Recherche appliquée

Sur 3 072 poulets, 300 sont autopsiés à différents âges et 2 772 partent dans le circuit alimentaire humain, ce que le porteur décrit comme une valorisation. Tous sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, infectés par des coccidies via l'eau de boisson à quatorze jours, pesés, soumis à des prélèvements de fientes puis à l'examen des lésions de leurs organes. Le porteur annonce comme seuls effets indésirables un retard de croissance et des fientes plus liquides, alors qu'il décrit par ailleurs une parasitose dont les effets peuvent aller jusqu'à la mort. L'essai compare des extraits de plantes à un antibiotique dans la ration, pour une filière qui cherche des alternatives aux médicaments.

Objectifs

Les poulets de chair peuvent être affectés par des parasites appelés « coccidies » ou, plus largement, « Eimeria spps », dont les effets délétères peuvent aller jusqu’à la mort. L’objectif de l’étude est de vérifier l’efficacité d'extraits de plantes (en comparaison à un antibiotique) apportés dans la ration de poulets sur leur bien-être et leurs performances de croissance. Le modèle d’inoculation doit permettre de tester des solutions alternatives à l’utilisation d’antibiotiques.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche permettra d’apporter des connaissances essentielles sur le mode d’action des plantes actuellement utilisées pour lutter contre la coccidiose. A court terme, ce projet nous permettra de proposer de nouvelles formulations d'aliments sans médicament. Ainsi, nos travaux offriront au long terme de nouvelles méthodes d'alimentation et de prévention pour traiter les volailles et améliorer leur bien-être.

Procédures

Durée prévue de l’étude : 30 jours Interventions prévues : - Les animaux seront pesés par groupe dès leur arrivée, puis à 6 jours, 20 jours, et la veille de leur départ. - Ces pesées permettront de calculer, pour chaque groupe, le poids moyen et la croissance quotidienne. - A 14 jours, les animaux seront parasités par les coccidies via l'eau de boisson. - Des échantillons de fientes seront prélevés à 19, 24 et 30 jours. Une boîte sera installée la veille pour faciliter la collecte. Ces échantillons seront ensuite analysés pour estimer la présence de parasites. - Des observations seront faites sur certains organes pour évaluer d’éventuelles lésions liées à l'infection.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront montrer les effets indésirables suivants : un retard de croissance et un aspect des fèces plus liquide.

Devenir

Au cours de chaque procédure, le nombre d'animaux qui seront autopsiés au total : 300 (à différents âges pour des biopsies). Nombre d'animaux gardés en vie (replacés afin d’être valorisés dans le circuit alimentaire humain, étant conforme au paquet hygiène ) : 2772.

Remplacement

Bien que nous menons en parallèle des études in vitro sur des cellules de parasites, la coccidiose est un syndrome global qui ne peut être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers avec leur physiologie et les différents échanges inter-organes. Avant de tester un additif sur poulet, des simulations informatiques seront testées afin de mettre en place seulement celles intéressantes nutritivement. De plus, avant de mettre en place des études sur poulets nous travaillons avec des analyses en laboratoire permettant de vérifier l’efficacité de nouvelles plantes, additifs ou matières premières. Seuls ceux efficaces après ces premiers tests seront testés sur animaux, afin d’observer leur appétence et leur effet sur les performances et l’immunité des animaux. Compte tenu de notre expérience d’essai (plus de 20 ans de données dans nos fermes de recherche zootechniques), nous avons accès à une très grande quantité de données. Toutes ces data nous permettent de réaliser des tests statistiques avant chaque essai, pour valider que nous aurons une probabilité importante d’obtenir des résultats significatifs avec le plus faible nombre d’animaux possible.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données préliminaires.

Raffinement

Dans le cadre de ce protocole, plusieurs mesures de raffinement seront mises en place afin de limiter le stress, la douleur et l’inconfort des poulets tout au long de l’expérimentation. Les animaux seront hébergés en groupe, dans des enclos équipés d'une litière de copeaux et enrichis à deux périodes avec caisses servant à récolter les fientes et servant de perchoir. Cet enrichissement vise à réduire l’ennui, améliorer le bien-être et permettre aux animaux d’adopter des comportements exploratoires et sociaux. Les manipulations, y compris les prélèvements hebdomadaires, seront réalisées par du personnel formé, en utilisant des techniques douces et des contenants adaptés pour limiter la contention et le stress. Une surveillance quotidienne sera assurée par l’animalier, et des critères de points limites spécifiques au protocole ont été définis pour permettre une détection précoce de toute souffrance, avec des mesures d’intervention rapide prévues en cas de besoin.

Choix des espèces

Les infections à Eimeria spp provoquent spécifiquement chez le poulet (Gallus gallus) des désordres digestifs associés à une altération du bien être animal, et une baisse des performances zootechniques. Les poulets utilisés auront de 1 à 30 jours d’âge, soit la durée classique d’élevage d’un poulet de chair standard.

5 450 nouveau-nés, 3 250 ratons et 2 200 souriceaux, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun passant ses quatorze premiers jours de vie enfermé dans une enceinte en hyperoxie pour lui provoquer une hypertension pulmonaire. Leurs mères sont échangées toutes les vingt-quatre heures pour leur éviter l'effet toxique de l'oxygène. Suivent des échographies cardiaques, des mesures de pression cardiaque et une pléthysmographie invasive, sur des animaux gardés jusqu'à un an afin de suivre les séquelles à l'âge adulte. Tous sont tués pour l'extraction du bloc cœur-poumon, le porteur affirmant qu'il est "indispensable" de comprendre les mécanismes de cette maladie et que "seul l'animal entier" permet les interactions entre organes.

Objectifs

La dysplasie broncho-pulmonaire (DBP) est la principale complication liée à la grande prématurité. La DBP peut se compliquer d’une hypertension pulmonaire (HTP-DBP) responsable d’une mortalité importante dans les 2 ans suivant le diagnostic, par défaillance cardiaque droite. Par ailleurs, les altérations pathophysiologiques présentes pendant la période néonatale persistent dans le temps chez les grands prématurés survivants, augmentant leur risque de développer des maladies respiratoires et cardiovasculaires sévères à l’adolescence et à l’âge adulte. Les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’HTP-DBP sont encore méconnus et il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement préventif ni curatif de cette maladie. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. Ainsi, dans ce projet, nous utiliserons des modèles animaux (rats et souris) d’HTP-DBP expérimentale induite par hyperoxie, classiquement décrits dans la littérature et utilisés au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Ces modèles animaux sont les modèles qui reproduisent le mieux la pathologie humaine. Dans ces modèles, nous étudierons de manière longitudinale, l’évolution des altérations pathophysiologiques de l’HTP-DBP à différents âges (jour (J)15, J60, J180 et J365 chez les animaux, ce qui correspond chez l’humain à la période de l’enfance (

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de l’HTP-DBP et leur évolution dans le temps. Cette étude permettra également de mettre en évidence l’effet thérapeutique de substances pharmacologiques sur ces divers mécanismes mis en jeu. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs sera comparée ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme sur les substances bénéfiques identifiées avec un rapport bénéfice-risque minimum pour les patients.

Procédures

Un groupe sera exposé à l’air ambiant (normoxique – groupe contrôle) et un 2ème groupe sera maintenu en hyperoxie chronique dans les 24h suivant la naissance, pour une durée de 14 jours (J). Un échange des mères entre les groupes sera effectué toutes les 24h, afin d’éviter l’effet toxique lié à l’oxygène chez ces mères. La méthode et la fréquence d’injection pendant la mise en place des modèles pathologiques seront ajustées en fonction de la substance considérée. Le protocole préventif sera appliqué dès le début du protocole (au jour 2 de vie des ratons ou souriceaux) et le protocole curatif sera appliqué à la fin des 14 jours d’hyperoxie jusqu’à la fin du protocole J60 (adolescence, 12-18 ans), J180 (jeune adulte, 25-30 ans) et J365 (adulte, 40-50 ans) chez le rat et la souris. Après 14 jours, une partie des ratons/souriceaux sera anesthésiée afin de réaliser des échographies cardiaques (10 minutes/animal), des mesures de pressions cardiaques (10-15 minutes/animal) et des mesures de la fonction respiratoire par pléthysmographie invasive (5-10 minutes/animal) pour diagnostiquer la présence d’une HTP-DBP et en évaluer la sévérité. Tous les animaux auront ces différentes mesures avant l’extraction du bloc-cœur-poumon. Les animaux seront euthanasiés pour l’extraction du bloc cœur-poumon. Des prélèvements de sang pourront être effectués sur certains animaux juste après l’euthanasie et avant de récupérer le bloc cœur-poumon. L’échographie, les mesures hémodynamiques et les mesures de fonction respiratoire permettront également d’évaluer l’efficacité des traitements thérapeutiques. L’autre partie des animaux sera placée en normoxie seule, en présence d’une mère allaitante jusqu’au sevrage puis en condition d’hébergement classique jusqu’à l’âge de 60, 180 ou 365 jours pour le rat et la souris. Durant cette période de « vieillissement », les animaux seront pesés 2 fois/semaine et tous les animaux auront une échocardiographie sous anesthésie générale aux différents temps d’évaluation, y compris ceux qui poursuivent le protocole de « vieillissement » à J60, 180 ou 365. Ainsi, les animaux explorés à J60, J180 et J365 auront au total, respectivement 2, 3 et 4 échographies cardiaques durant le protocole. A l’issue de chaque période de « vieillissement », les animaux seront anesthésiés afin de réaliser des échographies cardiaques, des mesures de pressions cardiaques, des mesures de la fonction respiratoire et des prélèvements de sang et extraction du bloc cœur-poumons.

Impact sur les animaux

L’HTP-DBP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Nous avons une grande expérience du suivi notamment respiratoire des animaux sous des atmosphères en oxygène variées au laboratoire et nous serons particulièrement attentifs aux points limites qui constitueront un arrêt des protocoles. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la mise en place de l’HTP-DBP chez les animaux. Les points d’injection des substances et/ou solvants à tester peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés. Le risque de douleur est le principal effet indésirable des expérimentations in vivo. De ce fait, nous réaliserons systématiquement une analgésie-sédation. Avant de débuter les expérimentations in vivo, la surveillance de la profondeur de l’analgésie-sédation sera réalisée en s’assurant de l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte en réponse au pincement des orteils des membres postérieurs. Le rythme cardiaque et la fréquence respiratoire seront surveillés pour s’assurer également de la profondeur de l’anesthésie. Le changement de mère toutes les 24h peut être source de stress pour les petits.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer le cœur et le poumon pour faire diverses analyses.

Remplacement

Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’HTP-DBP mais des études pourront être réalisées sur des cellules de poumons humains fœtaux en culture, exposées ou non à l’hyperoxie. Ce remplacement du modèle animal par un modèle in vitro permettra d’élucider certains mécanismes intracellulaires sans utiliser d’animaux. Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in/ex vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. Par ailleurs, cette pathologie implique plusieurs organes et plusieurs types cellulaires pulmonaires qui interagissent entre eux et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes et cellules.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux : (1) une partie des utilisateurs utilisera le poumon droit et l’autre partie des utilisateurs utilisera le poumon gauche, (2) une planification des expériences sera établie au long de chaque année d’expérimentation pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal avec utilisation de cellules en culture et enfin, (3) parallèlement à ce protocole, des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines fœtales exposées à l’hyperoxie in vitro pour simuler l’HTP-DBP. Quatre statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur ce projet donc l’utilisation des animaux sera optimisée en concertation avec tous les utilisateurs lors de nos réunions d’équipe hebdomadaires. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (randomisation, travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire, en accord avec les données de la bibliographie, compte tenu des quantités de tissu nécessaires et de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche. Le nombre d’animaux sera également réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs avant la fin de la totalité des séries prévues.

Raffinement

Selon la condition, 12-13 ratons ou 10 souriceaux et 1 mère allaitante seront placés soit dans l’enceinte à hyperoxie soit dans une cage classique. L’enceinte à hyperoxie et la cage classique contiendront une couche de litière suffisante pour absorber l’humidité, des éléments de nidification (coton, papier kraft) et du matériel d’enrichissement (un tunnel rouge et buchettes de bois). L’accès à l’eau et la nourriture sera ad libitum. Les paramètres ambiants (hygrométrie, température) seront contrôlés quotidiennement et conserver sur un registre. Un cycle jour/nuit de 12h sera également appliqué. L’échange quotidien des mères sera réalisé par le même opérateur en utilisant le tunnel mis à disposition dans la cage ou l’enceinte. Les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement. L’enceinte d’hyperoxie sera ouverte tous les jours pour l’échange des mères. A cette occasion, les animaux seront observés et pesés. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. En cas de souffrance ou de détresse persistante au-delà d’une période de 2 h post-administration d’antalgique, une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre. Une grille de scoring pour le suivi des animaux sera mise en place pour chaque animal L’ensemble des expérimentations in vivo sera réalisé sous anesthésie générale. Pour les mesures hémodynamiques un tapis chauffant sera utilisé pour préserver la température corporelle constante durant toute la procédure. Le degré d’anesthésie sera vérifié par l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte au pincement. Des modifications des paramètres physiologiques et notamment la fréquence cardiaque indiquant une souffrance ou une détresse de l’animal conduirait à une procédure d’euthanasie.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces classiquement utilisées pour le développement de modèles d’HTP-DBP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. L’utilisation de la souris permet d’envisager l’utilisation de modèles transgéniques qui sont quasiment absents chez le rat et qui sont nécessaires à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires. De plus, le rat et la souris sont particulièrement adaptés pour modéliser la DBP car au moment de la naissance leurs poumons sont au stade de développement pulmonaire qui correspond au stade de maturation des poumons de nouveau-nés grands prématurés humains et les expérimentations pourront être menées chez des rats/souriceaux nés à terme et ne nécessiteront pas d’induire une naissance prématurée de ces animaux. La première partie de l’étude vise à reproduire une pathologie concernant uniquement les nouveau-nés grands prématurés, les expérimentations concerneront des rats/souris nouveau-nés pendant leurs 14 premiers jours de vie. La deuxième partie du projet portant sur l’évolution longitudinale des anciens nouveau-nés grands prématurés ayant eu une dysplasie broncho-pulmonaire, les expérimentations porteront sur des ratons/souriceaux ayant été exposés pendant 14 jours à l’hyperoxie ou à la normoxie en période néonatale puis laissés en normoxie seule jusqu’à l’âge de 60, 180 ou 365 jours (adolescent, jeune adulte et adulte chez l’homme respectivement).

Pour mettre au point une technique de synchronisation des chaleurs à partir de progestérone extraite de plantes, 52 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une ovariectomie sous anesthésie générale, opération d'une trentaine de minutes, suivie de 12 prélèvements sanguins à la jugulaire, les brebis entières en subissant 31. La finalité reste zootechnique, remplacer les hormones de synthèse par des molécules végétales dans la maîtrise de la reproduction des troupeaux. Les brebis ne sont pas tuées à l'issue, elles retournent à l'unité expérimentale où le porteur les décrit comme "potentiellement réutilisables".

Objectifs

Mise au point, pour l'élevage caprin et ovin, d'une technique de synchronisation des oestrus et des ovulations à partir de progestérone et molécules associées, issues de plantes, en remplacement des techniques actuelles qui utilisent des substances de synthèse issues de l'industrie du médicament. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

1. Mise au point d'une technique durable de synchronisation des oestrus et des ovulations chez la chèvre et la brebis. 2. Fin de l'utilisation de substances chimiques de synthèse, remplacées par des molécules naturelles issues de plantes 3. Meilleure connaissance des contenus de certaines plantes en progestérone et molécules associées et du déterminisme génétique de ces contenus

Procédures

1. Ovariectomies réalisées en une seule fois sous 1 anesthésie générale dans l'EU1. L'opération dure une trentaine de minutes. Elle est réalisée par un chirurgien expérimenté. 2. Prélèvements sanguins à la veine jugulaire réalisés par des techniciens expérimentés. Chacun de ces animaux fera l'objet de 12 (ovx) ou 31 (entières) prélèvements ponctuels. Chaque prélèvement dure quelques secondes et sera réalisé dans l'EU2. 3. Pose d'une éponge intra vaginale contenant du FGA sur 15 chèvres de la partie 2 (chèvres entières) réalisée dans l'EU 02.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir du stress lors des manipulations, de la phase pre opératoire, de l'induction de l'anesthésie, et de la phase de réveil. L'apparition de douleurs suite à la chirurgie est également possible, ainsi qu'une éventuelle infection qui entraînerait abattement, fièvre et anorexie. Lors de l'anesthsie, une irritation de l'appareil respiratoire supérieur (lié à lintubation) peut apparaître, mais c'est rare. Un hématome peut apparaître suite aux prises de sang à la veine jugulaire, ainsi qu'aux injections intramusculaires, mais c'est rare. Du fait que la progestérone, au contraire d'autres stéroïdes comme l'oestradiol, est plutôt connue par ses effets protecteurs que néfastes sur le fonctionnement cellulaire et sur le système nerveux central, nous n'attendons pas de nuisances ou d'effets indésirables sur les animaux liés à l'administration de progestérone. Toutefois, compte-tenu du fait qu'il y a des molécules associées à la progestérone et d'autres composés encore inconnus dans la plante étudiée, nous mettrons en place au cours de l'expérimentation, des observations précises (troubles comportementaux, digestifs ou autres manifestations visibles) sur les animaux recevant les préparations testées.

Devenir

Les expérimentations prévues n'occasionneront aucun désordre de long terme ni aucune invalidité permanente. Les animaux retourneront donc dans l'unité expérimentale où ils seront potentiellement réutilisables.

Remplacement

Nous nous intéressons à une réponse physiologique complexe. Des méthodes de remplacement, telles que des cultures de cellules ou une modélisation mathématique, ne peuvent, du fait de cette complexité extrême, être utilisées.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été rationalisé afin de ne pas utiliser plus d'animaux que nécessaire, tout en conservant une bonne mise en évidence statistique. Sur la base d’un test-t et avec les concentrations de P4 attendues et des effectifs de 20(contrôle) et 20 (P4), on obtient une puissance de test de 100% .

Raffinement

Les animaux ovariectomisés recevront un traitement anti-douleur ; tous les animaux seront hébergés en groupe social sur paille et avec enrichissement (caisse en bois pour grimper). Le nombre de prises de sang a été réduit au minimum (ovx: 4 pour le premier jour et 2 par jour ensuite pendant 5 jours; entières : 1 par semaine pendant 3 semaines, puis 1 par jour pendant 4 semaines). Le transport des animaux entre l'EU1 et l'EU2, distants de 300 mètres, sera réalisé dans une bétaillère agréée, conduite par un chauffeur et un animalier diplômés et expérimentés. La vitesse sur le centre est limitée à 30 kms/heure et, de ce fait, n'occasionnera pas de trouble supplémenaire aux animaux. De la paille fraîche sera répandue sur le sol du véhicule prélablement nettoyé, ocassionnant ainsi un confort certain aux animaux transportés.

Choix des espèces

Les ovins sont une des espèces qui utilisent ces traitements en ferme sur le terrain. Aucun traitement de synchronisation analogue n’existe sur des espèces modèles de type souris, rat, poisson-zèbre ou C. elegans et l’effet mâle n’existe pas dans ces dernières espèces, ce qui justifie l’utilisation de l’espèce caprine choisie qui est, en même temps, l’espèce modèle et celle à qui s’adressera la technique si celle-ci débouche sur le terrain. Animaux adultes femelles et mâles (pour l'induction des ovulations), donc âgés de deux ans ou plus et qui sont choisis pour être dans la moyenne des âges des brebis et béliers en production susceptibles, dans les élevages cibles, de recevoir le traitement utilisant la la plante de nos campagnes contenant de la progestérone naturelle.

Huit prises de sang et douze ponctions de liquide cérébrospinal par un port d'accès implanté sous la peau des lombes, posé au cours d'une chirurgie de moins de deux heures : cinq macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués quatre jours après l'injection du produit testé pour prélever leurs organes. Les actes se font sur animal vigile, avec des contentions de trois à quinze minutes, et le porteur mentionne un risque rare de lésion de la moelle épinière pouvant causer une paralysie des membres postérieurs. L'objet est de vérifier si un anticorps dirigé contre les plaques amyloïdes, couplé à une molécule de transport, franchit la barrière hémato-encéphalique, en vue d'une mise sur le marché. Le porteur retient le primate pour son néocortex élargi et sa proximité génétique avec l'être humain, et des animaux jeunes parce que les macaques de plus de quatre ans altéreraient la qualité des échantillons prélevés après leur mort.

Objectifs

L’anticorps testé dans le cadre de ce projet a été développé pour cibler et éliminer les plaques β-amyloïdes impliquées dans progression de la maladie d’Alzheimer chez l’Homme. Lorsqu’il est injecté seul dans un organisme, cet anticorps n’a pas la capacité de traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) et ne peut donc pas atteindre sa cible située dans le cerveau. Cependant, s’il est lié à une petite molécule spécifique (non thérapeutique), il peut être pris en charge par un récepteur se trouvant à la surface des cellules endothéliales qui tapissent les vaisseaux sanguins et traverser la BHE. Le but final de ce projet est donc de déterminer si cet anticorps conjugué est capable de traverser la BHE chez le primate en étudiant son profil pharmacocinétique dans le sang, dans le liquide cérébro-spinal et sa biodistribution (notamment dans les tissus du système nerveux central). Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement de ce candidat médicament. L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de rechercher une dose toxique. C’est pourquoi, le dosage utilisé dans ce projet est efficace pharmacologiquement mais non toxique (d’après une étude préliminaire toxicologique réalisée chez le primate).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la validation et la mise sur le marché d’un anticorps conçu pour cibler et éliminer les plaques β-amyloïdes impliquées dans progression de la maladie d’Alzheimer chez l’Homme.

Procédures

Après deux semaines d’habituation, une chirurgie peu invasive (de moins de 2h) sera réalisée sous anesthésie et analgésie sur l’ensemble des animaux (après une mise à jeun inférieure à 16h ) afin d’implanter un port d’accès sous-cutané en région lombaire dans le but de réaliser des prélèvements de liquide cérébro-spinal (LCS) répétés au cours du projet. Des prélèvements de sang et de LCS seront réalisés avant et après administration de l’anticorps afin d'étudier son profil pharmacocinétique (au maximum : 8 prélèvements sanguins et 12 prélèvements de LCS au total). Le temps de contention nécessaire à la réalisation de ces prélèvements est compris entre 3 et 15 minutes. Les animaux recevront la molécule test par une injection unique de moins d’une minute (temps de contention d’environ 10 min) entre 7 et 14 jours après la chirurgie (selon la récupération des animaux). L’ensemble des actes techniques réalisés au cours de ce projet (prélèvements et injections) seront effectués sur animal vigile (hormis la chirurgie). Le suivi des paramètres physiologiques (poids suivi 1x/semaine et température corporelle suivie 4 fois avant administration et 4 fois après administration) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Le projet prendra fin 4 jours après administration de l’anticorps.

Impact sur les animaux

Les administrations peuvent provoquer un stress léger, une douleur légère lors de l’injection, des ecchymoses ou des hématomes. Les prélèvements de sang et de LCS (par ponction d’un port d’accès en sous-cutanée) pourront provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou oedème léger par exemple). Les pesées et les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux. La chirurgie d’implantation pourra provoquer des douleurs légères ainsi que des réactions locales au niveau du site d’incision ou une infection post-opératoire. L'insertion d’une aiguille spinale dans l’espace vertébral peut provoquer des lésions de la moelle épinière pouvant causer une paralysie des membres postérieurs dans de très rares cas. L'anesthésie des animaux dans le cadre de ces interventions pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (inférieure à 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...).

Devenir

À l’issue du projet, tous les animaux seront mis à mort afin de récolter leurs organes pour déterminer la biodistribution du produit.

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et de biodistribution in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapies. En effet, celles-ci permettent de déterminer la demi-vie de l’anticorps, l’évolution de sa concentration dans le sang et dans le LCS au cours du temps et sa la localisation dans les tissus après administration (afin de déterminer où sera distribué l’anticorps thérapeutique). Ceci ne pourrait être obtenu in vitro, car les modèles cellulaires utilisés en laboratoire restent trop simplifiés : ils ne reproduisent qu’une partie d’un organe isolée du reste du corps. Or, la biodistribution et la pharmacocinétique dépendent d’un grand nombre de facteurs qui interagissent en temps réel dans un organisme vivant complexe : le débit sanguin, les échanges entre les tissus, le fonctionnement du foie et des reins (qui métabolisent et éliminent l’anticorps), ainsi que les barrières biologiques comme celle du cerveau. Seul un organisme complet, où tous les organes sont en interaction constante, permet de suivre le trajet réel d’un anticorps et de comprendre s’il atteint efficacement sa cible.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. En effet, 2 groupes ont été constitués pour un total de 5 animaux. Le premier groupe comprendra 2 animaux qui recevront l’anticorps seul (non couplé à la molécule permettant hypothétiquement le passage de la BHE). Ce groupe contrôle permettra de confirmer, ou non, que l’anticorps seul ne peut pas traverser la BHE. Deux animaux seront utilisés afin de pouvoir détecter une tendance dans le groupe. Le second groupe est constitué de 3 animaux qui recevront l’anticorps couplé à une petite molécule permettant le passage de la BHE. Ce groupe test permettra de déterminer si l’anticorps conjugué (candidat-médicament sous sa forme complète) est capable de traverser la BHE. 3 animaux seront utilisés car, en plus de pouvoir détecter une tendance dans le groupe, ce nombre permet de déceler toute valeur extrême, ce qui est un paramètre critique pour l’interprétation des résultats scientifiques du projet. Cette étude n’étant pas règlementaire, elle ne nécessite pas de réaliser des tests statistiques sur de grandes cohortes d’animaux.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprendra des enrichissements structuraux, de la litière pour permettre aux primates de fourrager, des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine, des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs), de la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Les animaux sont acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) depuis plusieurs mois et bénéficieront d’une période d’habitation (training aux actes techniques et manipulations) de deux semaines avant le début du projet. Ce programme d’habituation est associé à du renforcement positif (ex : distribution de récompenses) ce qui permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (contention, prise de sang, température rectale...). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Un traitement antibiotique et analgésique post-opératoire sera également mis en place. L’administration de l’anticorps et les prélèvements de sang et de LCS seront réalisés sur animal vigile car l'anesthésie engendre un stress et un risque plus important pour l'animal que la procédure elle-même. Cependant, une sédation pourra être envisagée en cas de besoin. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou si son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

L’anticorps étudié dans ce projet ayant pour objectif d’atteindre le système nerveux central (SNC) chez l’Homme, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité avec l'Homme en termes de patrimoine génétique et d’organisation fonctionnelle de son SNC (notamment concernant la barrière hématoencéphalique), le primate non humain (PNH) a été retenu dans le cadre de ce projet. En effet, il est admis que les PNH présentent de nombreuses similitudes que l'on ne retrouve pas chez d'autres modèles animaux, par exemple une grande homologie de séquence d'ADN, des schémas d'expression génique similaires entre les cerveaux de macaques et les cerveaux humains (contrairement aux cerveaux de souris). Aussi les primates et les humains ont en commun un néocortex considérablement élargi et une spécialisation des zones corticales par rapport aux souris. Par conséquent, les données obtenues avec ce modèle sont communément les plus prédictives des réponses observées chez l'Homme vis à vis de cet anticorps. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter le système nerveux central et la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses post mortem. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Les souris utilisées portent une altération ciblée des cellules souches du poil, censée désorganiser le follicule, rompre la barrière de la peau et déclencher une inflammation cutanée. 1 113 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont épilées sous anesthésie, reçoivent pendant trois jours l'application cutanée d'un inducteur de recombinaison génétique, puis des injections dans l'abdomen, des prises de sang et un régime hypercalorique pendant cinq semaines que le porteur présente comme sans complications métaboliques notables. Toutes sont tuées pour suivre l'évolution de la réponse immunitaire sur l'ensemble de l'expérience, dont l'objet est de reproduire les premières étapes de l'hidradénite suppurée.

Objectifs

L’hidradénite suppurée est une maladie inflammatoire chronique de la peau, qui touche environ 1 % de la population. Elle se manifeste par des nodules douloureux, des abcès profonds, des fistules et des cicatrices, principalement localisés dans les zones de pli (aisselles, aine, régions anogénitales). La maladie évolue souvent vers une inflammation chronique, accompagnée de lésions malodorantes, de cicatrices rétractiles et de fibrose de la peau. Le diagnostic est souvent tardif, avec un délai moyen de plus de 7 ans entre les premiers symptômes et la prise en charge. L’hidradénite suppurée a un impact majeur sur la qualité de vie des patients, comparable à celui d’autres maladies chroniques sévères. Elle est associée à un risque accru de dépression, d’anxiété, de douleurs chroniques, de surpoids et de difficultés professionnelles. De façon préoccupante, les taux de suicide sont significativement plus élevés chez les personnes atteintes d'hidradénite suppurée que dans d’autres maladies de peau comme le psoriasis. L’hidradénite suppurée reste à ce jour une maladie difficile à traiter, et constitue un besoin médical non satisfait en l’absence d’options thérapeutiques réellement efficaces. Le développement de traitements ciblés est freiné par deux obstacles majeurs : d’une part, la méconnaissance des mécanismes physiopathologiques impliqués, accentuée par l’hétérogénéité des formes cliniques de la maladie ; d’autre part, l’absence de modèle animal fiable permettant de reproduire les caractéristiques clés de la maladie humaine et de tester de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le développement de ce nouveau modèle murin a pour objectif principal de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’hidradénite suppurée, notamment le lien entre dysfonction des cellules souches folliculaires, altération de la barrière épithéliale et inflammation cutanée. À court terme, ce modèle permettra de valider des hypothèses mécanistiques et d’identifier de nouvelles cibles moléculaires impliquées dans l’initiation et la chronicisation de la maladie. À moyen terme, il servira à tester des candidats thérapeutiques (anti-inflammatoires, anticorps monoclonaux) dans un système physiologiquement pertinent. À plus long terme, l’ambition est de contribuer au développement de traitements ciblés pour les patients atteints d’hidradénite suppurée, une maladie encore sans solution curative.

Procédures

Les souris seront épilées sous anesthésie (durée de l’intervention : environ 5 minutes) afin d’assurer une application homogène des traitements topiques. L’application cutanée d’un inducteur de recombinaison génétique ou de son solvant (type solvant organique hydrophobe) sera réalisée pendant 3 jours consécutifs. Des prélèvements sanguins seront réalisés à intervalles réguliers au cours de l’expérimentation. Chaque prélèvement durera moins de 20 secondes, afin de minimiser le stress animal. L’administration des substances expérimentales sera effectuée par voie intrapéritonéale, avec des injections réalisées en moins de 20 secondes, de manière à limiter l’inconfort des animaux. La bactérie utilisée dans ce protocole ne provoque pas d’infections cutanées chez la souris, garantissant une exposition sans risque infectieux significatif. Enfin, l’introduction d’un régime alimentaire hypercalorique sur une période de 5 semaines ne génère pas de complications métaboliques notables dans notre modèle, assurant le maintien du bien-être animal tout au long de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

L’administration d’un inducteur de recombinaison génétique pourrait entraîner des effets secondaires transitoires tels qu’une légère perte de poids, une réduction de l’activité locomotrice ou des modifications du métabolisme hépatique. Notre modèle cible spécifiquement les cellules souches du follicule pileux, considérées comme l’un des éléments déclencheurs de la maladie. Leur altération pourrait entraîner une désorganisation de la structure folliculaire, une rupture de la barrière épithéliale et une inflammation cutanée localisée

Devenir

L'ensemble des animaux est mis à mort afin de déterminer l'évolution de la réponse immunitaire sur la totalité de la cinétique expérimentale.

Remplacement

Plusieurs modèles in vitro ont été évalués, comme les cultures cellulaires ou les systèmes de type organoïdes. Toutefois, l’hidradénite suppurée est une maladie inflammatoire complexe, impliquant des interactions entre les cellules de la peau, le microbiote cutané et le système immunitaire. À ce jour, aucun modèle in vitro ne permet de reproduire fidèlement cette complexité. Les systèmes actuels permettent d'étudier certains mécanismes isolés, mais ils ne permettent ni d’observer l’infiltration de cellules immunitaires, ni de modéliser les interactions dynamiques entre les différents compartiments cellulaires de la peau. C’est pourquoi nous avons recours à un modèle animal spécifique, permettant de mieux comprendre les premières étapes de la maladie. Ce modèle permettra également de tester des stratégies thérapeutiques dans un environnement physiologique pertinent. En parallèle, nous poursuivons le développement de modèles alternatifs non animaux, dans l’objectif de réduire au maximum le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous avons optimisé notre approche expérimentale afin de limiter autant que possible le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la fiabilité scientifique de nos résultats. Des calculs de puissance statistique ont été réalisés en amont afin de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs tout en évitant une surutilisation. Nous utilisons aussi des approches multimodales sur un même animal, ce qui permet d’exploiter pleinement chaque individu et d’éviter la nécessité de cohortes supplémentaires pour différentes analyses. Des modèles in vitro, en amont, nous permettent également d’affiner nos hypothèses expérimentales et d’orienter nos analyses in vivo, réduisant ainsi le nombre d’animaux requis

Raffinement

Les animaux sont suivis quotidiennement par un personnel formé afin de détecter précocement tout signe de souffrance : lésions cutanées, altération du pelage, changements de comportement ou de posture, perte de poids, ou automutilation. Ils sont hébergés en cages collectives enrichies, avec litière douce, matériaux de nidification (neslets), abris (dômes ou tubes en carton) et accès à l’alimentation et à l’eau ad libitum. L’environnement est contrôlé (température, humidité, cycle lumière/obscurité) pour garantir des conditions de vie optimales tout au long de l’expérimentation. Nous collaborons avec les vétérinaires référents afin d'assurer un raffinement constant des procédures, notamment par l’adaptation des soins ou l’euthanasie anticipée dès l’apparition de signes cliniques dépassant les seuils définis.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue un modèle bien établi pour l’étude des maladies humaines. Ce modèle présente plusieurs avantages : 1. De nombreuses souches sont disponibles et bien caractérisées sur le plan génétique, ce qui permet de cibler précisément certaines populations cellulaires impliquées dans la maladie étudiée. 2. La petite taille de l’animal, sa facilité d’élevage, et la courte durée de sa gestation permettent de conduire des études dans des délais raisonnables. 3. Il existe aujourd’hui des outils permettant d’activer ou de désactiver certains gènes de façon localisée ou temporaire, ce qui est essentiel pour étudier les mécanismes biologiques complexes de la maladie.

Pour évaluer la digestibilité de nouvelles matières premières destinées à l'alimentation des volailles, 2 400 poulets de chair vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever le contenu de leur tube digestif. Chacun passe neuf jours seul en cage, de 17 à 25 jours d'âge, et subit deux jeûnes de dix-sept heures. L'enrichissement consommable est exclu pour ne pas biaiser la mesure, les cages recevant des chaînettes et des perchoirs. Douze animaux par régime suffisent selon le porteur, ce qui rapporte les 2 400 poulets annoncés à environ deux cents régimes testés sur la durée du projet.

Objectifs

La viande de volaille représente une source de protéine animale importante et est en augmentation dans l'alimentation humaine. La production française se fait avec du tourteau de soja importé (3,5 millions de tonnes, majoritairement OGM) et des céréales. L'alimentation animale représente trois quart du coût de production et doit faire face à des enjeux sociétaux majeurs : réduction des gaspillages, bien être animal, valorisation de nouvelles ressources, OGM, diminution de l'importation de certaines matières premières, sécurité du consommateur. Dans ce contexte, le projet vise à caractériser de nouvelles ressources alimentaires pour l'alimentation animale, en diversifiant les sources de matières premières tout en limitant la concurrence avec l'alimentation humaine et de développer de nouveaux programmes alimentaires dont l'objectif est d'optimiser l'efficience des rations en réduisant, à la source, les rejets d'azote en mettant l'accent sur les stratégies nutritionnelles. Pour cela, des "bilans digestif" seront réalisés, en mesurant de façon précise, les nutriments digérés par le poulet de chair et ceux rejetés dans les fientes. Un bilan permet donc de quantifier le pourcentage de chaque nutriment réellement disponible pour le maintien, la croissance ou la production de l’animal. Le bilan est réalisé selon une méthode de référence standardisée, afin de fournir à la filière des tables d'alimentation précises et complètes, sur la valeur nutritionnelle des matières premières.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet concernent : 1) Les éleveurs et fabricants d’aliments : le projet permettra de leur fournir des données sur de nouvelles matières premières ou des matières premières issus de nouveaux process afin de limiter le gaspillage et les rejets, de choisir des matières premières non importées ou non utilisables directement par l’homme, l’ensemble contribuant à préserver l’environnement. 2 ) L'alimentation de l'homme : trouver des alternatives aux solvants issus du pétrole (hexane par exemple) utilisés dans la fabrication d’aliments pour volailles (tourteaux par exemple), améliorer la qualité des produits animaux. 3) L'alimentation des animaux : utiliser des aliments mieux digérés par les animaux, accompagner l'élevage vers l'alimentation de précision.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à une procédure de bilan digestif en cage individuelle d'une durée de 9 jours, de 17 à 25 jours d’âge et avec perception visuelle, auditive et olfactive entre congénères. Ils sont également soumis à deux mises à jeun (sans restriction hydrique) de 17h chacune, la nuit, afin de vider le tube digestif.

Impact sur les animaux

Les effets négatifs sur les animaux sont liés, d'une part au stress léger lié à l'isolement en cage individuelle de 9 jours (sans isolement visuel et olfactif) et d'autre part liés à la légère sensation de faim que pourraient avoir les animaux lors de la mise à jeun réalisée pendant 17h, sur la période de nuit principalement (sans restriction hydrique).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation à des fins de prélèvements des contenus digestifs dans le but d'analyses chimiques pour les mesures de digestibilité.

Remplacement

Il n'existe, actuellement, aucune méthode pour reproduire in silico, le tube digestif d'une volaille. Quant aux méthodes in vitro, elles sont en développement mais ne sont actuellement pas encore opérationnelles pour permettre ces études de digestion. L'étude du microbiote et des processus de digestion nécessitent donc le recours à des animaux.

Réduction

La réduction du nombre d'animaux est basée sur deux principes : 1) Grouper au maximum les régimes à tester pour n'avoir qu'un seul régime témoin (régime standard). 2) Disposer de 12 animaux par régime est nécessaire et suffisant pour avoir des résultats robustes malgré la variabilité individuelle importante.

Raffinement

Avant leur mise en cage à 17 jours, les animaux sont hébergés tous ensemble, en groupe, au sol et sur copeaux. Les animaux sont mis en cage à 17 jours d'âge, ce qui correspond à l'âge à partir duquel le tube digestif et leur microbiote sont pleinement fonctionnels. La durée du séjour en cage individuelle est réduite au maximum. Les cages sont disposées de manière à procurer aux poulets une perception visuelle, auditive et olfactive entre congénères. La période de mise à jeun de 17h a été définie la nuit, moment où les animaux ne consomment, naturellement, pas d'aliment. Afin d’éviter d’induire un biais expérimental, il n'est pas possible d'enrichir le milieu avec des matériaux consommables ; les cages seront néanmoins enrichies de chaînettes et de perchoirs. Les aliments distribués aux animaux permettent de couvrir les besoins physiologiques sans carence ou excès. L'eau est maintenue à volonté. La température de la salle est augmentée de 2 degrés par rapport à un programme classique d'élevage pour améliorer le confort thermique des animaux. Une grille d’évaluation du bien-être des animaux, basée sur leur comportement et leur état de santé, est complétée quotidiennement par le personnel animalier afin de détecter toute altération de leur état de bien-être. Pour chaque paramètre d’atteinte au bien-être, nous avons défini plusieurs niveaux d’action.

Choix des espèces

Les objectifs du projet portent sur la nutrition des volailles, avec un objectif de valorisation par les filières avicoles. Le poulet de chair représente l'espèce majeure concernant la production de viande de volailles. Les bilans digestifs sont réalisés entre 17 et 25 jours d'âge, ce quicorrespond à l'âge à partir duquel le tube digestif et son microbiote sont pleinement fonctionnels. Aussi, à ce stade, les animaux sont suffisamment développés pour s'adapter à une période de 9 jours en cage et sont en pleine croissance, ce qui permet une réponse physiologique maximale.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre injections espacées de deux semaines et subissent trois prises de sang, avec un risque d'accumulation de liquide dans l'abdomen qui peut gêner l'alimentation et les déplacements. Leur rate est prélevée après la mise à mort pour fabriquer des anticorps monoclonaux. Ces anticorps alimentent des kits de détection des maladies des plantes destinés aux agriculteurs et aux viticulteurs.

Objectifs

Nous avons recours à l’immunisation de souris pour fabriquer des anticorps spécifiques monoclonaux capables de reconnaitre des pathogènes végétaux afin d’établir de nouveaux outils de phytodiagnostic pour détecter rapidement et efficacement les maladies des plantes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer des kits de phytodiagnostic permettant de détecter de manière rapide et précoce les maladies des plantes, qui peuvent entraîner des retards de croissance, des pertes de récoltes significatives et des conséquences économiques importantes pour les agriculteurs, viticulteurs, etc. Les kits de phytodiagnostics permettent de réduire la propagation des maladies grâce à une détection rapide avant que la maladie ne se propage et évitent donc la perte de grandes superficies de culture. Ils permettent également de cibler les traitements grâce à un diagnostic précis, à l’aide des anticorps monoclonaux, et de réduire l’usage inutile de produits phytosanitaires. Les bénéfices de ce projet sont donc d’ordres environnemental et économique (moins de pertes de récoltes et de traitements non appropriés). Du coté scientifique, ce projet permet d’obtenir des anticorps monoclonaux qui pourront être par la suite produit in vitro grâce à l’obtention d’hybridomes, ce qui permet de limiter l’utilisation des animaux à des fins scientifiques.

Procédures

4 injections espacées de 2 semaines. 3 prélèvements sanguins espacés de 3 à 4 semaines.

Impact sur les animaux

Il existe un risque de production d’ascite (accumulation anormale de liquide dans l’abdomen) suite aux injections pouvant entrainer des difficultés pour l’animal à se nourrir ainsi qu’une gêne pour se déplacer. Les animaux peuvent ressentir du stress lors des manipulations et une douleur modérée suite aux injections tel que des rougeurs au point d’injection et des courbatures.

Devenir

A l’issue de chaque programme les animaux serons mis à mort afin de récupérer la rate pour réaliser la production d’anticorps monoclonaux.

Remplacement

Il n’existe actuellement aucune méthode ou technique in vitro permettant de produire de nouveaux anticorps monoclonaux murins. L’induction d’une réponse immunitaire chez l’animal est nécessaire afin de pouvoir fusionner la rate contenant les cellules productrices d’anticorps avec des cellules cancéreuses pour obtenir des hybridomes permettant par la suite, la production d’anticorps monoclonaux in vitro. Une fois la production réalisée, il ne sera donc plus nécessaire de renouveler le protocole d’immunisation et donc d’utiliser les animaux à des fins scientifiques.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum afin d’obtenir dès le 1er projet une quantité suffisante d’anticorps monoclonaux pour ne pas avoir besoin de réitérer les productions.

Raffinement

Pour réduire au maximum les sources de souffrance, les animaux seront anesthésiés avant les prélèvements. Les souris seront hébergées en communauté, avec enrichissement du milieu, et dans des conditions appropriées afin de préserver leur bonne santé et leur bien-être. Les aiguilles utilisées pour les immunisations seront adaptées au point d’injection et les plus fines possibles afin de limiter la douleur. Une période d’acclamation de 7 jours sera respectée avant les manipulations. Les souris seront manipulées précautionneusement et déplacée à l’aide des enrichissements et dans la paume de la main autant que possible afin de s’habituer au manipulateur. Les gestes techniques seront réalisés par du personnel formé. Les souris seront surveillées quotidiennement après les injections afin de réagir rapidement en cas de production d’ascite. Si une gêne dans la mobilité est détectée, l’accès à la nourriture et à la boisson seront facilités.

Choix des espèces

L’utilisation de souris permet d’obtenir à la fois des cellules qui fabriquent des anticorps et des cellules qui peuvent se multiplier facilement, compatibles entre elles pour l’étape suivante, la fusion. Les souris utilisées ont un organisme qui contient peu d’anticorps naturels, elles permettent ainsi une bonne réponse de leurs système immunitaire donc une production d’anticorps hautement spécifique à l’antigène. Les souris seront âgées de minimum 6 semaines car c’est à ce stade qu’elles permettent une bonne réponse immunitaire à une stimulation antigénique.

Les rats utilisés portent une mutation qui affaiblit leur système immunitaire pour éviter le rejet du greffon, ce qui leur vaut une perte de poils, des poils qui s'accumulent sous les paupières et une sensibilité accrue aux infections. 180 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur rétine est lésée au laser ou par injection d'un composé chimique, puis un fragment de rétine cultivé à partir de cellules souches humaines est greffé sous la rétine au cours d'une opération de quinze à vingt minutes, suivie d'imageries hebdomadaires et d'électrorétinogrammes sous anesthésie générale. Tous sont tués à la fin pour analyser la rétine et le devenir des cellules greffées, et tout signe d'infection de l'œil entraîne une mise à mort anticipée.

Objectifs

Les maladies choroïdiennes héréditaires et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), sont des pathologies qui entraînent une perte de la vision pouvant conduire jusqu’à la cécité. Elles affectent des millions de personnes dans le monde, et dans la plupart des cas aucun traitement disponible. Ce projet a pour objectif de démontrer que l'on peut rétablir la vue avec la transplantation d’un morceau de rétine fabriqué en laboratoire à partir de cellules souches humaines. Les transplantations seront réalisées dans un modèle de rats porteur d'une mutation qui altère le système immunitaire (pour éviter les mécanismes de rejet du greffon). Afin de mimer les pathologies humaines, la rétine des animaux sera lésée avec le laser ou avec l’injection d’un composé chimique. Le potentiel thérapeutique des greffons sera évalué par des approches comportementales et électrophysiologiques (sensibilité de la rétine à la lumière).

Bénéfices attendus

Il n'existe peu ou pas de traitement pour soigner les dystrophies rétiniennes (prévalence de 1 sur 3000) et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (8 pourcent de la population française) ou pour restaurer la vision quand celle-ci est perdue. L 'objectif est de développer des approches de thérapie cellulaire à base de morceaux de rétine obtenus à partir de cellules souches humaines. Cette thérapie aura pour objectif de restaurer la vision dans ces maladies.

Procédures

Pour cette étude une lignée de rats immunodéprimés sera transplantée avec des cellules humaines. Afin de mimer la pathologie humaine, deux techniques seront testées : lésion de la rétine avec le laser (moins d'une minute) ou injections d’un composé chimique (injections d’une durée de quelques secondes) : 1 injection pour les animaux concernés. Chirurgie: Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée chez les rats. De plus, la chirurgie sera réalisée sous analgésie en complément de l’anesthésie. La procédure chirurgicale consiste en une transplantation intraoculaire (sous la rétine) d’un tissus rétinien fabriqué en laboratoire. Cette opération dure 15 à 20 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois. Tous les animaux feront l’objet de 3 types d’examen : 1/Un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique); cet examen qui nécessite l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes. Cet examen sera réalisé une fois par semaine pendant 2 mois pour mettre en place le modèle par injection de composé chimique (maximum 8 fois) ou 1 fois par mois (maximum de 3 fois pour les animaux greffés et gardés le plus longtemps). 2/ Un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permettent l’étude de la fonction de ce tissu. Cet examen qui nécessite l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale. L’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Cet examen sera réalisé une fois par mois (maximum de 3 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). 3/ Un test comportemental à l’état vigil sans contrainte particulière (maximum de 3 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Cet examen sera réalisé une fois par mois (maximum de 3 fois). Analgésies et antidote anesthésie (injections d’une durée de quelques secondes): maximum 11 fois par animal au cours de l’étude qui dure jusqu'à 3 mois. Les rats seront euthanasiés à la fin de l'étude par une méthode réglementaire en vue d'une analyse histologique de l'œil.

Impact sur les animaux

Le phénotype immunodéprimé entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s’accumuler dans l’œil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Les animaux sont plus susceptibles de développer des infections opportunistes du fait de leur statuts immunodéficient. Un léger stress et une brève douleur localisée au moment de l’introduction de l’aiguille peuvent être induits par les injections des différents médicaments en intrapéritonéale ou sous cutané. L’anesthésie peut entrainer un risque cardio-respiratoire et d’hypothermie. La photocoagulation au laser et les greffes sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Une douleur et/ou un risque infectieux peuvent survenir pendant ou après les greffes. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme).

Devenir

A la fin de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologies) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (intégration aux tissus de l’hôte, etc…).

Remplacement

Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une préservation de la fonction visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Les approches in vitro ne permettent d’évaluer que des paramètres isolés de culture et non pas des interactions avec une rétine. Il n’est ainsi pas possible de démontrer la fonctionnalité d’un produit de thérapie cellulaire de la rétine autrement que in vivo. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30 pour cent (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Le nombre a été calculé sur la base des données de la littérature pour des approches similaires et en fonction du devenir post-mortem des animaux. Pour limiter le nombre d’animaux, les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques non-paramétriques adaptes aux petits effectifs. Au final, 180 animaux seront utilisés dans le projet.

Raffinement

Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés avec enrichissement de nourriture et boisson à volonté. Les animaux utilisés dans ce projet ont une perte de poils dans la 3-4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'œil sous les paupières nécessiter un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Pour les expérimentations qui le nécessitent, les rats bénéficieront d’une anesthésie générale. Le risque de douleur généré par la transplantation de tissus est géré en pré-opératoire et post-opératoire par l’injection d’analgésiques. Les animaux feront l’objet d’une surveillance plus accrue pendant les 24h suivant les différents actes (réveil post-anesthésie, état de la surface oculaire après les électrorétinogrammes, signe d’inflammation, etc…). Tout signe d’inflammation ou d’infection de l’œil entrainera l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisés dans les études précliniques. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Rats immunodéficients : Ces rats possèdent une modification génétique qui affaibli le système immunitaire (pour prévenir le rejet de greffe). Les différentes analyses seront réalisées chez le rat adulte sur une durée maximum de 3 mois après greffe, le stade le plus tardif prévu per l’étude. Le choix de l'âge adulte est lié au fait que les greffes sont plus aisées à réaliser dans l'oeil adulte (plus grand) de même que les traitements lasers. De plus , la DMLA est une maladie qui touche les adultes.

Une grille de cotation de la douleur fixe le seuil au-delà duquel un rat sera mis à mort avant terme. 80 rats porteurs d'une mutation analogue à celle de la maladie de Huntington vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun subit une neurochirurgie d'environ une heure pour implanter des électrodes non amovibles, puis des enregistrements de douze à quarante-huit heures deux fois par mois pendant dix mois, des stimulations sonores mensuelles, et vit seul en cage pendant neuf mois avec un accès à la nourriture contrôlé. L'objet déclaré est de trouver des marqueurs électriques cérébraux transposables entre le rat et le patient, pour servir de test dans la mise au point de médicaments.

Objectifs

Les patients atteints de la maladie de Huntington, souffrent, en plus des symptômes moteurs et d'une altération de certaines capacités intellectuelles, de troubles du cycle veille-sommeil, ces perturbations du sommeil pouvant déjà être présentes au stade précoce (présence de symptômes avant-coureurs) de la pathologie. L'électroencéphalographie (EE) représente un outil de choix lors des tests précliniques en raison de son caractère transposable entre le rat et l’Homme car les activités cérébrales de base sont largement conservées dans l’évolution des mammifères ce qui permet donc l’application chez le rongeur d’observations faites chez le patient et inversement. Un modèle de rat porteur d’une mutation analogue à celle identifiée chez les patients atteints de la pathologie est disponible et a été caractérisé d’un point de vue comportemental. Il présente des troubles moteurs proches de ceux décrits chez l’Homme. Il est donc pertinent d’explorer les autres caractéristiques de la maladie décrites chez le patient afin de confirmer la pertinence de ce modèle dans l’étude de la maladie et la recherche de nouvelles solutions thérapeutiques. Dans ce projet, nous étudierons donc les phases de veille-sommeil et les oscillations cérébrales spontanées et évoquées dans un modèle de la maladie de Huntington.

Bénéfices attendus

La découverte et l’optimisation de nouveaux médicaments nécessite d’identifier des signes de la maladie dans le cerveau et des tests transposables entre les études cliniques et précliniques. Ils doivent permettre d’évaluer de façon fiable et robuste l’efficacité des molécules testées. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l’humain et le rongeur. Dans ce projet, nous utiliserons des rats modélisant la maladie de Huntington et chercherons à mettre en évidence des marqueurs de la maladie qui pourront par la suite être applicables à l’Homme et permettre de tester de nouvelles molécules thérapeutiques.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux seront tous soumis à des enregistrements longs (12 à 48 heures) qui seront réalisés sur l’animal éveillé de façon bimensuelle avec un intervalle minimum d’une semaine, sur une durée de 10 mois maximum. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores qui seront réalisées sur l’animal éveillé une fois par mois (durée de quelques heures) sur une durée de 10 mois maximum (entre l’âge de 6 mois et de 15mois). Les stimulations sonores intermittentes dureront au maximum 2h. Les animaux sont hébergés de façon individuelle sur la totalité du projet à partir de la chirurgie (9 mois maximum). L’accès à la nourriture est contrôlé pendant la totalité du projet à l’exception des 2 semaines suivant la chirurgie.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l’activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaître dans les heures suivant l’intervention chirurgicale. Les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress sur les animaux. Après implantation des électrodes, les animaux seront hébergés en cages individuelles, avec un contact social réduit (plusieurs semaines) ce qui peut engendrer du stress. Des troubles de la démarche et de la coordination sont décrits dans la littérature sur cette lignée.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électriques du cerveau qui ne sont pas amovibles. De plus, des analyses des tissus cérébraux sont nécessaires pour compléter la caractérisation du modèle et vérifier le positionnement des électrodes les animaux doivent donc être mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle étudie des mécanismes physiopathologiques complexes, comme le sommeil, qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou informatique).

Réduction

Les études sur le long terme présentent un avantage significatif en permettant à chaque animal de servir de contrôle pour lui-même, réduisant considérablement le nombre d'animaux nécessaires par groupe. Cette approche méthodologique nous a permis de déterminer le nombre d'animaux de manière à minimiser celui-ci, tout en veillant à préserver la validité scientifique et la fiabilité des résultats des expériences menées. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires à nos études, les protocoles combineront un ensemble de recueil de mesures permettant de faire un suivi et d’obtenir plusieurs informations chez le même rat.

Raffinement

Le raffinement a été appréhendé à travers les conditions d'expérimentation et d'hébergement qui sont optimisées afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long des procédures expérimentales. Les rats qui entrent dans ce projet ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Les animaux seront regroupés dans une grande enceinte lors d’une session hebdomadaire afin de favoriser les contacts. Le projet prévoit des recueils des mesures engendrant des douleurs post-opératoires modérées. Toutefois, les animaux recevront un protocole de soins post-opératoires comprenant une évaluation clinique quotidienne, des antidouleurs et des anti-inflammatoires. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir le point limite, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. De plus, nous appliquerons des actes expérimentaux les moins invasifs possibles aux rats testés comme le choix d’une anesthésie gazeuse (par rapport à une injection). L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. La prise en compte de ces points permettra de juger du bien-être et d'éviter l'inconfort des animaux au cours de l'expérimentation de manière à garantir la qualité des résultats. Les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité sonore en dessous de l’intensité dommageable.

Choix des espèces

Nous utiliserons une lignée de rats dont la mutation est similaire à celle présente chez les patients de la maladie de Huntington. Le choix de l’espèce est donc directement lié à cette similarité : la mutation de ce même gène chez l’homme et le rat induit en effet des troubles similaires dans les deux espèces. Les animaux sont manipulés au minimum à l’âge de 6 mois puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. Les animaux seront gardés jusqu’à l’âge de 15 mois maximum. A ce stade, le cerveau est mature et présente des caractéristiques intéressantes pour reproduire les troubles observés chez le patient humain.