Recherche appliquée

Cinq injections abdominales en cinq jours induisent la myopathie, puis chaque souris est transportée une demi-journée vers un second établissement et passe trois examens RMN de quarante-cinq à soixante minutes sous anesthésie, espacés de quinze jours. 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin pour prélever leurs muscles. Le porteur attribue un stress modéré à la perte de poids et de force musculaire ainsi qu'au transport, et affirme que les molécules testées n'induiront pas d'effet indésirable puisqu'elles ont déjà été administrées à des humains ou à d'autres animaux. Une grille de score propre à ce modèle doit fixer les points limites et les critères d'arrêt.

Objectifs

La myopathie à cores centraux est une maladie causée par des mutations dans un gène codant pour une protéine essentielle à la contraction musculaire dont l'absence est mortelle. Chez l'homme, nos études précédantes ont montré qu'une réduction de sa quantité en dessous de 50% conduit à une myopathie à cores centraux dont la sévérité augmente avec la quantité de protéines manquantes. Nous avons développé et caractérisé un modèle de souris qui reproduit cette maladie et ses mécanismes. Il n’existe actuellement aucun traitement contre cette maladie. Cependant, différentes molécules, déjà testées chez l'homme ou la souris pour d'autres pathologies, présentent un potentiel thérapeutique fort pour la myopathie à core car elles agissent sur les mécanismes identifiés dans ce modèle. Il apparaît donc opportun d'évaluer les répercussions fonctionnelles au niveau du muscle de l'administration de ces molécules dans un modèle animal parfaitement caractérisé de cette pathologie. C'est l'intérêt de ce projet qui vise à étudier chez l'animal dans son intégrité les effets des traitements sur le métabolisme et la fonction musculaire chez un modèle de souris souffrant de cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester des approches thérapeutiques susceptible d’améliorer les performances musculaires chez un modèle de souris de la myopathie à cores centraux. Sachant qu’il n’existe encore à l’heure actuelle aucun traitement curatif contre cette myopathie, ce projet est une première étape indispensable avant l’application à l’homme.

Procédures

Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs, avec, pour chaque animal, un seul transport entre les deux établissements dans un véhicule dédié (durée environ 1/2 journée) . Chaque animal subira cinq injections (une par jour, durée: moins de 15s/injection) dans l'abdomen et trois explorations strictement non invasives par RMN. Ces explorations, espacées entre elles de 15 jours, auront une durée de 45-60 minutes et seront réalisées sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

1/ Les injections dans l'abdomen pour induire la pathologie pourront entrainer une petite irritation au site d'injection et un stress léger. 2/L’induction de la pathologie pourra engendrer un stress modéré lié à la perte de poids et de force musculaire. 3/ Le transport des animaux d'un établissement à l'autre pourra engendrer un stress modéré. 4/Les explorations RMN pourront provoquer un stress léger de l’animal pendant les phases d’induction de l’anesthésie et de réveil. Le traitement n'induira pas d'effet indésirable car les molécules testées ont déjà été utilisées chez l'homme ou l'animal sans effet indésirable observé.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet afin de réaliser des prélèvements post-mortem de muscles sur lesquels seront réalisées des analyses. Cette étape est indispensable pour caractériser chez chaque animal l’état d’avancement de la pathologie.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer de façon non invasive et à différents temps lors du développement de la maladie si les molécules testées permettent d’améliorer les performances des muscles atteints de myopathie à cores centraux. Le métabolisme et la force musculaire que nous allons étudier mettent en oeuvre une communication entre différents organes, et ne sont donc pas reproductibles avec des cultures de cellules musculaires. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.

Réduction

Notre approche non invasive offre la possibilité d’explorer les animaux au cours de l'évoution de la pathologie ce qui permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés. Le recours à la RMN réduira également le nombre d’animaux utilisés car elle permettra d’obtenir pour chaque animal les mesures dans différentes conditions (repos, activité musculaire, récupération post-activité) au cours d’un seul examen, contrairement aux techniques classiques qui auraient nécessité d'euthanasier des animaux à différents temps pour chacune de ces conditions afin de réaliser les mesures sur muscles. Lorsque cela est possible, les mêmes animaux controles seront utilisés pour le test de deux molécules afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Les injections seront réalisées par du personnel formé, le geste sera rapide et précis. Le transport des animaux entre les deux établissements sera réalisé par un transporteur agréé avec une livraison dans la foulée du chargement. Le suivi en RMN sera réalisé sur animaux anesthésiés afin de réduire le stress des animaux. Enfin, une grille de score spécifique à ce modèle de souris de la myopathie à cores centraux a été établie et permettra l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui ait une physiologie proche de l’Homme et qui soit génétiquement modifiable, c'est pour cela que la souris a été choisie. Les animaux seront utilisés au stade adulte (ils seront âgés de 8-10 semaines au début du projet) afin de pas avoir d'interférence avec le développement musculaire, et parce que l’induction de la pathologie ne peut se faire que dans les fibres musculaires adultes.

Une greffe chirurgicale de cellules tumorales dans le foie, sous anesthésie, de cinq à dix minutes, est pratiquée sur des souris dont une partie a déjà reçu une injection à quinze jours de vie. 840 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur foie et leur rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif est de mesurer l'effet d'une protéine du virus de l'hépatite B sur les cellules immunitaires qui entourent la tumeur, à un stade précoce de cancer du foie. Le porteur annonce des douleurs de suture et des complications per-opératoires possibles, hypothermie et saignement, et mentionne l'injection pratiquée à quinze jours de vie sans jamais dire ce qu'elle contient.

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) se développe souvent sur un terrain cirrhotique associé à une inflammation chronique. Le virus de l’hépatite B (VHB) est le facteur de risque majeur du CHC. Le CHC est la seconde cause de mortalité par cancer dans le monde. Des travaux de recherche ont montré une corrélation entre certaines formes virales du VHB et la sévérité de l’atteinte hépatique jusqu’au cancer du foie. Ce projet a pour objectif de développer des travaux, portant sur l'impact de ces formes virales, via la modulation de la réponse immunitaire, au cours de la carcinogenèse hépatique. L’un des mécanismes semble passer par la modulation de l'infiltration immunitaire intratumorale. L'objectif est de caractériser la composante immunitaire dans le microenvironnement tumoral (TME) en présence de ces différentes formes virales. A l'aide de nouvelles approches et modèles expérimentaux, le mécanisme de l'impact pro-tumoral de ces formes virales du VHB à un stade cancer du foie précoce sera étudié. Ce projet présente l'avantage d'étudier spécifiquement le stade précoce du CHC établi (3 semaines post-transplantation)

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'avoir une meilleure compréhension des mécanismes associés à la modulation de la carcinogenèse hépatique liée à l’infection par le virus de l'hépatite B (VHB), qui pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques améliorant la prise en charge de carcinome hépatocellulaire de patients. La principale hypothèse est qu'une protéine du VHB module le micro-environnement tumoral facilitant l’activité pro-tumorale de certaines sous populations immunitaires. Grâce aux modèles murins, la modulation de l'activité et/ou du recrutement de l'infiltrat immunitaire intra/péritumoral par cette protéine virale, exprimée dans les hépatocytes, sera déterminée. À terme, ces travaux de recherche pourraient permettre de bloquer ces interactions intercellulaires et, en conséquence, la progression du carcinome vers un stade tardif.

Procédures

Une injection unique à 15 jours de vie (une fois par animal concerné, d'une durée de 5 secondes) sur souris vigiles. Une injection de cellules tumorales du foie murin sera réalisée par greffe : cette transplantation chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et couverte par des antalgiques en pré-opératoire, et en post-opératoire. Cette intervention ne sera réalisée qu'une fois par animal et sa durée est évaluée entre 5 à 10 minutes. Une euthanasie sera réalisée à la fin du projet de recherche à l'aide d'une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

La manipulation des souris, en particulier les injections, peuvent induire un stress et une douleur de courte durée au site d’injection ou encore une inflammation locale. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. La greffe au niveau du foie implique une chirurgie, les souris pourront donc éprouver de la douleur au niveau des sutures des plans cutanés et musculaires, ainsi que les complications per-opératoires (hypothermie, saignement) malgré une prise en charge médicamenteuse adaptée.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié sous anesthésie afin de prélever le foie et la rate et permettre de réaliser de nombreuses analyses post-mortem (histologie, quantification de paramètres cliniques, virologiques et immunologiques...) pour répondre à la question scientifique. Cet acte nécessaire sera réalisé par du personnel compétent et selon les bonnes pratiques d'euthanasie des animaux en utilisant une méthode réglementaire.

Remplacement

Nous avons précédemment réalisé des cultures cellulaires en utilisant des modèles 2 et 3 dimensions de différentes lignées cellulaires et d'hépatocyes primaires afin d'étudier in vitro l'impact de l'expression de protéines du virus de l'hépatite B (VHB) sur la progression tumorale. Nous avons développé un modèle de co-culture en transwell permettant d'étudier les interactions entre les cellules d'hépatome exprimant ou non ces protéines du VHB et une sous-population immunitaire. Cependant, la mise en place d'un modèle in vitro récapitulant l'ensemble de la réponse immunitaire innée et acquise hépatique n'est pas encore disponible, même dans un modèle d'organoïdes multicellulaires. C'est pourquoi nous nous sommes tournés vers le modèle in vivo pour étudier l'impact de la présence d'une des protéines du VHB sur l'activation des différents acteurs du système immunitaire au cours du carcinome hépatocellulaire.

Réduction

Un total de 840 animaux seront inclus dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Des souris contrôles seront réutilisées, si possible, entre différentes procédures afin de réduire le nombre d'animaux. A l'issue des procédures, de nombreux tissus seront récupérés sur chaque souris (sang, foie, rate, éventuelles métastases tumorales) afin de permettre de réaliser un grand nombre d'analyses sur une même souris.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation pour l’espèce concernée et un suivi quotidien sera assuré par un personnel formé et compétent. De plus, les cages seront raffinées par la présence de lanières Kraft et des abris en carton et installées sur des portoirs ventilés. Aucune souris ne sera isolée dans une cage. Les animaux seront manipulés uniquement par du personnel qualifié et sensibilité au bien-être animal. Les procédures nécessitant l'endormissement de l'animal sont raffinées avec un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié, la gestion du risque d’hypothermie par l’utilisation d’une lampe chauffante ou d'un tapis chauffant durant les manipulations des animaux sous anesthésie, et l’ajout d’un gel de protection oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire si besoin. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le modèle murin génétiquement identique (syngénique) est un modèle parfaitement calibré à l'expérimentation animale. De plus, il existe une homologie relative avec l'Homme dans le fonctionement du système immunitaire et les interactions foie/autres tissus, que nous souhaitons explorer. Les animaux seront utilisés à deux stades de développement, soit à 15 jours de vie soit de 7 à 10 semaines de vie. L'établlissement d'un cancer du foie au stade précoce nécessitera une période allant de 3 semaines à 6 mois de suivi selon les différents modèles expérimentaux.

Valider une voie d'administration en vue d'un dossier d'essai clinique, telle est la finalité affichée de ce projet, pour lequel 20 cochons de trois mois vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit quatre à cinq prises de sang sous sédation, une injection intramusculaire hebdomadaire d'immunorégulateur, des comprimés quotidiens et une à deux urétéroscopies sous anesthésie générale de une heure trente à deux heures. Après trois à quatre semaines, une dernière anesthésie sert à ouvrir l'animal, prélever ses organes et le tuer. Le porteur présente le porc comme la seule espèce possible et l'urétéroscopie comme une voie non invasive, voie que des chirurgiens viennent aussi apprendre sur des porcs.

Objectifs

--- La cystinurie est une maladie rénale qui aboutit à l’insuffisance rénale suivies de dialyse/transplantation. Bien que l'incidence de la cystinurie soit faible (≈1/7000), les calculs de cystine sont très récurrents et entraînent une morbidité importante : interventions chirurgicales fréquentes et lésions rénales dans près de 80% des cas. La précipitation de cystine est la seule manifestation de cette maladie rare, qui se traite par des mesures diététiques visant à obtenir des urines non sursaturées en cystine. Une information du patient et un suivi diététique pour réduire les aliments riches en méthionine, à boire >3L/j. Malheureusement, malgré un régime diététique efficace, plus de 85% des patients récidivent. Il existe des traitements médicamenteux qui visent à modifier la cystine urinaire pour la rendre incapable de former des cristaux mais, ces médicaments sont associés à des effets secondaires. --- Dans le contexte du développement thérapeutique de maladies rares, et notamment rénales, nous avons identifié un vecteur viral de thérapie génique qui permet le transfert de gène dans les parties malades du rein grâce à une injection dans les voies urinaires, en direction des reins. Dans le cadre d’une preuve de concept, le mode opératoire pour une telle administration a été réalisé chirurgicalement. Nous souhaitons dès lors, nous pencher sur des indications thérapeutiques et commencer par explorer l’usage atraumatique de la voie endourologique, c’est-à-dire en passant par les voies naturelles. Ceci est rendu possible par l’utilisation d’un urétéroscope flexible (endoscope souple, fin, équipé d’une microcaméra et d’instruments à son extrêmité) ammené jusqu’au centre des reins pour délivrer le vecteur de thérapie génique. Cette méthode est cliniquement pertinente et peut-être réalisée en ambulatoire – couramment utilisée en clinique pour détruire des calculs ou retirer des tumeurs rénales. Cette validation préclinique est indispensable pour la constitution à terme d’un dossier d’essai clinique de thérapie génique et nécessitera donc l’utilisation du modèle porc étant donné la similitude anatomique des voies urinaires avec l’Homme. En conclusion, notre projet repose sur l’usage du porc pour la validation du protocole d’administration en vue de la constitution d’un dossier d’essai clinique de thérapie génique dans une indication en néphrologie. --- Modification: une extension de la durée du projet a été demandée pour terminer l'étude en cours.

Bénéfices attendus

****Opportunités thérapeutiques : La confirmation que l’emploi d’un urétéroscope flexible permet d’atteindre ces résultats ouvrirait de multiples opportunités pour traiter un ensemble important de maladies rénales originaires du néphron, tels que la cystinurie ou encore la polykystose rénale. ****Sécurité thérapeutique : éviter les effets secondaires : La validation de la méthode d’administration par urétéroscope permet de concentrer le vecteur de thérapie génique dans l’organe cible (ici les reins) limitant ainsi la circulation sanguine et les effets secondaires comme ont pu en être observés dans le cas de thérapies géniques contre la myoptahie de Duchenne par exemple. ****Mode d’administration raffiné : une fois validée l’administration par les voies naturelles offrira aux patients un traitement rapide, non invasif, précis et ne nécessitant pas d’hospitalisation.

Procédures

Sur la durée du projet, les animaux subiront les interventions suivantes : -4 à 5 prises de sang (selon les groupes d’animaux) sous sédation ce qui représente une injection intramusculaire du sédatif d’une durée de moins d’une minute. La prise de sang dure environ 2 minutes. La sédation complète dure environ une demi-heure. -Un traitement immunorégulateur (pour éviter le rejet de la thérapie génique) qui se présentera sous la forme d’une injection intramusculaire par semaine (durée moins d’une minute) et de la prise de comprimés quotidienne qui seront mélangés à un aliment ou une boisson appétente. -1 à 2 procédures d’administration de vecteur de thérapie génique (selon les groupes d’animaux) qui se déroulent sous anesthésie générale. L’anesthésie inclut une injection intramusculaire pour la sédation (durée de moins d’une minute). L’animal est ensuite inconscient pour le reste de la procédure. La procédure totale sous anesthésie dure entre 1h30 et 2h, selon qu’un seul rein ou deux sont traités. -A la fin du projet (au bout de 3 à semaines selon les groupes) : les animaux feront l’objet d’une dernière anesthésie générale (injection intramusculaire de moins d’une minute), la suite de la procédure se déroule sous anesthésie générale. Au cours de celle-ci une chirurgie sera réalisée afin de réaliser des prélèvements d’organes. L’animal sera ensuite mis à mort, toujours lors de cette anesthésie générale.

Impact sur les animaux

La plupart des actes se dérouleront sous sédation ou sous anesthésie générale. Ainsi, les cochons vont recevoir une injection de sédatif en intramusculaire. Nous prenons nos dispositions pour que l’injection soit la moins stressante, la moins douloureuse et la plus courte possible. Lorsqu’une anesthésie est prévue, sous sédation, un cathéter intraveineux sera posé sur une veine de l’oreille, l’animal étant profondément sédaté, il n’y a que peu de réaction à cet acte qui dure environ une minute. La suite de la procédure se déroule sous anesthésie générale maintenue par un respirateur fiable permettant de nous assurer de l’absence de toute souffrance. Pour les injections intramusculaires du traitement immunomodulateur, là aussi, nous prenons nos dispositions pour que l’injection soit la moins stressante, la moins douloureuse et la plus courte possible. La prise de comprimés ne présente pas de contrainte pour les animaux grâce au mélange dans un aliment ou une boisson appétente.

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort en fin de projet car une autopsie doit être réalisée afin d’étudier l’effet de la thérapie génique sur les reins post mortem.

Remplacement

Compte tenu que le but du projet est de démontrer l’emploi d’un urétéroscope flexible pour délivrer un vecteur viral de thérapie génique par les voies naturelles, il ne peut y avoir d’alternative à l’usage d’un modèle animal. Après administration intra-rénale du vecteur de thérapie génique, il sera nécessaire de maintenir l’animal en vie afin de pouvoir évaluer le niveau et la distribution de l’expression du gène transféré. Ainsi, nous ne pourrions substituer l’utilisation d’un animal vivant.

Réduction

****Stratégie de réduction: Ce projet se découpe en une Phase pilote incluant 6 porcs suivie d’une Phase de Consolidation incluant 14 porcs. La Phase Pilote aura la particularité d’injecter les 2 reins d’un même animal permettant ainsi de diviser le nombre d’animaux par 2. En fonction des résulats obtenus à l’issue de la Phase Pilote, la Phase de Consolidation n’injectera qu’un seul rein sur les deux afin de disposer d’un rein contrôle non exposé au vecteur de thérapie génique. Cependant, compte tenu qu’au cours de la Phase Pilote, les injections seront restreintes soit à la partie supérieure soit inférieure du rein, il est possible que le pôle rénal non directement exposé puisse servir de tissu contrôl interne. Auquel cas, là également, nous pourrons exploiter les 2 reins chez un même animal et ainsi diviser le nombre total d’animaux par 2. Il faudra donc attendre l’issue de la Phase Pilote avant de pouvoir décider la meilleure option pour promouvoir la Réduction du nombre d’animaux. ****Statistiques: cette étude ne prévoit pas d'analyse statistique des résultats. Il s'agit d'une étude qualitative qui est destinée à tester quelques paramètres d’injection car nous sommes en mode exploratoire. Une fois nous aurons identifiés les paramètres et conditions clés, une seconde session incluera des ‘n’ plus conséquent pour confirmer et valider les conditions optimales d’injection.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les porcs sont réceptionnés au sein de l’animalerie où ils sont acclimatés et hébergés en groupe sociaux dans de larges box enrichis de jeux à mâcher et de balles, avec des conditions d’ambiances contrôlées. Ils sont douchés quotidiennement à l’eau tiède et un programme de familiarisation basé sur la distribution de récompenses facilite les interactions avec les soigneurs et réduit leur stress lors des manipulations. Un programme musical apaisant est diffusé pour couvrir les bruits d’ambiance aversifs. Conditions expérimentales : L’urétéroscopie par les voies naturelles est justement choisie comme méthode d’administration des vecteurs de thérapie génique car cette voie n’est pas invasive. En effet, en clinique humaine, l’urétéroscopie ne nécessite pas de prise en charge particulière après l’examen. De plus, cet examen mobilisera l’intervention d’un urologue spécialisé dans cette pratique chez des patients humains mais également lors d’enseignements sur des porcs pour former des chirurgiens à cette abord chirugical non-invasive. Les animaux sont anesthésiés et recevront des analgésiques pour toutes les procédures et ils font l’objet d’un suivi au réveil afin de s’assurer qu’ils ont bien récupéré de leur anesthésie. Nous travaillerons de manière aseptique (matériel stérile, à usage unique ou stérilisable, champs stériles, tenue stérile de l'opérateur et du chirurgien, désinfection cutanée et des muqueuses) afin de pouvoir éviter les risques infectieux et garder en vie pendant 3 à 4 semaines l’animal injecté sans que sa fonction rénale et son état général n’en soit affectés. L'usage d'une antibiothérapie de couverture en peropératoire et posopératoire immédiat permettra également d'éviter les risques infectieux. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance.

Choix des espèces

Afin que l’étude que nous proposons ait une pertinence forte pour ensuite déposer un dossier de demande d’essai clinique aux agences réglementaires ad hoc, l’espèce animale doit permettre d’évaluer précisément la procédure d’administration du traitement avec un équipement identique et un protocol adapté à celui déjà utilisé chez les patients humains. Il faut également que l’anatomie de l’espèce animale et de l’organe ciblé soient similaires à l’homme. Le porc est donc la seule espèce qui nous permettra une validation préclinique de la procédure d’injection. Des porcs de 3 mois environ (soit 40-50 kg) seront utilisés. A ce stade de développement, le système urinaire du porc est très proche de celui de l’humain tant du point de vue anatomique que du point de vue de sa taille, permettant ainsi de se positionner dans les mêmes conditions que celles de la thérapie chez l’Homme.

14 080 rongeurs, 7 040 souris et 7 040 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les composés leur sont administrés par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou intranasale, jusqu'à 120 administrations par animal, avec des prélèvements sanguins pouvant retirer 15 % de leur volume sanguin. Le porteur prévoit que certains animaux atteignent les points limites du fait des substances elles-mêmes, ce qui déclenchera leur mise à mort anticipée. Deux phrases suffisent au RNT pour exposer objectifs et bénéfices de cette évaluation toxicologique de candidats médicaments, sans nommer aucun composé ni justifier l'effectif de 14 080 animaux.

Objectifs

L’évaluation toxicologique de nouveaux candidats médicaments est une étape clé dans leur processus de développement. Ce projet vise donc à évaluer le profil toxicologique de nouveaux candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’avancer dans la caractérisation de nouveaux candidats médicaments en s’assurant de leur innocuité chez l’animal avant toute administration chez l’Homme.

Procédures

1) L’administration des composés à tester ou de leur solvant en moins d’une minute par animal pendant la durée de l’étude pourra être réalisée via différentes voies d’administrations : - par voie orale (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 120 administrations pour la procédure 3) - par voie intraveineuse (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 14 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 24 administrations pour la procédure 3) - par voie intrapéritonéale (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 24 administrations pour la procédure 3) - par voie intramusculaire (une administration pour la procédure 1) – par voie sous cutanée (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 120 administrations pour la procédure 3) – par voie intranasale sous anesthésie gazeuse a l’isoflurane (1 administration pour la procédure 1) 2) De 1 à 3 prélèvements sur 24h pourront être réalisés jusqu’à 2 fois dans l’étude avec un volume total ne dépassant pas 15% du volume sanguin de l’animal avec un temps de récupération de 2 semaines minimum. Le prélèvement pourra être fait à la veine submentale, saphène (sans anesthésie). Les prélèvements se feront sur une durée de deux minutes par animal.

Impact sur les animaux

On pourrait observer des effets indésirables (stress, douleur de courte durée) liés à la voie d’administration des composés ou aux composés testés en eux même avec pour certains animaux l’atteinte potentielle des points limites. Des effets indésirables (stress, douleur de courte durée) liés aux prélèvements sanguins pourraient également être observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales, des analyses sur les organes étant nécessaires pour évaluer l’innocuité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne permet de rendre compte des potentiels effets indésirables in vivo des nouveaux candidats médicaments. De plus l’évaluation de la toxicité potentielle des candidats médicaments est une étape clé de leur développement.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’études, et donc le nombre d’animaux utilisés, les différents candidats médicaments seront préalablement testés in vitro. Ne rentreront dans les études in vivo que ceux ayant montré le plus d’efficacité ainsi qu’une absence de toxicité dans ces tests in vitro. Le nombre d’animaux utilisés par étude sera réduit au maximum de manière à pouvoir observer de potentiels effets indésirables et est adapté des recommandations de l’OCDE associées à la réalisation d’étude toxicologique chez le rongeur. Pour la détermination des doses maximales tolérées un groupe vehicule unique sera utilisé tout au long du processus afin de réduire le nombre d’animaux. De plus, l’administration des composés se fera séquentiellement ce qui permettra d’utiliser le nombre minimum d’animaux possible en n'incluant pas les reste des animaux prévu si le composé est toxique. Enfin, les études de toxicité chronique avec récupération ne se feront que sur les dose maximales testées la encore afin de réduire le nombre d’animaux. De ce fait, ce projet permet de réduire le nombre de composés qui seront testés dans les études d'éfficacité nécessaires aux études précliniques.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. Enfin, si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort éthiquement et de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance animale, de la nourriture pourra être ajoutée dans les cages sous forme de nourriture humidifiée. Lors de la mise à mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton, feuilles de cellulose, …).

Choix des espèces

L’évaluation toxicologique des candidats médicaments est une étape clé de leur développement qu’il est nécessaire de réaliser dans au moins une espèce de rongeurs. Pour cela ce projet sera réalisé chez la souris et/ou chez le rat qui sont les deux espèces de rongeurs les plus utilisées pour des études de toxicologie. Cela permettra également de définir les doses maximales pouvant être utilisées dans les futures études d’efficacité qui seront réalisées dans ces deux espèces. L’âge des animaux utilisé dans ce projet sera choisi en fonction de l’indication du nouveau candidat médicament.

Les souris de ce projet sont immunodéficientes et humanisées, la rate qu'on leur retire étant remplacée par des fragments de rate humaine, y compris de rate fœtale. 1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de quarante-cinq minutes, jusqu'à huit prélèvements sanguins répartis sur 112 jours et une échographie de quarante-cinq minutes tous les quatorze jours, leur immunodéficience les exposant par ailleurs aux infections. Le porteur justifie la mise à mort par le fait que ces animaux sont modifiés et greffés de tissu humain, et prévoit de proposer les rates murines retirées à des équipes d'immunologistes du campus comme source de cellules.

Objectifs

Le premier objectif du projet est d’explorer expérimentalement le rôle de filtration de la rate et les différents mécanismes physiques et biologiques à l’origine de la rétention des globules rouges dans la rate, en particulier dans le cadre de maladies héréditaires (drépanocytose, sphérocytose héréditaire, ...) ou acquises (Paludisme,...). Dans ces maladies, la déformabilité des globules rouges est altérée, entraînant une rétention dans la rate à l’origine d’anémie et de complications pouvant être graves. Les mécanismes d’anémie et de congestion de la rate sont complexes et requièrent un modèle expérimental. Les modèles murins conventionnels ne sont pas totalement pertinents pour analyser cette fonction physiologique et les mécanismes physiopathologiques. Des souris greffées par des fragments de rate humaine permettraient en revanche d’aborder ces questions. La filtration des globules rouges est un phénomène dynamique, tridimensionnel et multicellulaire, impossible à répliquer entièrement in vitro dans l’état actuel de la technique. L’étude aura également pour objectif d’étudier la prise de greffe et le développement de fragments de rate fœtale. Cela permettra d’analyser la fonction filtrante et immunologique de ces rates immatures en considérant que leur développement reflète – ou non – en partie la poursuite de leur développement physiologique. En deuxième objectif, nous souhaitons explorer la faisabilité de l’auto-greffe splénique humaine afin de restaurer une fonction déficiente, sur le modèle de la préservation de la fertilité par cryopréservation-réimplantation différée des ovaires en médecine humaine. Chez les patients atteints de drépanocytose, une splénectomie est parfois nécessaire du fait de complications graves. La cryopréservation d’une partie du tissu splénique permettrait sa réimplantation et la restauration d’une fonction splénique normale chez les patients guéris ultérieurement de leur drépanocytose. Démontrer dans le modèle murin la prise de greffe avec des fragments de rate humaine serait une indication forte du succès possible de notre démarche. La probabilité de succès est élevée du fait du phénomène de splénose (repousse de petits fragments spléniques), observé tant chez l’être humain que chez la souris.

Bénéfices attendus

La rate joue un rôle crucial dans le système immunitaire et aide à maintenir une circulation fluide des globules rouges en éliminant ceux qui pourraient obstruer les petits vaisseaux. En cas de certaines maladies des globules rouges, la rate peut devenir hyperactive, entraînant une anémie et d'autres complications. Les mécanismes exacts de ces processus ne sont pas encore bien compris. Un processus spécifique appelé "pitting" permet à la rate d'éjecter des corps rigides ou des parasites morts des globules rouges sans les endommager. Ce processus est difficile à étudier en laboratoire, car il nécessite l'utilisation de rates humaines, qui sont rares et limitées. Pour mieux comprendre ces mécanismes, l’étude propose de greffer des fragments de rate humaines sur des souris afin d'observer directement la filtration des globules rouges et d'évaluer les effets de médicaments sur la déformabilité des globules rouges. Ce modèle pourrait également être utilisé pour des interventions thérapeutiques ou prophylactiques. L’utilisation de rates fœtale permettrait également d’étudier la maturation de ces dernières dans notre modèle. La perte de fonction splénique peut entraîner des complications graves. Après une rupture de rate traumatique, la rate peut se régénérer spontanément, ce qui suggère qu'une réimplantation contrôlée de tissu de la rate pourrait améliorer le pronostic à long terme des patients. Cette étude préclinique est une étape nécessaire avant de solliciter l'agence de la biomédecine pour la mise en œuvre d'une démarche ambitieuse de préservation de la fonction de la rate chez l'être humain, ce qui pourrait avoir de grands bénéfices pour certains patients.

Procédures

Les animaux dans ce projet expérimental seront soumis : Procédure 1 : - 2 à 6 injections (15sec) sur animaux vigiles répétables toutes les 8-12h - 1 à 3 injections (15sec) sur animaux vigiles répétables toute les 8-12h - 1 chirurgie (45 min) sur animaux anesthésiés et analgésiés - 8 prélèvements sanguins sur animaux vigiles (30 sec) répétés tous les 14 jours sur une période totale de 112 jours - 1 échographie tous les 14 jours sur animaux endormis jusqu’à 112 jours (45min) Procédure 2 : - Pour l’ablation de la rate et la greffe, les interventions seront les mêmes que pour la procédure 1 - 1 échographie tous les 14 jours sur animaux anesthésiés jusqu’à un temps déterminé en procédure 1 (45 min) sur animaux anesthésiés - 2 injections (30 sec) espacées de 3 jours si besoin - 1 injection sur animaux endormis (2min) - 5 prélèvements sanguins (30sec) de faible volume répété à 1 min, 30 min, 2h, 24h et 48h - Imagerie sur animaux anesthésiés durant un temps défini ne dépassant pas 4 heures

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sont immunodéficiente ce qui augmente leurs sensibilités aux infections. Les injections et prélèvements de sang peuvent causer une douleur légère et temporaire à chaque site d'injection. La piqure d’aiguille pour l’injection elle-même provoque une douleur légère de courte durée. La chirurgie (exérèse de la rate, greffe) quant à elle, entraîne une douleur et un inconfort modérés.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront mis à mort car étant des organismes génétiquement modifiés et/ou greffés et/ou injectés avec du tissu humain ils ne peuvent pas être réutilisés ou replacés.

Remplacement

La démarche n'est pas directement applicable chez l'être humain et nécessite une étape préclinique. Les seules données antérieures disponibles sur cette démarche de greffe de rate humaine ont été obtenues chez la souris. Les modèles in vitro et ex vivo préalablement développés présentent des limites dans leur puissance d’exploration (visualisation directe de la filtration des globules rouges, évaluation de l’impact des médicaments in vivo), ne pouvant être franchies que par l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre de souris impliquées est réduit au maximum pour confirmer la faisabilité de la démarche et évaluer les médicaments avant leur utilisation chez l'être humain. Nous souhaitons nous assurer d'une probabilité de prise de greffe fonctionnelle supérieure à 70%. L’utilisation de l’échographie pour évaluer la prise de greffe lors de nos procédures permet un suivi transversal permettant de réduire le nombre d’animaux. Les rates murines enlevées lors de la splénectomie préparatoire seront proposées à des équipes d’immunologistes du campus comme source de cellules. Le nombre d’animaux a été défini avec un biostatisticien et à l’aide d’un outil statistique où nous considérons deux groupes et 3 répétitions. Chaque répétition sera divisée en 4 jours d'expériences, avec 2 animaux par groupe et par jour. Par conséquent, nous considérons un effet aléatoire jour qui inclut à la fois les effets de la répétition et du jour. Un effet lot/jour pourrait représenter 10,00 % de la variabilité totale, ce qui nous amène à multiplier le nombre total d'individus par un facteur adapté par rapport à une situation où aucun effet de lot n'est attendu. Résolution statistique de l'expérience : Nous avons décidé d'utiliser 8 individus par groupe et par répétition, ce qui porte le nombre total d'individus à 48. En tenant compte d'un effet lot/jour de 10,00 %, ces nombres devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des effets importants à très importants.

Raffinement

Le choix du modèle animal participe au raffinement en sélectionnant une espèce et une souche adaptées aux objectifs scientifiques tout en minimisant l’inconfort. Leur immunodéficience impose un hébergement en conditions sanitaires strictes où tout ce qui sera en contact avec les animaux sera stérile pour limiter les risques infectieux. Les interventions chirurgicales et injections seront faites sous anesthésie gazeuse avec une analgésie adaptée afin de limiter la douleur, le stress et d’optimiser la récupération. Des plaques chauffantes préviendront l’hypothermie, une réhydratation post-opératoire sera assurée, et un gel appliqué pour éviter le dessèchement oculaire. Les greffons stériles seront traités afin de garantir une asepsie maximale et prévenir toute infection ou réponse inflammatoire. La greffe sera effectuée là où la rate se régénère naturellement. Cette technique est privilégiée car elle est robuste et évite une nouvelle incision. L’échographie permet un suivi transversal des animaux et déceler des signes précoces de nécrose des greffons. Les animaux seront observés quotidiennement, avec des critères d’évaluation précis basés sur les recommandations de la SBEA. Des points limites spécifiques et précoces, tels qu’une perte de poids, des signes de détresse, des signes inflammatoires ou d’infections sont identifiés et pourrons permettre de traiter l’animal avec l’avis du vétérinaire et le cas échéant, la mise à mort sera réalisée.

Choix des espèces

Notre objectif est de développer des mesures fiables et indépendantes de fonctionnement anormal de la rate. Nous utilisons plusieurs techniques. Les marqueurs actuels, peu adaptés aux contraintes hospitalières, nécessitent une validation plus robuste comme prédicteurs de gravité. Le produit final visé est un test biologique de routine quantifiant la fonction splénique. Pour atteindre cet objectif, un modèle expérimental animal est indispensable. Après avoir testé diverses hypothèses physiopathologiques et agents pharmacologiques in vitro, nous devons désormais confirmer nos résultats in vivo pour proposer de nouvelles solutions thérapeutiques. Un modèle murin est essentiel, car les systèmes moins évolués ne reflètent pas suffisamment le contexte humain. L’humanisation du modèle murin par greffe d’organes humains a déjà permis des avancées significatives dans la compréhension de plusieurs phénomènes physiopathologiques. De jeunes adultes de 8 semaines seront utilisés afin d’être suffisamment âgés pour permettre une chirurgie aisée et suffisamment jeunes pour permettre un suivi prolongé (3 mois). De plus, cet âge correspond à l’âge des souris dans l’article publié sur lequel nous nous basons pour ce projet.

Livrées par un transporteur spécialisé après un trajet limité à trente minutes, les souris arrivent à cinq semaines et entrent en expérience une semaine plus tard, une partie d'entre elles quasiment dépourvue de système immunitaire. 6 539 souris vont être utilisées sur les deux sites du projet, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une tumeur du pancréas ou du foie implantée sous la peau ou dans l'organe, une radiothérapie externe ou un produit radioactif injecté, puis jusqu'à une heure trente d'IRM sous anesthésie. Les essais en éprouvette ont déjà confirmé l'efficacité des produits testés, ce dont le porteur déduit qu'il est "indispensable" de passer à l'animal, faute de reproduire in vitro la complexité du milieu tumoral.

Objectifs

Les avancées récentes en cancérologie ont considérablement amélioré les options de traitement, notamment en radiothérapie. Parmi les techniques utilisées, il y a la radiothérapie externe, qui cible les tumeurs à l'aide de rayons et la radiothérapie interne, qui consiste à injecter des substances radioactives se fixant directement sur les cellules tumorales. L'objectif principal de ce projet, qui se déroulera sur 2 sites de recherche différents (EU1 et EU2), est d'identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse aux radiothérapies dans des modèles animaux de cancers pancréatique et hépatique. Actuellement, l'absence de biomarqueurs fiables pour évaluer l'efficacité et la toxicité de ces traitements empêche de personnaliser les soins oncologiques. Ce projet vise à relier des marqueurs biologiques à la réponse tumorale et aux effets secondaires des traitements, afin d'adapter ces approches thérapeutiques en clinique. L'utilisation de modèles animaux est essentielle pour se rapprocher des conditions humaines. De plus, nos techniques d'imagerie permettront de suivre l'évolution des biomarqueurs d'intérêt sur le long terme, sans avoir à euthanasier les animaux à chaque étape. Ces outils aideront à identifier des biomarqueurs prédictifs la réponse aux traitements en milieu clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider de nouveaux biomarqueurs d’imagerie prédictifs pour mieux identifier les patients susceptibles de bénéficier de la Radiothérapie externe ou de nouvelles approches en Radiothérapie Interne Vectorisée, tout en permettant une évaluation rapide de l’efficacité des traitements.

Procédures

Dans ce projet, des tumeurs pancréatiques et hépatiques seront implantées chez des souris, soit sous la peau (1 minute), soit directement dans l'organe (4 minutes), après anesthésie gazeuse (5 minutes). Certaines souris recevront un médicament radioactif par injection (20 secondes), tandis que d'autres auront un traitement de radiothérapie externe (4 minutes), également sous anesthésie chimique par voie intrapéritonéale (15 secondes). Des prises de sang (15 secondes) seront effectuées pour vérifier l'impact des traitements sur le sang, le foie et les reins. Une partie des souris sera utilisée pour tester l'efficacité des différents traitements, et une autre pour étudier par imagerie des marqueurs biologiques. L’imagerie PET-CT sera réalisée au sein de l’EU1 (1 heure maximum), l’imagerie IRM sera réalisée au sein de l’EU2 (1h30 maximum). En outre, certaines souris permettront de mesurer la répartition du médicament dans différents organe après euthanasie. La croissance des tumeurs sera suivie minutieusement et évaluée deux fois par semaine par des techniques n'induisant pas de nuisances.

Impact sur les animaux

On peut s'attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux. La douleur associée aux injections intrapéritonéales, intratumorales et intraveineuses est équivalente à celle d'une piqüre avec une aiguille. De plus, la douleur générée par les prélèvements sanguins, l'implantation des cellules tumorales sera soigneusement contrôlée. Le suivi du développement tumoral, avec des mesures et observations régulières, garantira que leur augmentation de volume n’entraine pas de souffrance ou de difficulté pour la locomotion. Si nécessaire, des médicaments anti douleurs seront administrés.

Devenir

Les souris seront toutes euthanasiées en fin de procédure expérimentales ou plus précocement sur la base de critères éthiques

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisés en laboratoire pour évaluer la cytotoxicité des traitements ainsi que leur impact sur la survie et la prolifération des cellules tumorales. Ces essais ont confirmé l’efficacité des radiopharmaceutiques et des modalités de traitement dans un environnement contrôlé. Ils ont également fourni des informations clés sur les mécanismes d’action des traitements et leurs effets sur les cellules tumorales ainsi que sur les fibroblastes associés au cancer. Cependant, malgré la richesse de ces résultats, il est indispensable de passer à des modèles in vivo, car les tests in vitro ne peuvent pas reproduire la complexité du milieu tumoral ni permettre l'évaluation de l’efficacité thérapeutique par imagerie ou la recherche de biomarqueurs prédictifs dans un contexte vivant. Ainsi, les protocoles qui seront utilisés in vivo reposent directement sur les résultats obtenus lors des tests in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Grâce à des techniques d'imagerie non invasive, nous pourrons suivre l'évolution des traitements sans avoir à euthanasier les animaux à chaque étape. Les effets des traitements seront suivis de près pour observer l'évolution des tumeurs et comprendre les effets de chacun des traitements. Tout au long du projet, le bien-être des animaux sera une priorité.

Raffinement

Afin de limiter la douleur et le stress des animaux, nous avons établi des point limites gradés, précis et adaptés pour toutes les procédures mises en oeuvre au cours de ce projet. Si les animaux atteignent ces points limites, cela constitue un critère d’arrêt de l’expérimentation et les animaux seront euthanasiés. Une surveillance minutieuse des animaux sera réalisée (suivi journalier du poids, du volume tumoral et du comportement) afin réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux. En cas de douleur, un traitement antidouleur adapté sera donné. Concernant l’enrichissement du milieu, les souris disposent de carrés en cellulose pour la formation d’un nid commun confortable, de baguettes en bois qu’elles peuvent ronger. En cas d’isolement forcé d’une souris dans une cage, un abri supplémentaire sera également fourni. Certains animaux utilisés dans ce projet n’ont quasiment pas de système immunitaire, ils seront donc hébergés dans des conditions sanitaires strictes. Les animaux seront transportés par un transporteur spécialisé, dans des boîtes de transport ventilées, avec de la litière, de l’hydrogel et de la nourriture. Le trajet sera court et ne dépassera pas 30 minutes pour limiter leur stress.

Choix des espèces

La souris est un mammifère suffisamment proche de l’espèce humaine d’un point de vue physiologique et la souris immunodéprimée est un bon modèle pour l’étude de la cancérologie humaine. Les animaux, âgés de 5 semaines, seront utilisés après une période d’acclimatation d’une semaine après la réception. Ils seront alors âgés de 6 semaines, âge où l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une bonne homogénéité de réponse.

66 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un lymphome humain leur est greffé, suivi sept jours plus tard de lymphocytes T génétiquement modifiés, puis de six à huit séances d'imagerie sous anesthésie et de prélèvements sanguins étalés jusqu'au cinquante-deuxième jour. Le modèle tumoral paralyse les membres postérieurs, une douleur que le RNT classe comme modérée tout en indiquant qu'elle peut durer jusqu'à quatorze heures. Des tests en éprouvette ont déjà montré que la molécule déclenche le gène suicide et tue les cellules, ce dont le porteur conclut que la validation chez la souris est "indispensable".

Objectifs

Les lymphocytes T (LT) font partie d’une catégorie de globules blancs qui jouent un rôle très important pour les défenses de l’organisme. Ces cellules sont responsables de la réponse immunitaire cellulaire visant à détruire les agents pathogènes, aussi bien les bactéries que les cellules cancéreuses. L’idée d’utiliser ces LT pour le traitement des cancers est en plein développement. Ces thérapies par ces cellules, appelées CAR-T (Chimeric Antigenic Receptor-T), ont révolutionné le traitement des maladies du sang. Le principe consiste à prélever des cellules LT d’un patient, de les modifier génétiquement et de les lui réinjecter dans le but qu'elles reconnaissent et éliminent spécifiquement les cellules cancéreuses. Cependant, des préoccupations en matière de sécurité, tel que le risque d'effets secondaires, nécessitent des mécanismes d'élimination contrôlée des cellules CAR-T. Les gènes dit « suicides » offrent une solution prometteuse à cet effet. En effet, pour contrôler ces cellules CAR-T en clinique chez l’homme, elles peuvent être équipées de ces gènes suicides qui sont activables par des médicaments cliniquement approuvés. Les cellules CAR-T activées par ces médicaments meurent. Les objectifs de ce projet sont doubles. Dans un modèle de lymphome humain greffé chez la souris nous souhaitons : (1) Valider et définir la quantité de cellules CAR-T nécessaires pour éliminer le lymphome greffé chez la souris et (2) Evaluer l'impact du gène suicide sur l'efficacité antitumorale des cellules CAR-T et leur élimination.

Bénéfices attendus

Le bénéfice est la validation de systèmes de sécurité, inductibles et contrôlés, permettant d'éliminer des cellules CAR-T greffées chez un patient en cas d’effets secondaires graves pour le traitement de pathologies. Cette sécurité vise à perfectionner considérablement les protocoles actuels de cellules CAR-T et favorisera leurs utilisations en première intention améliorant ainsi la prise en charge des cancers et le traitement de certaines pathologies anti-tumorales.

Procédures

Dans notre étude, 66 souris analgésiés et anesthésiées seront transplantées avec un lymphome humain (1 fois, 30 secondes), 7 jours après la greffe, 58 souris recevront des lymphocytes T génétiquement modifiés (1 fois, 30 secondes) et 14 jours après la greffe 28 souris seront injectées par le médicament induisant l’activation du gène suicide ou une solution de contrôle (1 fois, 30 secondes). 30 souris vigiles auront deux prélèvements de sang (2 minutes maximum), un réalisé à 14 jours et l’autre 28 jours après la greffe. 28 souris vigiles auront à J17 après la greffe un prélèvement de sang d’une durée de 2 minutes maximum, 14 souris vigiles auront ensuite 3 autres prélèvements de sang (2 minutes) à J28, J42 et J52 après la greffe. Toutes les souris seront anesthésiées pour les 6-8 imageries durant 5 minutes et auront au préalable une injection d’un produit pour réaliser les imageries.

Impact sur les animaux

Un stress, de courte durée de moins de 30 secondes, pourra être généré au moment des contentions des souris et lors des pesées. Du stress sera également généré lors des anesthésies gazeuses d'une durée de 3 à 5 minutes maximum. Les injections pour l'inoculation des cellules tumorales, des lymphocytes et du médicament ainsi que les prélèvements de sang pourront également générer une douleur d'intensité légère de courte durée (10 secondes à 2 minutes). Le modèle tumoral induit des paralysies des membres postérieurs de la souris entraînant une douleur d'intensité modérée d'une durée de quelques minutes à 14 heures maximum.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus et d'organes pour des analyses tissulaires.

Remplacement

Des tests in vitro réalisés sur les cellules CAR-T ont montré que la molécule utilisée dans ce projet induit le déclenchement du gène suicide et l'activation du signal de mort dans les cellules par apoptose. Nous souhaitons maintenant valider le concept in vivo aussi l'utilisation du modèle souris est indispensable.

Réduction

Il s'agit d'une étude comportant un effectif de 66 animaux au total. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, les groupes comporteront 2-6 animaux maximum tout en permettant une analyse statistique fiable des prélèvements par une méthode permettant de caractériser et compter des cellules.

Raffinement

Tout au long du déroulement des procédures, une observation quotidienne de l'état clinique des souris sera réalisée et le registre de soins est complété en se rapportant à la grille de suivi de soins. Les injections de cellules sont réalisées sous anesthésie et sous analgésie, afin de réduire à son strict minimum le stress et l'inconfort de l’animal. Des points limites prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

Afin de pouvoir greffer des cellules cancéreuses et les lymphocytes humains, une souris imunodéficiente doit être utilisée afin d'éviter le rejet des cellules humaines injectées. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines dont le poids varie entre 15-25 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors de la greffe de cellules humaines.

Une injection de buprénorphine trente minutes avant, une anesthésie gazeuse de quarante-cinq minutes, un fémur entaillé pour y créer un défaut osseux, une plaque d'ostéosynthèse vissée, puis des injections d'analgésique deux fois par jour pendant trois jours : 32 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié d'entre eux reçoit en plus une greffe osseuse prélevée sur leur propre squelette. Le RNT annonce trente animaux dans sa rubrique consacrée à la réduction, quand le tableau des dommages attendus en déclare trente-deux. Tous sont tués, quatre semaines ou trois mois après la chirurgie, pour que leurs fémurs soient prélevés puis testés en traction et en flexion.

Objectifs

La distraction ostéogénique est une procédure permettant un allongement osseux par allongement d’un cal, qui est la substance fibreuse liant initialement les deux fragments d’une fracture, à la suite d’une ostéotomie, qui est le geste consistant en la réalisation de cette fracture. Cette technique est utilisée pour corriger entre autres des défauts de croissance osseuse ou pour combler les défauts osseux en traumatologie. Afin de faciliter l’activation de la distraction, nous avons développer un distracteur mandibulaire activé magnétiquement. Ce projet est un exemple parmi d'autres de dispositifs médicaux utilisant les propriétés mécaniques et magnétiques des aimants Néodyme. Ces dispositifs induisent la présence d'un champ magnétique statique de l'ordre du Tesla sur des tissus biologiques sains ou en cours de reconstruction, notamment, dans le cas qui nous concerne ici, sur de l'os. Cependant, si le champ statique généré par l’aimant intégré dans un dispositif se situe dans les limites normatives d’innocuité, des articles de la littérature ont observé qu’il pourrait avoir des effets bénéfiques sur le remodelage osseux. La plupart des études ont été menées sur des lignées cellulaires d'ostéoblastes. D'un point de vue macroscopique, des études ont montré que la densité des os augmente en présence de champs magnétiques à tel point qu'un usage thérapeutique est envisagé. L’analyse des caractéristiques biomécaniques, histologiques et volumétriques d’os soumis à un champ magnétique statique permettra une meilleure compréhension et caractérisation de cet effet. Confirmer et identifier le mécanisme clair de cet effet, à savoir le rôle de l'intensité et de la topologie du champ, est la principale motivation du projet dont cette expérimentation animale fait partie. La greffe est une technique très répandue et simple pour traiter les pertes de substance osseuse. L’utilisation in vivo de greffon osseux soumis à un champ magnétique statique permettra d’analyser ces caractéristiques, en s’apparentant le plus à un cal osseux formé lors d’un procédé de distraction. Les fixateurs internes utilisés lors des temps opératoires intègreront ou non des systèmes d’aimants permanents afin d’étudier l’influence d’un champ magnétique statique sur la consolidation osseuse.

Bénéfices attendus

Le bénéfice montré sur une étude in vivo, évaluant l’effet de l’application d’un champ magnétique statique interne sur un greffon osseux protégé par un manchon périosté permet d’envisager le développement de nouveaux dispositifs utilisables en pratique clinique courante entraînant une amélioration de cicatrisation osseuse et donc diminuant le risque d’échec de procédure et le temps de convalescence. Cette recherche s’applique particulièrement à la reconstruction osseuse de patients fragiles ne pouvant bénéficier de procédés de reconstruction lourds (d’un point de vue chirurgical ou anesthésique) en leur proposant une solution alternative sûre et produisant un os de bonne qualité. Par ailleurs, la fabrication de plaques d’ostéosynthèse interne nouvelle génération magnétisées pourrait voir son utilité étendue dans toutes ostéosynthèses avec une accélération du processus de consolidation, même en l’absence de défect osseux.

Procédures

Chaque animal sera soumis une fois à une injection sous-cutanée (moins d'une minute) de buprénorphine 30 minutes avant l’anesthésie, à une anesthésie générale par isoflurane d’une durée de 45 minutes avec administration durant cette période d’une injection (moins d'une minute) sous-cutanée d’antibiotique type céphalosporine, à une intervention chirurgicale avec pour 14 rats la réalisation d’un défaut osseux non critique sur un fémur et pour 16 rats la réalisation d’un défaut osseux critique avec mise en place d’un greffon osseux autologue sur un fémur, et dans tous les cas une fixation par plaque d’ostéosynthèse interne. Au réveil de l’animal, il bénéficiera d’une injection de buprénorphine (moins d'une minute) à 6 heures de la chirurgie puis de manière bi-quotidienne durant les 3 jours post-opératoire. Des injections supplémentaires d’analgésique (moins d'une minute) de manière biquotidienne pourront être réalisés sur signes d’appels. Pour 14 rats, la mise à mort sera faite par une injection intrapéritonéale (moins d'une minute) à 4 semaines de la chirurgie, pour les 16 autres, la mise à mort sera faite par la même technique à 3 mois de la chirurgie. Les animaux seront manipulés quotidiennement afin de vérifier l’état de la cicatrice jusqu’à confirmation d’une bonne cicatrisation et seront pesés trois fois par semaine jusqu’au sacrifice.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse par isoflurane, une intervention chirurgicale, une injection sous-cutanée d’antibiotique et une injection d’analgésique 30 minutes avant l’intervention, une injection d’analgésique à 6h de la chirurgie et de manière biquotidienne sur les trois jours post-opératoire ainsi qu’une mise à mort médicamenteuse par injection intra-péritonéale. En cas de signes de douleurs, les animaux pourront être soumis à de nouvelles injections d’analgésiques dans les jours suivants. La manipulation des animaux pour leur contrôle clinique peut générer un stress bien que celui-ci soit minime. L’intervention chirurgicale avec défaut osseux stabilisé par ostéosynthèse interne peut induire un stress et entrainer l'apparition d'une légère boiterie, bien que la mise en charge immédiate soit recommandée. La cicatrisation cutanée peut être responsable de démangeaison ou de douleur en cas d’inflammation locale.

Devenir

Pour évaluer l'intérêt de la présence d'un champ magnétique statique dans la réparation osseuse, les os doivent être prélevés, dans ce cas les fémurs, et les animaux mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives in vitro ne permettent pas l’analyse des caractéristiques structurelles mécaniques par des tests biomécaniques de traction et de flexion. Elles ne rendent pas compte non plus des modifications osseuses de l’architecture histologique et volumétriques en condition réel avec présence d’inflammation à la suite d’une intervention chirurgicale et de contrainte de pression par remise en charge. L’utilisation des animaux est nécessaire pour cette étude car il est impossible de vérifier in vitro ou par d’autres moyens nos hypothèses. Seuls les prélèvements osseux sur animaux (analyse ex vivo) nous permettront d’étudier simultanément l’effet du champ magnétique sur l’architecture et la mécanique osseuse. Le recours à un modèle animal est indispensable afin d’évaluer les effets du champs magnétiques sur la consolidation osseuse.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Leur nombre a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires à l’étude comparative des deux techniques. L’analyse de la littérature nous a permis de définir u nombre d’animaux réduit mais suffisant (n=30 : 14 pour la phase 1 et 16 pour la phase 2) de telle sorte à exploiter statistiquement les résultats obtenus avec les différents outils d’analyses (microCT, test mécanique, examen histologique). La comparaison des valeurs moyennes et des déviations standards obtenues pour chaque paramètre (microstructural, spectral…) fera l’objet de tests statistiques.

Raffinement

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale. L'anesthésie sera gazeuse avec une induction et un entretien par isoflurane. Une dose d’antalgique est administrée 30 minutes avant la chirurgie en sous cutanée renouvelé ensuite 6 heures après le réveil et de manière bi-quotidienne sur les trois jours post-opératoire. L’animal sera placé dans une enceinte chauffée et surveillé jusqu’à son réveil. Le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs assureront une surveillance quotidienne. De la nourriture gélifiée sera placée dans la cage des rats en post-chirurgie pour faciliter la prise alimentaire. Pour éviter les potentiels points limites (perte de poids>20%), les rats seront suivis quotidiennement par la mesure de la prise alimentaire et la mesure du poids corporel sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi). S’il y a apparition de points limites, les mesures décidées seront immédiatement mises en œuvre.

Choix des espèces

Le modèle du rat est bien décrit dans la littérature comme le modèle de choix en première intention pour les études animales visant à évaluer la consolidation et la ré ossification des défauts critiques osseux. Les procédures expérimentales sont bien codifiées et maîtrisées au laboratoire. Ces raisons justifient pleinement le choix de ce modèle. Les animaux utilisés seront utilisés à 10-12 semaines.

6 539 souris, dont des immunodéprimées, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une tumeur pancréatique ou hépatique implantée sous la peau ou directement dans l'organe, puis un médicament radioactif ou une séance de radiothérapie externe, des prises de sang et des examens d'imagerie allant jusqu'à une heure de PET-CT ou une heure trente d'IRM. Le bénéfice annoncé, identifier des marqueurs prédisant quels patients répondront à ces radiothérapies, reste entier à démontrer. Sur la réduction, le porteur écrit que le nombre d'animaux sera "limité au strict nécessaire" et que leur bien-être sera "une priorité", sans avancer le moindre calcul justifiant les 6 539 souris.

Objectifs

Les avancées récentes en cancérologie ont considérablement amélioré les options de traitement, notamment en radiothérapie. Parmi les techniques utilisées, il y a la radiothérapie externe, qui cible les tumeurs à l'aide de rayons et la radiothérapie interne, qui consiste à injecter des substances radioactives se fixant directement sur les cellules tumorales. L'objectif principal de ce projet, qui se déroulera sur 2 sites de recherche différents (EU1 et EU2), est d'identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse aux radiothérapies dans des modèles animaux de cancers pancréatique et hépatique. Actuellement, l'absence de biomarqueurs fiables pour évaluer l'efficacité et la toxicité de ces traitements empêche de personnaliser les soins oncologiques. Ce projet vise à relier des marqueurs biologiques à la réponse tumorale et aux effets secondaires des traitements, afin d'adapter ces approches thérapeutiques en clinique. L'utilisation de modèles animaux est essentielle pour se rapprocher des conditions humaines. De plus, nos techniques d'imagerie permettront de suivre l'évolution des biomarqueurs d'intérêt sur le long terme, sans avoir à euthanasier les animaux à chaque étape. Ces outils aideront à identifier des biomarqueurs prédictifs la réponse aux traitements en milieu clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider de nouveaux biomarqueurs d’imagerie prédictifs pour mieux identifier les patients susceptibles de bénéficier de la Radiothérapie externe ou de nouvelles approches en Radiothérapie Interne Vectorisée, tout en permettant une évaluation rapide de l’efficacité des traitements.

Procédures

Dans ce projet, des tumeurs pancréatiques et hépatiques seront implantées chez des souris, soit sous la peau (1 minute), soit directement dans l'organe (4 minutes), après anesthésie gazeuse (5 minutes). Certaines souris recevront un médicament radioactif par injection (20 secondes), tandis que d'autres auront un traitement de radiothérapie externe (4 minutes), également sous anesthésie chimique par voie intrapéritonéale (15 secondes). Des prises de sang (15 secondes) seront effectuées pour vérifier l'impact des traitements sur le sang, le foie et les reins. Une partie des souris sera utilisée pour tester l'efficacité des différents traitements, et une autre pour étudier par imagerie des marqueurs biologiques. L’imagerie PET-CT sera réalisée au sein de l’EU1 (1 heure maximum), l’imagerie IRM sera réalisée au sein de l’EU2 (1h30 maximum). En outre, certaines souris permettront de mesurer la répartition du médicament dans différents organe après euthanasie. La croissance des tumeurs sera suivie minutieusement et évaluée deux fois par semaine par des techniques n'induisant pas de nuisances.

Impact sur les animaux

On peut s'attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux. La douleur associée aux injections intrapéritonéales, intratumorales et intraveineuses est équivalente à celle d'une piqüre avec une aiguille. De plus, la douleur générée par les prélèvements sanguins, l'implantation des cellules tumorales sera soigneusement contrôlée. Le suivi du développement tumoral, avec des mesures et observations régulières, garantira que leur augmentation de volume n’entraine pas de souffrance ou de difficulté pour la locomotion. Si nécessaire, des médicaments anti douleurs seront administrés.

Devenir

Les souris seront toutes euthanasiées en fin de procédure expérimentales ou plus précocement sur la base de critères éthiques

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisés en laboratoire pour évaluer la cytotoxicité des traitements ainsi que leur impact sur la survie et la prolifération des cellules tumorales. Ces essais ont confirmé l’efficacité des radiopharmaceutiques et des modalités de traitement dans un environnement contrôlé. Ils ont également fourni des informations clés sur les mécanismes d’action des traitements et leurs effets sur les cellules tumorales ainsi que sur les fibroblastes associés au cancer. Cependant, malgré la richesse de ces résultats, il est indispensable de passer à des modèles in vivo, car les tests in vitro ne peuvent pas reproduire la complexité du milieu tumoral ni permettre l'évaluation de l’efficacité thérapeutique par imagerie ou la recherche de biomarqueurs prédictifs dans un contexte vivant. Ainsi, les protocoles qui seront utilisés in vivo reposent directement sur les résultats obtenus lors des tests in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Grâce à des techniques d'imagerie non invasive, nous pourrons suivre l'évolution des traitements sans avoir à euthanasier les animaux à chaque étape. Les effets des traitements seront suivis de près pour observer l'évolution des tumeurs et comprendre les effets de chacun des traitements. Tout au long du projet, le bien-être des animaux sera une priorité.

Raffinement

Afin de limiter la douleur et le stress des animaux, nous avons établi des point limites gradés, précis et adaptés pour toutes les procédures mises en oeuvre au cours de ce projet. Si les animaux atteignent ces points limites, cela constitue un critère d’arrêt de l’expérimentation et les animaux seront euthanasiés. Une surveillance minutieuse des animaux sera réalisée (suivi journalier du poids, du volume tumoral et du comportement) afin réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux. En cas de douleur, un traitement antidouleur adapté sera donné. Concernant l’enrichissement du milieu, les souris disposent de carrés en cellulose pour la formation d’un nid commun confortable, de baguettes en bois qu’elles peuvent ronger. En cas d’isolement forcé d’une souris dans une cage, un abri supplémentaire sera également fourni. Certains animaux utilisés dans ce projet n’ont quasiment pas de système immunitaire, ils seront donc hébergés dans des conditions sanitaires strictes. Les animaux seront transportés par un transporteur spécialisé, dans des boîtes de transport ventilées, avec de la litière, de l’hydrogel et de la nourriture. Le trajet sera court et ne dépassera pas 30 minutes pour limiter leur stress.

Choix des espèces

La souris est un mammifère suffisamment proche de l’espèce humaine d’un point de vue physiologique et la souris immunodéprimée est un bon modèle pour l’étude de la cancérologie humaine. Les animaux, âgés de 5 semaines, seront utilisés après une période d’acclimatation d’une semaine après la réception. Ils seront alors âgés de 6 semaines, âge où l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une bonne homogénéité de réponse.