Organes sensoriels
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Etude de l’impact du diabète induit sur la fonction auditive chez la souris C57Bl/6JRj
- Recherche fondamentale
- Oncologie
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- Système endocrinien
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète est provoqué par injection de streptozotocine, puis les animaux subissent des mesures répétées de glycémie par piqûre de la queue, des tests auditifs et une électrophysiologie du nerf caudal sous anesthésie, avant prélèvement des cochlées, pour préciser l'atteinte auditive liée au diabète. Le porteur prévoit la mise à mort des souris perdant plus de 20 % de leur poids ou montrant prostration, léchage excessif ou automutilation, ce seuil déclenchant l'euthanasie. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace ces tests menés sur animal vivant et retient la souris pour la "similitude" de sa fonction auditive avec celle de l'homme.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris : la souris de souche C57Bl/6J Rj (souris présentant une dégradation de sa fonction auditive dès le 2ème mois de vie, modèle de surdité liée à l’âge ou presbyacousie).
Bénéfices attendus
Le diabète représente aujourd’hui la plus fréquente des maladies chroniques puisqu’elle touche près de 6 % de la population. Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par un excès du taux de sucre dans le sang (hyperglycémie). Actuellement le patient diagnostiqué et pris en charge dispose de nombreuses propositions thérapeutiques plus souples d’utilisation et l’innovation pharmacologique est au coeur des progrès dans le traitement du diabète. Cependant au fil du temps, un diabète mal surveillé et mal géré peut entrainer des conséquences dont les plus fréquentes et les plus connues sont la cécité et les amputations des extrémités (doigts et orteils) ou des membres. Ces complications semblent être induites par la détérioration et l’obstruction des petits vaisseaux ou la dégénérescence des nerfs. Cette atteinte des nerfs est classiquement appelée neuropathie. Par ailleurs, les données de la littérature concernant la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques (de type 1) sont contradictoires. Selon une récente méta-analyses, la prévalence de la surdité serait évaluée entre 5.17% et 48% chez les patients diabétiques de type 1. Une autre étude clinique ne révèle aucune différence significative de la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques de type 1 comparativement aux sujets non diabétiques. Les outils d’exploration audiologiques sont-ils assez sensibles pour détecter l’installation d’une atteinte auditive subtile ? De nombreuses études pré-cliniques ont révélé que des pertes massives de cellules ciliées internes, ou de fibres nerveuses pouvaient être sans conséquence sur les seuils liminaires (seuils de détection, déterminés par l’audiométrie). L’atteinte auditive chez les patients diabétiques pourraient donc être sous-estimées car mal évaluée. Il semble donc indispensable de documenter du point de vue fonctionnel et histologique plus précisément sur des modèles murins cette complication « silencieuse » du diabète.
Procédures
- La glycémie sera déterminée par des "prélèvements capillaires" sanguins (gouttes de sang) suite à une légère piqûre au niveau de la queue de l'animal (utilisation de lecteur de glycémie identique au lecteur clinique humaine avec bandelette de prélèvement stérile à usage unique). Cette procédure dure moins de 5 minutes. Cette procédure de détermination de la glycémie est réalisée de façon hebdomadaire. - Injection intrapéritonéale de streptozotocine (1 fois en moins de 2 minutes). Le test pour évaluer si un diabète a été induit par l'apparition d'une neuropathie périphérique, sera effectuée à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%). Par l'insertion de deux paires d'électrodes distantes (une stimulatrice et une enregistreuse du signal) au niveau de la queue de l'animal, une réponse éléctrophysiologique du nerf caudal sera mesurée afin de montrer une possible neuropathie périphérique liée à l'induction du diabète. Une asepsie sera pratiquée sur la queue des animaux par une application d'alcool 70°. Les explorations auditives seront effectuées à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%) . Les deux méthodes utilisées dans ces explorations fonctionnelles sont : -Les otoémissions acoustiques : lorsqu’une stimulation acoustique calibrée est appliquée dans le conduit auditif externe, il est possible de recueillir en retour une réponse physiologique acoustique issue d’une population particulière de la cochlée : les cellules ciliées externes. Cette technique de réalisation simple et rapide (5min par animal) renseigne sur la fonction cochléaire et sur la physiologie des cellules ciliées externes. -Les potentiels évoqués auditifs précoces : il est possible à l’aide d’électrodes intradermiques (3 électrodes placées : au niveau de la mastoïde (électrode active), du vertex et au niveau dorsal) de recueillir la réponse électrophysiologique de la cochlée et des voies nerveuses auditives périphériques. Ainsi à l’aide de stimulations calibrées adéquates il est possible de déterminer des seuils auditifs (corrélat de l’audiogramme clinique, pour les fréquences de 8, 10, 16, 24 et 32kHz) et de déterminer des latences de conduction des voies nerveuses (temps de réalisation 15-20min par animal).
Impact sur les animaux
Si les animaux sont diabétiques, une altération de leur état de santé général peut être visible (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…)).
Devenir
A la fin des explorations fonctionnelles, l’euthanasie des animaux sera réalisée au moyen d’une injection léthale d'euthanasiant chimique en vue de prélèvement des os temporaux pour une étude histologique des cochlées. Les animaux ayant reçu une injection de streptozotocine mais ne développant pas un diabète seront euthanasiés (inhalation de CO2). Les animaux présentant une altération de leur état de santé général (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être) seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2).
Remplacement
Ce projet a pour but d'évaluer l'impact du diabète induit sur l'appareil auditif chez une souche de souris (étude fonctionnelle et histologique). Le modèle de diabète induit par la streptozotocine fait référence dans la communauté scientifique. Du fait d’une grande similitude de la fonction auditive de la souris avec celle de l’homme, cette espèce a depuis longtemps été retenue dans notre équipe de recherche. Pour mieux caractériser l'impact du diabète sur l'audition d'un point de vue fonctionnel, les tests auditifs doivent être réalisés sur des animaux vivants. Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal anesthésié, sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements dans de prochains projets.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au minimum, nous projetons d’employer les mêmes animaux diabétiques (n=20) et témoins (n=10) pour les tests fonctionnels auditifs et pour les analyses histologiques. Cependant, dans un premier temps, nous devons déterminer si une seule injection intra-péritonéale de 150mg/kg de streptozotocine induit un diabète chez la souche de souris C57Bl6/JRj (10 animaux). Pour cela, la glycémie (prélèvement sanguin caudal -1goutte par dosage – animal vigil légèrement contraint) des animaux traités par STZ sera évaluée quotidiennement sur 6 semaines pour déterminer le statut « diabétique » définitif des animaux (selon la souche). Les animaux seront euthanasiés dès statut «diabétique » confirmé (inhalation gazeuse de CO2). L’étude statistique sera réalisée à l’aide d’un test de Student en comparant les valeurs obtenues de chaque groupe exposé avec les valeurs du groupe témoin pour chaque test fonctionnel aux différents temps du suivi.
Raffinement
Les animaux seront pesés et observés tous les jours (mobilité dans la cage et/ou immobilité, prostration, prise alimentaire). Le comportement général de l’animal, son apparence, la présence d’eau et de nourriture dans chaque cage seront surveillés quotidiennement (7j/7). Si besoin, les souris diabétiques recevront une injection sous-cutanée (s.c.) d’insuline (dissoute dans du sérum physiologique, 0,6UI/souris) tous les deux jours, afin de leur assurer un statut clinique satisfaisant et de limiter l’inconfort dû au diabète. L’animal sera euthanasié s’il présente un des symptômes suivants : -une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, - une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), -l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…). En référence à un document « points limites », tout comportement de léchage excessif, d’autotomie, de prostration ou de vocalisation conduira à l’euthanasie rapide des animaux par inhalation gazeuse de CO2.
Choix des espèces
La souris de souche C57Bl/6J Rj présente une dégradation de sa fonction auditive dès le 2ème mois de vie (modèle de surdité liée à l’âge ou presbyacousie). L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris présentant une dégradation spontanée de leur fonction auditive. Les animaux utilisés sont âgés de 6 semaines à l'initiation des expérimentations (réception à l'âge de 5 semaines, 1 semaine d'habituation aux conditions d'hébergement). L'appareil auditif de la souris est mature à l'âge de 30 jours.
Evaluation de l’efficacité de molécules thérapeutiques dans un modèle de dermatite atopique chez la souris et le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 600
1 800 rongeurs, 1 200 souris et 600 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de légères à modérées. Sous anesthésie, ils sont tatoués et dépilés sur le dos, puis une dermatite atopique est induite par application locale, avant traitement local ou oral et suivi par imagerie. Le porteur décrit une desquamation, un érythème, un épaississement de la peau et un grattage excessif, réversibles à l'arrêt de l'induction. Il indique tester des molécules dans l'espoir d'une mise sur le marché et affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace complètement la peau vivante.
Objectifs
La dermatite atopique, encore appelée eczéma atopique, est une des maladies les plus fréquentes de l'enfant qui peut apparaître dès les premiers mois de la vie. C’est une maladie inflammatoire chronique de la peau. Elle débute le plus souvent vers l'âge de trois mois, mais peut également s'observer dès les premiers jours de la vie. Chez le nourrisson les lésions de la peau s'observent sur les joues et le menton, les cuisses, les bras et l'abdomen. Les lésions évoluent progressivement ou simultanément sous la forme de rougeurs, de démangeaisons, de vésicules puis de croûtes. L’origine de cette pathologie est principalement allergique. Il n’existe pas de traitement curatif efficace à ce jour. Les traitements utilisés sont symptomatiques et permettent de réduire les signes cliniques. Il est donc important d’avoir un modèle préclinique pertinent permettant de tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’homme)
Bénéfices attendus
La dermatite atopique est une maladie de la peau qui a d'importantes répercussions physiques et psychologiques chez les patients (grattage, plaies, croutes, modification de l'image corporelle...) Les bénéfices de ce projet, si une molécule se révélait efficace, serait de mettre sur le marché une molécule permettant aux patients atteints de cette pathologie de réduire voire effacer l'inconfort cutané ainsi que les lésions associées.
Procédures
Pas de prélèvements sur animaux vigiles. Pas de procédures chirurgicales. Les animaux seront anesthésiés (temps d'intervention
Impact sur les animaux
L'induction de la dermatite atopique est assez bien décrite dans la littérature, elle induit uniquement une inflammation locale caractérisée par de la desquamation, de l'érythème et par un épaississement de la peau. L'animal peut également présenté un grattage excessif du à l'induction de la dermatite atopique. Ces réactions sont transitoires chez l'animal et peuvent être réversées par un arrêt d'induction. Il est également possible que les molécules testées notamment par voie topique puissent assécher localement de façon excessive la peau du dos ou des oreilles. Si tel était le cas, les fréquences de traitement seraient espacées.
Devenir
Tous les animaux des procédures 1, 2 et 3 seront mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
L'utilisation du modèle animal de dermatite atopique ne sera utilisé qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme).
Réduction
La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d’imagerie. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (ANOVA; seuil de significativité alpha de 5% dont le critère principal sera l'épaisseur de la peau du dos et des oreilles en fonction du temps) et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle car une observation est réalisée avant d’initier les phases de traitement. Le nombre d’animaux sera de 8 répartis en 5 groupes (un groupe induit mais non traité, un groupe induit et traité avec une molécule de référence type bétaméthasone, un groupe induit traité avec l'excipient de la molécule à tester, 2 groupes d’animaux devant recevoir la molécule à tester à deux différentes doses ou recevant 2 molécules à tester). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable avec une variation de 15%, une puissance de 70 %, et une différence à souligner de 20 % entre groupes témoins et tests comparativement à l’approche classique. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées (histologie / immunohistologie / PCR/ Cytométrie et approches « omiques ») afin d’obtenir le plus d’informations possibles relatives à l’efficacité des molécules administrées sur les animaux. L'utilisation d'imagerie OCT permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés de 50% du fait du suivi longitudinal de chaque animal.
Raffinement
Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, buchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation - Perte de poids >20 % du poids normal maintenue sur 72h - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule topique. Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris immunocompétentes Balb/c) et les rats (hairless immunocompétents) sont d’excellents modèles de dermatite atopique. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l’évaluation de la dermatite atopique induite dans ces espèces. De plus, ces animaux développent des symptômes de dermatite atopique très semblables à ceux observés chez l’humain. Ils présentent aussi certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~8-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Tous les animaux auront le même âge. Les résultats publiés avec ce modèle utilisent des animaux de cet âge.
Creation d’un modèle murin des affections neurosensorielles et étude d’une thérapie
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation reproduisant une neuropathie humaine, elles développent des déficits auditifs et visuels, et subissent des mesures de l'audition et de la vision sous anesthésie générale avec pose d'électrodes sous-cutanées et cornéennes, puis un traitement par gavage. Le porteur indique que la privation sensorielle perturbe leurs interactions avec l'environnement et génère du stress. Il teste une molécule censée restaurer la régulation du fer, présentée comme préalable à un essai clinique chez les patients.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’étudier l’efficacité d’un traitement médicamenteux dans la récupération ou la stabilisation des fonctions auditives et optiques dans un modèle animal présentant ces atteintes neurosensorielles causées par des mutations du gène étudié. Il s’agit d’un gène découvert chez l’Homme dans un contexte de neuropathie auditive et optique débutant à l’adolescence et s’aggravant rapidement pour entrainer une cécité quasi-complète ainsi qu’un déficit auditif profond. La protéine qui est codée par ce gène présente un rôle important dans la synthèse de protéines régulant le fer intracellulaire (protéines à centre fer-soufre). Les études cellulaires ont montré que les mutations du gène entrainent une surcharge de fer dans la cellule. Les défauts de synthèse des acteurs de la régulation du fer, dont les protéines fer-soufre, sont à l’origine de cela. Il a été démontré dans ces cellules que la molécule A permet de restaurer la régulation du fer lorsque ces acteurs manquent. Or, nous ne savons pas si cela peut se traduire par la restauration des fonctions auditives et/ou optiques chez les patients. L’étude du modèle murin permettra donc, d’une part de comprendre les mécanismes physiopathologiques sous-jacents à la mutation du gène, en étudiant d'une part, les modifications des structures de l'oreille interne et de la rétine, et d'autre part, l’efficacité de la molécule A dans la récupération des fonctions sensorielles.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de comprendre les mécanismes in situ des atteintes neurosensorielles (auditive et oculaire) chez les patients portant une mutation. Nous serons capables d’étudier l’évolution de ces atteintes neurosensorielles chez la souris qui présente un développement plus rapide que l’Homme, cela nous permettra d’avoir une idée du pronostic. Nous analyserons la morphologie des cellules ciliées et du nerf auditif, ainsi que les éléments permettant la neurotransmission au niveau de la synapse. De même, une étude parallèle des cellules de la rétine, ainsi que du nerf optique, sera effectuée de la même manière. Ces éléments permettront de comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces atteintes. Le traitement des souris par la molécule A permettra d’avoir des éléments de réponses pour juger de son efficacité dans la préservation ou la récupération des fonctions auditives et optiques.L’efficacité chez la souris permettra de mettre en place un protocole de traitement des patients durant un essai clinique.
Procédures
Nous étudierons cette lignée à différentes étapes de son développement en mesurant les fonctions auditive et oculaire. La fonction auditive sera évaluée par la mesure des potentiels évoqués auditifs ainsi que des otoémissions acoustiques provoquées via le recueil des produits de distorsions. Ces mesures dureront environ 30 à 45mn. La fonction oculaire sera étudiée par l’électrorétinogramme (environ 15mn) Les enregistrements des fonctions oculaires et auditives seront réalisés après anesthésie générale (injection intrapéritonéale d’un mélange kétamine 100mg/Kg, et xylazine 10mg/Kg) Le traitement sera administré sous forme liquide par gavage oral une fois par jour chez des souris vigiles qui seront surveillées dans les minutes qui suivent afin de s'assurer de l'absence de fausse route.
Impact sur les animaux
Les souris étudiées seront atteintes de déficit auditifs et visuels, ces atteintes entraineront une perturbation leurs interactions avec l’environnement du fait de la privation sensorielle, ainsi que des modifications de leurs comportements liées au stress que cela va entrainer. Les explorations fonctionnelles auditives et optiques nécessiteront une anesthésie générale des souris par ketamine et xylazine afin de limiter au maximum la douleur liée à la mise en place d’électrode sous-cutanée permettant de recueillir les potentiels évoqués auditifs durant les stimulations auditives. Durant cette même anesthésie générale, l’implantation d’une électrode de recueil cornéenne associée à des stimulations lumineuses permettront de réaliser l’electrorétinogramme.
Devenir
Toutes les souris utilisées pour cette étude seront mises à mort à la fin de chaque procédure afin d'obtenir les prélèvements histologiques pour analyser post mortem
Remplacement
L'utilisation de cellules en culture (fibroblastes) permettra d’effectuer les premières analyses fonctionnelles pour caractériser l'impact des mutations et pour évaluer l'efficacité de la molécule A in vitro dans les fibroblastes de patients. Dans un deuxième temps, dans le cadre de développement thérapeutique, il sera indispensable d’utiliser un modèle animal afin de tester l'efficacité de la molécule in vivo, avant que son utilisation ne soit envisagée chez l’homme.
Réduction
Afin de Réduire le nombre d'animaux utilisés, la procédure d'enregistrement de l'électrorétinogramme et des potentiels évoqués auditifs et les Otoemissions acoustiques par produits de distorsions seront standardisée sur les deux yeux et sur les deux oreilles respectivement. De plus, les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les études fonctionnelles (électrorétinogramme,des potentiels évoqués auditifs et les Otoemissions acoustiques par produits de distorsions) et les analyses histologiques.Les explorations fonctionnelles serons réalisées à chaque stade de développements chez 10 souris dans chaque groupe (mutantes et témoins) avant la mise à mort de celles-ci. Le nombre de 10 animaux par condition par groupe sera suffisant pour obtenir des résultats statistiquement exploitables.
Raffinement
Les enregistrements de la fonction visuelle par électrorétinogramme ainsi que la fonctionne auditive par potentiels évoqués auditifs et les Otoemissions acoustiques par produits de distorsions seront réalisés sous anesthésie générale pour éviter toute souffrance et éviter que les animaux bougent. Les procédures mises en place pour réaliser le projet sont peu traumatiques, de courte durée, elles peuvent néanmoins engendrer du stress. Les animaux seront surveillés quotidiennement, des antalgiques seront administrés en cas de douleur et des points-limites seront établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
Le globe oculaire et l'oreille de la souris présentent des structures similaires à celles de l’humain et représentent donc des modèles adaptés pour les études physiopathologiques. De plus, les neuropathies optiques et auditives sont des pathologies pour lesquelles il est difficile de récupérer du matériel biologique adapté chez l’humain (énucléation ou pétrectomie inenvisageables), et donc de réaliser une étude scientifique fondamentale précise du tissu d'intérêt. Enfin, pour tester l’efficacité d'une molécule in vivo dans le cadre d'un développement thérapeutique, il est indispensable d’utiliser un modèle animal. Le modèle murin présente également l'avantage d'une reproduction relativement rapide compte tenu de la durée d’ovulation et de gestation de la souris. Pour toutes ces raisons, nous avons considéré le modèle murin comme étant le plus adapté pour l’étude de ces affections neurosensorielles.
Modélisation de la maladie de Stargardt chez un rongeur diurne
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
48 Psammomys obesus, rongeurs diurnes, vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement des rétines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Leur gène est inactivé par CRISPR-Cas9 dans un œil pour reproduire une dégénérescence maculaire, puis leur vision est suivie par imagerie sous anesthésie gazeuse. Le porteur indique que la perte de photorécepteurs ne touche qu'un œil et n'attend aucun autre effet indésirable. Il justifie ce rongeur, dont la rétine compte 40 % de cônes, par l'échec des modèles souris à reproduire cette maladie.
Objectifs
Ce projet a pour but de créer et caractériser un nouveau modèle animal de la maladie de Stargardt, dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente, touchant des personnes jeunes et provoquant un handicap visuel lourd dû à la perte de la rétine centrale, appelée macula. Le gène impliqué a été identifié, mais son inactivation chez la souris n'entraine aucune des lésions rencontrées chez les patients. Le rongeur diurne Psammomys obesus présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, ayant une structure rétinienne ressemblant à celle de la macula humaine. La technologie « CRISPR-Cas9 » sera utilisée pour bloquer l'expression du gène à l'origine de la maladie dans les yeux des Psammomys. Un suivi ophtalmologique longitudinal sera ensuite effectué, avec des techniques d'imagerie non invasives (tomographie par cohérence optique, fond d'œil, angiographie). Il sera suivi d’analyses cellulaires et moléculaires post-mortem. Nous espérons ainsi obtenir le premier modèle fidèle de la maladie de Stargardt, et ainsi ouvrir la voie à des approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
La suppression du gène Abca4 dans l’œil de Psammomys obesus, dont la rétine est riche en cônes comme la macula humaine, devrait permettre l’obtention d’un modèle animal de la maladie de Stargardt récapitulant les atteintes affectant les patients, et donc de déterminer les mécanismes conduisant à la perte des cônes dans cette maladie et ainsi d'ouvrir des perspectives thérapeutiques pour les patients.
Procédures
Une anesthésie gazeuse sera utilisée afin d’obtenir l’immobilité des animaux au moment des examens ophtalmologiques (imagerie OCT et fond d’œil). La durée d'anesthésie sera de 10-15 minutes pour chacun des points du suivi longitudinal. Ce suivi comprendra au moins 3 points (1, 2 et 4 semaines après injection) avec la possibilité de un à deux points supplémentaires (2 et 3 mois après injection), selon l'évolution des symptômes.
Impact sur les animaux
L’inactivation du gène à l’origine de la maladie humaine devrait entrainer une perte localisée des photorécepteurs de la rétine. Cette perte ne concernera qu’un seul des deux yeux de l’animal. Aucun effet indésirable n’est attendu à l’issue des procédures expérimentales, basées sur de l’imagerie sans contact et pratiquée au cours d’une anesthésie de courte durée.
Devenir
A la fin de chaque étape de cette procédure, les animaux retournent dans leur établissement d'origine. Ils y seront euthanasiés après la dernière étape pour prélèvements des rétines afin d'effectuer des analyses moléculaires et cellulaires complémentaires.
Remplacement
Nous cherchons à modéliser une maladie complexe - maladie de Stargardt, forme de dégénérescence maculaire précoce. Pour ce faire, il est nécessaire de pouvoir disposer d'une rétine dont la structure est proche de celle de l'homme (le modèle souris a montré ses limites pour cette maladie, le rat ne semble pas mieux adapté avec seulement 1% de cônes, contre 3% chez la souris et 40% chez Psammomys obesus), avec des interactions maintenues avec l'épithélium pigmentaire sur une durée d'un mois ou plus. Aucun modèle in vitro disponible à l’heure actuelle ne permet de reproduire ces conditions.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, l’approche Crispr-Cas9 a été validée par analyse génomique puis sur des cellules. Chaque animal sera son propre contrôle. Avec la précision de l’imagerie OCT, 12 animaux par condition (traitement, sexe) ceci permettra de valider les résultats avec une puissance statistique satisfaisante (>90%) même en cas d’un amincissement rétinienne de l’ordre de 10%, en nous basant sur la variabilité inter-animal observée chez le rat. Au cours de la maladie de Stargardt, une réaction inflammatoire est observée. Afin de vérifier si une inhibition précoce de cette inflammation permettrait de limiter les atteintes rétiniennes, la moitié des animaux sera placée sous traitement anti-inflammatoire dès l’inactivation du gène. Ceci fait donc un total de 48 animaux (24 mâles, 24 femelles).
Raffinement
OCT et fond d’œil sont des méthodes d’imagerie non invasives. Elles sont réalisées sous anesthésie chez les animaux uniquement afin d’obtenir leur immobilité sur le temps d’observation. Chez l’homme, elles sont réalisées avec des équipements comparables sans anesthésie ou analgésie. Une anesthésie gazeuse est préférée à une anesthésie par injection intra-péritonéale, car la durée d’anesthésie peut être maintenue au minimum nécessaire, avec un réveil rapide. Les deux examens seront effectués de manière bilatérale sur la même anesthésie. Comme le réflexe de clignement est absent sous anesthésie, la cornée sera maintenue hydratée grâce à du gel ophtalmique pendant toute la durée de perte de connaissance. Les animaux seront placés sur un coussin chauffant afin de maintenir leur température corporelle. Les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil complet.
Choix des espèces
Les études sur modèles murins n’ont pas permis de reproduire les symptômes de la maladie de Stargardt. La souris, rongeur nocturne avec seulement 3% de photorécepteurs cônes (3% des photorécepteurs). Nous utiliserons ici un modèle rongeur diurne, Psammomys obesus, dont la rétine est enrichie en cônes (40% des photorécepteurs), ce qui rapproche sa structure de la macula humaine. Le gène à l’origine de la maladie de Stargardt sera inactivé à partir du 15ème jour postnatal, car c’est à ce stade (équivalent à 7-12 ans) que la maladie se déclare chez l’homme. Les examens ophtalmologiques commenceront une semaine après. Ils seront répétés une puis deux semaines plus tard, puis si nécessaire de mois en mois jusqu’à stabilisation des atteintes rétiniennes.
Evaluation de la propriété analgésique de la mycolactone dans un modèle incisionnel plantaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une incision plantaire sous anesthésie, puis une douleur post-opératoire volontairement laissée sans analgésique chez les groupes témoins, le porteur indiquant qu'un traitement "irait à l'encontre de l'étude". Des tests plantaires répétés jusqu'à sept fois évaluent la sensibilité, et les pattes sont prélevées à la mise à mort, 48 heures au plus après l'incision. Le projet teste la mycolactone, toxine bactérienne, comme analgésique local, et le porteur affirme ne pas pouvoir se passer d'animaux.
Objectifs
Notre équipe travaille sur les propriétés anti-douleurs de la mycolactone, toxine produite par la mycobactérie M. ulcerans. En effet, les personnes atteintes d’une infection à M. ulcerans présentent de vastes ulcérations cutanées qui ne sont pas douloureuses. Dans ce contexte, nous avons démontré grâce à des tests cellulaires que la mycolactone induisait une diminution de la sensibilité locale pendant plus de 24h après son inoculation. Cela nous a également permis de disséquer son mécanisme d’action. Jusqu’à maintenant, l’activité analgésique (anti-douleur) de la mycolactone n’avait été évaluée au laboratoire que chez des souris ne présentant pas de douleur. Cela a d’ores et déjà permis de démontrer que la mycolactone présente des propriétés anti-douleur supérieures à la morphine. Dans ce contexte, notre objectif est de déterminer si la mycolactone pourrait être utilisée comme analgésique local (en raison de sa faible diffusion après inoculation) dans des modèles de « douleur ». Compte tenu de son effet durable (entre 24 et 48 h après une injection unique en sous cutanée) et de sa faible diffusion dans l’organisme, la mycolactone pourrait présenter un intérêt pour traiter les douleurs post opératoires. Ainsi nous proposons d’évaluer l’effet analgésique de la mycolactone dans un modèle pertinent de douleur post-opératoire.
Bénéfices attendus
Nos résultats antérieurs ont montré que la mycolactone présentait des propriétés anti-douleur lorsqu’elle était administrée par injection en sous cutanée chez des souris naïves (chez lesquelles aucune douleur n’a été induite). Compte tenu de ces résultats, il nous semble judicieux d’évaluer les propriétés analgésiques de la mycolactone dans le traitement des douleurs post opératoires. Ce projet se justifie puisque l’arsenal thérapeutique contre les douleurs reste limité.
Procédures
Les animaux seront répartis en 4 groupes de 180 animaux chacun (soit 720 animaux au total) : - avec incision traité par la mycolactone - sans incision - avec incision non traité - avec incision traité par un anesthésique de référence (buprénorphine). Incision plantaire, réalisée une seule fois. Procédure réalisée sous anesthésie gazeuse. La durée de la procédure est d’environ 5 à 10 minutes. Les animaux concernés sont au nombre de 540. Les 180 animaux restants subiront toute la procédure (anesthésie, désinfection de la patte) mais sans l’incision. Traitement par instillation de la mycolactone sur la plaie avant la suture, réalisée une seule fois. Procédure réalisée sous anesthésie gazeuse pendant la procédure d’incision. L’instillation ne dure que quelques secondes avant de suturer la plaie. Les animaux concernés sont au nombre de 180. Traitement par injection de la buprénorphine en intrapéritonéale, réalisée une seule fois. Procédure réalisée sous anesthésie gazeuse juste après la procédure d’incision. L’injection en intrapéritonéale ne dure que quelques secondes. Les animaux concernés sont au nombre de 180. Acclimatation au test plantaire, 5 jours consécutifs pendant 15 minutes à chaque fois. Tous les animaux sont concernés par cette procédure soit 720 animaux. Tests plantaires à T-1 avant incision, puis après incision et traitement par mycolactone ou buprénorphine : 2h, 4h, 6h, 24h, 30h et 48h, soit au maximum 7 fois. Le test plantaire dure environ 20 minutes. Tous les animaux sont concernés par cette procédure soit 720 animaux. Chronogramme des procédures : J-5 : acclimatation au test plantaire 15 min J-4 : acclimatation au test plantaire 15 min J-3 : acclimatation au test plantaire 15 min J-2 : acclimatation au test plantaire 15 min J-1 : acclimatation au test plantaire 15 min T-1 : test plantaire pré-incision T0 : incision + instillation de la mycolactone sur la plaie avant suture ou injection de la buprénorphine (groupe test ou groupe témoin incisé traité) T2h : test plantaire T4h : test plantaire T6h : test plantaire T24h : test plantaire T30h : test plantaire T48h : test plantaire puis sacrifice et récupération des pattes
Impact sur les animaux
Suite à l’incision, il est attendu une douleur modérée, tout particulièrement chez les animaux non traités. Plusieurs indicateurs seront suivis : - L’induction d’une sensibilité accrue que nous détecterons lors des tests plantaires par un temps de réaction réduit par rapport aux souris non incisées. Les données des tests plantaires seront analysées au fur et à mesure et les tests seront arrêtés si, 2h suite à l’incision, aucun effet analgésique n’est observé de la part de la mycolactone. Si un effet analgésique apparait, les tests se poursuivront jusqu’à ce que l’effet disparaisse (lorsque le temps de réaction des souris ayant reçu la mycolactone sera de nouveau identique à celui des souris du groupe témoin incisé non traité). - Une perte de poids est attendue mais ne devra pas excéder 5% en 24h ou 10% sur la durée totale de l’expérience (48h), sinon, les souris concernées seront euthanasiées. - L’induction d’une modification de la démarche (telle qu’un boitement). Si un animal présente une absence totale d’utilisation de sa patte, il sera euthanasié. - Un changement du comportement les 24 premières heures. Il est à noter que les animaux seront mis à mort maximum 48h après l’incision. De plus, malgré nos précautions, une surinfection de l’incision n’est pas à exclure. A l’apparition des signes de surinfection, les animaux seront mis à mort. Le comportement sera analysé selon une grille d’évaluation des scores. Son utilisation nous fournira un score qui sera décisionnel : - Pas d’action nécessaire. - Douleur légère, l’animal sera surveillé plus régulièrement pour vérifier l’évolution de son état. - Douleur modérée, l’animal sera surveillé plus régulièrement pour vérifier l’évolution de son état et un enrichissement supplémentaire sera apporté. - Douleur sévère, le point limite sera considéré comme atteint et l’animal sera euthanasié. Les souris seront systématiquement euthanasiées si elles présentent une infection de la patte. La douleur sévère ne sera pas atteinte. Si des animaux atteignent ce stade, ils seront immédiatement mis à mort. Nous n’utiliserons pas d’analgésiques (en dehors de la mycolactone pour le groupe test et de la buprénorphine pour le groupe témoin) car ceux-ci iraient à l’encontre de l’étude. Le but étant de provoquer une douleur post opératoire et de vérifier l’efficacité de la mycolactone dans le traitement de cette douleur. Une observation biquotidienne des souris sera réalisée.
Devenir
A la suite du dernier test plantaire, tous les animaux seront sacrifiés et les pattes seront récupérées pour des études histologiques.
Remplacement
Le bien-être animal a été une des priorités dans la conception de cette étude mais nous ne pouvons à ce stade nous passer d'utiliser des animaux. En effet, la phase réalisée chez les animaux permettra de valider l’effet de la mycolactone dans le traitement de douleurs post opératoires dans un système biologique complexe où de nombreux facteurs peuvent intervenir (disponibilité du composé, dégradation, capacité du composé à atteindre sa cible...). De plus cette phase est obligatoire pour le développement d’analgésiques destinés à la santé humaine et animale.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour cette étude est suffisant pour que les résultats soient statistiquement significatifs sans pour autant exagérer ce nombre. Afin de valider des différences statistiques, les groupes seront composés de 6 souris. Si l’analyse des résultats montre l’absence d’effet analgésique de la part de la dose/formulation de mycolactone utilisée, ou souligne des effets secondaires (non rapportés à ce jour dans nos travaux précédents), les expériences ne se poursuivront pas pour cette dose/formulation. Cependant, si les résultats montrent un effet analgésique sans effet indésirable, alors l’expérience sera répétée une seconde fois indépendamment pour accroître la qualité de nos résultats. Il est nécessaire de répéter les résultats (formulations/doses retenues) dans une deuxième expérience indépendante. Ce préalable est indispensable pour la poursuite de notre étude, qui vise à réaliser une étude dans un modèle animal plus complexe.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des souris, un suivi adapté des animaux a été instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'elles pourraient éprouver. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. Un suivi régulier sera effectué sur l'ensemble des animaux et des indicateurs comportementaux et physiques sont prédéfinis et constituent les points limites. Pour éviter toute souffrance ou stress lors du protocole expérimental, un anesthésique gazeux (isoflurane) sera utilisé. La procédure d’incision sera d’abord pratiquée sur des cadavres pour s’entrainer à maitriser et calibrer l’incision avant de démarrer le protocole sur animaux vivants. Cet entrainement permettra de réaliser la procédure efficacement et rapidement pour éviter toute souffrance ou stress inutile aux animaux et diminuer le temps d’anesthésie générale. La dose de mycolactone appliqué sera plafonnée à une certaine dose, quelle que soit la formulation, car nos travaux précédents montrent qu’au-delà de cette dose il y a un risque de lésions tissulaires et d’inflammation. Lors de chaque expérience, les données des tests plantaires seront analysées au fur et à mesure et les tests seront arrêtés si à 2h aucun effet analgésique n’est observé de la part de la dose/formulation de mycolactone testée. Si un effet analgésique apparait, les tests se poursuivront jusqu’à ce que l’effet disparaisse, c’est-à-dire lorsque le temps de réaction au test plantaire des souris ayant reçu la mycolactone sera de nouveau identique à celui des souris du groupe témoin incisé non traité. De plus, pour le groupe de souris ayant reçu la buprénorphine, les tests de ce groupe seront arrêtés une fois que l’effet de la buprénorphine aura disparu (soit environ 6h selon la bibliographie). C’est-à-dire lorsque leur temps de réaction au test plantaire sera de nouveau identique à celui des souris du groupe témoin incisé non traité. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et, est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.
Choix des espèces
De nombreuses études visant à identifier de nouveaux analgésiques utilisent « l’espèce souris ». Dans notre contexte, cette espèce nous semble très pertinente puisque son utilisation nous a permis de disséquer la propriété anti-douleur de la mycolactone. De plus, de très nombreux outils pour cette espèce sont disponibles (pour analyser les propriétés analgésiques et les effets secondaires indésirables). Les animaux utilisés pour ce protocole devront, à l’initiation de l’expérimentation être âgés de 8 semaines (maturation immunitaire et maturation du système nerveux).
Etude de modèles de surexpression d’HTRA1 dans la pathogénèse de la DMLA dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
1740 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent du tamoxifène pour surexprimer une protéase, puis une inflammation sous-rétinienne induite par photocoagulation laser ou par exposition lumineuse forte de quatre jours, pour créer un modèle de dégénérescence maculaire. Le porteur qualifie l'atteinte de légère au motif que la vision n'est pas indispensable à la souris, qui se repère à ses vibrisses. Il affirme que les cultures cellulaires ne peuvent reproduire ce processus impliquant de nombreux types cellulaires.
Objectifs
Le but de cette étude est dans un premier temps de générer des souris surexprimant une protéase impliquée dans l’inflammation sous-rétinienne dans différents types cellulaires impliqués dans la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) afin de développer un modèle de souris présentant un phénotype le plus proche possible de la DMLA. Cela permettra de tester d’éventuelles nouvelles thérapies de façon plus spécifique. Dans un deuxième temps, et après avoir sélectionné les souches de souris présentant le phénotype le plus proche de la DMLA, nous tenterons de traiter la maladie par injection d’un inhibiteur de la protéase en question et d’un agoniste d’un récepteur connu pour jouer un rôle dans le processus de résolution de l’inflammation. Ce projet permettra de déterminer si ce sont des cibles pharmacologiques pertinentes pour le traitement de l’accumulation de macrophages dans l’espace sous-rétinien, ce qui permettrait de développer une potentielle thérapie contre la DMLA avec des répercussions majeures en termes de santé publique.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'évaluer le rôle d’une protéase impliquée dans la DMLA comme potentielle cible thérapeutique (de manière constitutive ou induite sur certains types cellulaires spécifiquement) et le traitement par inhibition de cette protéase ou par induction d’un agoniste d’un récepteur connu pour jouer un rôle dans le processus de résolution de l’inflammation. Il permettra en outre d’établir un modèle murin plus spécifique de la DMLA.
Procédures
Induction de la surexpression d’une protéase impliquée dans l’inflammation par injection de tamoxifène 1 fois par jour pendant 5 jours (IP, moins d’une minute par injection) Induction d’une inflammation sous-rétinienne par photocoagulation laser (sous anesthésie gazeuse, moins d’une minute par œil) ou illumination (4jours) ou simplement vieillissement et traitements en injection intra-vitréenne, sous anesthésie systémique (injection IP, moins d’une minute par œil). Tous les prélèvements se feront suite à l’euthanasie par méthode réglementaire de l’animal. Il n’y a pas de procédure chirurgicale engagée dans ce projet.
Impact sur les animaux
Induction d’une inflammation sous-rétinienne par photocoagulation laser ou illumination ou simplement vieillissement. Cela entraîne un phénotype léger : nuisance visuelle mais vision non indispensable à la souris pour se déplacer (utilisation de ses vibrisses) et pas de douleur perceptible (pas de changement du comportement de la souris). La procédure d’illumination est la seule procédure jugée à gravité modérée en termes de stress car les animaux sont placés dans une autre cage dédiée et seront exposés à une intensité lumineuse forte pendant 4 jours. Les souris peuvent être stressées par ce changement d’environnement, aussi l’illumination ne démarre que plusieurs heures après que les souris n’aient été mise dans ce nouvel environnement plus restreint.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Les études in vitro sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’études des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Dans nos études nous nous intéressons aux mécanismes d’inflammation sous-rétinienne associée à une néo vascularisation. Ce processus implique l’interaction de nombreux types cellulaires qui ne peut être étudié qu’au sein d’un organisme entier et ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus.
Réduction
Le phénotype des 6 souches de souris surexprimant la HTRA1 dans différents types cellulaires spécifiques seront étudiées dans des conditions normales et après deux modèles d’induction in-vivo d’inflammation sous-rétinienne. Dans un deuxième temps, et après avoir sélectionné les souches de souris présentant le phénotype le plus proche de la DMLA pour réduire le nombre de souris, nous tenterons de traiter la maladie par injection d’un inhibiteur de la HTRA1 et d’un agoniste de CD47 ou de la solution contrôle. Nous devons donc induire plusieurs expériences avec les différentes souches en comptant des groupes de 10 souris. Le nombre de 10 animaux permet la réalisation des analyses statistiques adéquates pour une interprétation fiable des résultats. Ces expériences pourront être induites 3 fois en raison de la grande variabilité du développement de la maladie entre les souris d’un même groupe (sévérité de l’inflammation plus ou moins importante) et pour permettre des analyses fiables et des résultats reproductibles. Ce projet compte 3 procédures pour un total de 1740 souris nécessaires.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées avec enrichissement, alimentation et abreuvement à volonté. Les animaux auront une période d'une semaine d'acclimatation avant expérimentation. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Pour éviter toute souffrance ou détresse animale, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale lorsque nécessaire. Tout signe d’inconfort ou de détresse avant l’apparition des signes cliniques autres que ceux de la DMLA sera particulièrement surveillé, tels que l'apparence et la position anormale : poil ébouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, couché sur le côté ; comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit, changement des périodes de sommeil, réduction de la mobilité. Les critères absolus sont : État de choc, léthargie, inconscience, immobilité, difficultés respiratoires. Ils entraîneront l’euthanasie de l’animal. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées.
Choix des espèces
Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour la DMLA. La souris est un animal petit, facilement manipulable, qui se reproduit bien. En outre, l’étude des mécanismes physiopathologiques conduisant à la dégénérescence maculaire sur la souris a été validée par de nombreuses publications, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développée les modèles de surexpression de la HTRA1. Le laboratoire dispose de l’ensemble des fonds génétiques de souris permettant de réaliser ces études. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines minimum à leur entrée dans la procédure expérimentale. C’est l’âge à partir duquel le système immunitaire et vasculaire de la souris est mature et donc à partie duquel elle est susceptible de développer la maladie.
Etude de la réponse mémoire à Staphylococcus aureus dans des modèles murins de psoriasis, de dermatite atopique et d’eczéma allergique de contact
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des applications cutanées répétées de la bactérie Staphylococcus aureus, d'imiquimod, de calcipotriol et de l'allergène DNFB, ainsi que des injections de toxine diphtérique, pour induire psoriasis, dermatite atopique et eczéma de contact, avec un risque de nécrose cutanée. L'objectif est d'étudier la réponse immunitaire mémoire de la peau. Le porteur affirme que cette réponse tissulaire ne peut être remplacée par des modèles in vitro.
Objectifs
Staphylococcus aureus (S. aureus) est une bactérie colonisant la peau des patients atteints de dermatite atopique (DA) et de psoriasis (Pso). Des données cliniques montrent que S. aureus aggrave la DA, mais il n’y a pas d’évidence pour le Pso. La compréhension des mécanismes par lesquels la bactérie aggrave une inflammation cutanée plutôt qu’une autre permet de définir de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées sur ces mécanismes. Des résultats préliminaires obtenus dans un modèle murin montrent qu'une souche de S. aureus isolée de patients atteints de DA, est capable d’induire une inflammation cutanée de type DA, ainsi qu’une infiltration de lymphocytes T. D’autres résultats montrent que la réponse mémoire à S. aureus diffère dans des modèles sans inflammation cutanée préalable, des modèles de Pso ou de DA. Mais le rôle des lymphocytes T induits par S. aureus dans ces modèles est actuellement inconnu. Un modèle d'eczéma allergique de contact (EAC), fort pourvoyeur de lymphocytes T, sera également inclus. L’objectif principal du projet est de caractériser la réponse mémoire à S. aureus dans les différentes conditions d’inflammation cutanée (DA, Pso ou EAC) afin de trouver de nouveaux mécanismes par lesquels S. aureus est capable d’aggraver la DA. Les objectifs des procédures sont : (i) caractériser l’infiltration de lymphocytes T induite par S. aureus dans des modèles de Pso, de DA et d’EAC ; (ii) caractériser le rôle de l’infiltration de lymphocytes T dans la réponse d’hypersensibilité à S. aureus et son rôle protecteur lors d’une réexposition à la bactérie.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objet l’étude des mécanismes impliqués dans la dermatite atopique (DA), une maladie complexe touchant jusqu’à 20% des enfants dans les pays occidentaux. Les bénéfices attendus sont multiples. 1. Comprendre l’interaction entre colonisation cutanée à S. aureus et réponse immunitaire cutanée ; 2. Corréler la qualité de la barrière cutanée (normale, inflammée type 2, 17 ou 1) et la réponse mémoire cutanée à S. aureus ; 3. Comprendre les mécanismes par lesquels S. aureus aggrave la DA. Ces analyses mécanistiques s’intrègrent dans la réflexion actuellement menée sur les thérapeutiques à développer pour traiter et/ou prévenir la DA chez l’homme. La compréhension des mécanismes par lesquels S. aureus pourrait aggraver une inflammation cutanée, selon la qualité de la barrière cutanée, devrait ouvrir des opportunités thérapeutiques ciblant 1. S. aureus et ses toxines, 2. le microbiote cutané commensal et 3. la réponse immunitaire cutanée à S. aureus. Ainsi ces données alimenteront la réflexion sur l’utilisation des inhibiteurs de toxines de S. aureus, la restauration de la barrière cutanée par l’utilisation d’émollients éventuellement associés à l’application de bactéries commensales ou de pré/probiotiques et l’utilisation de traitements ciblés sur les lymphocytes T résidents mémoires.
Procédures
Application de Staphylococcus aureus à J0, J2, J6 et J8 pour induire une réponse primaire (4 applications) et éventuellement une application à J60 (1 application). Durée 5 secondes par face. Application quotidienne de 10 µl d’imiquimod de J0 à J3 et J6 à J8 (7 applications). Durée 5 secondes par face. Application de 12.5 µl de calcipotriol par face d’oreille, à J0, J2, J6 et J8 (4 applications). Durée 5 secondes par face. Application de 5 µl/face d’oreille de DNFB 0.13% à J0, J2, J6 et J8 (4 applications). Durée 5 secondes par face. Injection intrapéritonéale d'un mélange dilué de kétamine et xylazine à J0, J2, J6 et J8 pour induire une réponse primaire (4 injections) et éventuellement une injection à J60 (1 injection). Durée de l'injection 5 secondes. Injection de toxine diphtérique diluée à J56 et J59, et J66 (3 injections). Durée de l'injection 5 secondes. Mesure de l'épaisseur quotidienne des oreilles. Durée de la mesure 3 secondes par oreille. Sédation par isoflurane 3,5% pendant 30 secondes. Pesée dans une boîte adaptée, durée 5 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux, toutefois les animaux sont surveillés 5 jours par semaine et tout animal qui présenterait des signes physiologiques anormaux (souris prostrées ou encore apparition de nécrose cutanée) suite à l’application cutanée des composés, serait mis à mort.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort et certains organes sont utilisés pour analyse de la reponse immunitaire
Remplacement
L’utilisation de modèles in vivo, animaux, ne peut être remplacée par d’autres modèles. Il s’agit d’une caractéristique de la biologie cutanée : nous analysons la réponse immunitaire tissulaire, et non systémique. Ainsi les modèles in vitro, s’ils tendent à être optimisés, ne permettent pas d’analyser la réponse mémoire tissulaire. Par ailleurs, les modèles humains ne sont pas développés pour cette thématique, limités par le nombre de prélèvements réalisables. Il n’existe pas d’autre modèle expérimental de DA, de Pso ou d'EAC avec colonisation cutanée par S. aureus. Les modèles de peau reconstruite, de plus en plus utilisés en biologie de la peau, ne permettent pas l’inclusion et la stabilité de cellules immunitaires de type lymphocytes T ; l’analyse en phase mémoire est actuellement impossible. Par ailleurs, l’étude des lymphocytes T résidents mémoires se fait nécessairement au sein d’un complexe immun cutané qui n’est aujourd’hui pas modélisé dans ces peaux reconstruites. Au niveau humain, isoler les mécanismes immunitaires induits par S. aureus chez des patients atteints de DA (ou d’autres pathologies cutanées) est évidemment impossible. Les méthodes d’exposition aux bactéries (type patch-tests) ne sont pas développées et sont limitées par le nombre de biopsies réalisables chez l’Homme.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédeure expérimentale, et les souris seront maintenues entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Les soins et les procédures seront réalisées par du personnel qualifié. Le poids des animaux sera egalement suivi tout au long de l'experience, et si des animaux perdaient du poids (+ de 5% de leur poids), des croquettes humides seraient mises dans le fond de la cage.
Choix des espèces
L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique telle que l’allergie et autres inflammation cutanée en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires ou encore l’induction de des différentes populations de lymphocytes mémoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris entrent dans les procédures à 8-10 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.
Thérapie cellulaire dans un modèle de dégénérescence rétinienne le rat RCS
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
186 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rats porteurs d'une dégénérescence rétinienne reçoivent une greffe de cellules par chirurgie oculaire, sous immunosuppresseur, puis des tests comportementaux d'acuité visuelle par optométrie et boîte clair-obscur, avant d'être tués au CO2 pour prélever les yeux. Le projet teste une thérapie cellulaire dérivée de cellules souches humaines. Le porteur affirme qu'aucune méthode substitutive ne permet de mesurer l'acuité visuelle.
Objectifs
L’objectif principal du projet est de transplanter différentes populations cellulaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines (hCSPi) obtenues à partir de sujets sains (sans pathologie oculaire) chez le rat RCS (Royal College of Surgeons). Nous pourrons ainsi évaluer l’impact de la transplantation de ces différentes populations sur la survie des photorécepteurs de l’hôte et l’amélioration de l’acuité visuelle. Le rat RCS est un modèle de dégénérescence rétinienne dû à une mutation spontanée responsable de la mort des photorécepteurs (cellules photosensibles de la rétine). Cette mutation va donc induire une cécité qui débute vers 18 jours post-natal et qui sera totale au 3 mois de vie de l'animal. En résumé, dans ce projet nous souhaitons étudier (1) la survie et l'intégration (2) l'effet thérapeutique de la transplantation de différentes populations cellulaires dans un modèle de dégénérescence rétinienne par des anaylses comportementales et histochimiques réalisées à différentes temps post-transplantations : 3, 7 et 13 semaines.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet de thérapie cellulaire est de restaurer l'acuité visuelle ou ralentir la dégénérescence grâce à la transplantation de différentes populations de cellules rétiniennes chez le rat RCS. Des précédentes études ont démontré l'inocuité et la survie du transplant lors de transplantation de cellules de l'épithélium pigmentaire chez ce modèle. Aussi, une amélioration de l'acuité visuelle suite à une transplantation de ce type cellulaire a été décrite chez ce modèle animal. Cependant, de nombreuses hypothèses suggèrent que la transplantation d'un seul type cellulaire dans l'espace sous-rétinien n'est pas optimale dans le but d'une restauration visuelle. Ainsi, nous proposons de réaliser une transplantation multicellulaire avec l'obtention in vitro de mini-rétine. L'hypothése de notre étude est que (1) les différents transplants (unicellulaire et multicellulaire) vont survivre et s'intégrer (2) l'amélioration visuelle engendrée par la thérapie cellulaire sera supérieure dans le cas d'une transplantation multicellulaire en comparaison avec une transplantation unicellulaire. Il est à noter que la transplantation de mini-rétine dérivées d’hCSPi n’a jamais été réalisée dans ce modèle, rendant ce projet innovant. Chez l'Homme, la thérapie cellulaire et l’utilisation des cellules souches est une approche thérapeutique prometteuse dans le cadre de nombreuses maladies dégénératives telles que les dystrophies rétiniennes. À l’heure actuelle, la majorité des essais cliniques ont mis en évidence la faisabilité et l’innocuité de l’utilisation des cellules souches. Malgré des résultats encourageants, ces approches doivent être améliorées afin d’optimiser la récupération de l’acuité visuelle.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé. En revanche, les animaux seront soumis à 1 procédure expérimentale dont la gravité est estimée modérée. Les animaux (2 lots de 3 animaux pour l'étude pilote, 4 lots de 30 animaux dans l'étude principale) recevront une transplantation de différentes populations rétiniennes sous traitement anesthésique, antalgique et anti-inflammatoire. La durée de la chirurgie est estimée à 30 minutes. Afin de limiter le risque de rejet du greffon, les animaux seront sous traitement immunosuppresseur. Afin de mesurer le bénéfice de cette thérapie cellulaire, l'acuité visuelle de l'ensemble des animaux de l'étude principale sera testée grâce à 2 tests comportementaux réalisés à 3, 7 et 13 semaines post-tranplantation. Le premier test est un test d’optométrie, qui durera 1 minute / œil. Le deuxième test (light dark-box) permet de tester l’acuité visuelle globale des rongeurs grâce à leur instinct photophobique. Il sera réalisé pendant 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont : hémorragie oculaire non maitrisable lors de la greffe, opacité de la cornée persistante, stress et photophobie des animaux lors des tests comportementaux lié au changement d’environnement (durée courte de 1 à 5 min).
Devenir
L’objectif du projet est d’évaluer l’effet de la transplantation de populations rétiniennes sur l’acuité visuelle. A l’issue des tests comportementaux permettant de mesurer l'acuité visuelle, les animaux seront euthanasiés par inhalation de CO2 afin de récupérer les yeux pour des analyses anatomiques et histochimiques ultérieures : à 3 semaines post-transplantation pour tous les sous-lots 1, à 7 semaines post-transplantation pour tous les sous-lots 2, à 13 semaines post-transplantation pour tous les sous-lots 3.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de valider l’utilisation de cellules rétiniennes dérivées de cellules souches pluripotentes induites dans le cadre d’une thérapie cellulaire. Cela nécessite au préalable une approche dans un modèle animal avant de pouvoir être transposer à l'Homme à des fins thérapeutiques. Il ne peut pas être envisager l’utilisation d’une méthode substitutive puisque que nous devons ici mesurer l’acuité visuelle.
Réduction
Pour l'étude pilote, 2 lots de 3 animaux recevront une transplantation afin de valider la procédure chirugicale. Afin de diminuer le nombre d’animaux, les tests comportementaux et les analyses post-mortem seront réalisés sur l’ensemble des animaux. Les tests comportementaux seront réalisés de façon longitudinale afin que chaque animal soit son propre contrôle (mesures répétées à plusieurs temps). Le nombre d’animaux utilisé a été statistiquement défini selon la loi de Cochran. La réduction du nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation a été calculé en s’assurant d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour garantir la qualité statistique des données et ainsi empêcher la reproduction de ces expérimentations. Ainsi, nous nous sommes basés sur un niveau de confiance déduit de 95% (z) avec une marge d’erreur de 5% (d). La proportion estimative de la population ayant la caractéristique étant inconnue, elle a été définie à 0,5 (p). Ainsi, suivant ce calcul (nombre d’animaux =(z)2/4d2 quand p=0.5), 180 animaux seront utilisés pour l'étude principale : 10 animaux multiplié par 3 cinétiques temporelles et 6 conditions expérimentales soit n = 10 x 3 x 6 = 180 animaux.
Raffinement
Les méthodes expérimentales utilisées dans cette étude sont validées, reproductibles et classiquement retrouvées en laboratoire. Conformément à la règle des 3R, différents dispositifs seront mis en place afin de réduire au maximum la souffrance, la douleur et l’angoisse des animaux. Ainsi, une grille de scoring du bien-être des animaux sera remplie tous les jours afin de détecter le plus précocement possible le point limite et de diminuer ou éviter toute souffrance animale. Ainsi, cela engendrera la mise en place d'un traitement antalgique. En cas d'atteinte d'un point limite terminal, la souffrance sera arrêtée immédiatement par la mise à mort de l'animal. De plus, les animaux seront observés tous les jours afin de mettre en évidence des signes de détresse (stéréotypie, hyper toilettage, oreilles positionnées en arrières et moins rosées). De plus, suite à la transplantation, l’absence d’hémorragie oculaire ou/et d’opacité de la cornée seront vérifiées quotidiennement pendant 7 jours puis de façon hebdomadaire. Pour un raffinement maximum, les rongeurs seront maintenus dans un environnement de statut sanitaire contrôlé et dans des conditions de température et d’hygrométrie réglementaires. Ils seront hébergés par groupe de deux, dans des conditions d’élevage standardisées (litière propre, au calme, cycle lumière/obscurité 12 heures) avec accès à un bâton de bois, leur permettant d’assouvir leur besoin naturel de rongeur. Par ailleurs, de la veille de la transplantation jusqu'à la mise à mort, les animaux seront immunodéficients par traitement à la cyclosporine A : ainsi ils seront hébergés en portoir ventilé permettant le maintien d'un statut sanitaire en adéquation avec l'immunité réduite. De plus, les tests comportementaux utilisés dans ce projet, ne nécessiteront pas d’intervention directe de l’expérimentateur. Une étude pilote sera réalisée sur deux lots de 3 animaux (lot 1 : rats RCS transplantés avec une population multicellulaire, lot 2 : rats RCS transplantés avec une population unicellulaire) afin de vérifier que le transplant est présent au niveau de l'hôte 3 semaines post transplantation et confirmer ainsi la procédure chirurgicale.
Choix des espèces
Le rats RCS est un modèle largement décrit dans de nombreuses études précliniques des pathologies rétiniennes. En effet, ce modèle de dégénérescence rétinienne précoce est l'un des 2 modèles les plus utilisés en ophtalmologie dans le monde (plus de 900 publications à ce jour), notamment pour tester de nouvelles approches thérapeutiques pour restaurer la fonction visuelle. Cette espèce animale présente une mutation spontanée responsable d’une incapacité pour les cellules rétiniennes à phagocyter les segments externes du photorécepteur entraînant l'accumulation de débris du segment externe et, par la suite, la dégénérescence des photorécepteurs. La cécité débute vers le 18ème jour post-natal et est totale environ 3 mois après la naissance. Par ces caractéristiques, l’utilisation d’une telle espèce animale est pertinente et justifiée pour tester la capacité des transplantations sous rétiniennes sur la restauration visuelle. Des rats Long Evans seront utilisés comme animaux contrôle (dont l’acuité visuelle n’est pas affectée). Les LE sont des rats pigmentés (comme les rats RCS) possédant une bonne acuité visuelle. Chez le rat RCS, le nombre de photorécepteurs commence à diminuer à 18 jours post-natal, de façon continue et progressive jusqu’à l’âge de 3 mois (cécité totale). Dans cette étude, nous souhaitons réaliser des transplantations à 22 jours post-natal, période précoce de la dégénérescence, qui est représentatif de la fenêtre temporelle qui serait utilisée dans le cas d’une transplantation chez l’Homme (phase précoce et diagnostique de la maladie).
Effet de l’intensité lumineuse sur le développement et la croissance de Sepia officinalis
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
700 seiches juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les animaux subissent une exposition lumineuse continue de douze heures pouvant induire un stress, puis sont anesthésiés et tués pour prélever cerveau, lobe optique et yeux. L'objectif relève de la recherche fondamentale sur l'effet de la lumière sur le développement de la seiche. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative in vitro pour étudier un "organisme entier".
Objectifs
L’intensité lumineuse et le type de lumière ont des effets sur le développement du système nerveux. Ce projet a pour objectif de tester l’effet de l’éclairement sur le développement et la croissance après éclosion des juvéniles de seiche, Sepia officinalis, une espèce de mollusque aux comportements élaborés. Il s’agit plus précisément de déterminer si la photosensibilité et la neurogenèse varie lorsque l’animal est éclairé par des sources lumineuses artificielles différentes en terme quantitatif (intensité) et qualitatif (LED versus néons T5). Ce projet permettra de mieux comprendre comment le développement du système nerveux central (cerveau et lobes optiques de la seiche) peut être modifié par la source lumineuse afin d’inférer des hypothèses évolutives et fonctionnelles sur l’influence du facteur lumière sur l’acquisition de comportements élaborés.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’identifier si la lumière est un facteur important voire essentiel au développement et à la croissance du système neuro/photosensoriel permettant la mise en place des capacités cognitives chez la seiche dont le système nerveux est analogue à celui des vertébrés. Les résultats attendus sont de déterminer l’intensité et le type de lumière permettant une mise en place du système nerveux sans « défaut » et a contrario de voir si certains types et intensité lumineuses sont néfastes pour la neurogenèse et donc les comportements. Par ailleurs, les résultats permettront d’optimiser les conditions d’élevage de cet animal d’intérêt économique pour lequel aucune aquaculture n’est encore possible
Procédures
Les animaux ne subissent aucune intervention avant leur mise à mort. Lorsqu’ils sont retirés des bacs, ils sont immédiatement transférés dans un récipient, anesthésiés, puis mis à mort
Impact sur les animaux
L’irradiation continue sur 12h peut induire un stress.
Devenir
Pour étudier l’expression des gènes dans les tissus, il est nécessaire que les organes soient extraits et fixés, ce qui implique la mise à mort des animaux. Il n’est pas possible de prélever une partie de l’animal sans causer des dommages irréversibles (pas de survie après prélèvement des yeux, du cerveau entre autres).
Remplacement
Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui cherche à déterminer, par une approche physiologique globale, l’effet de la lumière sur le développement et la croissance des organes photosensibles (cerveau, lobe optique, yeux) d’un organisme entier, en lien avec le comportement. Il n’y a pas d’alternative in vitro à l’heure actuelle.
Réduction
Le nombre de juvéniles est réduit mais optimisé pour cette expérimentation afin d’éviter de la répéter ultérieurement si les résultats n’étaient pas satisfaisants. Le nombre de 5 échantillons est le minimum adéquat pour garantir une puissance statistique suffisante pour examiner les variations d’expression. Les « qualités » des échantillons sont très inégales. Le nombre d’animaux prend donc en compte ce fait ainsi que le nombre de gènes à tester, et les variabilités intra expérimentales (correspondant à la variabilité biologique) afin de respecter les limites acceptables de la validité scientifique. Pour les estimations de neurogenèse, la variabilité interindividuelle peut être plus importante et les différences attendues entre deux intensités sont faibles. Chaque étape de prélèvement nécessite donc au total 20 individus. Nous utiliserons le test de Wilcoxon-Mann-Whitney pour estimer s’il y a une différence significative entre les niveaux d’expression hauts et bas pour un point donné.
Raffinement
Les juvéniles éclos auront un enrichissement environnemental varié à disposition dans les bacs sous la forme de cachette diverses (tube et pièces de PVC, « cabanes »…) leur permettant de se cacher comme en milieu naturel. Ils sont nourris à satiété avec des crevettes de taille adaptée (mysis sp.). L’intensité lumineuse maximale appliquée reste inférieure à l’irradiation maximale en plein soleil. Les constantes physico-chimiques (température, salinité, pH, oxygène) sont contrôlées quotidiennement sur toute la durée du développement. Une observation quotidienne permet de s’assurer du bon état physiologique, morphologique et comportemental des juvéniles. Les animaux qui présenteraient des anomalies comportementales (flottaison, immobilisme, blessure), seront écartés et immédiatement mis à mort par surdose d’éthanol. Une grille de suivi des animaux et une table scorée pour les manifestations de stress et de souffrance est mise en place et permet de décider de l’intervention (voir annexe). Au bout d’une semaine (puis 2, 3, 4 et 8), 20 juvéniles sont prélevés dans chaque bac. Afin de limiter le stress et la souffrance supposée des juvéniles, ils sont transférés délicatement et rapidement dans un récipient contenant de l’eau de mer du système d’élevage jusqu’à une salle adjacente où la mise à mort sera réalisée. Le récipient est mis sur glace ce qui permet un refroidissement progressif, et une anesthésie des animaux par le froid. Ils sont observés jusqu’à constatation d’une léthargie (relâchement pupillaire, le relâchement des bras et du manteau) puis une fois la mort confirmée (arrêt respiratoire); les juvéniles sont alors placés dans le fixateur.
Choix des espèces
La seiche européenne est le seul mollusque possédant un cerveau et des yeux performants, qui pond des œufs sur nos côtes. Contrairement à d’autres espèces de céphalopodes comme les pieuvres, son développement est court (
Essai d’une thérapie combinée cellulaire et optogénétique pour le remplacement de photorécepteurs chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
295 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des rats immunodéficients porteurs d'une dégénérescence rétinienne reçoivent une greffe de cellules sous la rétine par chirurgie oculaire, puis des examens d'imagerie et d'électrorétinographie sous anesthésie et des tests visuels, avant d'être tués pour analyser la rétine. L'objectif est de tester une thérapie combinée cellulaire et optogénétique censée restaurer la vision. Le porteur affirme que cette évaluation "ne peut être réalisée que chez l'animal".
Objectifs
Ce projet a pour objectif de valider le potentiel de restauration visuelle de cellules rétiniennes appelées photorécepteurs rendues artificiellement sensibles à la lumière grâce à la présence d’une protéine microbienne. Ces photorécepteurs sont obtenus in vitro à partir de cellules souches humaines appelées cellules iPS suivant une méthode établie dans notre équipe. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer dans un modèle de rats présentant une dégénération de la rétine similaire à celle observée chez l’homme et immunodéficient, le potentiel thérapeutique de ces cellules. Nos études précédentes ont montré la nécessité de sélectionner une population homogène de cellules à transplanter et permis de valider un système de sélection des photorécepteurs par tri magnétique. Nos premières études de transplantation dans un modèle murin de dégénération de la rétine, ont démontré que ces cellules survivent dans la rétine, peuvent devenir des photorécepteurs (cellules rétiniennes) matures, et se connecter aux autres neurones de la rétine de l'hôte. En revanche, aucune amélioration significative de la vision n’a pu être observée. La maturation de ces cellules greffées en photorécepteurs fonctionnels restant un obstacle, nous avons combiné notre approche de thérapie cellulaire avec l’optogénétique, dans le but de conférer artificiellement aux cellules transplantables une sensibilité à la lumière. L’objectif de ce projet est donc de tester le potentiel de restauration visuelle de ces cellules modifiées après transplantation dans une modèle de perte visuelle liée à une dégénérescence des photorécepteurs.
Bénéfices attendus
Les travaux de thérapie cellulaire humaines de ces dernières années utilisant des photorécepteurs dérivés de cellules souches pluripotentes ont permis d’établir sa faisabilité en termes de survie et d’intégration dans le tissus hôte des cellules transplantées. En revanche, la plupart des études témoignent d’une absence ou d’une faible récupération fonctionnelle, liée notamment à un défaut de maturation des cellules transplantées. L’approche proposée ici vise à contourner cet obstacle à l’aide de cellules rendues photosensibles artificiellement par une approche d’optogénétique qui devrait permettre d’observer une récupération fonctionnelle beaucoup plus importante.
Procédures
Trois groupes d’animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste en l’injection intraoculaire (sous la rétine) de deux types de cellules différentes (2 groupes) en suspensions ou de solution tampon(1 groupe) ; cette opération dure 15 à 20 minutes. Cet opération n’est réalisée qu’une seule fois. Tous les animaux feront l’objet d’un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique) et d’un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permette l’étude de la fonction de ce tissu; ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes; l’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Ces examens seront réalisé une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps) Les animaux réaliseront également des tests comportementaux à l’état vigil sans contrainte particulière. ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants.
Impact sur les animaux
Très peu d’effets indésirables sont attendus pour ce projet. Les nuisances ou effets indésirables possibles de l’étape chirurgicale consistant en la transplantation cellulaire dans l’espace sous-rétinien sont une douleur oculaire et péri-oculaire dans une courte période post-opératoire. Les procédures post-opératoire (tests visuels, imagerie) n’ont pas d’effets indésirables avérés. Dans de rares cas, une inflammation anormale de l’œil peut être observée en post-opératoire.
Devenir
A la suite de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (intégration au tissus de l’hôte, etc…).
Remplacement
Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une récupération fonctionnelle visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d’animaux pour cette étude est de 295 réparti en trois groupes distincts. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30% (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Cet effectif a été déterminé à l’aide d’un calcul de puissance permettant une analyse statistiquement robuste et ainsi l’interprétation fiable des données obtenues.
Raffinement
L’alopécie précoce des animaux de phénotype « Nude » peut se traduire par une petite accumulation de poils sous la paupière, source d’irritation oculaire et potentielle source d’infection locale si elle n’est pas traitée. Les procédures prévoient une surveillance accrue de ces animaux et un nettoyage des yeux au sérum physiologique en cas de besoin. Les procédures utilisées comportent plusieurs tests comportementaux qui n’ont pas d’effets indésirables avérés ou documentés et ne génèrent pas de douleur avérée. Les actes, test ou examen (imagerie, ERG) qui nécessitent l’immobilité complète de l’animal sont réalisées sous anesthésie générale pour éviter tout stress de l’animal qui pourrait être provoqué par une contention stricte. le risque d’une légère irritation de la surface oculaire ne pouvant pas être totalement exclue, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant les 24h suivant les différents actes (réveil post-anesthésie, état de la surface oculaire après les électrorétinogrammes, signe d’inflammation, etc…). Le geste chirurgical, qui peut générer une nuisance ou douleur temporaire est géré en pré et post-opératoire par un traitement analgésique (Buprénorphine puis AINS longue durée (métacam). Les animaux sont élevés en cages de stabulation avec enrichissement pour toute la durée du protocole (bâton à ronger, lambeaux de papier kraft), nourriture et abreuvement à volonté. De manière plus spécifique, tout signe extérieur d’inflammation oculaire sera recherché (gonflement, paupière fermée, grattage) suite au geste chirurgical et examens d’imagerie ; les signes de comportement anormal signe de souffrance seront recherché (réaction violente à la manipulation ; vocalisation) Les points limites sont : Une perte de poids supérieure ou égale à 20% Apparence : Traces de blessures importantes ; tout signe d’inflammation ou d’infection de l’œil avec une fermeture prolongée de l’oeil ou augmentation du volume de l’oeil opéré (x2) ou abcès et écoulement ; l'observation d'un de ces points limites entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal par inhalation de CO2 et élongation cervicale.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études précliniques. Ce choix permettra une comparaison des résultats obtenus avec ceux de la littérature. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Nous utiliserons une lignée particulière, chez laquelle le système immunitaire est altéré, Ce modèle permet l’étude de xénogreffes (greffe entre donneur et hôte d'espèces différentes) sur le long-terme en réduisant drastiquement le rejet des cellules transplantées normalement provoqué par une forte réponse immunitaire (xénogreffe). Il permet également d’éviter les traitements anti-rejets potentiellement toxiques à long terme ; Les animaux sont inclus dans l’étude à l’âge de 3 mois, stade auquel la dégénérescence de la rétine est effective et l’ensemble des procédures s’étalera sur une durée de 6 mois (étude jusqu'à 6 mois post-transplantation) donc jusqu’à un âge maximal de 9 mois.
Induction d’une anosmie à long terme chez le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
56 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit une injection de méthimazole pour détruire sa muqueuse olfactive et le rendre anosmique, puis passe un test de discrimination de deux odeurs sous restriction alimentaire, avant d'être tué pour analyse des tissus. Le porteur indique que la perte d'odorat peut perturber la prise alimentaire et le poids, suivis quotidiennement. L'objectif affiché est de valider ce modèle d'anosmie pour tester ensuite des implants olfactifs.
Objectifs
L'anosmie, ou perte complète de l’odorat, est une maladie qui affecte gravement la qualité de vie, étant donné l’importance de ce sens pour la prise alimentaire et les interactions sociales. L'anosmie est également liée à un risque accru de dépression et de décès, et peut handicaper les individus face aux dangers (nourriture avariée, fuite de gaz…). On estime que 5% de la population générale est anosmique. Par rapport à d'autres pertes sensorielles telles que la cécité ou la surdité, l'anosmie a attiré peu d'attention en partie parce qu'il s'agit d'une condition socialement « invisible ». La pandémie de COVID-19 a considérablement augmenté le nombre de personnes touchées par la perte d'odorat et a sensibilisé le grand public à ce sujet. Toutefois, il n'existe actuellement aucun traitement pour l'anosmie de longue durée, en dehors de l'entraînement olfactif, dont le bénéfice est significatif (surtout pour les anosmies causées par une infection virale) mais limité. L'implant olfactif représente une approche prometteuse pour traiter l'anosmie, toutefois il est nécessaire d'évaluer un tel dispositif sur des modèles animaux in vivo. Notre objectif est dans un premier temps d’induire une anosmie à long terme chez des rats afin de pouvoir par la suite tester des implants olfactifs qui seraient adaptables chez l'homme. L'anosmie sera induite pharmacologiquement par injection de méthimazole, composé connu pour produire une altération de la muqueuse olfactive. Nous avons choisi le rat, qui a un système olfactif dont l’organisation est proche de celle de l’Humain et qui permettra de tester l'efficacité d'un implant olfactif.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider un modèle d'anosmie induite chez le rat. Notre objectif est dans un premier temps d’induire une anosmie à long terme chez des rats afin de pouvoir par la suite tester des dispositifs de récupération olfactive.
Procédures
Les rats recevront une injection intra-peritoneale en début de protocole (1 injection/animal) qui doit altérer la muqueuse olfactive et diminuer significativement leur odorat. Afin de tester l'efficacité de cette méthode, les rats seront soumis à un test olfactif dans lequel ils doivent discriminer 2 odeurs. Pour cela, ils sont soumis à un test olfactif dans une cage dédiée à laquelle ils seront habitués au préalable. Deux odeurs sont présentées l'une récompensée par une boulette de sucre, l'autre non récompensée. Quand le rat sait quelle odeur prédit une récompense (son comportement l'indique) alors on considère qu'il discrimine bien les deux odeurs. Pour que le rat soit motivé à aller chercher sa récompense, on réduit sa nourriture. Cette réduction peut conduire à une perte de poids que l'on contrôle. La restriction dure environ 10 jours , le test olfactif 5 à 10 jours environ.
Impact sur les animaux
Le composé injecté peut présenter une toxicité qui devra être évaluée pré et post-mortem. L’anosmie chez le rat peut perturber la prise alimentaire, celle-ci ainsi que le poids des animaux devront être contrôlée quotidiennement suite au traitement.
Devenir
Analyse des tissus après euthanasie après 3 jours de traitement afin de voir si l'injection a bien conduit à une altération de la muqueuse olfactive: 12 rats traités / 12 rats véhicule maximum Analyse comportementale puis analyse histologique après euthanasie après 30 jours de traitement pour évaluer la durabilité du traitement: 16 rats traités / 16 rats véhicule maximum
Remplacement
Cette étude ne peut être remplacée par d’autre moyen, comme la culture cellulaire, car nous regardons le comportement de l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au minimum en optimisant au maximum les groupes expérimentaux. Pour une première approche histologique (3 jours), l'analyse est qualitative et un nombre d'animaux réduit sera utilisé. Cette procédure nous permettra de tester avec un nombre réduit d'animaux les éventuels effets indésirables et l'efficacité de notre traitement avant de décider si nous pouvons réaliser notre projet. Pour les test olfactifs, des tests statistiques montrent qu'une différence en fonction du traitement peut être observée avec un nombre d'animaux de 6 traités versus 6 controles. Nous prévoyons 2 groupes.
Raffinement
Tout sera mis en oeuvre afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux. Le bien-être animal est pour nous primordial vis-à-vis de l’animal mais aussi de nos expérimentations. Le stress modifie les capacités olfactives des animaux, ainsi les résultats de comportement ne peuvent être valable que si l’animal est bien portant. L’anosmie chez le rat peut perturber la prise alimentaire, celle-ci ainsi que le poids des animaux devront être contrôlée quotidiennement suite au traitement. Les tests olfactifs seront réalisés en condition de restriction alimentaire en s'assurant au préalable que l'état des animaux le permet. L’eau est disponible à volonté. Des points limites spécifique d’évaluation de la douleur à chaque procédure sera mise en place. Nous proposerons un autre type de nourriture si nous notons une dénutrition (gel nutritif ou nourriture enrichie en graisse et en sucre). Si l'animal présente une forte baisse du poids >15% malgré un régime adapté il est sera euthanasié s'il n'y a pas d'amélioration de son état. Une quantité de nourriture, mesurée par rapport au poids de l'animal, est donnée chaque jour aux animaux à heure fixe. Si l'animal présente une forte baisse du poids >15% il est remis sur un régime à volonté et le test est arrêté jusqu'à récupération. S’il y a l’apparition d’un mal être sévère (poil hérissé, catatonie, trouble du comportement...) et/ou une perte de poids de l’animal supérieure à 15% sans reprise malgré des soins particuliers (surveillance, nourriture en gel, réchauffement le cas échéant) au bout de 3-4 jours, l’animal sera euthanasié. Si une douleur est visible, elle sera soulagée par un analgésique, si la douleur persiste plus de 2 jours, l'animal sera euthanasié. Les cages sont agrémentées d’un nid végétal et d'objets pour le confort de l'animal.
Choix des espèces
Les rats ont de très bonnes capacités olfactives, ils peuvent apprendre facilement les odeurs. Le système olfactif est très conservé avec l'évolution, et les rats ont un système olfactif très similaire à celui de l'homme et sont de bons modèles pour tester l'implant olfactif sur lequel nous allons travailler. Les animaux sont utilisés à l'age adulte pour ne pas intérférer avec le développement.
Etude d’une nouvelle interface pour la transmission sensorielle chez le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
800 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des composés sont injectés dans le derme puis stimulés par voie électrique ou lumineuse pendant jusqu'à soixante jours, pour poser les bases d'une interface sensorielle destinée à des prothèses humaines. Le porteur indique des nuisances possibles comme une inflammation, des lésions aux sites de stimulation, une modification de la démarche et des signes d'automutilation des doigts, et précise qu'aucun antidouleur ne sera administré car il fausserait la réponse des nerfs mesurée. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour ce projet mené pour un client.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’étudier une nouvelle interface sensorielle, c.a.d., étudier la capacité de nouveaux composés à transmettre/moduler localement un signal provenant de l’extérieur, envoyé au système nerveux périphérique sensoriel, lorsqu’ils sont placés au niveau du derme de l’animal (comme un tatouage) et exposés à une stimulation physique en surface de la peau (une stimulation électrique ou lumineuse).
Bénéfices attendus
La vision, l'ouïe, le toucher, l'odorat et la perception gustative nous relient au monde extérieur. La perte de perception sensorielle affecte notre qualité de vie à des degrés divers. Les dispositifs de restauration ou de substitution sensorielle apportent l'espoir de rétablir totalement les fonctions sensorielles déficientes humaine. Par exemple, des personnes ayant perdu l’usage d’un membre et portant une prothèse ont l’espoir de retrouver le sens du toucher. Dans ce contexte, les interfaces nerveuses périphériques sensorielles doivent pouvoir activer chaque fibre nerveuse pour tenter de reproduire le sens du toucher tel qu’il serait ressenti si le membre était intact. Concernant la substitution sensorielle (i.e., l’utilisation d’un sens tel que le toucher ou l’ouïe pour assister ou pour remplacer un autre sens tel que la vision, comme l’écriture braille qui utilise le sens du toucher pour l’écriture et la lecture), l’interface doit être adapté à la quantité d’information à transmettre. Ce projet vise à placer les bases pour la conception d’une nouvelle interface sensorielle en étudiant la possibilité de connecter les composés d’intérêts aux fibres sensorielles situées dans le derme (ce qui permettra d’anticiper la résolution spatiale de l’interface, liée à la densité de connexion) et la vitesse de propagation du signal lorsque ces connexions seront stimulées (ce qui permettra d’anticiper la résolution temporelle de l’interface).
Procédures
L'ensemble des animaux subiront une injection intradermique ou sous-cutanée (1 à 5 sites) sous anesthésie gazeuse. Chaque injection dure environ 2 minutes. Un test pour mesurer la conductivité nerveuse dure au maximum 5 minutes et il est réalisé sous anesthésie gazeuse. 3 stimulations la première semaine (une à J0 (baseline) et deux supplémentaires), et 1 stimulation par semaine pour les semaines suivantes. La durée maximale de l’étude est établie à 60 jours.
Impact sur les animaux
Au vu des interventions subits par les animaux des nuisances peuvent apparaitre comme : une inflammation au niveau du site d’injection, des lésions au niveau de sites de stimulation, une modification de la démarche ainsi hypoactivité. Les animaux pourraient également présenter des signes de mutilation des doigts ainsi qu'une perte de masse qui feront donc l'objet d'un suivi.
Devenir
Tous les animaux sont tous euthanasiés à la fin de la procédure soit parce qu’ils subissent des prélèvements de sang ou de tissus soit en raison du fait qu’ils ont été traités aux composés de recherche dont l’inoccuité à long terme reste inconnu.
Remplacement
Aucune méthode de remplacement n’est disponibleà l’heure actuelle pour étudier la problématique du présent projet, car la réponse du système nerveux périphérique sensoriel à sa stimulation met en jeu des interactions complexes in vivo.Toute fois si des informations supplémentaires nous sont apportés par le client, elles seront intégrées et prises en compte.
Réduction
Nous cherchons toujours un compromis expérimental qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisé. Par exemple, nous favorisons le test de plusieurs conditions expérimentales en parallèle (typiquement différents composés sont testés à un ou plusieurs sites d’injection dans une étude pour réduire le nombre d’animaux contrôles). En règle générale, chaque groupe expérimental d’un plan d’étude se compose de 8 animaux afin d’obtenir un résultat statistiquement satisfaisant. De plus, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous envisageons également de retirer le groupe contrôle si les différentes études sont basées sur le même véhicule et de prendre les données historiques pour réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en oeuvre notamment une inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. L’enrichissement du milieu comporte des tunnels en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux (2-5 individus). Les manipulations sont faites par du personnel compétent pour détecter les potentielles points limites ou points d’arrêts, l’objectif étant de soustraire l’animal aux souffrances inutiles. Le nombre et durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. L’injection des composés et des véhicules mais également les mesures sont réalisées sous anesthésie générale afin d’éviter que l’animal ne bouge pendant le traitement. L’administration d’agents anti-douleur ou anti-inflammatoire n’est pas envisagée lors des études car la prise de ces médicaments pourrait compromettre les résultats de l’étude en modulant eux-mêmes la réponse des nerfs sensoriels par rapport aux valeurs de référence lors des expériences de stimulation.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Nous utilisons généralement des femelles car celles--ci présentent un déclin moins prononcé de la fonction du nerf périphérique sensoriel lors du vieillissement comparativement aux mâles. Elles prendront moins de poids que des mâles de la même espèce durant la période du projet (60 jours). En effet, il est connu comme chez l’homme que l‘index de masse corporelle influence la conduction nerveuse.