Système immunitaire

2 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections induisant des tumeurs du foie et un suivi par échographie sous anesthésie, pour étudier le rôle des macrophages dans le cancer hépatique et la réponse aux immunothérapies. Le porteur indique qu'un quart des animaux peut développer une encéphalopathie foudroyante deux à quatre semaines après l'invalidation d'un gène. Il affirme que les lignées cellulaires ne permettent pas d'appréhender le foie dans sa globalité et présente le recours à Crispr comme une réduction du nombre d'animaux.

Objectifs

Notre objectif est d’étudier comment les macrophages du foie sont impliqués dans le développement du cancer du foie dépendant de la beta-caténine et modifient la réponse aux traitements d’immunothérapie dans des modèles murins de CHC (carcinome hépatocellulaire) relevants. Ce projet est divisé en 3 grands axes: 1) déterminer de manière cinétique au cours du processus tumoral comment une activation oncogénique de la beta-caténine dans les hépatocytes remodele le paysage immunitaire à son voisinage et notamment les macrophages embryonnaires. 2) comprendre comment les macrophages embryonnaires sont progressivement perdus au cours du processus tumoral pour être remplacés par des macrophages dérivés des monocytes et comment des événements oncogéniques associés à l'activation de la beta-caténine modifient ce remodelage macrophagique et 3) déterminer comment la réponse aux immunothérapies de ces cancers est modifié selon le remodelage des macrophages.

Bénéfices attendus

En aidant à la compréhension des mécanismes de développement et de réponse aux traitement des cancers du foie en s'intéressant à une population immunitaire qui fut longtemps peu étudiée et dont la diversité des sous-populations a récemment été mise en lumière grâce à l'utilisation du single RNAseq (scRNAseq), ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques à coupler aux traitements d'immunothérapie émergeants ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre.

Procédures

1) Injection intrapéritonéale sur animaux vigiles durant 10 secondes, 2) Injection intraveineuse sous anesthésie durant 30secondes 3) échographie hépatique sous anesthésie durant 10minutes si l'animal ne présente pas de tumeurs jusqu'à 25minutes si les tumeurs sont nombreuses 4) prélèvement sanguin sous anesthésie durant 30secondes

Impact sur les animaux

Les modèles de CHC décrits dans ce projet sont des modèles créés au laboratoire et que nous utilisons depuis plusieurs années. Entre la 2ème et la 4ème semaine après invalidation d’Apc un phénotype délétère lié à une encéphalopathie foudroyante peut être observé chez 25% des animaux, sans perte de poids. Ce phénomène est aussi observé dans le modèle de déletion de l'exon 3 de la beta-catenine par Crispr/Cas9 mais un mois et demi à deux mois après édition du gène du fait du temps de latence plus long pour que la machinerie Crispr soit pleinement efficace. Les autres traitements sont sans nuisances sur les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet seront euthanasiés pour analyse de leurs tissus hépatiques et leurs tumeurs afin de comprendre les événements génétiques et immunitaires à l'origine du développement de ces tumeurs et si nos traitements ont pu modifier leurs caractéristiques (invasion, prolifération)

Remplacement

Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire (cellules immunitaires, cellules endothéliales...). L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité, d’autant plus que les CHC mutés pour la beta-caténine sont peu proliférants et donc difficiles à maintenir en culture. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous optons pour la technique des ciseaux moléculaires ou crispr/cas9. 1290 animaux sur les 2650 nécessaires au projet suivent ce protocole, le quadruple ayant été nécessaire sans l’utilisation de cette stratégie. Nous suivrons le développement des tumeurs par suivi échographique, un appareil ayant été acquis récemment au sein de l'animalerie, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral évitant d'euthanasier les animaux à l'aveugle. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à nos expériences précédentes et à un calcul de puissance pour obtenir des résultats robustes : le suivi échographique de 20 animaux par lot est nécessaire et suffisant pour générer des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Nous suivrons le développement des tumeurs par échographie, ce qui permet un suivi longitudinal depuis les phases précoces du développement tumoral évitant la souffrance des animaux liée à un développement tumoral trop important. Nous connaissons les phases possiblement délétères après invalidation génique, et les procédures se dérouleront avec une surveillance adaptée - les animaux étant euthanasiés si le score de souffrance est trop élevé. Les injections stressantes et les échographies seront réalisées sous anesthésie et les animaux mis sur tapis chauffant pour limiter l’hypothermie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues et les animaux hébergés à raison de 5 animaux par cage au maximum.

Choix des espèces

Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié : 1) A notre expertise pour l’étude, l’utilisation et le développement de modèle murin. 2) A la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les CHC humains. Pour toutes les procédures, des souris mâles âgées de deux mois seront utilisées pour induire les délétions géniques d'intérêt (par Cre/lox ou Crispr/cas9) afin de réaliser un suivi longitudinal de l’initiation et du développement tumoral chez la souris adulte jeune et de les traiter avec les immunothérapies

Une souris qui montre une difficulté respiratoire dans les cinq à dix minutes suivant l'injection hydrodynamique est mise à mort. 3 260 souris profondément immunodéficientes vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : une irradiation, une injection de cellules souches sanguines humaines avant l'âge de neuf jours, l'injection hydrodynamique et jusqu'à huit prises de sang pour mesurer la part de cellules humaines dans leur sang. Le porteur cite parmi les effets une grande sensibilité aux infections, des dermatites et des tumeurs après l'irradiation. Les souris produites sont fournies aux laboratoires utilisateurs de la plateforme, 75 en moyenne par utilisateur et par an, pour être réutilisées dans d'autres projets.

Objectifs

L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite utilisées par ou en collaboration avec des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements.

Bénéfices attendus

Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).

Procédures

- irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes)

Impact sur les animaux

Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.

Devenir

Les animaux issus de la procédure 1 pourront être inclus dans la procédure 2. Certaines souris issues de la procédure 1 pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet ultérieure. Les souris issues de la procédure 2 pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet.

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.

Réduction

Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).

Raffinement

La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+isolées dans des souriceaux nouveau-nés (

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues dépourvues de microbiote, elles sont inoculées par voie orale avec des souches d'Escherichia coli dont une pathogène, puis tuées 72 heures après pour prélever leurs organes. Le porteur indique que la souche pathogène peut provoquer faiblesse, diarrhée et déshydratation, les souris atteignant le point limite étant mises à mort par anticipation. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale capable de simuler un organisme constitué de plusieurs organes, comprendre ces mécanismes étant selon lui "indispensable" pour la santé publique.

Objectifs

Les Escherichia coli producteurs de shigatoxines (STEC) sont des bactéries responsables d’infections humaines. Les symptômes vont de la diarrhée bénigne à la colite hémorragique et au syndrome hémolytique et urémique (SHU). Les principaux modes d’infection sont la consommation d’aliments contaminés, la transmission interhumaine, le contact avec des animaux porteurs. Les infections à STEC constituent un problème majeur en raison de l’extrême sévérité possible des symptômes. Le SHU est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. La mortalité est de 3 à 5 % et plus d’1/3 des malades ont des séquelles rénales à long terme. L’Argentine a l’incidence la plus élevée au monde de ce syndrome. Compendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique lié à ces bactéries. La shigatoxine est une protéine formée de 2 sous-unités codées par les gène stxA et B. Ces 2 gènes font partie du génome d’un bactériophage (virus infectant les bactéries), qui infecte spécifiquement E. coli. Le génome du bactériophage peut s’intégrer au chromosome des bactéries infectées. On parle alors de prophage. Le plus étudié des prophages des STEC est le prophage 933W. Expérimentalement, chez la souris, une souche d’E. coli dont le chromosome porte le prophage 933W est pathogène. Á l’inverse, les STEC chez lesquelles le prophage a été éliminé ne sont plus pathogènes. Les gènes stxA et B sont précédés d’une séquence d’ADN qui contrôle leur expression. Cette séquence est reconnue par la machinerie cellulaire de la souris ou de l’Homme, ce qui amène à faire l’hypothèse que l’infection se déroule ainsi : libération des prophages dans l’intestin sous l’action d’un facteur environnemental qui stresse les bactéries porteuses ; les particules virales libérées traversent la muqueuse intestinale et pénètrent dans les cellules cibles de l’organisme (ex : cellules rénales) ; la séquence d’ADN qui contrôle l’expression des gènes stxA et B est reconnue par la machinerie cellulaire ; ces gènes sont alors exprimés et la shigatoxine est produite. L’objectif du projet est de tester cette hypothèse en comparant des souris inoculées avec l’une des souches d’E. coli suivantes : C600:933W (prophage et sa séquence d’ADN contrôlant les gènes stxA et B, souche pathogène), C600:933W delta-pr1 (prophage sans la séquence de contrôle, souche non pathogène), C600 (pas de prophage, souche non pathogène).

Bénéfices attendus

Les bénéfices obtenus sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC, en particulier dans l’expression des gènes stxA et stxB in vivo. L’utilisation de souris axéniques, c’est-à-dire dépourvues de microbiote intestinal, permettra de s’affranchir de facteurs confondants (transmission possible du prophage à d’autres souches d’E. coli présentes naturellement dans le microbiote intestinal), et de facteurs pouvant affaiblir le pouvoir pathogène de la bactérie modèle étudiée (effet « barrière » possible du microbiote intestinal). Les infections à STEC constituent un problème majeur de santé publique en raison de l’extrême sévérité de certaines de leurs manifestations cliniques. La forme la plus grave, le syndrome hémolytique et urémique (SHU), est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. Si la dialyse a permis de réduire la mortalité, celle-ci reste non négligeable (3-5 %) et beaucoup de ces jeunes malades conservent des séquelles rénales à long terme. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique de ces bactéries pathogènes, en particulier lors d’infection par les denrées alimentaires. Cette évaluation est très importante pour l’Argentine, qui a l’incidence de SHU la plus élevée au monde chez l’enfant.

Procédures

En début de procédure, les animaux sont soumis à un jeûne hydrique de 4 heures, suivie d'une unique inoculation par voie orale. Puis deux prélèvements de fèces à 24 h d’intervalle après l’inoculation sont réalisés. La procédure s’arrêtera 72 h après l’inoculation. Les animaux recevront une injection sous-cutanée d’un analgésique ayant une action puissante sur les douleurs viscérales. Une heure plus tard, ils seront profondément anesthésiés à l’isoflurane (dose létale). La paroi abdominale sera incisée, une ponction de la veine cave (située dans l’abdomen) sera faite pour prélever du sang, puis une perfusion intra-cardiaque sera faite pour éliminer le sang restant dans le système circulatoire afin de pouvoir prélever des tissus sans trace de sang, condition nécessaire pour des analyses histochimiques de bonne qualité. L'ensemble de cette procédure durera entre 5 et 10 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les groupes recevant la souche C600 ou la souche C600:933W delta-pr1 sont réduites. En effet, la seule intervention invasive sera une inoculation orale avec 150 µL de culture bactérienne. D’une part, ces souches ne sont pas pathogènes. D’autre part, l’inoculation sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Les nuisances attendues dans le groupe recevant la souche pathogène C600:933W sont l’expression d’un syndrome infectieux : faiblesse ; possible diarrhée ; possible déshydratation consécutive à la diarrhée et aggravée par la difficulté des souris à s’abreuver du fait de leur faiblesse. Des contre-mesures et des points limites seront mis en place : ramequins d’aliment gélifié déposés sur la litière pour leur permettre alimentation et abreuvement sans effort physique ; surveillance 3 fois par jour pour détecter l’apparition du syndrome infectieux. Fréquence de surveillance accrue aux premiers signes cliniques, et mise à mort anticipée si les symptômes atteignent le point limite indiqué dans la procédure expérimentale. Les souris sont mises à mort au plus tard 3 jours après l’inoculation, ce qui exclut toute nuisance à long terme. Pendant toute la durée de l’expérience, les souris seront maintenues en groupes sociaux de 3 individus, dans un environnement enrichi ; de l’eau stérile, des croquettes de nourriture stérile de formulation standard et de l’aliment gélifié stérile de formulation standard seront mis à leur disposition à volonté.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Celle-ci est nécessaire pour l’obtention des organes et tissus dans lesquels seront pratiquées des analyses destinées à étudier l’effet de la production de shigatoxine par la souche d’Escherichia coli introduite dans le tube digestif des souris.Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

L'analyse des mécanismes du pouvoir pathogène des STEC, qui se traduit par l’envahissement de différents organes par une toxine, n’est actuellement possible que chez des animaux vivants. Il n’existe en effet pas d’alternative non animale suffisamment sophistiquée pour simuler un être constitué de plusieurs organes interagissant entre eux par de multiples voies.

Réduction

L’expérience de nos partenaires argentins dans le domaine étudié permet de considérer que 6 souris par groupe sont un effectif suffisant pour comparer des résultats d’immunohistochimie de manière robuste entre groupes. Nous utiliserons donc 6 souris par groupe dans les deux groupes témoins. Dans le groupe inoculé avec la souche pathogène, la survenue d’un syndrome infectieux pourra amener à mettre à mort des souris de manière anticipée, si les points limites définis à l’avance sont atteints. Les analyses de tissus seront tentées sur ces animaux. Mais, si la mise à mort est très anticipée par rapport à la date prévue pour mettre à mort toutes les souris, les résultats pourraient ne pas être comparables à ceux des groupes témoins. Nous prévoyons donc 6 souris supplémentaires dans ce groupe, qui seront utilisées si nécessaire. Le protocole comportera donc 3 groupes de 6 souris, plus 6 souris supplémentaires, ce qui aboutit à un total de 24 animaux.

Raffinement

Il n’y a pas de souffrance liée à l’hébergement en isolateur. Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 3 individus par cage, sur une litière de copeaux. Croquettes de nourriture de formulation standard et eau stériles seront distribuées à volonté. Un enrichissement de milieu sera apporté : papier à déchiqueter, bûchettes à ronger, tunnel dans lequel se cacher. Cet enrichissement est similaire à celui dont auront préalablement disposé les souris dans les cages d’élevage, elles y seront donc habituées. De plus, des ramequins d’aliment gélifié de formulation standard (gel diet) seront déposés sur la litière. Ce raffinement permettra aux souris de pouvoir s’alimenter plus facilement en cas de faiblesse et fatigue induites par un syndrome infectieux (possible dans le groupe inoculé avec la souche pathogène C600:933W). De plus, du sérum physiologique stérile à 37°C pourra être injecté par voir sous-cutanée aux souris si elles montrent des signes de déshydratation (1 ml par injection, 3 fois par jour). Les animaux seront visités 3 fois par jour après l’inoculation bactérienne pour détecter au plus vite les premiers signes d’un syndrome infectieux et décider d’une mise à mort anticipée si les points limites sont atteints. L’inoculation orale des souris avec les souches bactériennes sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Préalablement à la mise à mort des souris, au cours de laquelle une laparotomie et une perfusion intra-cardiaque seront réalisées, un analgésique sera administré par voie parentérale (flunixine ; 2,5 mg/kg ; puissante action analgésique sur les douleurs viscérales).

Choix des espèces

La souris est un modèle établi pour l’étude du pouvoir pathogène des STEC, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des jeunes souris (semaine suivant le sevrage). Chez l’Homme, les infections à STEC touchent principalement les très jeunes enfants.

2 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une à trois injections et une greffe de cellules tumorales pour induire un mélanome, la plupart des injections étant faites sans anesthésie, que le porteur juge plus traumatisante que l'acte lui-même. Il décrit comme principal risque l'ulcération de la tumeur, et toutes les souris sont mises à mort en fin d'étude pour des analyses post-mortem. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative n'existe et que ces expériences sont "indispensables" car les interactions in situ ne peuvent être modélisées in vitro.

Objectifs

Notre projet vise à déterminer le rôle précis d’un récepteur de signal de danger dans les réponses immunitaires anti-tumorales dans un modèle de mélanome chez la souris. Pour cela nous utiliserons des modèles de souris conditionnellement déficientes pour ce récepteur et nous leur injecterons des cellules tumorales suivi ou non de transfert adoptif de lymphocytes T protégeant ou attaquant la tumeur et nous étudierons la pousse tumorale, le phénotype des cellules immunitaires recrutées au sein de la tumeur et des ganglions drainants. Enfin nous évaluerons l’influence de traitements immunothérapeutiques dans ces modèles de souris.

Bénéfices attendus

Le cancer est un problème de santé publique majeur, et la 2ème cause de mortalité dans le monde. Récemment, des traitements développés chez la souris visant à lever les phénomènes de tolérance immunitaire contre le cancer ont prouvés leur efficacité chez l’Homme et redonnés un espoir de réduire la mortalité liée à cette maladie. Ces traitements n’ont néanmoins pas encore permis d’éradiquer la maladie. Ce projet permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d’améliorer les immunothérapies visant à inhiber la tolérance immunitaire aux tumeurs et augmenter l’efficacité des vaccins contre le cancer.

Procédures

Les animaux seront soumis à des Injections sous cutanées, intra péritonéales, intraveineuses. Chaque animal recevra entre 1 et 3 injections selon la procédure: procédure 1 : 1 seule injection sous-cutanée; procédure 2: une injection sous-cutanée et une injection intraveineuse (sur animal anesthésié) 1 à 3 jours plus tard; procédure 3: 1 injection sous-cutanée et 2 injections intrapéritonéales, chacune à 7 jours d'intervalle. Sauf cas indiqué, les procédures ne justifient pas l’utilisation d’anesthésiques. Une procédure de sédation rendrait en effet l’ensemble de la procédure plus traumatisante pour l'animal que la procédure expérimentale elle-même.

Impact sur les animaux

Les procédures de notre projet sont bien établies et réalisées par du personnel expérimenté pour leur réalisation. Les nuisances et effets indésirables possibles ont donc peu de chance de se produire. Etant donné les précautions prises dans l’exécution du projet, les risques comportent principalement l’ulcération de la tumeur chez les animaux porteurs de tumeurs et les éventuelles réactions secondaires (irritations cutanées, diarrhées, poil hirsute, perte de poids) aux traitements immunothérapeutiques. Pour éviter leur apparition, le comportement des animaux sera contrôlé régulièrement (tous les jours par le zootechnicien et 3 fois par semaine par l’expérimentateur). Nous serons vigilants aux changements de comportement et d’aspect des souris et les évalueront au moins 3 fois par semaine à l’aide d’un système de scoring détaillé. L’apparition de nuisance ou d’effet indésirables donnera lieu à une réponse graduée en fonction du score. Parmi les actions à prendre, figurent le traitement des animaux par des analgésiques ou la mise à mort des animaux qui atteidraient un point limite.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique que l’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l’étude de façon éthique par des personnes expérimentées.

Remplacement

En termes de remplacement, aucune alternative à l'utilisation d'un modèle murin n'étant disponible pour cette recherche, ces expériences chez la souris sont indispensables car les interactions complexes se déroulant in situ ne peuvent être modélisées in vitro. Mais pour les tests fonctionnels nous remplacerons chaque fois que possible l’utilisation des animaux par des tests in vitro. Il est à noter que parmi les 10 molécules les plus efficaces en cancérologie développées depuis 20 ans, toutes ont été découvertes grâce aux modèles murins. En particulier les découvertes de James Allison et de Tasuku Honjo leur ont valu le Prix Nobel en 2018, signe que l’immunothérapie est un espoir contre le cancer et que les avancées majeures passent par l’étude de modèles animaux.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons établi des procédures expérimentales tenant compte de l'effectif minimal pour atteindre une puissance statistique suffisante. L’utilisation de techniques modernes de phénotypage et les tests in vitro développés par notre équipe permettra également de réduire le nombre de souris utilisées. Des études exploratoires sur un petit nombre de souris seront réalisées pour sélectionner les meilleures stratégies avant d’évaluer leur impact sur un nombre plus important d’animaux. Pour mener à bien le projet sur l'ensemble des lignées, 2860 souris seront étudiées.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, nous avons mis en place des points limites précis et un système de score afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux. Les animaux seront contrôlés régulièrement et scorés par du personnel formé et compétent afin de détecter les changements de poids d’aspect et l’apparition de comportements associés à la douleur. En cas de signes précoces d’ulcération tumorale ou de souffrance, les animaux recevront des antidouleurs, et s’ils présentent de l’hypothermie ou des difficultés à se nourrir, ils seront placés dans des cages chauffées ou en présence de nourriture humidifiée respectivement. Ils seront mis à mort si le diamètre tumoral dépasse une valeur seuil ou s’ils perdent une valeur seuil de leur poids. Les souris âgées de 7 à 15 semaines seront hébergées en groupe en accord avec la législation en vigueur avec un nombre maximum de 5 souris par cage dans un environnement enrichi (lanières de papier permettant la nidification) avec un accès illimité à la nourriture et l'eau de boisson au sein d’une animalerie A2 avec surveillance informatique du respect des paramètres environnementaux (température, hygrométrie). Les animaux seront anesthésiés pour la réalisation des procédures les plus stressantes pour l'animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle valide en immunologie, en immunologie des tumeurs et particulièrement dans les études visant à mieux décrire une voie de signalisation. L’homme et la souris ont un système immunitaire proche et partagent les mêmes sous-populations de cellules immunitaires. Les modèles mimant le développement tumoral existent et sont très bien caractérisés. Nous pourrons facilement implémenter ces modèles et ainsi minimiser le nombre de souris nécessaires pour notre étude. Par ailleurs, le modèle souris offre l’avantage de pouvoir utiliser des outils immunologiques puissants permettant de suivre les cellules spécifiques d’antigène. Du fait de l’utilisation de ces modèles très spécifiques, le projet tel qu’il est ne pourrait pas être réalisé dans une autre espèce animale. Nous utiliserons des souris adultes de 7 à 15 semaines d’âge, conditions favorables permettant d’obtenir un stade de maturité immunitaire suffisant tout en limitant le temps d’hébergement total.

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre injections intrapéritonéales et subissent deux tests de saignement passant par une section de l'extrémité de la queue, pour créer un modèle d'auto-anticorps dirigés contre une protéine de la coagulation. La mise à mort sert à récupérer la totalité du sang et les organes pour doser ces anticorps. Le porteur affirme que ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris et qu'aucun modèle fiable n'existe chez des espèces jugées moins sensibles.

Objectifs

La présence d’auto-anticorps dirigé contre l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) a était historiquement décrit dans les lupus Erythematosus. Même si dans ces études il a était démontré que ces anticorps étaient dirigés contre le domaine catalytique, les techniques de l’époque n’ont pas permis de mettre en évidence un impact des anticorps sur les fonctions du tPA. D’autres études ont aussi montré la présence de ces autoanticorps dans le syndrome des antiphospholipides, une étude en particulier suggère que ces anticorps pourraient éventuellement inhiber l’activité du tPA et augmenterait ainsi le risque de thrombose. De façons plus intéressante, les travaux de Massimo Cugno et collaborateurs en 2010 ont montré que la thrombolyse de patients atteints d’infarctus du myocarde induit une réaction immunitaire qui amène à la production importante d’anticorps anti tPA. Les auteurs proposent ici que ces anticorps diminueraient les fonctions du tPA endogène à moyen terme. Dans ce contexte, au sein de notre laboratoire, nous avons développé un outil original permettant d’évaluer la quantité d’anticorps anti tPA circulant. Nous avons ainsi mis en évidence la présence de ces anticorps dans le plasma de 80 individus ayant donné leurs sangs à l’établissement français du sang. Ces résultats montrent des niveaux très hétérogènes et démontrent que certains individus présentent des taux très supérieurs. Nous avons aussi démontré un impact de ces auto anticorps sur certaines fonctions du tPA. Afin de mieux comprendre le rôle de ces auto anticorps nous avons aujourd’hui besoin de mettre en place un modèle chez la souris. Ce modèle reposerait sur l’immunisation active de souris c57b6 et de souris c57b6 tPA ko (souris tPA NULL).

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est la création d'un modèle original permettant de comprendre les fonctions de ces auto anticorps et de leur impact sur l’hémostase.

Procédures

- quatre injections intrapéritoneales (duree 5 min chacune) - deux tests de saignement (30 min chacun)

Impact sur les animaux

Lors de projets précédents utilisant des procédures identiques ou similaires, nous n’avons pas observés de signe de douleur ni souffrance des animaux à la suite des injections. Nous pouvons néanmoins nous attendre à du stresse lors de la manipulation de la contention, d’où l’importance de réaliser une habituation préalablement. Une réponse à l'immunisation est attendu avec une augmentation modérée de la température de l'animal. Par ailleurs dans nos expérimentations précédentes, les animaux ayant subi une section de l'extrémité de la queue n'ont pas présenté de signe de douleur ni de souffrance.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin d'évaluer la présence des auto anticorps dans le sang et dans les différents organes. Par ailleurs les études sur l'activité et la quantité de tPA circulant nécessite la totalité du sang de l'animal.

Remplacement

Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 56 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques c57b6 WT et c57b6 tPA Null. Ces modèles transgéniques ne peuvent être réalisés que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’homme. Les souris tPA WT et tPA Null utilisées dans cette étude seront commandées à l'age de 8 semaines, à la fin de l'expérimentation les animaux seront âgés donc de 16 semaines correspondant à un stade jeune adulte (4 mois). Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature dans l'étude de la neuroinflammation.

4 995 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des bactéries, greffées de cellules tumorales ou exposées à des substances cancérigènes, puis traitées par antibiotiques, immunothérapies ou phages, pour étudier la réponse immunitaire de la vessie. La description des procédures reste très générale et le porteur reconnaît des douleurs d'infection et un risque d'obstruction urétérale par les tumeurs. Il justifie ce nombre élevé par la nécessité d'organes intacts et affirme n'avoir "aucune autre alternative pertinente".

Objectifs

Notre objectif est de comprendre la réponse immunitaire à l'infection, au cancer et aux immunothérapies dans la vessie. Cette compréhension nous permettra d'identifier des cibles pour les futures imunothérapies afin d'améliorer le traitement des infections, des cancers et d'autres maladies de la vessie.

Bénéfices attendus

Nous espérons avoir une meilleure compréhension du fonctionnement de la réponse immunitaire dans la vessie et comprendre les mécanismes par lesquels les approches thérapeutiques, telles que la vacciantion ou la phagothérapie, améliorent l'immunité contre la maladie.

Procédures

les animaux seront infectés par des bactéries, ou implantés avec des cellules tumorales, ou recevront des substances cancérigènes pour développer des tumeurs. Ensuite, les animaux seront traités avec des médicaments, tels que des antibiotiques, des immunothérapies ou des phages.

Impact sur les animaux

Bien que nous ayons mis en place un plan pour éviter les effets néfastes, il est possible que les animaux ressentent des douleurs dues à une infection, comme c'est le cas chez l'homme, ou que des tumeurs à croissance rapide provoquent une obstruction urétrale. Nous pouvons surveiller ce scénario pour éviter cette possibilité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de toutes les procédures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est absolument nécessaire pour ce projet puisqu’il n’existe aucune autre alternative pertinente pour ce genre de projet. En outre, ces études doivent être effectuées in vivo, parce qu’il est nécessaire que les organes et les systèmes impliqués soient intacts afin de bien comprendre la migration cellulaire et la réponse immunitaire (innée et adaptative).

Réduction

Réduction : Le nombre de souris a été calculé pour utiliser le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'analyse statistique, sur la base d'expériences antérieures. Dans la mesure du possible, un seul groupe témoin sera utilisé pour plusieurs groupes expérimentaux afin de réduire le nombre total de souris nécessaires, sans compromettre l'intégrité de l'expérience.

Raffinement

Raffinement : Tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress, l'inconfort et la douleur des animaux. Cela comprend une surveillance régulière, l'administration de médicaments antidouleur approuvés si les souris souffrent (aspect voûté, piloérection) et la détermination de points limites avant de commencer l'expérimentation (perte d'un pourcentage prédéterminé de poids, par exemple) (le tout conformément à la réglementation européenne).

Choix des espèces

Les souris sont un bon modèle pour étudier les réponses immunitaires contre les bactéries. Il a été démontré empiriquement que les infections des voies urinaires chez la souris reflètent, dans de nombreux aspects essentiels, l'état de la maladie observée chez l'homme. Il a été démontré que la voie utilisée par les pathogènes identifiés comme uropathogènes chez la souris est également utilisée chez l'homme, ce qui justifie l'utilisation de la souris comme un modèle approprié pour l’infection des voies urinaires. Des travaux précédents de notre laboratoire ont démontré que la réponse des souris traitées par BCG-thérapie pour le cancer de la vessie est très similaire à celle observée chez l'homme, justifiant à nouveau la souris comme un modèle utile pour l'étude de l'immunothérapie dans la vessie. On va utiliser les souris de 6 à 24 semaines. Cet âge chez la souris équivaut à l’âge adulte chez l’homme. Dans un très petit nombre d'observations, nous analyserons la vessie de souris néonatales non manipulées qui n'ont pas encore été sevrées, âgées de 0 à 28 jours, afin d'identifier spécifiquement le moment où les populations de macrophages résidents dans la vessie divergent en deux populations distinctes et si cela dépend du passage de l'allaitement à l'alimentation solide. Nous pensons avoir besoin de 8 à 10 souris par point temporel, 4 points temporels étant prévus. Donc, 40 souriceaux femelles et 40 souriceaux mâles