires entraine des douleurs chez la souris.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasié à la fin de leur procédure afin de récupèrer différents organes pour phénotyper les altérations fibro-inflammatoires du foie par histologie, cytométrie en flux, expression de gènes…
Remplacement
Afin de prouver l'implication de notre protéine d'intérêt, dans le développement de la fibrose et de l'inflammation hépatique, nous avons utiliser la strégie d'invalidation génique dans des cellules spécifiques comme les macrophages. Pour ceci, nous avons utilisé le systéme "Cre-Lox" chez la souris. Ces souris sont actuellement disponibles. De plus, la souris est un des meilleurs modéles avec le rat dans l'étude de la fibrose hépatique. Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. En effet, dans le but de répondre à notre étude du rôle de la protéine GPS2 dans la régulation de voies de signalisation métabolique et inflammatoire, l’utilisation des modèles murins génétiquement modifié est nécessaire. Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé est de 440. Afin de réduire le nombre d’animaux dans l’étude, nous avons développé des protocoles permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même animal, comme par exemple l’évaluation de la tolérance au glucose et l’évaluation de la sensibilité à l’insuline. Avec une période de récupération d’au moins 3 jours entre chaque test, chaque animal sera soumis aux 2 évaluations. Pour chaque condition expérimentale, des groupes de 20 souris seront créés. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. De plus, des tests statistiques seront nécessaires pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés et ont un accès ad libitum a la nourriture. Les conditions de température et d'hygromètrie sont controlées et monitorées tous les jours. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (8h-20h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Si, pour des raisons de protocole, une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté. Pour s’assurer du « bien être » des souris, elles bénéficieront de coton et de « maisons » en carton afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un « nid ». Les souris seront sous surveillance journalière. Pour l'ensemble des procédures, des points limites ont été établis. Des protocoles d'anesthésie et d'analgésie ont été mis en place lorsque cela était nécessaire.
Choix des espèces
Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques ont été validés chez la souris. Les souris sont faciles à manipuler et la présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’élevage. Les souris utilisées auront entre 8 et 10 semaines au début de chaque procédure.
Analyses moléculaires et cellulaires de l’infection par STLV chez le primate non humain naturellement infecté
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
9 babouins vont être utilisés dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Le porteur indique que la colonie, naturellement infectée par le virus STLV, a été destinée à la mise à mort dans le cadre de la "gestion sanitaire" du centre, avant qu'un grand prélèvement sanguin puis une injection mortelle ne soient décidés pour récupérer du matériel biologique. Il présente cette procédure terminale comme la "meilleure façon de valoriser scientifiquement, et en conséquence éthiquement" la situation. Il qualifie le modèle primate d'"incontournable", cette colonie étant selon lui la seule d'Europe présentant ces caractéristiques.
Objectifs
Dans le cadre de la gestion sanitaire des colonies de notre centre, nous avons décidé de mettre à mort notre colonie de babouins naturellement infectés par STLV. Cette décision a été prise par la Direction et l’équipe de vétérinaires du centre avec l’accord d'un Groupe de Recherche national expert en l'utilisation du modèle primate en expérimentation animale. Plusieurs équipes de recherche nationales et internationales ont exprimé leur souhait de récupérer le maximum de matériel biologique de ces animaux pour leurs recherches. Un des prélèvements les plus importants est le sang frais. Le grand volume de sang requis (environ 500mL) rend très difficile un prélèvement post-mortem. Une fois ce prélèvement sanguin réalisé, l’animal sera euthanasié et le reste des prélèvements (environ 20 prélèvements tissulaires différents) se fera en post-mortem. Le présent projet décrira la procédure d ‘anesthésie, le prélèvement sanguin et la mise à mort des animaux. Tous ces gestes seront réalisés par l’équipe vétérinaire du établissement utilisateur. Les animaux seront capturés le jour même du prélèvement et de l’euthanasie. Les femelles seront transférées à l’aide des nids de transfert à des cages individuelles pour faciliter l’induction des animaux. Le mâle sera anesthésié à distance par fléchage
Bénéfices attendus
Lobjectif de ce projet est d'analyser les conséquences moléculaires (intégration provirale et expression du provirus, induction d'instabilités génétiques dont des mutations somatiques et des défaut de caryotypes), cellulaires (altération des voies de signalisation, modification de la fonction du centrosome, prolifération et apoptose cellulaires) et immunologiques (modification de l'immunophénotype dans le sang) de l'infection par STLV-1.
Procédures
Prelevements sanguin sur animal anesthesie. Ce prélèvement durera 30’ aprox. Les animaux seront euthanasiés an fin de prélèvement.
Impact sur les animaux
Le prelevement sanguin se fera avec l'anesthésié profonde de l'animal (administration intramusculaire d’un mélange de kétamine à la posologie de 4mg/kg et de médétomidine à la posologie de 40µg/kg), une injection mortelle de Doléthal® (pentobarbital) est réalisée par voie intraveineuse à la posologie de 180 mg/kg (soit 1mL/kg). Aucune nuisance ou effet indesirable est attendu sur les animaux.
Devenir
Aucun animal ne sera gardé en vie. Tous les animaux (i.e. 9) de la colonie seront mis à mort. La mise à mort de ces animaux se fait dans le cadre de la gestion sanitaire du centre d’élevage. La participation dans une procédure terminale de ces animaux nous paraît la meilleure façon de valoriser scientifiquement (et en conséquence, éthiquement) cette situation.
Remplacement
Pour l’étude de cette maladie, le modèle primate est incontournable. Les individus qui participeront à cette étude sont des individus naturellement infectés par le STLV et, à notre connaissance, la seule colonie Européenne de PNH à des fins scientifiques avec ces caractéristiques. Les échantillons obtenus ne peuvent donc pas être obtenus ni sur d’autres modèles animaux, ni sur des cultures cellulaires.
Réduction
Tous les animaux (i.e. 9) de la colonie seront mis à mort. La mise à mort de ces animaux se fait dans le cadre de la gestion sanitaire du centre d’élevage. La participation dans une procédure terminale de ces animaux nous paraît la meilleure façon de valoriser scientifiquement (et en conséquence, éthiquement) cette situation.
Raffinement
Les animaux de cette colonie font partie du même groupe social et ils sont hébergés dans un grand parc extérieur d’environ 500m2 aménagés avec différentes structures en bois pour faciliter l’utilisation de tout l’espace (i.e. enrichissement structurel). Ils ont libre accès à deux installations intérieures d’environ 60m2 climatisés. Les animaux font partie d’un programme d’enrichissement alimentaire approuvé par le SBEA qui consiste en plusieurs moments de nourrissage par jour avec l’utilisation de fruits, légumes et grains divers tous les jours, l’utilisation d’un substrat biologique de type paille/foin pour promouvoir le fourragement des individus (comportement typique de tout primate) ainsi que d’améliorer leur confort. Lors de tout prélèvement, les animaux seront anesthésiés profondément pour éviter toute douleur ou souffrance.
Choix des espèces
Les effets pathologiques du virus sur l’ensemble d’un organisme ne peuvent êtres étudiés à ce jour que par le prélèvement direct des tissus provenant d’animaux infectés par le rétrovirus STLV. De plus, et à notre connaissance, il n’existe pas à ce jour de biothèque proposant ce type d’échantillons. La colonie de babouins olive proposée est la seule colonie, a notre connaisance, naturelelment infecte par le virus STLV.
Rôle des isoformes de CXCL12 dans la vascularisation et la réparation tissulaires
- Enquêtes médicolégales
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
819 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une cryolésion, une brûlure par le froid de degré 4 détruisant le muscle, réalisée sous anesthésie et provoquant une boiterie transitoire, pour étudier le rôle d'une chimiokine dans la réparation musculaire. Le porteur soutient, références à l'appui, que la destruction des terminaisons nerveuses rend la zone insensible, et prévoit un antalgique péri-opératoire. Il affirme qu'aucun système de culture ne pourrait reproduire la complexité des interactions cellulaires impliquées.
Objectifs
L’objectif du projet est de détailler le rôle des isoformes de CXCL12 dans la stabilité de la microvasculature musculaire à l’homéostasie et dans la réparation musculaire après lésion. La microvasculature à l’homéostasie et les étapes de réparation tissulaire seront étudiées dans des souris de phénotype sauvage, dans des souris dont CXCL12 est dépourvu de tous ses sites de fixation à la matrice extracellulaire (souris CXCL12gatm) et dans des souris n’exprimant pas CXCL12γ qui est l’isoforme ayant de loin la plus forte affinité à la matrice extracellulaire (souris CXCL12gamma). Nous avons des souris portant également la mutation Flk1-GFP qui permet de visualiser directement les vaisseaux sanguins en microscopie confocale. Les lésions musculaires seront créées en suivant le protocole de cryolésion décrit dans le projet dont celui-ci prend la suite. A différents temps post-lésions, les muscles seront prélevés après mise à mort des animaux et étudiés par des méthodes standard d’histologie impliquant des colorations de coupes et des immunomarquages des populations cellulaires impliquées. Ces analyses seront complétées par des quantification d’expression, par qPCR, des isoformes de CXCL12.
Bénéfices attendus
Ces expériences devraient permettre de comprendre de façon plus fine l’implication de CXCL12 dans les processus de réparation musculaire et devraient à plus long terme ouvrir à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation de cette chimiokine multifonctionnelle, exprimée dans de nombreux organes et tissus depuis les premières étapes du développement et tout au long de la vie. La très grande similarité entre CXCL12 de souris et CXCL12 humaine (CXCL12 est extrêmement conservée dans l’évolution) est évidemment un atout important dans une perspective translationnelle. Des interventions thérapeutiques ciblées sur un isoforme, dans le cas de processus pathologiques impliquant CXCL12, pourraient permettre de moduler l’action de cette cytokine qu’il est difficile de cibler dans sa totalité du fait de son caractère essentiel.
Procédures
Cryolésion une fois dans leur vie (une intervention réalisée sous anesthésie). L’intervention dure quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les mutations sur CXCL12 ou sur flk1 n’entraînent aucun phénotype particulier, en particulier aucune altération visible du comportement ou de la fertilité. Chez l’humain les brûlures par le froid (gelures) de degré 3 (atteinte de toute l’épaisseur du derme) et 4 (destruction musculaire) détruisent les terminaisons nerveuses et s’accompagnent d’une perte de sensibilité. Cf les deux sites web ci-dessous : https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/frostbite/symptoms-causes/syc-20372656 (“Deep (severe) frostbite … [that] affects all layers of the skin as well as the tissues that lie below [makes] the skin turns white or blue-gray and you lose all sensation of cold, pain or discomfort in the area.”) http://www.brulures.be/index.php/degres-de-gravite/fr/ (« les atteintes du 3e degré sont indolores du fait de la destruction des terminaisons nerveuses ») La brûlure que nous appliquons aux souris est de degré 4 et donc après cryolésion les terminaisons nerveuses du tissu sont détruites. Nous pouvons en déduire que, par les mêmes mécanismes que chez l’Homme, il y a une perte de sensibilité au niveau de la cryolésion. Les souris seront protégées de la douleur de l’incision cutanée par une anesthésie générale à l’isoflurane, complétée d’un traitement antalgique péri-opératoire. Il est possible que des douleurs apparaissent à la ré-innervation ou du fait de la réaction inflammatoire. Le risque d’infection secondaire qui accompagne les brûlures graves chez l’Homme est ici très faible parce que la brûlure sera protégée par la peau qui, elle, sera intacte (quoique suturée). Du côté lésé, les souris auront une perte transitoire de la fonction musculaire engendrant une boiterie, qui n’empêchera pas les animaux d’accéder à la nourriture dans la grille.
Devenir
Tous les animaux inclus dans le projet seront euthanasiés.
Remplacement
Nous nous intéressons à la régulation complexe par CXCL12 et ses isoformes d’interactions entre des populations cellulaires différentes (résidentes du tissu et recrutées à partir du sang) permettant la régénération d’un tissu lésé. CXCL12 lui-même peut avoir différentes cibles cellulaires. Aucun système de culture ne pourrait reproduire fidèlement la complexité de l’environnement cellulaire impliqué.
Réduction
Le nombre de souris a été déterminé en comptant 7 animaux par groupe, et en multipliant par le nombre de points d’observation prévus. Le nombre de souris pour chaque groupe a été déterminé sur la base de précédentes expériences. Un effectif de 7 animaux par groupe a été retenu pour permettre de détecter les différences de moyenne attendues entre les deux lignées mutantes, avec une puissance statistique suffisante. Chaque animal fournit un muscle lésé et son contrôle controlatéral, non lésé, et un groupe contrôle présentant le phénotype sauvage est également inclus.
Raffinement
La cryolésion sera réalisée dans le cadre d’une anesthésie gazeuse et d’un traitement antalgique complémentaire. Les animaux seront sur plaque chauffante le temps de l’intervention et des chaufferettes seront utilisées jusqu’au réveil complet. De l’aliment appétent facilement absorbable sera rajouté dans les cages qui seront également enrichies d’un igloo. Les souris seront surveillées quotidiennement par le responsable du protocole à la recherche de signes de complications locales, de douleur ou d’altération de l’état général. Si certains de ces signes apparaissent, des actions adaptées seront mises en oeuvre.
Choix des espèces
Nous travaillons chez la souris car il s’agit d’un petit Mammifère, étudié par de nombreuses unités de recherche (important pour les confrontations avec les résultats antérieurs), pour lequel de nombreux outils existent (anticorps, biologie moléculaire, etc…), génétiquement manipulable, aux temps de génération courts et aux portées nombreuses, permettant d’obtenir rapidement le nombre d’animaux nécessaire pour nos expérimentations. De plus, le CXCL12 murin est homologue à 99% au CXCL12 humain. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes âgés de 6 et 10 semaines. Le choix de cette tranche d’âge résulte des éléments suivants : 1) L’importance de garder les mêmes conditions expérimentales que celles qui ont été utilisées dans une étude antérieure dont celle-ci prendra la suite ; 2) Pour ces deux études, le but est d’étudier des processus de réparation tissulaire et vasculaire à l’âge adulte, sans interférence avec la croissance et la maturation du système immunitaire des premières semaines de vie, ni avec les processus de vieillissement qui surviennent au-delà de quelques mois.