Organes sensoriels

Toutes les souris subissent une chirurgie préliminaire de vingt minutes, puis deux séances de trente minutes de vidéo-oculographie sur animal éveillé pour mesurer leurs réflexes de stabilisation du regard. 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de protocole. Beaucoup sont sourdes et tournent en rond sans arrêt, ce que le porteur classe en "phénotype dommageable" tout en affirmant qu'elles sont "parfaitement capables de se nourrir et de se reproduire normalement" et ne demandent pas de soins particuliers. Le projet ne poursuit pas de question scientifique propre, il met une plateforme de mesure à disposition d'équipes extérieures qui y font phénotyper leurs lignées de souris sourdes ou vestibulaires.

Objectifs

Ce projet porte sur la quantification comportementale des réflexes vestibulaires et de souris présentant des suspicions de troubles vestibulaires et auditifs. Les pathologies vestibulaires sont caractérisées par des épisodes imprévisibles de vertiges accompagnés de déséquilibres oculomoteurs et posturaux. Les pathologies vestibulaires chroniques sont très invalidantes et conduisent à un isolement psychologique et social. La prévalence des vertiges en clinique est très importante, de l'ordre de 20 à 30%, et augmente avec l'âge. Les vertiges vestibulaires peuvent être liés à des atteintes du système nerveux périphérique et notamment des organes vestibulaires de l'oreille interne ou du nerf cochléo-vestibulaire. Les pathologies touchant l’oreille interne ont souvent des conséquences auditives et vestibulaires. Alors que les surdités partielles ou totales sont facilement identifiées et mesurées expérimentalement chez la souris, les troubles vestibulaires sont difficiles à identifier et rarement quantifiés. Chez l’homme, le meilleur test consiste à mesurer les réflexes vestibulo-oculaires par vidéo-oculographie, une pratique réalisée dans la plupart des centres ORL. Chez la souris, cette même technique qui permet la quantification des troubles vestibulaires est une expertise rare qui demande du matériel couteux. De nombreuses équipes travaillant sur des pathologies ORL nous contactent donc afin de bénéficier de notre expertise et de notre plateforme intégrée de vidéo-oculographie permettant de réaliser des tests comportementaux vestibulaires. Ce projet générique destinée à permettre le phénotypage de différentes souris sur notre plateforme expérimentale utilisera un total maximum de 720 souris sur 5 ans. Ce nombre permettra de couvrir les besoins d'au moins 7 études sur la période.

Bénéfices attendus

Les pathologies vestibulaires sont très invalidantes. De nombreuses pathologies congénitales d'origine génétiques conduisent chez l'enfant à des surdités qui sont détectées et traitées par des implants cochléaires, et depuis peu par thérapie génique. Dans la plupart des cas, seule la partie auditive de ces pathologies est prise en compte par l'entourage et les médecins, les aspects vestibulaires étant imparfaitement diagnostiqués et évalués. Alors que de nombreux modèles murins sont développés pour mimer les pathologies humaines et font l'objet de tests de thérapie génique, il est essentiel d'évaluer si ces thérapies peuvent également fonctionner sur les organes vestibulaires et permettre in fine une récupération des fonctions sensorimotrices et cognitives associées à ces déficits congénitaux.

Procédures

Tous les animaux (n=720) seront soumis à des chirurgies préliminaires d'une durée de 20 minutes sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont phénotypés à l'aide de tests sensorimoteurs: les réflexes de stabilisation du regard sont mésurées par vidéo-oculographie afin de mesurer précisément les fonctions vestibulaires et oculomotrices. Ces tests durent 2 fois 30 minutes et sont effectués chez la souris éveillée. Des tests locomoteurs et posturaux d'une durée totale de 6 minutes sont également effectués 2 fois chez la souris éveillée, afin de mesurer leur équilibre.

Impact sur les animaux

Les souris génétiquement déficientes vestibulaires présentent parfois des hyper activités ou locomotion anormales (circling) ce qui constitue des nuisances les classant en phénotype dommageable. Elles sont également fréquemment sourdes ou mal entendantes. Elles sont cependant parfaitement capables de se nourrir et de se reproduire normalement et ne nécessitent pas de soins particuliers. Ces déficits auditifs et locomoteurs constitent un point d’attention pour la gestion et le cas échéant le suivi plus particulier de ces animaux. Le traitement spécifique pour réduire ces nuisances consiste en une restauration de la fonction vestibulaire par thérapie génique qui fait l'objet d'une partie de l'étude de phénotypage, mais qui ne s'appliquera qu'à une partie des lots.

Devenir

Les souris, le plus souvent mutants génétiques et sujets de thérapie génique, doivent être euthanasiées en fin de protocole. Le cas échéant, après la mise à mort, des analyses post-mortem validant les effets des traitements seront réalisés.

Remplacement

Afin d'évaluer les déficits sensorimoteurs associés à des pathologies de l'oreille interne et de tester l'efficacité de thérapie génique, il est nécessaire de travailler sur un animal vivant et éveillé. Il s’agit d’un projet de Neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.

Réduction

Des tests statistiques seront effectués en cours de protocole afin de réduire le nombre nécessaire d’animaux au minimum nécessaire pour atteindre des différences significatives entre les différents groupes testés. Le nombre de souris estimé l’a été en considérant que 20% des souris pourraient ne pas compléter l'ensemble des tests. Le nombre de souris correspond à une estimation du maximum de souris qui pourraient être nécessaires, et une estimation des capacités maximales de tests offertes par notre plateforme, il est donc susceptible d'être revu à la baisse au cours du projet.

Raffinement

Les souris sont maintenues par groupes de 4. Les cages sont enrichies avec des roues et rouleaux. Les animaux sont suivis individuellement, leur poids est controlé régulièrement pendant les phases de tests. Chaque animal bénéficie tout au long de l’étude d’une attention et de soins de qualité par du personnel qualifié, afin d’assurer un bien-être optimal. Des traitements antalgiques et anesthésiques adaptés sont utilisés. Des points limites objectifs sont définis afin le cas échéant d’adapter les soins ou de mettre fin à l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative visant à mieux comprendre le fonctionnement du cerveau des mammifères, c'est le modèle animal privilégié pour les études génétiques et la mise au point de traitement de thérapie génique. L'utilisation de lignées génétiquement altérées permet de reproduire les pathologies génétiques conduisant à des surdités et pathologies vestibulaires congénitales chez l'homme, afin de développer des thérapies ciblées. Les tests sensorimoteurs sont effectués sur des animaux plus âgés que 6 semaines. Les réflexes oculomoteurs et locomoteurs étudiés se développent en effet au cours des 4 premières semaines de développement post-natal, et sont considérés comme acquis et matures chez l'ensemble des individus après 6 semaines.

Tuées pour que leurs yeux soient prélevés et l'innervation de leur cornée examinée, 189 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral leur est injecté dans la glande lacrymale et dans la cornée, avec des sutures posées dans la joue, puis un mois plus tard la surface de leur œil est abrasée ou le nerf cornéen sectionné pour mimer une blessure. Le porteur indique que les souris se frottent et peuvent perdre deux ou trois points de suture par joue, ce qui augmente le risque d'infection, et compare la douleur des 72 heures suivant l'abrasion à celle d'un grain de sable dans l'œil. Il conclut que la souris est "le seul modèle" permettant d'explorer cette maladie rare dans son ensemble.

Objectifs

L'œil est protégé par une surface transparente : la cornée. Il s’agit du tissu contenant le plus de nerfs du corps humain. L’extrémité des nerfs se trouve à la surface de la cornée afin de capter les stimulations et agressions extérieures. Ces nerfs confèrent une grande sensibilité à la cornée qui est elle-même protégée par les larmes (rendant la surface de l'œil en permanence humide). Tous ces éléments fonctionnent ensemble formant un équilibre fragile. La moindre atteinte de cet équilibre peut entraîner des défauts de la cornée pouvant eux-mêmes rendre aveugle le patient. Cette situation se déroule typiquement dans la maladie que l’on appelle la kératite neurotrophique, une maladie neurodégénérative rare touchant 5 personnes sur 10 000 en Europe. Elle entraîne la mort des nerfs et donc à terme une perte de sensibilité et de vision. A l’heure actuelle, les traitements disponibles sont limités (gouttes) et les formes sévères de la maladie nécessitent une greffe de cornée. Or, la greffe reste une intervention lourde avec un taux de rejet élevé en plus d’une efficacité souvent temporaire. On se trouve en impasse thérapeutique où le manque de thérapies innovantes constitue un frein majeur à l’avancée scientifique. L’objectif du projet serait donc d’aider à la croissance de ces nerfs contenus dans la cornée qui auront été altérés par la maladie. Or, la repousse des nerfs une fois altérés est un processus long (plusieurs semaines). Le but ici est d’accélérer ce processus en se focalisant sur le facteur responsable de la repousse des nerfs. L’hypothèse de l’équipe repose sur la stimulation de la production d’un facteur particulier déjà contenu dans les larmes mais en quantité limitée. Pour atteindre une production satisfaisante et un effet bénéfique sur les nerfs de la cornée, la technique utilisée est l’injection du facteur en question dans la glande lacrymale (responsable de la production des larmes) ainsi que l’injection de son récepteur dans la cornée. Ainsi, en produisant les larmes, la glande lacrymale produira une grande quantité du facteur d’intérêt qui sera contenu dans les larmes. Ces dernières, une fois à la surface de l'œil, permettront au facteur de se lier directement à son récepteur qui aura été injecté au préalable dans la cornée. On parle donc de double injection (ou de double thérapie génique).

Bénéfices attendus

Dans ce contexte, notre approche innovante de thérapie génique ciblant à la fois la glande lacrymale et l’innervation de la cornée vise à induire la repousse des nerfs de la cornée. Ce travail pourrait ainsi ouvrir la voie à une stratégie thérapeutique curative pour la kératite neurotrophique (KN), en s’attaquant directement au manque d’innervation à l’origine de la maladie rare. Enfin, ce travail devrait aboutir à des publications scientifiques dans des revues à comité de lecture, et potentiellement à un ou plusieurs dépôts de brevet, assurant ainsi une valorisation scientifique et technologique du projet.

Procédures

Un vecteur viral est comme une petite « enveloppe » qu’on utilise pour transporter un message (le gène qu’on veut introduire) vers une cellule afin de soigner une maladie. Celui-ci va être injecté dans un organe cible, c’est ce qu’on appelle la thérapie génique. Dans notre cas, on réalise une injection dans la glande lacrymale, qui sécrète les larmes, couplée à une injection dans la cornée, communément réalisée chez l’Homme avec des antibiotiques. Pour cela, les animaux seront anesthésiés puis recevront une dose d’antidouleur. Les injections se réalisent en une fois pour une durée totale de 7 minutes environ. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil. Un mois après l’injection, on vient réaliser une blessure sur l’œil afin de mimer une maladie ou un accident : l’abrasion ou l’axotomie. Ces deux techniques (5min environ) ne traversent par la barrière protectrice de l'œil, elles restent donc des méthodes n’impliquant pas de défauts profonds à l'œil. Celles-ci sont réalisées en une seule fois sur animaux également endormis ayant à leur tour reçu une dose d’antidouleur. Les souris sont suivies de façon journalière après les procédures afin de prévenir les risques. Les prélèvements de larmes et la mesure de la sensibilité cornéenne sont effectués en amont et en aval des chirurgies. Le test de sensibilité est réalisé 3 jours consécutifs afin d’avoir une moyenne la plus juste. Ces procédures réalisées sur animaux vigiles sont rapides (1-2 min maximum) et n’occasionnent que le stress de la contention.

Impact sur les animaux

Des résultats antécédents au projet ont montré que l’injection dans la cornée n'entraîne pas de traumatisme au niveau de la cornée. Toutefois, la qualité des injections peut varier en fonction de l’expérimentateur ; les souris seront donc scrupuleusement surveillées dans les jours suivant la chirurgie. En revanche, les sutures effectuées au niveau de la joue de la souris peuvent entraîner des sensations de tiraillement, malgré la réalisation minutieuse des points. Il arrive que les souris se frottent, ce qui peut provoquer la perte de deux ou trois points par joue, augmentant ainsi le risque d’infection de la plaie. C’est précisément pour cela que les animaux sont sous surveillance pendant les jours qui suivent l’opération. La modélisation d’une blessure de la cornée chez la souris pourra impliquer une douleur passagère dans les 72h suivant la manipulation, douleur comparable à une sensation d’irritation causée par la présence d’un grain de sable dans l'œil. Aussi, le stress d’être manipulé peut être retenu. L’axotomie quant à elle ne détruit pas la surface de la cornée, la dégénérescence des fibres au centre de la cornée n’induit pas de douleur mais au contraire une perte de sensibilité. Pour le test de sensibilité cornéenne, les souris sont contentionnées pendant 1 à 2 min, une fois par jour, pendant 3 jours consécutifs sur plusieurs semaines afin d’évaluer la régénération de l’innervation (4 +/- 1 semaines).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever des yeux afin d’étudier l’effet des procédures sur l’innervation de la cornée.

Remplacement

La souris comme modèle de pathologie humaine, telle que la kératite neurotrophique, est un excellent système intégrant la complexité des interactions entre les différents éléments de la cornée (nerfs, cellules de surface et larmes). Ces intéractions, à l’origine de l’équilibre naturel de l’œil, se mettent en place durant des mois, et impliquent de nombreux types de cellules, elles ne peuvent donc pas être mimées in vitro (hors organismes vivants, c'est-à-dire dans des boîtes de pétri). Seuls les mammifères présentent la diversité des échanges cellulaires et moléculaires entre les structures de l'œil. Le modèle souris présentant une atteinte des nerfs de la cornée est donc le seul modèle qui permet d’explorer la maladie de la KN dans son ensemble (morphologie, aspect, chimie…). Le modèle vivant demeure donc une étape requise pour étudier la complexité du projet et la pathologie. Le modèle murin présente l’avantage d’être peu coûteux et de se développer rapidement. Les souris que nous utiliserons présentent une forte variabilité génétique, reflétant celle observée chez les patients humains.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux et de respecter la règle des 3R, un calcul est réalisé à l’aide d’un logiciel. Cette analyse nous permet d’optimiser la quantité d’animaux (ici 189 souris) tout en garantissant un nombre suffisant de souris par condition pour effectuer par la suite les tests statistiques nécessaires. Cette estimation rigoureuse vise à assurer la robustesse des résultats tout en évitant la reproduction inutile des expériences.

Raffinement

Pendant la période d’acclimatation, les procédures habituelles seront appliquées : contacts et observations quotidiens par les soigneurs, hébergement en groupe d’au moins deux individus, et mise en place d’un environnement adapté et enrichi. La durée et la répétition des expérimentations sont rigoureusement réfléchies, afin de limiter au maximum les contraintes pour les animaux, notamment en évitant toute anesthésie répétée. Puisque les animaux seront soumis à des manipulations et contentions journalières rapides (≤2min) nécessaires aux expérimentations, nous mettrons en place une période d’habituation afin de limiter l'angoisse et familiariser les animaux aux expérimentateurs. L’état général, le poids, et le comportement des animaux seront suivis régulièrement pour détecter toute altération. Si nécessaire, un animal présentant des signes de souffrance sera retiré de l’expérimentation et pris en charge conformément aux recommandations vétérinaires. L’animal sera placé sous anesthésie générale durant toute la durée des injections, de l’abrasion cornéenne, et de l’axotomie avec l’administration de médicaments anti-douleur et anesthésiques appropriés. Un suivi quotidien avec la grille de scoring permettra qu’en cas de douleur l’animal soit immédiatement pris en charge. L'œil est formé de telle manière qu’une abrasion superficielle comme celle-ci n’impactera en rien l’intégrité de l'œil, mais simplement la couche la plus superficielle de la cornée. Nos précédentes expériences ont montré qu’une marge supplémentaire de 5 % est nécessaire afin de pallier les pertes potentielles liées à l’anesthésie, ainsi qu’aux complications post-opératoires telles que le développement d’ulcères cornéens. Les animaux développant de telles complications sont retirés de l’étude, les points limites sont décrits dans la procédure. Les animaux en sus seront intégrés aux expérimentations en cours, permettant ainsi d’augmenter la puissance statistique des analyses.

Choix des espèces

La lignée de souris utilisée présente une grande variabilité génétique en raison de l’absence de consanguinité, ce qui en fait un modèle proche des humains. Nous étudions des souris âgées de 12 semaines car c’est à cet âge que la cornée est mature et que l’animal a dépassé la puberté.

376 souris génétiquement modifiées pour développer un glaucome vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque jour pendant 28 jours, elles reçoivent un collyre conservateur dans les yeux, avec des prélèvements de larmes et des mesures de sensibilité cornéenne répétées trois jours de suite sur animaux vigiles, puis elles sont tuées pour que leurs yeux soient analysés. Leurs yeux peuvent grossir jusqu'à empêcher la fermeture des paupières, et l'animal est alors tué immédiatement. Le porteur affirme que les cultures cellulaires ne suffisent pas et que l'action du conservateur doit être observée sur un œil complet et fonctionnel, ce qui rend selon lui ces expériences "indispensables".

Objectifs

Les collyres, ou gouttes pour les yeux, sont très utilisés pour traiter certaines maladies comme le glaucome. On y ajoute souvent des conservateurs pour que le produit reste efficace et sans danger plus longtemps. Le glaucome est une maladie fréquente après 40 ans, qui touche jusqu’à 10 % des personnes après 70 ans. Elle abîme lentement le nerf optique, ce qui réduit le champ de vision, jusqu’à la cécité si elle n’est pas traitée à temps. Le traitement repose sur l’usage quotidien de collyres dont beaucoup contiennent des conservateurs. Mais au bout de quelques mois, beaucoup de patients ressentent une gêne : la surface de l’œil devient moins sensible, et les opérations deviennent plus difficiles à cause d’une inflammation. Nos recherches ont montré que les conservateurs peuvent abîmer les nerfs de la cornée, la surface transparente de l'œil, ralentissant la régénération naturelle de cette zone fragile. Cela rend l’œil plus vulnérable, et peut aller jusqu’à former des plaies (ulcères), nécessitant parfois une greffe de cornée : une opération lourde, avec des résultats souvent temporaires. Notre objectif est de mieux comprendre les effets de ce conservateur sur la cornée dans un contexte de glaucome. Pour cela, nous utilisons un modèle de souris qui développe la maladie de façon naturelle et progressive, comme chez l’humain. Nous mesurerons différents indicateurs, comme la sensibilité de la cornée, la pression dans l’œil, ou encore la qualité des larmes. D’autres examens, comme des photos du fond de l’œil ou des tests de réponse à la lumière, permettront de suivre l’évolution de la maladie. Grâce à cette étude, nous espérons mieux évaluer les effets secondaires des collyres avec conservateurs et, à terme, améliorer les traitements pour les patients atteints de glaucome.

Bénéfices attendus

Dans le glaucome, surtout lorsque les patients sont traités avec des collyres contenant des conservateurs, la perte de vision peut évoluer lentement. Cela donne un certain délai pour agir, mais une fois les lésions installées, elles sont irréversibles. Aujourd’hui, les options de traitement restent limitées : certains collyres permettent de contrôler la pression dans l’œil au début de la maladie, mais quand celle-ci progresse, la vision peut être fortement altérée. Dans certains cas, les collyres irritants abîment aussi la surface de l’œil, ce qui complique les soins. Cela peut mener à des atteintes de la cornée graves, parfois nécessitant une greffe. Mais cette solution reste lourde, avec un risque de rejet et un bénéfice souvent temporaire. Notre projet vise à mieux comprendre les effets des conservateurs présents dans les gouttes et du glaucome sur la cornée. En identifiant les changements précoces au niveau cellulaire, nous espérons ouvrir la voie à de nouveaux traitements plus ciblés et mieux tolérés. Ces recherches pourraient donner lieu à des publications scientifiques et peut-être à des dépôts de brevets, valorisant les résultats du projet à l’échelle médicale et technologique.

Procédures

Les souris génétiquement modifiées sont génotypées à l'aide d'un morceau de queue de moins de 2mm prélevé avant l’âge de 10 jours, le prélèvement dure environ 1min. Le projet implique ensuite l’administration quotidienne de gouttes (pendant 28 jours), ainsi que la réalisation de prélèvements de larmes et la mesure de la sensibilité cornéenne avant et après traitement, sur des animaux vigiles. La mesure de la sensibilité se fait sur 3 jours afin de faire une moyenne des résultats. Ainsi, ces procédures sont de courte durée. Les souris sont contentionnées pendant 1 à 2 minutes maximum par animal, mais leur caractère répété nécessite une attention particulière. Afin de limiter le stress induit par la contention, les souris seront habituées progressivement à la manipulation dès le sevrage. Cette habituation permet de réduire considérablement les réactions de défense, en favorisant une meilleure tolérance aux gestes techniques. Les traitements oculaires sont appliqués de manière non-douloureuse, avec une goutte de collyre déposée délicatement sur chaque œil pendant 30 secondes. Les manipulations seront réalisées par du personnel expérimenté, afin d’assurer une gestuelle rapide et précise, minimisant l’impact sur les animaux. Les animaux seront mis à mort pour prélever les yeux qui seront ensuite analysés. Aucun prélèvement invasif ne sera effectué sur animaux vivants.

Impact sur les animaux

Le glaucome est une maladie chronique de l’œil qui évolue lentement et peut entraîner une perte totale de la vue s’il n’est pas traité. Dans le cadre de ce projet, nous étudierons un modèle de souris génétiquement modifié qui présente une mutation sur le gène jouant un rôle essentiel dans le développement de l’œil. Ce modèle est bien connu grâce à des recherches précédentes. Les souris glaucomateuses présentent une perte progressive de la vue, mais cela n’affecte ni leur santé générale ni leur espérance de vie. Chez la souris, la vue n’est pas le sens principal, et cette baisse de vision n’a pas de conséquences visibles sur leur comportement : elles continuent à manger, interagir normalement et prendre soin de leurs petits. Les souris peuvent développer une augmentation anormale de la taille des yeux, comme cela peut arriver chez les personnes atteintes de glaucome. Si les yeux deviennent tellement gros que l’animal ne peut plus fermer les paupières, il ne poursuivra pas l'expérimentation et sera euthanasié immédiatement pour éviter toute souffrance. Les traitements utilisés lors de cette étude sont couramment utilisés chez l’humain, agissant uniquement sur l’œil et n’étant pas douloureux. Toutes les expériences seront menées sur des animaux jeunes (moins de 5 mois), avant que la perte de vision ne devienne importante. Les souris recevront quotidiennement des collyres et seront manipulées brièvement pour ces soins. Ces gestes peuvent générer un peu d’angoisse, mais un programme d’habituation est prévu pour qu’elles s’y adaptent en douceur. Les manipulations seront aussi espacées et limitées dans le temps, afin d’éviter un stress inutile ou des anesthésies répétées, en accord avec les bonnes pratiques en matière de bien-être animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever des yeux afin d’étudier l’effet du conservateur sur les différentes structures du segment antérieur (cornée, iris, cristallin).

Remplacement

Il est encore très difficile de reproduire toute la complexité d’un organe comme l’œil en laboratoire, notamment ses différentes structures et leur fonctionnement coordonné. C’est pourquoi les tests uniquement réalisés « in vitro » (c’est-à-dire sur des cellules en culture) ne suffisent pas pour étudier certaines maladies oculaires. Dans notre projet, nous utilisons un modèle animal qui développe le glaucome. Ce modèle est essentiel car il permet de mieux comprendre comment la maladie évolue dans un organisme vivant. De plus, les conservateurs présents dans les collyres peuvent avoir des effets secondaires sur l’œil. Pour les étudier de manière fiable, il est nécessaire d’observer leur action dans un contexte réel, c’est-à-dire sur un œil complet et fonctionnel, avec tous ses mécanismes de défense, d’irrigation et de régulation. C’est pour cela que les expérimentations doivent se faire sur un organisme vivant : elles sont indispensables pour comprendre précisément l’impact de ces substances dans un cadre pathologique comme celui du glaucome.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour ce projet a été soigneusement réfléchi. Il a été calculé à l’avance afin d’avoir assez d’animaux pour obtenir des résultats fiables sur le plan scientifique, tout en évitant de multiplier inutilement les tests. Cela permet de limiter le nombre d’animaux tout en garantissant que les expériences n’auront pas besoin d’être répétées. Les analyses prévues permettront de comparer les différents groupes traités de manière rigoureuse, en utilisant des méthodes statistiques adaptées. Au total, sur toute la durée du projet (42 mois), un maximum de 376 souris sera utilisé, avec une petite marge de sécurité de 16 animaux supplémentaires, pour pallier d’éventuelles pertes imprévues. Par ailleurs, des souris mâles et femelles seront incluses afin d’assurer une bonne représentativité dans les résultats.

Raffinement

Pendant la période d’adaptation, les souris seront suivies chaque jour par les soigneurs, logées par petits groupes (au moins deux par cage) et bénéficieront d’un environnement confortable et stimulant. La mise en place de points limite permet de retirer les animaux de l'expérimentation afin d'éviter toute forme de souffrance (physique et psychique). Pour les examens comme le fond d’œil, la mesure de la pression oculaire, les animaux seront endormis grâce à une anesthésie générale. Ils ne ressentiront donc ni douleur ni gêne pendant les procédures. De plus, les souris ne seront pas gardées au-delà de 16 semaines, ce qui permet d’éviter les effets tardifs du glaucome, notamment la perte de vision qui apparaît habituellement vers 8 mois.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris pour ce projet car c’est un modèle bien connu, couramment utilisé en recherche médicale, notamment pour les maladies de l’œil. Sa petite taille, sa reproduction rapide et le fait qu’elle partage de nombreuses similarités génétiques avec l’être humain en font un outil précieux pour mieux comprendre certaines pathologies. Dans notre étude, nous utilisons des souris transgéniques porteuses d’une mutation connue pour provoquer un glaucome, une maladie oculaire fréquente chez l’humain. Ce modèle a déjà été bien étudié et permet de reproduire les signes du glaucome de manière fiable. Les expériences seront réalisées sur des souris jeunes, âgées de moins de 16 semaines. À cet âge, les animaux sont en bonne santé, ne présentent pas encore de perte de vision liée à la maladie, et les examens seront effectués sans douleur, sous anesthésie. Ce choix permet également de limiter le stress et d’éviter toute souffrance liée à l’évolution de la maladie. Ainsi, ce modèle permet d’étudier de manière précise l’impact de certains traitements sur l’œil, dans un cadre contrôlé, tout en garantissant des conditions éthiques et respectueuses du bien-être animal.

Rasées sur le dos, puis enduites chaque jour pendant cinq jours d'une crème qui provoque rougeurs, épaississement de la peau et desquamation, 100 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de la peau et des organes. Vingt d'entre elles sont gavées trois jours de suite, quarante reçoivent des injections quotidiennes d'un anticorps ciblant la molécule CD146 ou d'un placebo. Le projet cherche à savoir si cette molécule intervient dans le psoriasis et si la bloquer soulage la maladie, ainsi que l'athérosclérose qui l'accompagne souvent. Le porteur cite des études cliniques déjà menées sur des patients psoriasiques, les juge descriptives, et affirme qu'il n'existe "aucune alternative à l'animal" pour étudier cette maladie.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la molécule d'adhésion cellulaire CD146 également appelée MCAM (Melanoma Cell Adhesion Molecule) dans la physiopathologie du psoriasis et à évaluer cette molécule comme cible thérapeutique dans le psoriasis et une comorbidité associée au psoriasis, l'athérosclérose.

Bénéfices attendus

Plusieurs études cliniques portant sur des patients psoriasiques ont été menées antérieurement pour évaluer les niveaux d’expression de la molécule d'adhésion cellulaire CD146/MCAM sur des biopsies de peau, quantifier les concentrations de sa forme soluble dans le sang ou pour étudier les différentes sous-populations leucocytaires exprimant ce marqueur cellulaire dans le sang. Cependant, ces études restent descriptives et ne permettent pas d’évaluer le rôle du CD146 global, du CD146 endothélial ou du CD146 exprimé par certaines cellules du système immunitaire sécrétrices de la cytokine proinflammatoire interleukine 17 dans la pathogenèse du psoriasis. Contrairement à notre projet qui compare des souris mutées ou non pour CD146, ces études ne permettent pas d’étudier les voies de signalisation régulées par CD146. De plus, ces études cliniques n’ont pas évalué l’effet de thérapies ciblant CD146. Ainsi, ce projet permettra d'identifier des mécanismes moléculaires régulés par CD146 dans la pathogenèse du psoriasis. Il permettra aussi d'évaluer dans un modèle murin le bénéfice thérapeutique d'anticorps monoclonaux ciblant CD146 pour traiter le psoriasis et une comorbidité associée au psoriasis, l'athérosclérose.

Procédures

Tous les animaux du projet seront rasés une fois sur le dos (2 minutes par souris). Ils recevront un traitement sous la forme d'une application quotidienne de crème sur le dos pendant 5 jours (30 secondes par application). 20 souris seront gavées avec une solution diluée dans de l'huile de maïs une fois par jour pendant 3 jours (30 secondes par gavage). 40 souris recevront des injections quotidiennes d'un traitement ciblant CD146 ou un placebo pendant 5 jours (30 secondes par injection). Un prélèvement sanguin sera effectué sur toutes les souris (30 secondes par prélèvement).

Impact sur les animaux

20 souris seront gavées une fois par jour pendant 3 jours avec une solution à base d'huile de maïs. Bien que le gavage ne soit pas douloureux, cela pourrait tout de même causer une gêne à l'animal ou un stress du fait de sa répétition et de la contention. Les souris seront rasées sur le dos, ce qui pourrait générer un stress. L'application d'un traitement à base de crème sur la peau des souris pour induire le psoriasis devrait entraîner une inflammation associée à à l'apparition de rougeurs, un épaississement de la peau et une desquamation en plaques. Ce traitement peut entraîner une déshydratation et une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour pouvoir évaluer les conséquences physiopathologiques par de l'histologie, l’étude de l'expression protéique et génétique des marqueurs de dommages tissulaires et inflammation à partir des organes et des tissus d'intérêt.

Remplacement

Nous étudions l'implication de la molécule d'adhésion cellulaire CD146, également appelée MCAM (Melanoma Cell Adhesion Molecule) dans la pathogenèse du psoriasis. Cette pathologie autoimmune implique différents types cellulaires (kératinocytes, fibroblastes, cellules endothéliales, cellules du système immunitaire), avec de nombreuses interactions biochimiques et cellulaires. Malheureusement, il est impossible de reproduire un système aussi complexe dans un modèle in vitro, le recours à l'animal est donc nécessaire. A ce jour, dans la littérature, il n’existe aucune alternative à l’animal pour étudier cette maladie.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris nécessaires pour générer les effectifs de chaque groupe utilisé dans les procédures expérimentales, nous utiliserons des souris issues d'accouplements homozygotes et nous utiliserons aussi bien des mâles que des femelles, le psoriasis touchant chez l'humain autant les hommes que les femmes. En l'absence de toute étude antérieure sur le rôle de la molécule d'adhésion cellulaire CD146 dans le psoriasis chez la souris, nous évaluerons son implication dans cette pathologie en comparant des groupes de 10 souris entre eux, effectif minimal déterminé par une approche statistique pour mettre en évidence de potentielles différences significatives.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 10 jours sera observée après l’arrivée des animaux issus des établissements d'élevage. Les souris seront observées avant d’initier le protocole et les animaux présentant des symptômes type infection seront écartés des protocoles. Le protocole sera arrêté si l’animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait, si ses poils sont hérissés. Les animaux seront pesés une fois par jour et observés deux fois par jour pour prévenir tout risque de déshydratation liée à leur traitement. Les animaux seront hébergés en groupe avec un enrichissement. Les animaux disposeront de nestlets, nids à base de fibres courtes de coton, utilisés comme enrichissement de l ’environnement et matériaux de nidification, ainsi que de tunnels afin de réduire l'ennui et de diminuer le stress en stimulant l'activité et en procurant un sentiment de sécurité à l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de souris présente de nombreux avantages pour notre protocole expérimental. Outre sa petite taille et son coût avantageux, la souris permet de générer un grand nombre de descendants très rapidement. Par ailleurs, sa manipulabilité génétique permet d'analyser l'effet de mutations du gène cible sur la pathogenèse du psoriasis. La souris permet également d'évaluer l'effet d'un traitement thérapeutique ciblant une protéine d'adhésion cellulaire potentiellement impliquée dans le psoriasis et une comorbidité associée, l'athérosclérose. Les souris utilisées seront âgées entre 8 et 16 semaines. Un âge compris entre 8 et 16 semaines est couramment utilisé dans la littérature pour ce modèle induit de psoriasis car l'épaississement de l'épiderme, l'érythème et la desquamation sont clairement visibles à cet âge là. De plus, cette tranche d'âge a permis de mettre en évidence dans plusieurs études les effets thérapeutiques chez la souris de différents traitements utilisés pour soigner le psoriasis chez l'homme.

Opérées de la cochlée entre leur sixième et leur neuvième jour de vie pour y recevoir un vecteur viral, 504 gerbilles de Mongolie attendent au moins huit semaines avant une seconde intervention dont elles ne se réveillent pas. Pendant celle-ci, leurs potentiels évoqués auditifs sont enregistrés de quatre à douze heures sous anesthésie entretenue par réinjections. Le niveau de souffrance déclaré est modéré pour la totalité de l'effectif, et le porteur ne mentionne comme nuisances que la douleur suivant l'injection intracochléaire et le stress lié aux piqûres. Toutes sont tuées pour que leur oreille interne et leur cerveau soient examinés au microscope, l'objet étant de préparer un implant cochléaire fonctionnant à la lumière plutôt qu'à l'électricité.

Objectifs

En 2050, près de 2,5 milliards de personnes dans le monde auront des problèmes d’audition. Pour 700 millions d’entre elles, ces problèmes seront très graves. Aujourd’hui, la meilleure solution pour les personnes qui n’entendent presque plus, c’est l’implant cochléaire électrique. C’est un petit appareil placé dans l’oreille interne. Il capte les sons et les transforme en courants électriques pour faire travailler directement les nerfs de l’oreille. Mais il y a un souci : l’électricité stimule trop large. Elle excite beaucoup de nerfs en même temps, ce qui fait perdre la précision des sons. Par exemple, dans un restaurant bruyant ou dans une classe, c’est difficile de comprendre une conversation. Pour améliorer ça, nous travaillons sur une nouvelle idée : utiliser la lumière au lieu de l’électricité. Comment ? On rend les nerfs sensibles à la lumière grâce à des petites protéines spéciales. Ensuite, on envoie de la lumière avec des mini-lampes dans l’oreille. Cette lumière active les nerfs, mais de manière beaucoup plus précise, un peu comme un rayon laser au lieu d’un éclair. Grâce à ça, on espère que les personnes entendront beaucoup mieux et comprendront les voix même dans le bruit. Notre projet a deux buts : Trouver la meilleure manière de rendre les nerfs sensibles à la lumière. Savoir exactement quels nerfs réagissent à cette lumière.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, un million de personnes qui ne pouvaient plus entendre utilisent déjà des implants cochléaires électriques. Grâce à ces appareils, la plupart arrivent à comprendre la parole quand il n’y a pas de bruit, par exemple dans une pièce calme. Mais dès qu’il y a du bruit autour – dans la rue, un restaurant, une salle de classe ou un bureau – ça devient très difficile. Parfois, ils n’arrivent presque plus à comprendre ce qu’on leur dit. Et il y a un autre problème : ils ne peuvent pas vraiment profiter de la musique, car les sons sont trop simplifiés. Pour améliorer ça, nous développons un implant cochléaire qui utilise la lumière. Cette nouvelle technologie devrait permettre d’entendre plus clairement, même quand il y a du bruit, et peut-être aussi de mieux profiter des sons comme la musique. Pour y arriver, il faut deux étapes importantes : Trouver la meilleure façon de rendre les nerfs de l’oreille sensibles à la lumière. Comprendre comment ces nerfs réagissent à la lumière pour pouvoir les contrôler de manière très précise. Ces recherches sont essentielles pour amener un jour cette nouvelle technologie aux patients et leur rendre une audition la plus naturelle possible.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales. La première procédure consiste à injecter un vecteur viral dans les cochlées des animaux entre le sixième et le neuvième jour de vie. Cette procédure permettra de photosensibiliser les neurones cochléaires. Cette procédure nécessitera environ 30 minutes par animal, en incluant l'induction de l'anesthésie et le réveil. La seconde procédure chirurgicale sera réalisée au moins 8 semaines après l’injection du vecteur viral, lors d’une procédure durant laquelle les animaux ne se réveilleront pas. Durant cette procédure, les potentiels évoqués auditifs seront enregistrés sur une durée de 4 à 12 heures. L'état de profonde anesthésie sera maintenu par reinjection régulière d'anesthésiant durant toute la procédure.

Impact sur les animaux

Les différentes nuisances ont été identifiées: - suite à l’injection intracochléaire à 6-9 jours de vie, douleur post-opératoire; - injection d’antalgiques et anesthétiques : stress

Devenir

À la fin de chaque étape, les animaux devront être euthanasiés (endormis définitivement sans douleur). C’est nécessaire car nous devons analyser leur oreille interne (cochlée) et leur cerveau pour vérifier si la thérapie génique a bien fonctionné. Pour cela, il faut prélever ces organes afin de les examiner au microscope.

Remplacement

Les travaux prévus nécessitent une organisation cellulaire extrêmement complexe, formant un réseau qui ne peut pas encore être reproduit en culture cellulaire ou dans les modèles in silico les plus sophistiqués. Une telle organisation cellulaire complexe ne peut être trouvée que chez d'autres mammifères, tels que les rongeurs. En outre, l'objectif du présent travail est de prédire les performances d'un implant cochléaire optique pour l'homme. Nous devons donc utiliser un modèle animal dont le système auditif est anatomiquement et physiologiquement aussi proche que possible de celui de l'homme. Nous avons donc choisi la gerbille de Mongolie. Les données générées seront partagées avec les scientifiques qui développent des modèles informatiques des voies auditives, ce qui permettra, nous l'espérons, d'utiliser des modèles in silico plutôt que des modèles animaux dans le cadre d'études futures.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été calculé avec soin grâce à un outil statistique. L’objectif est d’utiliser le moins d’animaux possible, tout en s’assurant que les résultats soient fiables. Pour cela, nous avons choisi des critères précis pour garantir que les expériences soient assez puissantes pour montrer un effet réel. Dans ce projet, les deux sexes (mâles et femelles) seront inclus sans faire de distinction.

Raffinement

Le bien-être des animaux est notre priorité pendant toute la durée du projet. Si un animal se retrouve seul, nous ferons en sorte qu’il ne reste pas isolé en le mettant avec d’autres animaux. Au début, un séparateur percé sera utilisé pour qu’ils puissent s’habituer les uns aux autres sans risque. Nous savons que manipuler les animaux peut être stressant pour eux. C’est pourquoi nous allons les habituer doucement à venir d’eux-mêmes sur la main des chercheurs, plutôt que d’être attrapés. Après l’injection (faite très tôt après la naissance), les animaux seront surveillés tous les jours et recevront des médicaments contre la douleur pendant deux jours. Ces médicaments seront donnés après une courte anesthésie (moins de 5 minutes) pour éviter tout stress. Si nous voyons qu’un petit n’est pas bien (par exemple, s’il n’est plus soigné par sa mère), il recevra des soins supplémentaires après avis d’un vétérinaire. Si malgré tout son état ne s’améliore pas, il sera endormi sans douleur. De même, si un animal montre des signes de souffrance plus tard, nous utiliserons une grille d’évaluation spéciale et, après avis du vétérinaire, il recevra des soins ou sera euthanasié.

Choix des espèces

Notre objectif est de savoir si l’implant cochléaire optique pourrait bien fonctionner chez l’être humain. Pour cela, nous devons faire des tests sur un animal qui a une oreille très semblable à celle de l’homme. Nous avons choisi la gerbille de Mongolie, un petit rongeur. Elle entend presque comme nous et sa grande oreille facilite l’accès à la cochlée pour y mettre un implant ou injecter le vecteur viral. Le vecteur viral (qui sert à rendre les nerfs sensibles à la lumière) sera injecté quand les petits ont entre 6 et 9 jours. Pourquoi ? Parce que le traitement marche beaucoup mieux à cet âge. Parce qu’à cet âge, l’os autour de l’oreille n’est pas encore formé, ce qui permet de faire l’injection sans opération lourde. Après 10 jours, cet os se durcit et il faudrait une chirurgie beaucoup plus invasive. Enfin, les mesures (tests) seront faites au moins 8 semaines plus tard, quand les animaux seront adultes et que leur système nerveux sera complètement développé.