Recherche appliquée

46 rats vont être utilisés, tous tués pour prélever et analyser leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection d'antibiotique dans la veine de la queue, puis subit sous anesthésie une ponction de liquide cérébrospinal et un prélèvement de sang, après quatre séances d'habituation au tube de contention. Le porteur signale que l'injection provoque une perte d'équilibre et une attitude prostrée. Tout tient à une mesure de concentration, et les résultats attendus "constitueront une base scientifique pour envisager, de manière raisonnée, la poursuite du développement" de l'antibiotique, formule qui tient le bénéfice pour les patients à bonne distance.

Objectifs

Les infections neuroméningées sont difficiles à traiter de par la présence de barrières physiologiques dans l'organisme protégeant le cerveau. De plus, l'émergence de résistance aux antibiotiques actuels accentuent cette problématique. La recherche de nouveaux antibiotiques pouvant traiter ces infections devient donc un enjeu majeur. L'objectif de ce projet est d'évaluer la capacité d'un nouvel antibiotique à passer la barrière qui protège le cerveau et à pénétrer dans le liquide cérébrospinal et dans le cerveau. L'antibiotique choisit a fait ses preuves dans des infections rénales ou pulmonaires compliquées.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de cette étude chez l'animal constitueront une base scientifique pour envisager, de manière raisonnée, la poursuite du développement de cet antibiotique dans l’indication des infections neuro-méningées chez l'homme.

Procédures

Tous les animaux recevront au cours du projet une injection d'antibiotique de 30 secondes environ, et 2 prélévements (liquide cérébrospinal et sang) seront réalisés sous anesthésie. La durée de l'anesthésie sera de 5 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Injection caudale :légère douleur, brève et transitoire. Injection antibiotique : Perte d'équilibre et attitude prostrée

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse de cerveaux

Remplacement

Dans les premières phases de développement d'un médicament à visée cérébrale, il est possible d'utiliser des cultures de cellules. Cependant ces cultures ne reproduisent pas la complexité des barrières protégeant le cerveau et elles ne prennent pas en compte l'existence d'autres organes dans lequel le médicament se distribue via la circulation sanguine. Les modèles animaux restent donc nécessaires avant de tester le médicament chez l'Homme.

Réduction

L'étude sera faite en deux étapes ; la première permettra de trouver les conditions optimales d'administration sur un rat par condition. Les résultats seront confirmés dans la seconde étape sur des lots de plusieurs d'animaux. En se basant sur des données de la littérature, nous avons calculé le nombre minimal d'animaux par lot permettant d'obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Les rats seront acclimatés pendant 10 jours. Une habituation au tube de contention qui permettra l'injection est prévue : 4 séances de 5 min sur 4 jours différents précédents l’administration . Les prélèvements seront faits sur des animaux anesthésiés sous couverture antalgique. Des points limites gradés ont été établis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations ce qui permettra d'agir sans délai.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats agés de 8 semaines ayant atteint la maturité physiologique, modèle couramment utilisé en pharmacologie. Il s’agit d'une lignée consanguine qui présente une certaine variabilité génétique entre les individus ce qui permet de mieux refléter la diversité génétique observée dans les concentrations d'antibiotiques dans la population humaine. De plus, leurs paramètres physiologiques, métaboliques et anatomiques sont bien connus, cela permet une interprétation fiable des données chez le rat et donc une extrapolation des résultats à l'homme plus robuste.

760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de leurs tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous anesthésie générale, puis jusqu'à neuf injections hebdomadaires sur animal vigile, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse ou par imagerie tous les trois jours. Le composé testé a déjà montré une forte activité antitumorale, y compris sur une xénogreffe de cancer du poumon, ce qui l'oriente selon le porteur vers des essais cliniques. Il écrit qu'il est "absolument indispensable" de passer par un modèle vivant pour confirmer que cette efficacité passe par le système immunitaire.

Objectifs

Les microtubules sont les composants majeurs du cytosquelette de la cellule et sont composés d’un seul type de protéine : la tubuline. Ils sont impliqués notamment dans la division cellulaire et la vascularisation tumorale. C’est pourquoi, en chimiothérapie antitumorale, cibler les microtubules est la stratégie thérapeutique à large spectre la plus efficace. Des petites molécules appelées agents ciblant les microtubules sont responsables de la régulation de la tubuline. Une société a développé un nouvel agent synthétique capable de réduler la tubuline et montrant une forte activité antitumorale ainsi que la capacité à outrepasser les mécanismes de résistance habituels. De plus, cette forte activité est également observée dans un modèle de xénogreffe de cancer du poumon non à petites cellules, orientant ainsi ce composé vers des essais cliniques en tant que nouveau médicament anticancéreux prometteur. Nos résultats in vitro (données non publiées) nous ont aussi permis d’observer que ce composé active la mort cellulaire immunogène, c’est-à-dire que le système immunitaire se retrouve activé par la mort des cellules tumorales. C’est pourquoi, nous souhaitons confirmer in vivo que l’efficacité antitumoral de ce composé synthétique est lié à l’activation du système immunitaire.

Bénéfices attendus

Notre composé a déjà démontré un fort potentiel in vitro pour le traitement du cancer du poumon. Cette étude in vivo explore le potentiel immunogène et l'efficacité d'un schéma thérapeutique combiné à une immunothérapie conventionnelle par blocage des points de contrôle immunitaire. Ainsi, cette étude préclinique ouvrira la voie à des essais cliniques ultérieurs et à une éventuelle homologation clinique.

Procédures

Les animaux recevront une injection sous anesthésie générale (2min) puis deux injections sous anesthésie locale (vigile,

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes de cellules tumorales sous anesthésie générale, des injections de traitements, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse ou d’imagerie tous les trois jours. Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress chez l’animal et les croissances tumorales en sous-cutanées peuvent entraîner des douleurs locales et modérées. Une perte d’appétit modérée et donc une perte de poids modérée peuvent apparaître chez la souris suite aux traitements médicamenteux.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées pour analyse des tumeurs après traitement, post-mortem.

Remplacement

Ce projet ayant pour objectif de tester si notre nouveau composé synthétique induit une réduction de la croissance tumorale avec une activation du système immunitaire, il est donc nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument indispensable pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre minimum d’animaux par groupe statistiquement nécessaire afin de réaliser notre étude. Nous aurons donc 9 animaux par groupe. Une souris supplémentaire a été ajoutée par groupe (soit un total de 9+1 souris par groupe) pour prendre en compte d’éventuelles exclusions d’animaux dans l’étude, telles que des tumeurs hétérogènes au moment du traitement, des problèmes comportementaux, l’atteint précoce d’un point limite, où la mort pendant l’expérimentation. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lors que cela est possible. L’étude sera interrompue si l’hypothèse initiale n’est pas validée lors des premières procédures, les procédures suivantes ne seront pas entreprises. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tous changements. Nous enrichirons le milieu à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes). La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons. Tout d’abord, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue, ce qui nous permet un contrôle précis de nos expérimentations. Ensuite, la souris est un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Et pour finir, la méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une grande pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

Une injection déclenche une fibrose rénale, puis deux à six injections ou gavages de molécules suivent, avec des collectes d'urine obtenues par contention. 280 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour l'analyse histologique de leurs reins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les gavages répétés peuvent irriter l'œsophage et les injections enflammer le site de piqûre, alors que le porteur écrit que ces souris "ne présentent aucun phénotype dommageable". Sur la réduction, il indique avoir dimensionné les groupes avec un plan d'expérimentation, sans donner un seul chiffre justifiant les 280 animaux.

Objectifs

La fibrose est une augmentation anormale de la quantité de tissu conjonctif fibreux dans un tissu ou un organe. Cette fibrose entraine des défauts d'organes puisque les cellules spécialisées de l'organe sont remplacées par des fibres non fonctionnelles d’où le nom de fibrose. Les maladies fibrotiques, telles que la fibrose rénale associée à l’insuffisance rénale chronique (IRC), constituent des enjeux thérapeutiques majeurs en raison de l’absence de traitements curatifs. Des résultats récents suggèrent que des récepteurs cellulaires de molécules présentes dans le rein lors de l'IRC jouent un rôle prépondérant dans l’initiation et la progression de la fibrose rénale. Dans ce projet, nous allons tester l’effet thérapeutique de molécules innovantes ciblant ces facteurs pro-fibrotiques dans un modèle murin de fibrose rénale. L’évaluation du degré de fibrose rénale après traitement avec les molécules innovantes permettra d’évaluer le potentiel thérapeutique de ces molécules pour traiter les patients atteints de fibrose rénale.

Bénéfices attendus

Les résultats générés par ce projet permettront d’envisager la mise en place en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la fibrose rénale et ainsi d’améliorer la prise en charge des patients souffrant d’insuffisance rénale chronique.

Procédures

Les animaux recevront une injection pour induire la fibrose rénale. Les molécules thérapeutiques seront ensuite administrées par injections (2 à 6 maximum) ou par gavage. Durée des injections : 3 à 5 secondes. Durée des gavages : environ 10 secondes. Les collectes d’urines permettant de suivre la fonction rénale se feront par une méthode non-invasive, à savoir par miction spontanée lors de la préhension des souris.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet ne présentent aucun phénotype dommageable. Le produit injecté en début d'étude va entrainer une fibrose rénale qui peut avoir des conséquences sur l’état de santé général des souris. Les injections répétées des produits thérapeutiques peuvent occasionner une gêne et une inflammation au niveau du site d’injection. Les gavages répétés peuvent induire une gêne et une irritation de l’œsophage. Les contentions pour traitement et prélèvement d’urine peuvent occasionner un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de permettre la réalisation d’analyses histologiques de leurs reins.

Remplacement

Les composés thérapeutiques innovants que nous testerons dans ce projet on fait l’objet d’études in vitro préliminaires. Néanmoins, le but de ce projet est de définir le potentiel thérapeutique de ces molécules dans l’apparition de la fibrose rénale. La complexité des processus cellulaires responsables de la fibrose ne peut être étudiée que dans un modèle in vivo intégrant tous ces facteurs.

Réduction

Pour cette étude nous avons dimensionné les groupes d’animaux en utilisant un plan d’expérimentation permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et ainsi de garantir l’obtention de résultat pertinents biologiquement et exploitable tout en minimisant le nombre d’animaux.

Raffinement

Notre expérience sur le modèle nous a permis d’adapter la fréquence de suivi et de préciser les différents points d’observation clinique qui caractérisent de manière précoce et prédictive les points limites. Ainsi nous accélèrerons la fréquence de suivi de animaux et de pesé dès la deuxième semaine après traitement afin de s’adapter à la cinétique réelle d’apparition de la maladie. Un examen clinique sera réalisé 2 à 3 fois par semaine dès le début des études et le remplissage d'une grille de score lors de ces examens cliniques permettra de déterminer de façon objective le devenir de l'animal.

Choix des espèces

Le but de ce projet est de tester l’effet thérapeutique de molécules innovantes ciblant la fibrose rénale. La souris apparait comme un excellent modèle pour répondre à cette question car elle présente de grandes similitudes avec l’être humain. En effet, le rein des souris est histologiquement et physiologiquement similaire à celui des humains. Dans ce projet, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, les animaux de cette tranche d’âge ont un fonctionnement rénal optimal qui n’est pas encore altéré par le vieillissement.

1 200 souris et 150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois injections de vaccin sous anesthésie, espacées de quinze jours sur soixante jours, et subit cinq prélèvements de sang, avec une fièvre, une perte d'appétit et un gonflement au point d'injection attendus pendant un à deux jours. Il s'agit de tester de nouveaux adjuvants censés déclencher une réponse cellulaire cytotoxique que les adjuvants autorisés chez l'humain n'obtiennent pas. Le porteur écrit vouloir démontrer que ses modèles cellulaires pourraient à terme remplacer les animaux, et tire de cette comparaison même la "nécessité de l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques".

Objectifs

Les vaccins protéiques sont une classe de vaccins qui utilisent des protéines spécifiques de pathogènes pour stimuler une réponse immunitaire protectrice chez l'organisme. A cette composante protéique est ajouté un adjuvant afin d’obtenir une réponse immunitaire capable de protéger contre le pathogène ciblé. A ce jour, les adjuvants acceptés chez l’homme induisent de bonne réponses anticorps, mais la réponse cellulaire cytotoxique est très faible. Ces vaccins protéiques sont donc à ce jour peu efficaces pour protéger des infections virales. Nous avons développé de nouveaux adjuvants dans le but d’augmenter fortement cette réponse cellulaire cytotoxique. Nous avons développé de plus des stratégies pour limiter les effets secondaires tel que fièvre, inflammation locale… Nous nous proposons maintenant de tester ces candidats adjuvants chez le rongeur sur un modèle de vaccination très classique nous permettant d’évaluer la réponse immunitaire ainsi que vérifier l’absence d’effets secondaires importants.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but premier de trouver de nouveaux adjuvants pour des vaccins protéiques capable d’induire une bonne réponse immunitaire humorale et cellulaire importante sans générer d’effets secondaires importants. Il est important de noter qu’à ce jour il n’y a pas d’adjuvants réellement efficaces pour les vaccins protéiques qui permettent d’obtenir une bonne protection contre les pathogènes viraux. Ce projet pourrait permettre de mettre au point des vaccins contre des maladies virales pour lesquelles il n’existe aucun vaccin efficace à ce jour.

Procédures

Les animaux anesthésiés auront 3 injections de vaccins (temps injection 1 min max) espacés de 15 jours sur une durée de 60 jours. Cinq prélèvements de sang seront effectués sur chaque animal (temps prèlèvement 1 min maximum) et sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont ceux attendus après une vaccination : Une rougeur locale au site d’injection, un petit gonflement, une induration, et une douleur au toucher pourront être observés, leur intensité est légère à modérée sur une durée de quelques heures à 1 jour. De la fièvre, une perte d’appétit et des poils hérissés peuvent également apparaître et persister en théorie de 1 à 2 jours, entraînant une nuisance modérée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever des tissus dans le but d’étudier au mieux la réponse vaccinale.

Remplacement

Le recours à des animaux est justifié par la nécessité d’avoir un système immunitaire complet pour mesurer l’immunogénicité et la réactogenicité de nos formulations vaccinales. Le recours à des animaux semble donc inévitable à ce jour. L’un des buts de ce projet est aussi de démontrer l’intérêt de nos modèles cellulaires ainsi que nos modèles de diffusion /relarguage in vitro pour remplacer ou fortement diminuer à terme l’utilisation des animaux. Mais, pour obtenir cet objectif, nous devons comparer les réponses entre modèles cellulaire et modèles animaux, d’où la nécessité de l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.

Réduction

Chaque expérimentation chez la souris est réalisée avec un maximum de 8 groupes de 6 souris. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à partir des publications de vaccination. D’après notre expérience, il est suffisant pour permettre à l’expérimentation de mettre en évidence des différences significatives sur le titre anticorps entre les groupes, notre critère majeur. Ces expériences chez la souris permettront de déterminer une ou 2 formulations vaccinales optimisées qui seront ensuite testées chez le rat. Les expérimentations chez le rat sont réalisées sur un maximum de 3 groupes de 5 rats. Ce nombre restreint permet de garder suffisamment d’animaux par groupe pour réaliser des études statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux sont anesthésiés avant chaque injection ou prélèvement pour limiter au maximum le stress et la douleur. Les animaux immunisés ne sont pas censés avoir de troubles de leur santé suite à l’injection des candidats vaccins. Une réaction locale au niveau du site d’injection ou de la fièvre peut cependant être induite par la réponse immunitaire innée de l’animal vis-à-vis du vaccin. Une surveillance particulière avec examen clinique individuel 4h et 24h après injection sera réalisée en plus de la surveillance quotidienne. Une grille de « scoring » permettra de mettre en place un traitement pour palier à la douleur que pourrait ressentir l’animal. A l’aide de cette grille de scoring, les éventuels signes cliniques de douleur (locale ou générale) sont détectés, et un traitement d’analgésique locaux ou injectable est appliqué pour y remédier. Dans le cas exceptionnel de douleur non maitrisée par ces traitements, les animaux sont immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les espèces animales sélectionnées, souris et rats, sont les espèces couramment utilisées pour les premiers tests de vaccination : la souris est utilisée dans un premier temps car notre modèle d’étude est le modèle immunologique de référence chez la souris. Dans un second temps, le rat est utilisé comme second modèle car sa taille plus importante permet d’avoir une première idée de l’extrapolation des doses injectables à un plus gros animal. Ces expériences seront réalisées sur des souris ou rats adultes matures âgées de 8 à 12 semaines. A cet âge, le système immunitaire est totalement développé.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant jusqu'à trente injections intradermiques d'acide hypochloreux. Le produit épaissit et durcit la peau du flanc, provoque des croûtes et une inflammation chronique, avec des léchages et des grattages excessifs, une perte de poids et une altération du pelage. Six injections intraveineuses et sept prises de sang par animal s'y ajoutent, pour tester des anticorps censés traiter la sclérodermie. Les anticorps ne seront testés que si la première partie du projet parvient d'abord à installer la maladie chez la souris, ce qui range les bénéfices annoncés derrière une condition quand les lésions cutanées, elles, sont programmées.

Objectifs

La sclérose dermique, maladie auto-immune, plus connue sous le nom de sclérodermie, est une maladie rare où la peau devient anormalement dure et épaisse. Cette maladie est due à une surproduction de collagène, une protéine qui rend normalement la peau souple, mais qui, en excès, la rend rigide et moins fonctionnelle. Dans ce projet, nous souhaitons mettre en place ce modèle sur des souris (première partie du projet) pour ensuite tester nos différents anticorps candidats ciblant une protéine membranaire pour traiter cette maladie (deuxième partie du projet).

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe pas de traitement curatif de la sclérose dermique. Les approches thérapeutiques visent à ralentir la progression de la maladie, à soulager les symptômes et à améliorer la qualité de vie. Le traitement est adapté selon la forme de la maladie et les organes atteints. C’est pourquoi le développement de nouveaux traitements est à ce jour nécessaire.

Procédures

Pesées : 8 pesées x 30 sec = 4 min Injections intradermales : 30 injections x 30 sec = 15 min Injection intraveineuses : 6 injections x 1 min = 6 min Prélèvements de sang : 7 prélèvements x 1 min = 7 min

Impact sur les animaux

Douleur et inconfort localisés : L’injection intradermique peut provoquer une légère douleur au point d’injection, avec un risque d’inflammation locale, d’œdème, de rougeur et de sensibilité accrue de la zone traitée. Développement de lésions cutanées : Les souris développent un épaississement local de la peau, une induration, ou des croûtes, pouvant gêner la mobilité ou entraîner des comportements de léchage ou de grattage excessifs. Inflammation et stress : L’administration répétée de d'acide hypocloreux induit une inflammation chronique locale, source d’inconfort, de stress pour l’animal. Altération de l’état général : Si la réaction inflammatoire est importante ou si les lésions sont étendues, on peut observer une baisse d’activité, une perte de poids ou une altération du pelage, signes d’une souffrance plus globale.

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, les organes et sites d’injections sont prélevés pour analyse

Remplacement

Il existe à ce jour des méthodes in vitro permettant de reproduire au mieux de manière limité l’induction de la sclérose dermique comme par exemple l’utilisation de cultures de cellules humaines ou de tissus reconstruits, tels que la peau artificielle ou des organoïdes cutanés. Ces modèles permettent d’étudier les mécanismes de la fibrose, de tester des molécules et d’observer les effets sur des tissus humains. Cependant il est toujours impossible de reproduire l’effet biologique et physiologique de l’organisme tout entier. Ainsi, les constructions testées dans ce modèle ont d’abord été validées par test in vitro, notamment pour tester leur efficacité sur la cible mais aussi leur tolérance

Réduction

Nous utiliserons donc un nombre minimal d’animaux par groupe : induction de la maladie chez 12 souris pour une inclusion dans les procédures de 10 souris par groupe minimum à la fin de l’expérience (le taux de réussite de l’induction de la sclérose dermique est de 80-90% selon la littérature). Ce nombre nous permettra d’arriver à des résultats statistiquement significatifs. Lors de la première partie du projet, nous développerons le modèle avant de tester dans une seconde partie nos candidats. Par conséquent, si le modèle n’est pas validé en première partie, les anticorps ne seront pas testés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe de 4 avec enrichissement du milieu (tunnel et fristotis en carton), et surveillés quotidiennement. Les injections intradermiques sur le flanc (induction) ainsi que les injections intraveineuses (traitement) sont réalisées par un expérimentateur entraîné, et réalisées sous anesthésie (lidcoaine au point d'injection). Observation quotidienne des animaux (apparence, consommation aliment et eau, comportement), pesée des animaux tout au long de la procédure (jour 0, 2, 4, 7 et 14 puis une fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude). Pour chaque animal et donc chaque injection l’aiguille sera changée, nous utilisons ici des aiguilles stériles. La salle de manipulation est intégralement nettoyée (paillasse et sol) avant toute injection. Nous veillerons à ce que toutes les conditions environnementales pour l’injection soient les plus propres possible. Les points limites sont décrits dans chacune des procédures. De plus, tout autre signe clinique observé, indépendamment des procédures (pendant la période d’acclimatation par exemple), fera l’objet de soins tels que définis en accord avec le vétérinaire suivant le tableau fourni en annexe.

Choix des espèces

Les souris C57BL/6 présentent une réponse inflammatoire marquée, ce qui les rend particulièrement adaptées à l’étude des maladies auto-immunes et inflammatoires comme la sclérodermie. Elles permettent de reproduire de façon fiable les mécanismes de fibrose et de vasculopathie observés chez l’humain. Elles sont sensibles au développement de la fibrose cutanée, notamment lors de l’administration de substances comme l'acide hypochloreux. Ce profil permet de modéliser efficacement les différentes phases de la maladie et d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements Nous utiliserons des jeunes adultes âgés de 6 semaines au début du protocole (20-25g). Cet âge permet d’assurer une bonne santé générale, une réponse immunitaire stable et une croissance terminée, ce qui est crucial pour la reproductibilité et l’interprétation des résultats. En fin d’expérience les animaux seront âgés de 12-17semaines (30-40g).

Tremblements, convulsions, posture anormale, absence de réaction à la stimulation : ce sont les signes dont l'apparition déclenche la mise à mort anticipée des rongeurs de ce projet. 300 souris et 300 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont exposés à des situations stressantes et à des chocs électriques, puis soumis à des tests d'anxiété de cinq à quinze minutes et à des administrations pouvant aller jusqu'à deux fois par jour pendant huit semaines, pour construire un modèle de trouble de stress post-traumatique et y tester une dizaine de candidats médicaments. Cent vingt d'entre eux pourront être réutilisés après une période de repos, les autres seront tués en fin d'étude, le porteur expliquant que les effets à moyen et long terme des substances testées sont méconnus.

Objectifs

Dans l'histoire américaine, les troubles de stress post-traumatique (PTSD) ont été reconnus sous divers noms après les guerres : "cœur de soldat de la guerre civile", choc de la Première Guerre mondiale, fatigue de combat de la Seconde Guerre mondiale, stress retardé de la guerre du Vietnam avant d’être formalisés en 1980. Ces dernières années, on a assisté à une augmentation d’intérêt pour ces psychopathologies liées à l’exposition aux traumatismes, en particulier à cause du terrorisme, des catastrophes naturelles ou encore des violences urbaines. La prévalence des troubles de stress post-traumatique serait de 5 à 12% de la population générale. Les patients, suite à leur exposition à un évènement traumatique, souffrent de symptômes sévères tels que la peur intense, des flash-backs, des cauchemars et des pensées imposées et incontrôlables. Malgré les avancées scientifiques importantes dans ce domaine, il n’y a aujourd’hui aucune thérapie réellement efficace sur l’ensemble des symptômes des troubles du stress post-traumatique. Les modèles animaux demeurent indispensables pour mieux comprendre ces troubles et identifier de nouveaux candidats médicamenteux. Ce projet vise à mettre en place un modèle de trouble de stress post-traumatique chez le rat qui intègre la sensibilité au traumatisme observée chez l’humain et de tester l’efficacité d'une dizaine de candidats médicaments existants ou en cours de développement.

Bénéfices attendus

Ce projet participera à l'amélioration de la qualité de vie des patients et de leur entourage. Un traitement plus efficace pourrait réduire plus rapidement et plus durablement les symptômes des troubles de stress post-traumatique permettant ainsi une meilleure qualité de vie des patients, de maintenir un état de santé stable plus longtemps, de diminuer les taux d'invalidité . Ce projet permettra également d'avoir un impact socio-économique positif en réduisant les coûts de santé (nombre de consultations médicales, d'hospitalisations et de traitements complémentaires nécessaires).

Procédures

Les animaux sont exposés à différentes situations stressantes en fonction des procédures. Les tests comportementaux visant à évalualer le niveau d'anxiété des animaux sont généralement effectués 1 seule fois et leur durée varie de 5 à15 minutes environ. Les administrations de substances pourront être réalisées jusqu’à 2 fois par jour (en général 1 minute par administration) principalement par voie orale sous cutanée ou intrapéritonéale sur animal vigile. La durée du traitement peut aller jusqu’à 8 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux seront exposés à des situations induisant une état de stress. Les chocs électriques pourront également induire une faible douleur de très courte durée. Les manipulations/contentions réalisées notamment pendant les phases d'administration ou de prélèvements peuvent également entrainer un léger stress. Les candidats médicaments qui seront évalués ont été selectionnés en amont pour leur absence de toxicité sévère.

Devenir

Tous les animaux ayant reçu une substance d’essai dont les effets à moyen et long terme sont méconnus seront euthanasiés en fin d’étude afin de s’assurer que le traitement expérimental n’induira pas d’effet délétère sur l’animal, ce qui ne serait pas compatible avec un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.

Remplacement

Dans le cadre du développement des médicaments, des tests in vitro ont déjà eu lieu avant l'utilisation chez l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité, réduisant de façon significative le nombre de substances à tester et donc le nombre d’animaux. L'impact des traitements pré-sélectionnés sur le comportement des animaux, et l'amélioration de symptômes liés aux états de stress et d'anxieté ne peut se faire que sur des animaux vigiles. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Selon les données de la littérature, il est estimé qu’un effectif de 12 animaux en standard par groupe (nombre d'animaux et groupes variables, selon l’objectif de l’étude) sera nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte des tests. Le cas échéant, une réutilisation des animaux pourra être envisager après une période de repos entre l'évaluation de différentes molécules. L'analyse statistique prévue repose sur des tests paramétriques de type ANOVA "analyse de la variance" et/ou test de Student selon l'objectif de l'étude. Par ailleurs, des prélèvements terminaux (tissus, organes, sang) peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur et de souffrance (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, tunnels, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux ou attendus ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation faite par du personnel formé inclut une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration, l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions. Une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à postériori la catégorie éthique si nécessaire. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données.

Choix des espèces

Les troubles de stress post-traumatique sont largement évalués chez les animaux, en particulier chez le rongeur. Ainsi, divers tests ont été conçus pour mesurer ces différents aspects. L’impact de substances pharmacologiques sur le comportement de rongeurs est prédictif de leur efficacité en clinique. Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage) que ce soient des rats ou des souris, conformément à la littérature. Les symptômes de stress et d'anxiété se retrouvent plutôt chez des sujets adolescents ou adultes, aussi les traitements qui seront appliqués dans ce projet seront appliqués sur des rongeurs dont le système nerveux central a atteint ce niveau de maturité.