Organes sensoriels

Pour cartographier les circuits nerveux de la sensibilité de la langue, 220 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit des injections dans la langue, l'application de molécules et jusqu'à deux chirurgies d'une heure sous anesthésie. Le porteur rattache ce travail au syndrome de la bouche qui brûle, une douleur orale touchant surtout les femmes ménopausées, et évoque un rôle des hormones. Les perspectives thérapeutiques annoncées restent renvoyées au long terme, les souris étant tuées pour le prélèvement de tissus.

Objectifs

La langue est un organe essentiel au bon déroulement de nombreuses fonctions orales (mastication, gustation, phonation etc.). Sa sensibilité conditionne le bon déroulement de ses fonctions. Certaines conditions médicales ou environnementales altèrent la bonne exécution de ces fonctions, dégradent la santé et altèrent la qualité de vie. Par exemple, le syndrome de la langue qui brûle correspond à une pathologie douloureuse encore mal comprise. Cliniquement, ce syndrome se manifeste par une sensation persistante de brûlure au niveau de la pointe de la langue, caractérisée par une douleur modérée à sévère sans lésion apparente. Avec son impact significatif sur la qualité de vie, elle représente un véritable enjeu de santé publique ainsi qu’un enjeu socio-économique majeur. Les traitements actuellement disponibles ne traitent pas les causes de la pathologie et ne soulagent que trop peu la douleur. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués pour permettre une meilleure prise en charge de la pathologie. Il faut noter que le syndrôme de la bouche qui brûle affecte 7 femmes pour 1 homme, et atteint principalement les femmes au moment de la ménopause. Ceci suggère un rôle des hormones dans cette pathologie. Ici, l’objectif du projet est de caractériser les circuits nerveux impliqués dans la sensibilité de la langue et d’évaluer l’effet des changements hormonaux sur cette sensibilité dans des modèles murins reproduisant la carence hormonale associée à la ménopause, et leur contrôle.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra une meilleure caractérisation des circuits nerveux du syndrôme de la bouche qui brûle, inconnus à ce jour. Plus largement, il permettra également d’évaluer les effets des modifications hormonales survenant à la ménopause, qui restent très peu étudiées du point de vue de la sensibilité (douleur, tact, goût, sensation de bouche sèche etc.). A plus long terme, l’identification des mécanismes sous-tendant ce syndrome et les circuits nerveux de modulation de la sensibilité ouvrira des perspectives thérapeutiques ciblées pour les patients.

Procédures

Injection (2x, 20 secondes, sous anesthésie), application de molécule (1x, 10 minutes, sous anesthésie), injection (jusqu’à 3x, 20 secondes, animal vigile), chirurgie (jusqu’à 2x, 1 heure, sous anesthésie).

Impact sur les animaux

La chirurgie peut engender une douleur post-opératoire transitoire et légère de quelques heures à quelques jours. Les procédures d’injection de molécules peuvent également induire une douleur transitoire de quelques heures à quelques jours, notamment localement au niveau des sites d’injection.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de procéder à des prélèvements de tissus pour des études immunohistochimiques.

Remplacement

L’innervation précise des neurones sensitifs innervant la langue, et les projections descendantes pouvant médier l’apparition des douleurs spécifiques à la langue n’est pas connue à ce jour. Cela nécessite donc une caractérisation chez l’animal vivant par traçage neuronal. En effet, il n’existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico permettant de modéliser des voies nerveuses qui n’auraient été caractérisées sur modèle vivant au préalable.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Le bien-être des animaux sera garanti grâce à l’utilisation d’anesthésie générale et grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout au long des procédures, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Des points limites pour lesquels les animaux seront mis à mort ont été définis.

Choix des espèces

Le travail sera effectué sur la souris car il s’agit d’un excellent modèle pour étudier le système nerveux et les pathologies pouvant affecter la sensibilité. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et humain, permettant l’extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout majeur dans l’analyse et l’interprétation des résultats. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, car les circuits neuronaux sont développés et matures.

472 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour étudier l'effet préventif d'une molécule sur la douleur. Toutes reçoivent une injection de la molécule ou d'un placebo, 252 subissent une incision de la peau de la patte au scalpel et 220 une injection d'un composé inflammatoire. La sensibilité est mesurée avant et après par des filaments pressés sur la patte. Les animaux sont tués moins de dix-huit heures après l'intervention pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Depuis 2013, notre équipe travaille sur une molécule nommée Tafa4, dont la perte de fonction chez la souris transforme une douleur aigue (inflammatoire, neuropathique ou post-opératoire) en douleur chronique. Nous avons aussi constaté que l'injection de Tafa4 permettait de réduire l'hypersensibilité mécanique suite à une lésion. Cette molécule a donc une forte valeur thérapeutique et notre équipe de recherche se propose d'étudier et de comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine de cet effet. Récemment, nous avons montré que l'injection de Tafa4 avant une lésion post-opératoire empêchait la mise en place de l'hypersensibilité mécanique chez la souris. Ainsi, ce projet possède un double objectif. D'une part de comprendre comment la preinjection de Tafa4 empêche la mise en place de l'hypersensibilité mécanique, augmentant encore son potentiel thérapeutique. D'autre part, cet effet préventif est le modèle parfait pour comprendre comment l'hypersensibilité mécanique se met en place, ce qui est une question biologique ouverte depuis des années et qui serait à même d'avoir une incidence sur la prise en charge de certaines douleurs.

Bénéfices attendus

Le but final est que TAFA4 soit prescrite comme une molécule antidouleur en clinique. De plus, comprendre quels types cellulaires permets la mise en place de l'hypersensibilité ouvrira un nouveau panel de solutions pour la prise en charge de patients souffrant de douleurs chroniques.

Procédures

Afin d’étudier l’effet préventif de TAFA4, nous serons amenés à injecter la molécule (ou un placebo) en sous-cutanée sur toutes les souris (472). 252 d’entre-elles seront opérées chirurgicalement sous anesthésie générale. L’anesthésique sera administré par voie intra-péritonéale. La chirurgie consiste en une fine incision de la peau de la patte avec une lame de scalpel. Pour le modèle inflammatoire, nous injecterons un composé inflammatoire dans la patte de la souris sur 220 d’entre-elles. Ces interventions dureront moins de 20 minutes. Un jour avant et un jour après ces procédures, nous mesurerons la sensibilité au niveau de la patte des animaux grâce à des filaments exerçant une pression donnée.

Impact sur les animaux

Les animaux seront amenés à recevoir l’administration de composés par injection intra-péritonéale et sous-cutanée. L’injection de ces produits n’entraine pas d’effet indésirable sur les animaux mais la contention et l’injection peut générer un stress chez les souris. De plus, nous utiliserons des modèles lésionnels mimant une lésion inflammatoire ou post-opératoire qui pourraient entrainer une douleur légère qui n'a pas d'incidence sur le comportement de l'animal. Le test d'hypersensibilité appelé test de Von Frey engendrera un léger stress et au cours duquel on évoquera une contrainte sur une patte. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en oeuvre pour minimiser la nuisance provoquée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort car nous devons prélever leurs tissus qui seront par la suite analysés. En effet, l’analyse est indispensable pour comprendre les mécanismes de la douleur et notamment l’effet préventif de TAFA4.

Remplacement

La thématique principale de notre laboratoire étant de comprendre la physiologie de la douleur, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes non animales. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. L’étude comportementale, constituant le point de départ de notre étude, est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers des zones spécialisées du cerveau. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet.

Réduction

Des stratégies seront mises en place afin d’éviter ou de limiter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l'étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles de comportement et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de notre équipe et sont maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés. Nos études se concentreront essentiellement sur la peau de la patte, mais nous utiliserons également d'autres tissus de chaque animaux pour pouvoir avancer sur d'autres projets parallèles.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans un environnement enrichi (coton et/ou dôme) pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. Nous avons recours à l'anesthésie lors du procédé chirurgical et des soins préopératoires adéquats sont administrés. Les procédures expérimentales seront planifiées (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation), ce qui permettra de diminuer le stress des animaux et de favoriser la validité des expériences. Après une lésion, de la nourriture humide sera placée au sol pour éviter que les animaux ne se dressent sur leur patte lésée. Enfin, des points limites les plus précoces possibles seront établis en fonction des tests de comportements utilisés. Moins de 18 heures après l'intervention sur les animaux, ceux-ci seront mis à mort.

Choix des espèces

Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. De plus, différents tissus impliqués dans l'intégration nociceptives (peau, neurones sensoriels et moelle épinière) sont parfaitement décrit chez la souris. Il est clairement admis et recommandé par la communauté scientifique que les expériences de comportement soient réalisées sur des individus ayant atteint leur maturité sexuelle et âgés de 8 semaines. A ce stade du développement, le système sensoriel primaire arrive à maturation avant tous les autres, aussi c'est à ce stade que nous avons choisi de réaliser nos expériences. Ainsi, les animaux auront été commandés à 7 semaines auprès du fournisseur agréé de manière à ce qu'ils s'acclimatent à notre animalerie.

Les tests sont interrompus dès qu'une souris cherche à s'échapper. 864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire leur est provoquée chimiquement par instillation d'un conservateur, une à deux fois par jour pendant cinq semaines, avec jusqu'à neuf tests de sensibilité oculaire sous contention et six anesthésies générales par animal. Le porteur présente ce travail comme la preuve de concept qu'exige la phase de prématuration d'une molécule déjà brevetée, conçue pour faire sécréter de l'eau par les glandes lacrymales.

Objectifs

La sècheresse oculaire (Dry Eye Disease ou DED) est l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Sa prévalence varie de 5 à 35 % chez des sujets âgés de plus de 50 ans. Cette pathologie du segment antérieur de l’œil est caractérisée par des sensations de douleur variables en intensité, allant du simple inconfort à une douleur oculaire prononcée. Les douleurs oculaires sont très difficiles à traiter et leurs mécanismes physiopathologiques demeurent peu connus. Nous avons récemment conçu une molécule qui induit la sécrétion d’eau à partir des glandes lacrymales. Notre projet a pour but d’apporter la preuve de concept nécessaire pour proposer cette molécule comme thérapie de la sécheresse oculaire en recherchant 1) si la composition des larmes induites est équilibrée et stable au cours du temps et 2) si, en induisant cette sécrétion naturelle, la molécule prévient l’inflammation et réduit l’activation des nocicepteurs responsables de la douleur oculaire. Nous utiliserons un modèle pharmacologique de souris validé pour l’étude du DED, permettant d’étudier la mise en place et la progression du syndrome. Les effets de la molécule d’intérêt (sous brevet) seront analysés dans le modèle in vivo en utilisant différents tests (nociception, volume des larmes et aspect de la cornée) et post mortem par des techniques de biologie cellulaire et histologie. Cette étude chez l'animal est un prérequis pour évaluer de manière intégrée le potentiel thérapeutique de notre molécule pour le DED.

Bénéfices attendus

La sécheresse oculaire est à l’origine d’une douleur oculaire chronique, fréquemment associée à des troubles visuels et à une hypersensibilité à la lumière, et constitue l’un des principaux motifs de consultation en ophtalmologie. Elle altère significativement la qualité de vie, près de 60 % des patients rapportant une gêne dans leurs activités quotidiennes, et demeure insuffisamment prise en charge, 80 % des patients estimant que leur douleur est sous-évaluée. Malgré une prévalence croissante, liée notamment au vieillissement de la population, à l’usage accru des écrans et à la chirurgie réfractive, les options thérapeutiques actuelles restent limitées, peu efficaces et souvent invasives, faisant de la sécheresse oculaire un véritable désert thérapeutique. Dans ce contexte, nos travaux visent au développement d’une solution thérapeutique originale et plus performante que les traitements actuellement disponibles. Le projet proposé a pour objectif de contribuer à une amélioration significative de la prise en charge de la sécheresse oculaire et d’ouvrir la voie au développement d’un futur médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis à des applications oculaires de solutions liquides, réalisées sur animaux vigiles sous contention légère, consistant en l’instillation de petites gouttes dans chaque œil. Tous les animaux inclus dans les procédures expérimentales recevront des applications oculaires quotidiennes, une à deux fois par jour selon les groupes et la procédure considérée, pendant une durée maximale de cinq semaines. Chaque application durera environ une minute. Dans la procédure n°1, les mêmes animaux sont suivis tout au long de l’étude. En plus des applications oculaires, ils participeront à des tests fonctionnels oculaires non invasifs réalisés à l’état vigile, sous contention douce, afin d’évaluer la sensibilité oculaire. Ces tests pourront être réalisés jusqu’à neuf fois par animal (habituation comprise) sur une période maximale de six semaines, avec une durée de trois à cinq minutes par session. À chaque temps de mesure, ces mêmes animaux subiront ensuite des examens oculaires non invasifs réalisés sous anesthésie générale brève par inhalation, sans intervention chirurgicale. Chaque animal pourra être anesthésié jusqu’à six fois au cours de la procédure n°1, avec une induction inférieure à deux minutes et une durée totale n’excédant pas quinze minutes. Les examens dureront environ une à deux minutes par œil. La procédure n°1 ne comporte pas de mise à mort systématique : les animaux sont réveillés après chaque anesthésie et retournent dans leurs cages. En fin de suivi de la procédure n°1 (J42), une partie des animaux sera réutilisée dans un objectif de réduction du nombre total d’animaux. Ces animaux subiront alors une seule fois une anesthésie générale brève permettant la réalisation de prélèvements biologiques oculaires, immédiatement suivis de la mise à mort. La procédure n°2 est distincte de la procédure n°1 et réalisée sur des animaux dédiés, utilisés une seule fois à un temps expérimental donné (J7, J14, J21, J28 ou J35). Les animaux sont brièvement anesthésiés afin de permettre la collecte d’échantillons biologiques oculaires, puis immédiatement mis à mort. Il n’y a pas de suivi longitudinal des mêmes animaux et les résultats obtenus ne sont pas appariés.

Impact sur les animaux

Inconfort voire douleur d’intensité légère à modérée résultant de la sécheresse oculaire induite chimiquement par l’application d’un conservateur traditionnellement utilisé dans les gouttes pour les yeux et le nez chez l’Homme. Très léger inconfort produit par les contentions nécessaires aux gestes expérimentaux, léger inconfort lors du test comportemental de douleur, très léger inconfort résultant d’une anesthésie générale. Ce modèle murin sera donc soumis, de par la génération du syndrome des yeux secs et des procédures appliquées, à des nuisances/effets indésirables d’intensité légère à modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques post mortem.

Remplacement

De précédents travaux ont permis de caractériser et de breveter la molécule d'intérêt, de déterminer sa structure et son mode d'action dans différentes cultures cellulaires sur le transport de chlore. Cette phase de prématuration du projet exige maintenant un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant pour caractériser précisément et quantifier les effets de la molécule in vivo. Le syndrome de sécheresse oculaire est d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts (neuro-inflammation etc) et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro à ce stade du projet. Néanmoins, nous mènerons en parallèle des analyses protéomiques sur des cultures immortalisées de cellules de l'oeil.

Réduction

Les effectifs minimaux permettant d’obtenir des résultats fiables et robustes ont été calculés selon la méthode statistique de référence. Nous avons utilisé le programme GPower 3.1 : F-tests ANOVA 2 ways : Fixed effects, special, main effects and interactions. Effects size (medium) : 0.25 alpha err prob : 0.05 Power (1-beta err prob) : 0.8 . Le nombre de prélèvements effectués par animal a été maximisé afin de limiter les effectifs d’individus nécessaire à la collecte des données.

Raffinement

Notre expertise nous permet de mettre en œuvre des mesures de raffinement directement liées aux procédures expérimentales de ce projet, afin de limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux. Des séances d’habituation sont mises en place en amont des tests afin de familiariser les animaux avec l’expérimentateur, la contention manuelle douce et les gestes expérimentaux. Cette habituation progressive permet de réduire les réactions de stress lors des manipulations et d’améliorer la tolérance des procédures répétées. Les évaluations fonctionnelles oculaires réalisées à l’état vigile sont choisies pour leur caractère non invasif et sont systématiquement interrompues dès l’apparition d’un comportement d’échappement, permettant de limiter l’inconfort des animaux. Lorsque cela est nécessaire, les examens oculaires sont réalisés sous anesthésie générale brève par inhalation d’isoflurane, afin d’éviter toute douleur ou stress liés à l’immobilisation. Cette anesthésie est utilisée pour la réalisation des tests de Schirmer, du temps de rupture du film lacrymal (tBUT) et du marquage cornéen à la fluorescéine. L’état des animaux est évalué tout au long de la procédure sur la base de critères cliniques et comportementaux, permettant une adaptation immédiate des manipulations, l’espacement des tests ou la mise en œuvre de points limites précoces lorsque cela est nécessaire.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Le modèle murins reproduisant le syndrome de l’oeil sec (DED, Dry Eye Disease) est un modèle validé et classiquement utilisé dans la littérature. Des animaux âgés de 3 à 5 mois seront utilisés. A cet âge les animaux sont de jeunes adultes, ce qui nous permet de déterminer l'efficacité de notre molécule sur la physiologie oculaire en nous affranchissant de biais potentiels liés au vieillissement.

Tués à l'issue du projet pour prélever leurs organes, sauf s'ils en sont retirés sur avis vétérinaire, 4 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun porte un collier de capture posé sous tranquillisation, une puce de température et une chambre implantée sous la peau, apprend à rester en chaise de contention pendant au moins trois semaines, puis traverse six à neuf études de 72 heures ponctuées de huit prélèvements sanguins le premier jour. L'objet est de mesurer combien de temps des vecteurs censés faire franchir la barrière hémato-encéphalique à un médicament survivent dans le sang, avant d'en retenir un pour y coupler un oligonucléotide. Le porteur décrit cette étape comme "incontournable" dans le développement préclinique, et indique qu'elle vise à proposer la technologie à l'industrie pharmaceutique.

Objectifs

Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et à développer des petites entités, dénommées vecteurs, pour faire pénétrer dans le cerveau des médicaments dont l’accès est proscrit par la présence d’une barrière biologique appelée Barrière Hémato-Encéphalique (BHE). Cette barrière est constituée par une paroi extrêmement étanche des vaisseaux sanguins du cerveau. Cette barrière laisse passer uniquement les composés du sang nécessaires au fonctionnement cérébral et le protège des agressions extérieures mais, ce faisant, en empêche l’accès à certains médicaments. Il existe un système de transport naturel de molécules au niveau des vaisseaux sanguins et nos vecteurs sont capables de s’y attacher pour être amenés vers le cerveau. Couplés à des médicaments ces vecteurs leurrent se système de transport comme un cheval de Troie. Cette thématique de recherche a donc un potentiel révolutionnaire pour le traitement des pathologies du cerveau comme Parkinson et Alzheimer. Nous venons d’optimiser une série de nouveaux vecteurs et dans ce projet nous souhaitons dans un premier temps étudier leur durée de vie dans le sang pour sélectionner celui qui aura le potentiel à amener le plus efficacement un médicament dans le cerveau. Le succès de ces travaux et les dernières études chez le primate non-humain ont démontré l’innocuité de nos composés et tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et optimiser notre technologie pour améliorer ou prolonger l’effet de cette stratégie chez le macaque. Nous comptons tout d’abord étudier la durée de vie dans le sang de 6 à 9 candidats vecteurs seul (sans impact pour les animaux) pour sélectionner le meilleur puis le coupler à une molécule thérapeutique pour évaluer son efficacité pharmacologique. Ce projet est une étape essentielle vers le développement d’un futur médicament et c’est pour cela qu’il s’effectue chez le primate non-humain.

Bénéfices attendus

Grâce à ces études nous pourrons envisager de meilleurs effets thérapeutiques dans le traitement de nombreuses pathologies du cerveau (neurodégénératives notamment) et d’optimiser ces traitements pour des maladies rares ou pour la médecine personnalisée. La molécule thérapeutique utilisée ici appartient à la classe des acides nucléiques ou oligonucléotides thérapeutiques. Dans notre cas c’est une molécule qui va permettre l’inhibition de la synthèse d’une protéine par les cellules du cerveau responsable dans notre cas du syndrome Lesch-Nyhan mais cette technologie peut-être couplé à n’importe quel oligonucléotide permettant de corriger à la baisse ou à la hausse n’importe quel type de protéines et donc de pathologies.

Procédures

Les 4 animaux seront dotés d'un collier de capture sous tranquillisation chimique. Durée pose inférieure à 1 minute. Ils seront ensuite habitués à être manipulés en chaise (au minimum 3 semaines). S'en suivra l’implantation d'une puce pour mesurer leur température corporelle et de port-à-cath (chambre d'administration et de prélèvement sanguin sous la peau) sous anesthésie générale (1h d’anesthésie générale par individu). Une série de 6-9 études débutera ensuite en vigile pour évaluer la durée de vie dans le sang des différents vecteurs (durée de chaque étude 72h) suivie d’une pause de 15 jours post administration. Au cours de ces études un vecteur sera administré (1 min) et des prélèvements sanguins auront lieu le 1er (8 prélèvements de 5 min chacun), le 2eme (1 prélèvement de 5 min) et le quatrième jour (1 prélèvement de 5 min) suivit d’une période de “rinçage” (élimination naturelle) par l’organisme pendant 10 jours. Enfin un entretien des chambres sera réalisé dans la 2eme semaine post administration (20 min par dispositifs). Après cette série d’étude, nous sélectionnerons le meilleur vecteur pour y coupler la molécule thérapeutique. Ce composé sera alors administré (1 min) aux animaux et le même nombre de prélèvements sanguins et d’entretien des dispositifs implantables seront effectués (actes de mêmes durées qu’explicité ci-dessus). Mais ici après les 2 semaines post-administration, les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale (induction anesthésie 15 min et administration euthanasiant : 5 min pour confirmer l’arrêt cardiaque) pour procéder à la récupération des tissus et ainsi évaluer l'efficacité thérapeutique.

Impact sur les animaux

Acclimatation et entraînement à la contention : source de stress générée par le changement d’environnement qui sera réduit au fur et à mesure par l’habituation aux expérimentateurs et par l’apport de récompenses. La pose de colliers, d’une puce de monitoring de la température et l’implantation des ports à cath se fera sous anesthésie générale. Un stress sera notable à l’induction de l’anesthésie, de même que lors du réveil en phase post-opératoire et accompagné d’antalgiques pour réduire la souffrance. L’entretien des port-à-cath : les interventions se feront en vigiles, sans douleur ni stress notables. Le seul geste invasif sera la piqûre de l’aiguille à travers la peau qui sera accompagnée par une analgésie de la peau si nécessaire. La procédure de nettoyage de la peau peut engendrer irritation. Malgré les procédures d’entretien, le dispositif peut se boucher. A cette occasion une et une seule réimplantation par dispositif sera envisagée Suivi de la durée de vie dans le sang : les prélèvements et administration sont réalisés avec une seule insertion de l’aiguille dans les dispositifs par jour. Aucun effet délétère n’est attendu à l’issue des administrations, de même qu’aucune toxicité d’origine pharmacologique (données de toxicité antérieures). L’administration des composés peut engendrer une légère augmentation de température et une modification très transitoire d’un type cellulaire sanguin, les réticulocytes. Selon nos données antérieures chez cette espèce cela reste sans impact sur les animaux. Etude terminale d’efficacité : Ici pas de nouvelles sources de stress, ni d’effets indésirables supplémentaire étant donné que la molécule thérapeutique supplémentaire a déjà été testée avec succès chez cette espèce lors d’une précédente étude.

Devenir

Si le projet arrive à son terme, les 4 animaux seront mis à mort pour prélèvement des organes/tissus d’intérêt. Si les animaux sont sortis du projet sur avis vétérinaire (en relation avec les points limites), ils seront soit Réutilisés ou Replacés par la structure d'accueil (si l'avis vétérinaire y est favorable), soit Adoptés (en cas d'avis vétérinaire contredisant une Réutilisation/Replacement).

Remplacement

L’évaluation de l’efficacité et de la sécurité des produits de santé destinés à l’humain doit être réalisée chez une espèce « rongeur » et une espèce « non rongeur » avant de faire une demande d’investigation chez l’humain en clinique. La capacité de nos vecteurs conjugués à amener un médicament dans le cerveau a déjà été démontrée sur différents modèles cellulaires in vitro puis confirmée in vivo chez le rongeur ainsi que chez le rongeur humanisé pour le récepteur ciblé. Afin de pouvoir proposer à l'industrie pharmaceutique cette technologie, nous devons maintenant établir la preuve de son efficacité et innocuité chez une large espèce non rongeur proche de l’humain, le macaque. Ce projet s’inscrit donc dans une étape incontournable de développement préclinique.

Réduction

La conception de ce projet a non seulement visé à réduire au maximum le nombre d’animaux inclus (4) tout en optimisant le nombre d’études et de prélèvements pour réduire au maximum le stress occasionné, mais aussi pour limiter les interventions à des manipulations transitoires, peu invasives. L’expérience acquise chez la souris permet de réduire le nombre de primate dans chaque groupe à n=3 pour les études de durée de vie dans le sang (nombre défini en amont par nos modélisateurs), puis à n=4 (3+1) pour l’étude d’efficacité en point final. Sur cette dernière étude, nous resterons sur un groupe extrêmement restreint de 4 animaux (n=2 : composé testé et n=2 : groupe contrôle). D’après nos données internes sur cette espèce c’est le plus petit n permettant d’obtenir des résultats interprétables. Fort de cette expérience et de la reproductibilité de nos résultats nous avons donc décidé de passer à un n=2 par groupe.

Raffinement

- Hébergement : Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales pendant toute la durée du projet. Pendant toute cette période, les animaux seront logés dans des enclos avec d’autres congénères. Une grande volière ensoleillée munie de perchoirs sera également en accès libre hors périodes de manipulation. - Alimentation : un régime alimentaire spécifique adapté pour primates sera délivré sans restriction. – Enfin, au cours de toutes les étapes du projet, des récompenses ainsi que des enrichissements (jouets, dispositifs de recherche de nourriture et enrichissements audio-visuels) seront délivrés de façon quotidienne aux animaux. - Enfin, une attention toute particulière portera sur l’anesthésie et l’analgésie avec des méthodes extrêmement conservatives en tout point similaires à l’homme et en relation avec le respect strict des points limites énoncés.

Choix des espèces

Ce projet s’inscrit dans une démarche de fin de développement chez le modèle animal avant une transposition à l'humain, un modèle de large espèce est donc requis. Le modèle Primate Non-Humain est préconisé par rapport à d’autres modèles, comme le chien/cochon. En effet les paramètres d'appariement de nos vecteurs au récepteur présent au niveau des vaisseaux sanguins cérébraux est optimal chez cette espèce. Cette "affinité" est de plus similaire à celle de l'humain pour une meilleure transposabilité (ce qui n'est pas le cas pour d'autres comme le ouistiti). Les animaux utilisés dans cette étude seront tous de jeunes adultes, >2 ans et d’environ 6-7kg. L’utilisation de jeunes adultes s’explique par le compromis entre le poids de l’animal, la quantité de molécule à administrer, ainsi que par le volume total sanguin permettant de réaliser les prélèvements sanguins sans impact pour l'animal.

1 350 souris sont exposées à un traumatisme sonore pouvant durer deux heures, et 1 080 subissent une injection dans la cochlée, opérées pour certaines dès l'âge de deux jours. 2 700 souris sont utilisées au total, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec cinq tests auditifs de quarante minutes sous anesthésie puis une mesure terminale des potentiels de l'oreille interne. Le porteur qualifie la perte auditive provoquée de dommage permanent "sans impact autre sur la santé de l'animal", et affirme que l'exposition sonore ne provoque ni douleur aiguë immédiate ni détresse comportementale manifeste. Les anciens reproducteurs, génétiquement modifiés et donc jugés non adoptables, sont tués au bout de six mois et remplacés.

Objectifs

Selon l’OMS, d’ici 2030, les atteintes de l’audition constitueront la 7ème cause la plus importante d’invalidité au quotidien soit plus de 500 millions de personnes. Dans plus de 80% des cas la surdité est liée à une atteinte de l’organe neurosensoriel de l'oreille (on parle de surdité neurosensorielle). Parmi les surdités neurosensorielles, on distingue les surdités d’origine héréditaire (on parle de surdité génétiques) et d’origine environnementale. La première cause environnementale des troubles de l’audition est la surexposition au bruit. De ce fait, un encadrement législatif de protection des travailleurs dans le milieu professionnel existe dans de nombreux pays. Mais selon l’OMS plus d’un milliard de jeunes sont confrontés au risque d’une perte auditive permanente en raison d’une exposition prolongée à des sons de forte intensité lors de loisirs tels que l’écoute de musique et les jeux vidéo. Il peut également y avoir un effet combiné : si la surdité génétique peut entraîner une perte d’audition dès la naissance (on parle de surdité congénitale), elle peut également entrainer une diminution des capacités au cours de la vie (on parle de surdité acquise) notamment par une sensibilité accrue au bruit. En d’autres termes pour un environnement acoustique donné, une personne présentant système auditif déjà fragilisé par une mutation génétique sera plus susceptible de développer une perte auditive qu’une personne n’en présentant pas. L’objectif de la présente étude est premièrement d’identifier quelles surdités génétiques entrainent une sensibilité accrue au bruit et deuxièmement de déterminer si un traitement symptomatique médicamenteux ou curatif par thérapie génique (nécessitant une chirurgie de l’oreille interne) de la surdité héréditaire permettrait de diminuer l’incidence ou la gravité de la surdité acquise qui s’y adjoint.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’identifier les surdités génétiques entrainant une sensibilité accrue au bruit et d’en documenter les processus physiopathologiques et, si les résultats sont probants, contribuera à plus long terme à une meilleure prise en charge des patients et une meilleure sensibilisation du grand public à l’adoption de bonnes pratiques d’écoute.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tests auditifs (40 minutes en comptant l’anesthésie) et ce 5 fois (reparti entre 1 mois et 2 mois d’âge). En fin de procédure, les animaux seront soumis à des mesures de potentiels endocochléaires qui nécessitent que l’animal soit vivant mais profondément sédaté et qui est une procédure terminale, sans réveil donc et qui dure 20 min. Parmi ces 2700 animaux, 1350 seront soumis à un traumatisme sonore (2h au maximum) Parmi ces 2700 animaux, 1080 animaux seront soumis à une procédure chirurgicale :injection dans la cochlée qui dure environ 10 à 15 minutes

Impact sur les animaux

Le dommage principal et permanent attendu pour cette étude est la perte/diminution des capacité auditive pour les animaux que l’on induit par une exposition sonore sans impact autre sur la santé de l’animal. Les autres dommages attendus pour cette étude sont une peur et un stress physique transitoire lors des traumatismes sonores et une douleur – modérée, contrôlée par des analgésiques - consécutive à la chirurgie de l’oreille interne.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Animaux pour élevage : Les anciens reproducteurs sont des animaux transgéniques ne pouvant être adoptés, ils seront mis à mort au bout de 6 mois et renouvelés Animaux utilisés pour les expériences : Les animaux seront mis à mort pour réaliser nos analyses sur prélèvements.

Remplacement

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central des rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble (de l’oreille interne au cortex auditif). De plus, il n’est pas possible de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux, et aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.

Réduction

Les tailles des groupes de souris indiquées ont été calibrées pour répondre aux questions posées. Les groupes sont constitués afin de détecter un certain niveau de différences entre groupes. Les groupes seront constitués de 6 animaux et les expériences répétées 2 fois. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et génotypons les animaux afin de ne pas maintenir inutilement les animaux qui ne portent pas les modifications génétiques d’intérêt pour ce projet.

Raffinement

Pour la chirurgie : • emploi d’analgésiques et application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. • les souris nouveau-nées anesthésiées seront gardées sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans leur cage initiale. • surveillance pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans notre grille d’évaluation de référence. Surveillance et si nous observions l’atteinte d’un point limite, l’animal serait immédiatement mis à mort. Pour les mesures auditives : • Les mesures auditives sont réalisées sur des souris anesthésiées, application d’un gel ophtalmique. A la fin des enregistrements, les souris seront placées dans des cages sur un tapis chauffant, et surveillées jusqu’à leur réveil complet. Un gel nutritif et hydratant sera disposé dans les cages d’hébergement. • Surveillance et si nous observions l’atteinte d’un point limite, l’animal serait immédiatement mis à mort. Pour l’exposition sonore : La procédure ne provoque ni douleur aiguë immédiate ni détresse comportementale manifeste . • Avant l'exposition au bruit, les souris sont placées dans la cage d'exposition pendant 15 minutes par jour pendant une semaine afin de s'y habituer et d'éviter un stress chez les animaux. • Pendant le traumatisme sonore, les animaux seront surveillés pour s’assurer que les animaux ne présentent aucun signe de douleur aiguë immédiate ni détresse comportementale manifeste. • Surveillance et si nous observions l’atteinte d’un point limite, l’animal serait immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec des souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris en post natal. : Pendant les 8 premiers jours après la naissance, le système auditif est immature, à 16 jours après la naissance le système auditif est fonctionnel, et à 30 jours après la naissance et au-delà, le système auditif est mature. Les chirurgies de l’oreille interne seront réalisées sur des nouveaux nés, 2 jours après la naissance. Les traumatismes sonores et les tests auditifs seront réalisés à l’âge adulte.

Tout signe clinique grave qui persiste plus de vingt-quatre heures déclenche la mise à mort de la souris concernée. 1 098 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever l'oreille interne. Injectées dans l'oreille interne au premier jour de vie, elles subissent ensuite des tests auditifs sous anesthésie de un à douze mois, puis des tests d'équilibre et d'orientation, dont une épreuve de trente et une minutes et un test de nage de dix secondes. Le porteur crée une lignée déficiente en deux protéines, sourde et probablement sujette à des troubles de l'équilibre, tout en affirmant qu'aucune dégradation de l'état des animaux n'est attendue et en renvoyant les essais cliniques au long terme.

Objectifs

Environ 40% des pertes auditives sont d’origine génétique. Les prothèses auditives (dans le cas des surdités légères) et les implants (dans les cas de surdités sévères ou profondes) sont des dispositifs médicaux qui permettent d’accéder aux sons, mais ne restaurent pas une audition naturelle. Depuis peu, la thérapie génique est l’une des pistes explorées pour soigner les surdités génétiques. Notre objectif est d’évaluer l’effet d’une telle approche dans des modèles murins de surdité liée à une déficience en molécule que nous souhaitions étudier. Nous testerons deux stratégies de thérapie génique dans des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de développer des stratégies thérapeutiques capables de prévenir et/ou retarder les déficits sensoriels (audition/équilibre) liés à une déficience en molécule étudiée. A court terme, nous identifierons les méthodes les plus efficaces pour apporter une protéine fonctionnelle (supplémentation de gène) ou réparer le gène d’une protéine mutée (édition de gène) au niveau des cellules sensorielles de l’oreille interne. A long terme, nous espérons grâce à ce travail développer des outils utilisables dans des essais pré-cliniques et cliniques afin de prévenir la surdité postlinguale chez les patients porteurs de mutation sur les gènes codant pour les Clarines. Le fait de générer une souris double déficiente en molécules étudiées va nous permettre de : 1) enrichir nos connaissances sur la possible redondance biologique des 2 molécules, 2) consolider les effets bénéfiques de la thérapie génique par supplémentation de gènes ou par édition génique pour corriger la perte auditive et les troubles d’équilibre.

Procédures

Chirurgie : Les animaux seront soumis à des injections sous anesthésie gazeuse et analgésie, elles seront uniques et ne dureront pas plus de 10 minutes. Tests auditifs : Les souris seront soumises à des tests auditifs dès l’âge de 1 mois. Ces tests pourront être répétés à 2, 3, 4, 5, 6 et 12 mois. Les souris seront anesthésiées puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Des mesures seront enregistrées à l’aide d’électrodes ou de sondes placées sous la peau ou à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Tests d’équilibre : Les souris seront également soumises à des tests comportementaux. Leurs déplacements seront analysés à l’aide d’un système vidéo (2 minutes). Leur capacité d’équilibre sera quantifiée par 2 tests (l’un durant 31 minutes, l’autre 2 minutes). Leur capacité d’orientation dans l’espace sera évaluée grâce à deux autre tests (10 à 60 secondes chacun). Un test de nage sera finalement réalisé (10 secondes) avant le retour en cage d’hébergement.

Impact sur les animaux

Les souris déficientes en molécule étudiée présentent des déficits auditifs progressifs. La nouvelle lignée de souris que nous souhaitons créer sera déficiente en deux molécules et pourrait présenter des troubles de l’équilibre, en plus d’un déficit auditif. Les injections dans l’oreille interne seront réalisées sous anesthésie gazeuse et analgésie, en conditions optimales d’asepsie et avec un contrôle rigoureux des animaux en pré- et post-opératoire. Aucune dégradation de l’état des animaux n’est attendue. Bien au contraire, nous espérons que le remplacement ou la correction du gène muté contribuera à rétablir les fonctions sensorielles des souris injectées. En découle la liste ci-dessous des interventions après raffinement, et de leurs éventuels effets indésirables supérieurs ou égaux à une piqûre d’aiguille : 1) Pour la création d’une lignée de souris transgénique déficiente en deux molcéules, élevées dans un milieu fortement enrichi -> surdité et troubles d’équilibre, 2) Pour les injections sous anesthésie gazeuse et analgésie, avec soins pré- et post-opératoires -> pas de nuisance attendue du fait des injections réalisées sous contrôle strict pré- et post-opératoire.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements post-mortem de l’oreille interne, à des fins d’analyses.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative in vitro ou in silico pour appréhender les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus mécanique par les cellules sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique aux neurones de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. De fait, nous aurons recours à la souris dans notre projet pour étudier les cascades physiopathologiques impliquées dans la surdité et pour tester l’efficacité thérapeutique de traitements préventifs.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué un test de puissance statistique à partir des données issues de l’une de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nous limitons également le nombre d’individus de nos groupes contrôles en réexploitant, quand cela est pertinent, les données contrôles de nos expériences antérieures. Afin d’éviter un éventuel « effet cage », les souris d’une même cage seront subdivisées pour recevoir au moins 2 traitements différents. Nos données quantifiées seront analysées avec un logiciel. Selon la taille et la distribution des échantillons, nous utiliserons différents tests statistiques.

Raffinement

A) Grille d’évaluation d’un phénotype dommageable : Notre projet prévoit la création d’une nouvelle lignée de souris transgéniques déficientes en deux molécules. Dans la mesure où toute création d’une nouvelle lignée de souris implique de surveiller la survenue d’un phénotype dommageable, nous suivrons la « fiche d'évaluation de phénotype suite à une création de lignée » proposée par notre SBEA. Ainsi, sur un minimum de 14 mâles et de 14 femelles (issues de 4 portées distinctes, nous examinerons un panel de critères physiques et comportementaux à trois stades : 1) à la naissance : taille des portées, soins apportés par les mères, présence d’une poche de lait stomacale, poids, apparence, réactivité, 2) au sevrage : âge de séparation, nombre de souris sevrées, proportion mâles/femelles, poids, apparence, réactivité, 3) à 2 ou 3 mois : poids, apparence, comportement, posture, consistance des selles. La survenue d’un signe clinique grave et persistant (plus de 24h) entrainera la mise à mort de l’individu concerné. B) Enrichissement de l’environnement Chez la souris, les troubles sensoriels peuvent s’accompagner d’hyperactivité, de désorientation, de stress et de bagarres (chez les mâles). D’expérience, nous avons remarqué que pour limiter ces effets, il suffisait d’ajouter deux igloos par cage, des copeaux en carton, des bâtonnets en bois à grignoter (1 par souris), et d’équilibrer le nombre d’animaux normaux et d’animaux déficients dans une même cage. Les cages doivent de plus être manipulées avec une très grande délicatesse et le moins souvent possible (une fois par jour maximum). Les personnes amenées à intervenir sur nos cages de souris déficientes sont alertées sur les consignes à appliquer. C) Monitoring des souris en amont et en aval d’une anesthésie avec ou sans chirurgie L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des souriceaux. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans leur cage. Les animaux opérés seront régulièrement inspectés pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans la grille d’évaluation fournie par notre SBEA.

Choix des espèces

Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Nous projetons d’en créer un nouveau, déficient pour deux molécules. Ces modèles vont nous permettre d’explorer les preuves de concept thérapeutique que nous pourrons transposer, du moins conceptuellement, chez l’homme. Les injections se feront sur des souris âgées de 1 jour, soit à un stade immature où les cellules sensorielles ne sont pas encore trop affectées. La mise à mort se fera entre 8 jours et 6 mois post-injection pour évaluer les effets à court, moyen et long termes d’une correction génique.