Recherche appliquée
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Mise en place et caractérisation d’un biomarqueur d’imagerie d’ischémie-reperfusion cérébrale et IDENTIFICATION DES CIRCUITS CÉRÉBRAUX DE LA NOCICEPTION POST-AVC chez le Primate Non-Humain (PNH) EU (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
12 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chacun subit une occlusion de l'artère cérébrale moyenne qui provoque un AVC et une perte des capacités motrices et cognitives, suivie de plusieurs jours de confinement, puis des séances d'imagerie TEP, IRM et EEG, des prélèvements de sang répétés et des stimulations thermiques allant jusqu'à 49 °C. L'apprentissage d'une tâche alimentaire s'étale sur quatre mois et demi sous contrôle de la quantité d'eau donnée, la ration étant ajustée aux performances de l'animal. Le porteur reprend d'une étude antérieure un taux de mortalité de 18 % lié à l'occlusion, prévoit deux à quatre animaux supplémentaires pour l'absorber, et affirme que le recours au primate est "essentiel" pour valider une inclinaison de la tête à 15° avant l'essai chez l'humain.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) est un déficit neurologique soudain causé par un caillot ou une hémorragie cérébrale. Le traitement le plus récent de l'AVC ischémique est la thrombectomie, visant à retirer l’occlusion par une intervention endovasculaire pour restaurer l'apport sanguin cérébral. L’étendue de la pénombre ischémique, la zone cérébrale affectée par l’infarctus, est un facteur déterminant de l'issue de l'AVC. Sauver la pénombre est crucial pour limiter les séquelles graves. Notre projet a pour objectif de valider la sécurité de la procédure HDT15°, qui consiste à incliner de 15° le corps et la tête du sujet pendant l’occlusion, pour augmenter l’apport sanguin vers la pénombre par les vaisseaux collatéraux. Cette approche, déjà validée chez le rongeur, doit être testée chez le primate avant un essai clinique. HDT15° pourrait réduire les risques de décès ou de handicaps graves. La mesure du métabolisme de l'oxygène cérébral (CMRO2) reflète l’état de la pénombre ischémique et peut servir de biomarqueur pour évaluer l'atteinte cérébrale et prédire la récupération post-AVC. Ce projet vise à valider l’utilisation de CMRO2 mesuré par IRM dans la phase aiguë de l'AVC, et à évaluer sa valeur prédictive pour la récupération. Des analyses corrélatives seront menées entre les déficits moteurs observés chez l'animal (par exemple, une tâche de prise alimentaire nécessitant dextérité) et les marqueurs d’activité cérébrale dans les zones corticales et sous-corticales afin de corréler l’intensité des déficits et la vitesse de récupération. CE MODÈLE ANIMAL UNIQUE A DÉJÀ ÉTÉ VALIDÉ POUR ÉTUDIER L’IMPACT DE L’AVC SUR LA RÉCUPÉRATION FONCTIONNELLE, QUI S’ACCOMPAGNE SOUVENT DE DOULEUR CHRONIQUE (20 % DES CAS CHEZ L’HOMME). C'EST POURQUOI NOUS DEMANDONS UN AMENDEMENT À NOTRE PROTOCOLE POUR AJOUTER UNE PROCÉDURE SUPPLÉMENTAIRE POUR ÉVALUER CE RISQUE. EN OUTRE, LA DÉCOUVERTE DE LIENS ENTRE L’ACTIVITÉ CÉRÉBRALE OBSERVÉE À LA SURFACE DU CORTEX VIA EEG ET LES MODIFICATIONS DE L’ACTIVITÉ SOUS-CORTICALE LIÉES À LA NOCICEPTION (MESURÉES PAR IRM FONCTIONNELLE ET IMAGERIE TEP) OFFRE DES INFORMATIONS PRÉCIEUSES SUR L’EFFET DES AGENTS PHARMACOLOGIQUES, COMME LE FENTANYL, QUI PEUVENT INDUIRE DES EFFETS ANALGÉSIQUES MAIS AUSSI INDÉSIRABLES. CETTE APPROCHE EXPÉRIMENTALE PERMETTRA D'ÉTUDIER DES MOLÉCULES DE REMPLACEMENT POTENTIELLES POUR TRAITER LA DOULEUR CHRONIQUE POST-AVC. CE PROJET SE DÉROULE DANS DEUX EU DIFFÉRENTS, L'UE1 POUR LE COMPORTEMENT ET L’UE2 POUR L’IMAGERIE.
Bénéfices attendus
Ce projet est conçu pour répondre à des questions en lien avec des problématiques cliniques, mais aussi pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et l’importance de la reperfusion dans la compensation et la récupération post-AVC. Ainsi, notre projet va permettre de recueillir des informations inédites concernant la procédure de l’HDT15°, un traitement non pharmacologique de première intention pour améliorer la récupération de nombreux patients atteints d’AVC. Une meilleure compréhension des mécanismes de compensation grâce à une imagerie par CMRO2 (consommation de l’oxygène) ouvrira certainement une meilleure prise en charge thérapeutique de ces patients, avec une approche de plus en plus individualisée. En combinant différents types d’imagerie, nous allons avoir l’opportunité de caractériser les marqueurs d’inflammation et de comprendre comment ces zones lésées peuvent compenser à travers l’utilisation d’autres circuits cérébraux. Cette compensation ayant lieu dans d’autres pathologies comme le coma, nos résultats seront donc également d’intérêt plus général. Afin d'être largement disponible pour une utilisation clinique dans les maladies cérébro-vasculaires, LES BIOMARQUEURS D’IMAGERIE CÉRÉBRALE QUI PERMETTENT DE PRÉDIRE LA RÉCUPERATION FONCTIONNELLE POST-AVC SERONT INTÉGRÉS DANS LES LOGICIELS PRODUITS PAR OLEA SPHÈRE ET AINSI OPTIMISERAIT L’AIDE AU DIAGNOSTIC EN SOINS INTENSIFS. L’AJOUT DE LA DEUXIÈME PROCÉDURE AVEC L’UTILISATION DE L’EEG POUR DÉTERMINER A LA SURFACE DU CRANE DES MODIFICATIONS DES CIRCUITS DE LA NOCICEPTION QUI PEUVENT ENTRAINER DES DOULEURS CHRONIQUES EST UN BÉNÉFICE MAJEUR APPORTÉ PAR L’AMENDEMENT QUE NOUS AVONS FAIT A CE PROJET. EN EFFET, LA DÉCOUVERTE DE LIENS CORRÉLATIFS ENTRE LES SIGNAUX EEG ET DES ANOMALIES D’ACTIVITÉS DES CIRCUITS DE LA NOCICEPTION PERMETTRA DE MIEUX ÉVALUER ET TRAITER CE SYMPTOME DES DOULEURS CHRONIQUES SURVENANT A DISTANCE DE L’AVC ET QUI CAUSE DES PROBLÈMES IMPORTANTS DE PRISES EN CHARGES DES PATIENTS AUSSI BIEN EN CLINIQUE HUMAINE QUE VÉTÉRINAIRE. NOUS POURRONS AINSI DÉTERMINER L’IMPACT D’AGENTS PHARMACOLOGIQUES POUVANT INDUIRE DES EFFETS ANALGÉSIQUES, COMME LE FENTANYL OU D’AUTRES MOLÉCULES EN DÉVELOPPEMENT.
Procédures
Une légère anesthésie sera réalisée pour poser le collier des animaux (sur le site EU1 : 1 heure). L’apprentissage et la réalisation de la tache alimentaire se fera sous un contrôle hydrique (SITE EU1: 4 mois et 15 jours). En fonction des performances de l'animal et de son apport hydrique venant des aliments obtenus dans la tâche, la quantité d'eau dans la bouteille sera ajustée pour donner un apport hydrique constant. Un apport nutritionnel complémentaire, composée de croquettes primates et légumes, sera dispensé dans la cage après chaque séance et sera pris en compte dans l’apport hydrique quotidien. Les jours de repos (week-end), les animaux auront un accès libre jusqu’au dimanche, ou l’apport hydrique de référence pour chaque animal sera repris. De plus, les animaux seront exposés à des stimuli nociceptifs (stimulation thermique) et somesthésiques (air puff). Les imageries multimodales TEP-IRMf-EEG seront réalisées (SITE EU2: 1/2 journée). Des imageries seront réalisées pour évaluer les lésions cérébrales et évaluer la valeur prédictive du CMRO2 ou de l’intensité du phénomène d’inflammation mesuré par IRM de diffusion ou imagerie TEP (SITE EU2: 1/2 journée par imagerie). Des prélèvements de sang seront effectués sur tous les animaux, lors des étapes d’imagerie sous anesthésie. Ces prélèvements de sang seront plus nombreux lors de l’étape d’occlusion-reperfusion (SITE EU2). Finalement un dernier prélèvement sanguin sera effectué avant l'euthanasie scientifique de l’animal (SITE EU1). A la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés par injection intraveineuse létale d’un agent euthanasiant vétérinaire suite à une sédation a la kétamine (SITE EU1).
Impact sur les animaux
La partie habituation/entraînement du projet peut induire un léger stress à l’animal au tout début de cette étape mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes. La partie du projet impliquant une intervention d’occlusion/reperfusion (étape 4) constitue une source potentielle de nuisances importantes. En effet l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, va provoquer des lésions cérébrales dans une zone localisée du cerveau. Ces lésions impliquent une perte des capacités motrices et cognitives de l’animal en post-opératoire, qui implique un isolement et un confinement de l’animal durant quelques jours, jusqu’à la récupération quasi-totale de sa motricité. CETTE CHIRURGIE SERA EFFECTUÉE LE MATIN AFIN DE POUVOIR SUIVRE L’ÉTAT DE REVEIL DE L’ANIMAL. SON ETAT SERA SURVEILLE TOUS LES JOURS AINSI QUE LES WEEK-ENDS ET EVALUE VIA DES GRILLES DE SCORE PAR L’EXPÉRIMENTATEUR. Une étude précédente utilisant ce même modèle d’AVC chez le macaque (Debatisse et al. 2021) a montré que la phase aigüe de l’AVC est la plus critique en termes d’effets indésirables sur les animaux (18% de risque de mortalité estimé). Une surveillance accrue des animaux sera donc réalisée lors de cette phase. Cette approche peut aussi induire des micro-accidents vasculaires par augmentation de la pression sanguine et de la rupture des vaisseaux cérébraux. C’est pour mesurer les risques de produire des effets indésirables, découlant de ces potentiels accidents vasculaires induit par l’approche thérapeutique testée qu’il est essentiel de valider cette approche thérapeutique de reperfusion. C’EST AUSSI POUR CELA QUE NOUS AVONS FAIT UN AMENDEMENT À CE PROTOCOLE POUR ÉVALUER PAR IMAGERIE TEP-IRM-EEG, L’EXISTENCE D’UNE POTENTIELLE DOULEUR CHRONIQUE DÉCOULANT DE L’AVC Les parties de l’étude intégrant la phase d’entraînement et les examens d’imagerie sont considérés légères et modérés tandis que l’intervention d’occlusion/reperfusion qui présente des risques de déficits lésionnels étant classée en procédure plutôt sévère, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure sévère pour tous les animaux. AUSSI, LES ANIMAUX PEUVENT DÉVELOPPER DES DOULEURS SUITE A L’INTERVENTION CHIRURGICALE VISANT A INDUIRE UN AVC. EN REVANCHE, LES STIMULI NOCICEPTIFS (STIMULATION THERMIQUE) INDUITS AUX ANIMAUX NE PEUVENT PAS INDUIRE DE FORTE DOULEUR NI DE BRULURE CAR LES TEMPERATURES NE DÉPASSERONT PAS 49°C.
Devenir
LES 6 PREMIERS ANIMAUX SERONT EUTHANASIES A J+45 POST-OCCLUSION TANDIS QUE LES 4 A 6 AUTRES ANIMAUX SERONT EUTHANASIES APRES AVOIR SUIVIS LES IMAGERIES TEP-IRM-EEG. L'EUTHANASIE DE TOUS LES ANIMAUX EN FIN DE PROTOCOLE EST ESSENTIELLE POUR VALIDER, AU NIVEAU CELLULAIRE, LES MÉCANISMES DES OUTILS D'IMAGERIE DÉVELOPPÉS DANS CE PROJET. Seulement des approches histologiques au niveau cellulaire, sur du tissu cérébral post-mortem, peuvent nous permettre de valider ces outils IRM de la CMRO2 ainsi que des processus inflammatoires et dégénératifs observés et mesurés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est nécessaire pour valider l’efficacité et l’innocuité d’un nouveau traitement de l’AVC ischémique. En effet, les alternatives non animales (in silico, in vitro ou ex vivo) ne permettent pas d’étudier la sécurité de l'angulation de la tête et du corps à 15° lors de l'occlusion, les interactions entre les déficits moteurs observés et les marqueurs cérébraux associés à l’intensité des déficits ou de la vitesse de récupération. Avant de tester cette procédure chez l’Homme, il est donc nécessaire de l’évaluer avec un modèle animal pertinent. Il est donc judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’Homme dans le cadre de l’AVC ischémique. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie TEP/IRM avec des analyses comportementales. Ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Ainsi, les informations obtenues sur le PNH seront plus facilement transposables et applicable à l’humain qui subit une perte de fonction similaire découlant d’un AVC. Enfin, le macaque cynomolgus est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale.
Réduction
Le nombre d’animaux minimum permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations mesurées grâce à un calcul de puissance est de 8 animaux. Au total, nous prévoyons 12 animaux dans le protocole. Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux pour réaliser des corrélations (n=8) chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2 à 4). En effet, en nous basant sur la précédente étude ayant utilisée ce modèle PNH d’AVC par occlusion de l’artère cérébrale moyenne, nous estimons à 18% le taux possible de mortalité suite à la procédure d’AVC. Si le nombre d’animaux atteignant un point limite s’avérait inférieur à notre prévision, dû probablement à l’effet bénéfique de l'angulation de la tête et du corps de 15° sur la reperfusion cérébrale, nous limiterons le nombre total d’animaux au nombre nous donnant une puissance statistique suffisante. Si nous réussissons à mener nos 8 premiers animaux à pouvoir faire toutes les étapes du protocole et que nous obtenons une puissance statistique suffisante, nous nous gardons la possibilité de réduire le nombre prévu de 12 à 8 animaux.
Raffinement
Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Par exemple, l’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’ischémie-reperfusion cérébrale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères, chaque sujet étant son propre contrôle. De plus, le fait que nos deux principales mesures d’imageries, l’IRM de la CMRO2 et la TEP, seront réalisées simultanément grâce à la caméra hybride, nous pourrons limiter le nombre d’examens par animaux dans cette étude. Dès leur arrivée et tout au long de l’étude, en dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés en groupes sociaux (4 ou 2), lorsque possible. Pour maximiser les effets bénéfiques de l’environnement, même durant les périodes post-AVC, les animaux seront toujours maintenus en hébergement par paire, pour limiter les effets délétères de l’isolement. Les animaux disposeront d’une quantité d’eau de boisson contrôlée et d’une quantité quotidienne d’aliment adaptée à leur poids.
Choix des espèces
L’organisation du système nerveux central est très différente selon les espèces, aussi bien au niveau macroscopique (taille des différentes structures) qu’au niveau moléculaire. Ce projet sera donc réalisé chez le macaque cynomolgus, du fait de sa proximité phylogénétique avec l’Homme et en particulier en raison des similitudes du cerveau et des comportements entre ces deux espèces. Les animaux utilisés seront adolescents car ce sont des animaux qui n’ont jamais été utilisés dans d’autres études.
Etude de l’effet anti-hyperalgésique d’une molécule dans un modèle de neuropathie chimio-induites par injections répétées de Paclitaxel chez le rat suivi en Pression de patte
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Injectés de paclitaxel de façon répétée jusqu'à développer une neuropathie, 1 950 rats sont ensuite soumis à un test de pression de patte, jusqu'à six mesures par jour, trois jours par semaine sur trois semaines. Ils reçoivent en parallèle les composés à évaluer, parfois plusieurs fois dans la journée, et jusqu'à vingt-cinq prélèvements de sang en théorie. 1 625 d'entre eux relèvent d'un niveau de souffrance sévère, avec une allodynie tactile, une constipation, une alopécie et une déshydratation possibles, et tous sont tués à la fin, le porteur écrivant qu'un anticancéreux administré de façon systémique rend impossible d'évaluer l'impact réel sur l'animal. Le test s'arrête à une valeur de cut-off, la pression maximale que le laboratoire s'autorise à exercer sur la patte.
Objectifs
Les patients atteints de tumeur solide (sein, ovaire, poumon...) sont souvent traités avec une chimiothérapie à base de paclitaxel. Le paclitaxel (Taxol) est un agent anti-néoplasique issus de l'écorce d'un arbre (Taxus brevifolia), qui entraine le développement d’une neuropathie périphérique chez 50-90% des patients dès une injection de paclitaxel à forte dose ou après plusieurs injections à plus faibles doses. La laboratoire a mis au point un modèle de neuropathie chimioinduite par injections répétées de paclitaxel. L’allodynie mécanique induite par ce modèle a été mesurée en Pression de patte et la réversion par des antalgiques de référence a été réalisée. Ce modèle doit permettre l’évaluation des propriétés analgésiques de candidats médicaments. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients souffrant de douleurs neuropathiques et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.
Bénéfices attendus
Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés sur les mécanismes de ces douleurs neuropathiques causées par l’administration de paclitaxel. Actuellement seul des antidépresseurs et des opiacés sont prescrits pour soulager les patients. Ces molécules ne sont pas efficaces à long terme et présentent de nombreux effets secondaires. Le but de ce projet est donc de permettre une meilleure prise en charge des neuropathies due à l’administration de paclitaxel chez les patients atteints de cancer. A plus court terme, la publication de posters/articles scientifiques pour mettre en évidence certains résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
Induction du modèle : injection afin d’induire le modèle. Tests : stimulation mécanique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours, pour un maximum de 3 tests par semaine sur 3 semaines différentes. Les animaux recevront des traitements de composés par injection. Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les limites de volume et de fréquence imposées par les recommandations en vigueur (maximum théorique :25 prélèvements).
Impact sur les animaux
Ce modèle entraine le développement d’une allodynie tactile (nuisance modérée) mais peut également entrainer une non prise de poids, de la constipation, de l’alopécie, de la piloérection et de la déshydratation (nuisances modérées à sévères). Les nuisances liées aux tests sont liées à l’application d’un stimulus douloureux (mécanique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal. Pour la pression de patte,les tests sont pratiqués avec les animaux en contention pour des durées d’environ une minute par rat par point de cinétique (nuisance légère). Le test peut être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limite de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. (nuisance légère). De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle). Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites. Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang unique ou répétés afin d’évaluer la pharmacocinétique du composé (nuisances légères).
Devenir
Les animaux sont induits de manière systémique par administration d’un agent anticancéreux. Il peut donc avoir un impact sur l’ensemble des mécanismes biologiques de l’animal. Il est donc impossible de déterminer l’impact réel. Pour cette raison, il n’est pas concevable de les replacer. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP(International Association for the Study of Pain), la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données bibliographiques disponibles et les données de la mise au point du modèle. un test statistique sera réalisé en fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale),suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation afin de limiter leur stress. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie) est réalisé tous les jours jusque J10 après la première induction puis une fois par semaine. Des croquettes sont déposés dans le fond de la cage pour stimuler la prise alimentaire des animaux. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimuli plus douloureux que nécessaire. Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, injectionde NaCl ou de Glucose en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre. Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumés en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration de la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP (International Association for the Study of Pain) est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Des rats pesants entre 200-250g pour les males et 150-200g pour les femelles, le jour de l’induction vont être utilisés. Cette gamme de poids correspond à un âge de cinq à six semaines. Ceci a été choisi en accord avec les données bibliographiques sur lesquels nous nous sommes basées pour choisir nos critères d’induction.
Prélèvements de sang sur poules à statut sanitaire spécifique pour fourniture d’échantillons sanguins
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Prélevées sur le troupeau reproducteur d'un élevage exempt d'organismes pathogènes spécifiques, 1 250 poules subissent chacune une prise de sang unique, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le prélèvement se fait sur animal vigile, au sinus occipital ou à la veine de l'aile, en cinq minutes au plus, avec un risque d'hématome, d'hémorragie ou de picage. Le sang part vers des laboratoires qui en isolent des globules rouges pour titrer des virus, des cellules immunitaires pour des tests in vitro, ou en tirent du sérum pour faire pousser des bactéries. Le porteur souligne que ces poules ne sont pas élevées uniquement pour fournir du sang et qu'elles retournent toutes au troupeau après le prélèvement.
Objectifs
Dans le cadre de leurs recherches, les scientifiques ont régulièrement besoin de sang de poulet exempt d'organismes pathogènes spécifiques (EOPS) pour entre autres : isoler des cellules immunitaires comme les leucocytes pour des tests in vitro, iIsoler des globules rouges et réaliser des tests d’hémagglutination pour le titrage de virus ou encore produire du sérum pour réaliser des études de croissance bactérienne. Un maximum de 250 prélèvements sont réalisés par an. Chaque série de prélèvements concerne au maximum 20 individus. Chaque animal n'est concerné que par un prélèvement sanguin sans répétition.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de fournir des échantillons de sang de volailles EOPS nécessaires aux études portant sur la réponse immunitaire (isolement de cellules immunitaires), aux études de certains virus (titration des virus grâce des tests d’hémagglutination) et la production de sérum.
Procédures
Prélèvement de sang sur animaux vigiles. Chaque animal ne sera sujet qu'à un prélèvement de sang sans répétition. La durée du prélèvement n'excède pas 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pourraient être liés à une réaction suite au prélèvement de sang : hématome, hémorragie, réaction inflammatoire locale, voire un phénomène d’autopicage (si la prise de sang est réalisée à la veine alaire).
Devenir
Les animaux prélevés faisant partie du troupeau reproducteur, tous les animaux sont maintenus dans l’élevage après prélèvement.
Remplacement
L’objet de la demande est la fourniture de sang de volaille à statut EOPS (Exempts d'organismes pathogènes spécifiques) comme échantillon biologique, le recours à l’animal est donc nécessaire.
Réduction
Les prélèvements sont réalisés sur des animaux du troupeau reproducteur de l’élevage EOPS : il s’agit donc d’animaux destinés au renouvellement de l'élevage et à la fourniture d’animaux expérimentaux. De ce fait, les animaux ne sont pas produits et utilisés exclusivement pour la fourniture de sang. De plus, le nombre d’animaux prélevés est adapté au plus juste en fonction du nombre de prélèvements et volume de sang requis.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe et bénéficient d'un enrichissement physique : perchoir, nid et bolduc suspendu dans chaque cage. 5 nids sont à disposition des poules pour la ponte. A l’issue de chaque prélèvement, une attention particulière est portée au comportement des animaux afin de détecter d’éventuels signes de souffrance. Un renforcement positif par récompense alimentaire est envisagé (petits vers secs par exemple). Il n’y a pas de désinfection de la zone de prélèvement (pour éviter toutes projections ou contacts avec les yeux). Il n’y a pas de point de compression au sinus occipital (un léger point de compression est réalisé lorsque le sang est prélevé à la veine allaire). Les aiguilles ont une garde et sont donc adaptées pour un prélèvement au sinus occipital. Les prises de sang seront réalisées par 2 opérateurs auxquels les animaux sont habitués : l’un maintient l’animal par une légère contention et l’autre procède au prélèvement de sang. Qu’une prise de sang ne dure pas plus de 5 minutes et qu’elle est réalisée dans le calme.
Choix des espèces
Les besoins de sang concernent des tests in vitro ou des mises au point de méthode pour des recherches portant sur le modèle volaille. Animaux de production adultes : Les prélèvements sont réalisés sur des animaux adultes afin de pouvoir fournir le volume requis par les scientifiques. C'est également moins préjudiciable pour les animaux car le prélèvement est plus facile (animal de plus grande taille).
Etude de l’efficacité de traitements innovants pour traiter le syndrome hématologique radio-induit chez le primate non humain (PNH)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Pour tester une molécule censée limiter les dommages de la moelle osseuse après une irradiation de guerre ou d'accident nucléaire, 67 macaques à longue queue sont utilisés, dont 59 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chacun subit une irradiation corporelle totale sous anesthésie générale, trente jours d'administration quotidienne, jusqu'à seize ponctions de sang veineux et six ponctions de moelle osseuse en trois mois, chacune sous anesthésie. Le porteur indique qu'environ la moitié des animaux témoins, ceux qui ne reçoivent pas le traitement, devraient atteindre un point limite après des pétéchies, une anémie, des saignements digestifs et une anorexie. Les 59 macaques irradiés seront tués pour constituer une tissuthèque, les 8 autres, qui n'auront reçu que la molécule, pouvant être réutilisés dans d'autres protocoles après avis vétérinaire.
Objectifs
Dans un contexte de guerre nucléaire ou d’accident nucléaire majeur, l’exposition à une forte dose de rayonnement ionisant conduit notamment à des dommages de la moelle osseuse, qui produit les cellules sanguines. Ces atteintes sont parmi les premières causes de mortalité des victimes civiles comme militaires. En dépit des avancées des dernières décennies, le besoin d’une molécule capable de réduire ces effets et de mise en œuvre facilitée dans le contexte d’un afflux de nombreuses victimes demeure. Le but du présent projet est d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle molécule pour 1) réduire la gravité des dommages de la moëlle osseuse et 2) accroitre le taux de survie des victimes. Cette évaluation sera réalisée chez le primate non humain (PNH). En effet, le présent projet est mené en parallèle du développement clinique de cette molécule et il apportera les données d’efficacité qu’il n’est pas possible d’obtenir chez l’humain. Les résultats obtenus seront inclus dans le dossier d’enregistrement. Une étude de pharmacologique préliminaire a déjà été réalisée chez le PNH et ses résultats seront utilisés dans raffiner notre étude. Conformément aux recommandations européennes, l’évaluation de l’efficacité thérapeutique sera réalisée chez des modèles animaux mâles et femelles. Des molécules dérivées de la nouvelle molécule pourront éventuellement être testées en complément, dans le cadre d’études pilotes. Cette étude comportera 2 phases : • une phase d’efficacité pilote, réalisée étape par étape, sur de petits nombres d’animaux, • si la la phase pilote est concluante, une étude d’efficacité incluant suffisamment d’animaux pour permettre une analyse statistique robuste.
Bénéfices attendus
Valider un nouveau traitement des lésions de la moelle osseuse après une exposition à des radiations, en particulier dans les situations d'urgence où il y a un grand nombre de victimes. L'objectif est de trouver une méthode efficace pour traiter ces lésions le plus rapidement possible et améliorer les chances de guérison des personnes touchées.
Procédures
Irradiation corporelle totale unique sous anesthésie générale Administration quotidienne pendant 30 jours de traitements médicamenteux (médicamenteux (voie orale, sous-cutanée ou intraveineuse ; durée de chaque traitement : 10 minutes maximum). Une éventuelle implantation d’une chambre d’administration du traitement sous anesthésie générale. Durée de l’intervention 30 minutes. Suites possibles : réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 joursPonctions de sang veineux (16 ponctions maximum sur une durée de 3 mois) et de moelle osseuse (6 maximum sur une durée de 3 mois) sous anesthésie générale durant 30 à 45 minutes chacune.
Impact sur les animaux
Après l’irradiation, les animaux qui ne peuvent reconstituer leur hématopoïèse sont victimes de petits saignements visibles sur la peau sous la forme de pétéchies, conséquence du manque de plaquettes. La perte de sang correspondante provoque une anémie et une fatigue jusqu’à des difficultés de respiration, entre 10 et 20 jours après irradiation. Des troubles gastro-intestinaux tels que nausées, vomissements, diarrhées et saignements digestifs peuvent se produire. Une anorexie résultant en une faible perte de poids est possible, entre 10 et 40 jours après irradiation. Une atteinte des points limite est attendue chez environ la moitié des animaux témoins. L’administration des molécules peut causer un stress.. L’éventuelle chirurgie pour implanter une chambre d’administration du traitement peut induire une réaction locale au site d’incision -gonflement, suintement de la plaie), rarement : une hémorragie et/ou une infection. Les anesthésies peuvent induire une légère perte d’appétit dans les premières heures qui suivent, pouvant causer une déshydratation chez les animaux qui sera surveillée et compensée au besoin.
Devenir
Animaux irradiés : mise à mort pour analyse anatomopathogique et constitution d’une tissuthèque Animaux non irradiés : les animaux ayant reçu uniquement le traitement pourront être réutilisés dans d’autres protocoles après un avis vétérinaire favorable.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de modèles animaux pour réaliser ce projet. L’évaluation de l’efficacité d’une molécule pharmacologique capable de réduire la durée et la profondeur l’atteinte de la moelle osseuse radio-induite sévère chez l’humain nécessite une étude de la réponse intégrée à l’échelle de l’organisme entier. D’autant plus qu’en cas d’irradiation corporelle totale où d’autres tissus que le tissu hématopoïétique, notamment le système digestif, sont impliqués. Il est donc nécessaire d’utiliser un organisme entier présentant les caractéristiques physiologiques et immunologiques les plus proches de l’humain que possible. Le modèle expérimental primate non humain (macaque) répond à ces requis entrant pleinement dans le cadre de l’évaluation d’un traitement d’une « maladie » létale . Il reproduit de plus le caractère intrinsèquement hétérogène des dommages radio-induits observés après irradiations accidentelles, lié notamment à l’atténuation du rayonnement par l’épaisseur corporelle. Ce paramètre est fondamental pour tester la capacité d’une molécule à stimuler l’hématopoïèse résiduelle issue des zones relativement sous exposées.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire. L’étude préliminaire inclura les animaux de façon échelonnée, pour tirer parti des résultats des cohortes précédentes afin de minimiser le nombre d’animaux inclus. Dans la même optique de réduction, nous réaliserons une phase de preuve de concept avec un nombre réduit d’animaux par groupe (n=4 ou 5), avec des cohortes échelonnées. Cette phase sera considérée un jalon décisif pour la poursuite de l'étude. L’étude permettant une analyse statistique robuste, qui inclut un nombre plus important d’animaux par groupe (n=8), nécessaire pour démontrer l’efficacité de la molécule candidate, utilisée seule ou en combinaison, selon les recommandations des agences réglementaires, ne sera réalisée que si la preuve de concept est concluante. Le nombre d’animaux par groupe a été calculé pour permettre de mettre en évidence l’efficacité du traitement selon les méthodes statistiques en vigueur.
Raffinement
Les interventions et l’irradiation seront effectuées sur des animaux anesthésiés. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et des mesures seront réalisées à chaque anesthésie. Une grille de suivi clinique et biologique, basé sur notre expérience et sur la bibliographie, a été établi. Ce score pourra être adapté si besoin afin de suivre de plus près l’évolution clinique des animaux pour limiter au mieux la souffrance. Les traitements seront réalisés en première intention sur les animaux vigiles après un entrainement comportemental par conditionnement opérant de type click-training, faisant appel à la collaboration des animaux. Après l’éventuelle chirurgie pour implanter une chambre d’administration des traitements,une surveillance accrue sera réalisée pendant 15 jours avec une échographie de contrôle à J15 post implantation. En cas de douleurs, une analgésie sera mise en place. Suivi quotidien : • Suivi de l’état général des animaux vigiles (1x/j minimum, week-end compris). En cas de modification de comportement de l’animal ou de signe de souffrance, un signalement vétérinaire sera effectué. • Les animaux seront scorés chaque jour avec la grille précédemment établie avec les vétérinaires de l’installation. Cette grille a une valeur prédictive quant à la possible dégradation de l’animal. Si un PNH venait à atteindre un score limite, un vétérinaire et le directeur d’étude seront consultés immédiatement pour prendre une décision rapide quant au devenir de l’animal. • Si des atteintes inattendues surviennent ou si l’animal démontre une souffrance non anticipée, une analgésie sera mise en place si pertinente et un vétérinaire et le directeur d’étude seront également consultés immédiatement pour prendre une décision rapide quant au devenir de l’animal. Suivi lors des prélèvements : En plus du suivi clinique (poids, température), un suivi biologique complémentaire sera réalisé. Ce suivi sera réalisé à une fréquence plus rapprochée au début de l’étude puis progressivement espacée lorsque la période critique sera passée. Transport : les animaux seront transportés vigiles, par paire au minimum. Des jouets, de l’eau et de la nourriture seront à leur disposition. Hébergement : les animaux seront hébergés en accord avec la réglementation et bénéficieront d’un l’enrichissement multimodal : sensoriel, alimentaire, social et ludique (jouets fixes et mobiles).
Choix des espèces
Le macaque cynomolgus jeune adulte (2 à 8 ans), qui est notre modèle animal historique, a été retenu pour ce projet car : - Il présente des caractéristiques physiologiques, hématologiques et immunologiques proches de l’humain adulte. - Il permet de plus de par sa taille, son âge (hématopoïese mature non sénescente) et son épaisseur corporelle de reproduire le caractère hétérogène des irradiations accidentelles (gradient de dose et donc de dommage antéro-postérieur significatif) fondamental pour tester la capacité d’une molécule à stimuler l’hématopoïèse résiduelle post accidentelle.
Étude de la livraison au cerveau de deux composés utilisés comme traitement thérapeutique potentiel contre la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injectées dans la veine de la queue en état vigile, dans une boîte de contention, 85 souris reçoivent une dose unique d'un composé, tandis que 25 autres, porteuses d'un cathéter dans la veine jugulaire, en reçoivent matin et soir pendant quatre jours. Ces 110 souris subissent des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, avec un risque de lésions et d'inflammation au point d'injection. L'objet est de vérifier si deux composés bloquant l'action d'un peptide franchissent la barrière entre le sang et le cerveau, étape que le porteur qualifie d'"impérative" avant d'envisager un usage contre la maladie d'Alzheimer. Toutes sont tuées pour prélever cerveau, foie, reins et sang, et y doser le composé.
Objectifs
L'objectif de cette étude est de faire une première analyse préclinique pour optimiser la livraison de composés thérapeutiques dans le cerveau chez la souris. Deux composés ont été sélectionnés en amont comme bloquant l'action d'un peptide sécrété naturellement dans le cerveau en condition physiologique. Une étude scientifique a montré un impact direct de ce peptide sur la régulation de l'activité des synapses (points de connexion entre les neurones). De plus, des données obtenues par l'équipe montrent qu'une augmentation anormale des niveaux de ce peptide dans le cerveau de patients atteints de la maladie d'Alzheimer pourrait contribuer à la perte d'activité des synapses et de la mémoire, symptômes typiques de cette maladie. Enfin, il est possible que ce peptide soit impliqué dans d'autres maladies neurologiques comme la schizophrénie. Afin de prévenir cette action néfaste, nous avons criblé une banque de composés afin de bloquer son action à la synapse. Il est impératif aujourd'hui d'évaluer la capacité de ces composés à entrer dans le cerveau pour confirmer leur potentiel thérapeutique. Ce projet s'engagera à répondre aux questions scientifiques suivantes : 1. Déterminer si ces composés parviennent à traverser la barrière hémato-encéphalique avec succès. 2. Définir les doses et les temps de stabilité de ces composés après injection. 3. Analyser la dose et le temps de stabilité pour un traitement chronique (jusqu'à un maximum de 4 jours).
Bénéfices attendus
Dans le monde, on estime qu'il y a environ 50 millions de personnes atteintes de démence, dont la maladie d'Alzheimer est la forme la plus courante. Cette maladie impacte un tiers des personnes de plus de 80 ans. Ces chiffres sont cependant en augmentation en raison du vieillissement de la population. Il n'y a pour l'instant aucune solution thérapeutique permettant de soigner ces patients. Trouver de nouvelles solutions thérapeutiques est donc une priorité absolue de santé publique. Notre groupe se concentre sur un nouveau peptide associé à la maladie d'Alzheimer, mais aussi possiblement à d'autres maladies neurologiques (schizophrénie…), comme nouvelle cible thérapeutique. Les analyses de pharmacocinétique prévues dans ce projet vont être essentielles pour confirmer la livraison au cerveau des composés bloquant l'action du peptide étudié, et donc renforcer leur potentiel thérapeutique. Ces données précliniques seront précieuses en vue d'une application thérapeutique future chez l'homme.
Procédures
Des souris vigiles seront soumises à une seule administration aiguë d'un composé par injection intraveineuse au niveau de la queue (85 souris, 5 minutes de manipulation). Un autre groupe de 25 souris avec un cathéter placé au niveau de la veine jugulaire sera soumis à l'administration du composé le matin et le soir via le cathéter sur un maximum de 4 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une injection en intraveineuse à la veine caudale de la queue dans une boite à contention ce qui peut entrainer un stress et un inconfort ainsi que des lésions ou de l’inflammation sur le site d’injection. Une nuisance légère dûe à la contention de l'animal lors des injections via le cathéter est attendue.
Devenir
À la fin du traitement, nous procéderons à la mise à mort de l'animal et au prélèvement de ses organes (le cerveau, le foie, les reins, le sang) afin d'évaluer la concentration des composés injectés ainsi que ses caractéristiques pharmacocinétiques et sa capacité à traverser la barrière hémato-encéphalique.
Remplacement
Pour compléter les études in vitro et ex vivo précédemment réalisées dans notre laboratoire sur des neurones de souris, il est désormais nécessaire d'utiliser ce même modèle comme modèle animal. En effet, la souris est idéalement adaptée pour des analyses de pharmacocinétique, notamment pour une livraison dans le cerveau avec une barrière hématoencéphalique intacte. Malheureusement, pour ce type d'analyse pharmacocinétique, il est impossible de recourir à des méthodes alternatives pour remplacer l'utilisation d'animaux ou pour opter pour des animaux moins sensibles. Bien qu'il existe des modèles ex vivo dédiés à l'étude du passage de la barrière hémato-encephalique, ce type d'analyse de pharmacocinétique chez l'animal vivant est nécessaire comme pré-requis avant transfert de l'utilisation de ces composées chez l'homme. Cette étude chez la souris est donc capitale pour fournir les données essentielles in vivo en vue d'une application thérapeutique chez l'homme.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux à utiliser, nous nous baserons sur des études pilotes précédemment menées ex-vivo. Ces expériences, déjà réalisées dans notre laboratoire, ont permis d'identifier une dose optimale à administrer de manière directe et aiguë sur des neurones en culture et des tranches de cerveau de souris ex vivo. Nous sommes toutefois conscients que passer d'un modèle ex vivo, avec une administration directe sur le tissu et en aigu, à une étude in vivo présente des différences significatives. C'est pourquoi le calcul final des doses sera recalibré si besoin de façon à ce que le niveau de concentration passant du flux sanguin au cerveau soit comparable à celui obtenu lors des expériences ex vivo. Pour réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons essentiellement des mâles pour la première partie de l'étude pharmacocinétique. Après identification des doses et temps optimaux en injection aigue et chronique, nous validerons ces points aussi chez la femelle. Aussi, c'est dans l'optique de reduction d'animaux que nous séparons ce projet en 2 procédures, en espérant ne devoir utiliser que la procédure 1 si la stabilité des composés lors de livraison in vivo en aigu le permet. Enfin, nous avons regroupé les groupes 'contrôle' pour les mâles pour les deux procédures afin de minimiser le nombres d'animaux utilisés et nous avons estimé avec l'outil statistique prédictif g-power le nombre de souris nécessaire par groupe (5 souris) pour obtenir une puissance statistique suffisante (>80%) en se basant sur les analyses d'effets des composés obtenus ex vivo.
Raffinement
Nous nous sommes assurés de la non toxicité des composés à injecter en amont de cette étude. En effet, les études préliminaires réalisées in vitro et ex-vivo avec les composés à l'étude n'ont montré aucune toxicité sur des neurones en culture ou sur des tranches de cerveau, même après application à forte dose et à temps long (24h). D'autres composés de même profile (même famille de molécules) ont déjà été utilisés in vivo montrant qu'ils ne présentent pas d'effets secondaires notoires. Nous accorderons une attention particulière aux conditions d'hébergement, en plaçant les animaux 5 par cage. Ils auront accès à l'eau et nourriture, dans un environnement enrichi où la temperature et l'hydrometrie sont controlées. Un suivi régulier sera assuré par des opérateurs formés, et les animaux seront surveillés de manière à permettre, le cas échéant, la mise en œuvre de points limites précoces et adaptés. Si les données obtenues montrent que la souris devra subir des injections répétées pour obtenir un niveau suffisant des composés dans le cerveau, nous avons aussi proposé une livraison du composé sur plusieurs jours via un cathéter inséré dans la veine jugulaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris est dû au fait que toutes nos données ex-vivo ont été obtenues sur des neurones de souris. Cela permettra de calibrer du mieux possible les doses à utiliser in vivo. La souris possède un système vaculaire, une barrière hémato-encéphalique et un cerveau avec des propriétés très similaires à celles décrites chez l'humain. Nos données de pharmacocinétiques obtenues dans ce modèle seront donc très pertinentes comme pré-requis pour pouvoir ensuite transferer l'utilistation des composés chez l'homme. Pour réaliser notre étude, nous utiliserons des souris adultes d'environ 8 semaines (environ 24-28g chacune). L’utilisation des composés pourrait être à terme envisagée pour d’autres maladies liées à la dysfonction des synapses, notamment aussi des pathologies présentes chez le jeune adulte, en plus d'une utilisation potentielle pour la maladie d'Alzheimer. La barrière hémato-encéphalique étant moins poreuse chez le jeune adulte que chez les sujets âgés, il est préférable d’obtenir ces données de pharmacocinétique chez le jeune adulte comme passage ‘à minima’ des composés.
Humanisation des souris MISTRG
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Privées par construction génétique de l'essentiel de leur système immunitaire, 18 souris MISTRG reçoivent un système sanguin humain puis des cellules leucémiques humaines, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. L'injection dans le foie a lieu à deux jours de vie, suivie d'une injection lente dans la veine de la queue à douze semaines, de cinq injections abdominales hebdomadaires, de cinq anesthésies pour imagerie de trente minutes, de deux prises de sang et d'un prélèvement de moelle osseuse dans le fémur. Le porteur décrit une diminution d'activité, une perte de poids et l'apparition possible de tumeurs dans l'abdomen. Aucun animal n'est gardé au-delà de seize semaines de vie, les tests étant arrêtés avant que la leucémie ne tue les souris elle-même.
Objectifs
Notre laboratoire a obtenu une lignée de souris transgénique appelée MISTRG, qui ne rejette pas les cellules sanguines humaines du fait de sa déficience profonde du système immunitaire : les cellules sanguines humaines prolifèrent et survivent longtemps selon une reconstitution équilibrée qui imite parfaitement le sang humain, issu de donneur sain ou de patients. L’idée est de recréer un environnement humain dans la souris, où des cellules cancéreuses du sang (leucémiques) peuvent se développer, de façon à pouvoir étudier en situation physiologique. Ce modèle, une fois mis au point, nous servira à évaluer l’efficacité pré-clinique de nouvelles thérapies appelées immunothérapies. Toutes nos futures études seront basées sur les résultats de ce projet de mise au point. Nous souhaitons donc mettre au point cette humanisation de la souris avec l’injection d’un système sanguin humain et l’adjonction d’un cancer du sang.
Bénéfices attendus
Les cancers du sang échappent au contrôle du système immunitaire par divers mécanismes, dans un environnement qui comprend de nombreuses cellules : des cellules leucémiques, des cellules de l’immunité, du tissu osseux, des vaisseaux sanguins qui est très difficile à reproduire in vitro. Seules des souris génétiquement modifiées pour imiter le fonctionnement humain peuvent reproduire ces interactions complexes. Ce projet a pour but de créer un modèle pré-clinique de cancer du sang humain pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements pharmacologiques ou cellulaires mis au point au laboratoire et aussi mieux comprendre les mécanismes de résistance des cancers du sang. Ce modèle permettra de proposer des pistes pour de futurs traitements plus efficaces. Ces avancées sont cruciales pour développer des traitements sur mesure et améliorer les soins pour les patients.
Procédures
-Une injection rapide (1min) dans le foie chez les souriceaux de 2 jours d’âge -Une injection lente dans la veine de la queue à 12 semaines d’âge (5 à 10 min) - 5 injections rapides dans l’abdomen (une fois par semaine entre 12 et 16 semaines d’âge, 1min) et 5 anesthésies pour réaliser une imagerie d’une durée maximale de 30 minutes par anésthésie - 2 prélèvements de sang à 8 et 12 semaines d’âge de durée (1min) -Un prélèvement de moelle osseuse dans le fémur sous anesthésie à 8 semaines d’âge (2 min)
Impact sur les animaux
- douleur légère de courte durée due à la piqûre d'aiguille pour l’injection et le prélèvement. - diminution de l’activité, perte de poids, et possible développement de petites tumeurs intra-abdominales dans les trois premières semaines chez les souris recevant l'administration de cellules tumorales.
Devenir
Les souris MISTRG étant partiellement dépourvues de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animal, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 16 semaines de vie, ni en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons nos expériences sans expérimentation animal en laboratoire pour tester les cellules humaines . Cependant, jusqu’à présent, nous n’avons pas réussi à recréer un modèle ne nécessitant pas d’expérimentation animal avec un environnement similaire à celui de la moelle osseuse humaine. Pour prouver l’efficacité de nos cellules, nous devons donc utiliser un modèle murin. De plus, les modèles sans animaux actuels pour étudier l’environnement des tumeurs humaines concernent uniquement les tumeurs solides, et non les cancers du sang comme les leucémies étudiées ici.
Réduction
Nous avons réuni des expériences en utilisant les souris humanisées pour l’expérimentation de la transplantation de cellules leucémique. Nous avons réduit au minimum notre nombre de souris par groupe en le déterminant par une approche statistique.
Raffinement
Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement dans un secteur spécifiquement adapté pour leur état immunitaire déficient. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation de leur état clinique sera utilisé. Des points limites sont mis en place. Nous aurons recours à de l'anesthésie, ainsi qu'à de l'analgésie en cas de douleur. Nous avons mit en place des points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris, car c’est la seule espèce qui permet de réaliser ce type d’étude. Cela est notamment possible grâce à la capacité de modifier son patrimoine génétique de façon précise et répétée. C’est grâce à cette méthode que la souris MISTRG a pu être obtenue. La souris MISTRG est un modèle qui imite le fonctionnement humain grâce à sa capacité à développer des cellules du sang après humanisation. Elle est reconnue comme le meilleur modèle pour étudier les cellules humaines cancéreuses du sang. Avec ce modèle, nous pouvons examiner l’environnement des leucémies et tester l’efficacité de nouveaux traitements, comme les thérapies cellulaires. Les expériences se font entre la naissance et 16 semaines de vie des souris. Nous arrêtons les tests avant que la leucémie ne se développe complètement et n’induise de mortalité.
Exploration des modèles de neuropathologies par des tests comportementaux dans le but de caractériser le phénotype des lignées murines
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
9 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, au sein d'un service d'animalerie qui met des batteries de tests comportementaux à la disposition des équipes de neurosciences. Les souriceaux subissent une biopsie de la queue entre trois et six jours de vie, les adultes une restriction alimentaire de quinze jours destinée à les motiver, puis jusqu'à huit tests de locomotion, huit tests d'anxiété et de sociabilité et sept tests cognitifs étalés sur onze semaines. Certaines lignées présentent des convulsions, des troubles moteurs qui compliquent l'accès à l'eau et à la nourriture, ou un retard de croissance, et le porteur présente ce phénotypage comme un moyen de fixer des points limites plus précoces et d'"assurer le bien-être animal". 3 264 animaux passent ensuite en utilisation continue vers d'autres projets autorisés, une partie rejoint les élevages, les autres sont tuées.
Objectifs
L’objectif du projet est de proposer par un service d’animalerie dédié un ensemble de tests (et protocoles) comportementaux mis à la disposition des équipes de recherche qui étudient les neurosciences. Le but est d’explorer des modèles de souris ayant des neuropathologiques qui miment un ensemble de maladies ou de troubles affectant le système nerveux, notamment le cerveau, la moelle épinière et les nerfs périphériques et de caractériser une altération de la santé de l’animal (phénotype dommageable). La meilleure connaissance de ces nouveaux modèles permettra dans le cas d’un phénotype dommageable de déterminer des points limites précoces afin d’améliorer le bien-être animal. L’ensemble des tests couvrent tous les âges (présevrage, juvénile, adulte et sénior) selon des protocoles classiques et modulables et selon les modèles pour s’adapter aux observations préliminaires qui ont conduit à la demande d’exploration comportementale par le chercheur.
Bénéfices attendus
Une meilleure connaissance du phénotype des animaux permet de déterminer des points limites plus précoces, permet d’assurer le bien-être animal, de faire progresser les connaissances neuropathologiques des modèles générés par les chercheurs afin d'établir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
Procédures
Dans le cadre du projet, différentes interventions sont réalisées : Interventions sur des animaux vigiles (conscients) : 1. Biopsie de queue : Réalisée sur des souriceaux âgés de 3 à 6 jours, cette intervention rapide (moins d’une minute) permet d’analyser leur patrimoine génétique afin de confirmer leur génotype. 2. Restriction alimentaire : Chez les souris adultes, une restriction modérée peut être appliquée pendant 15 jours afin de stimuler leur motivation lors de certains tests comportementaux. 3. Tests comportementaux : Divers tests sont menés pour évaluer l’activité motrice, la sociabilité, l’anxiété ou les capacités d’apprentissage. 4. Tests de locomotion : Très brefs (moins de 5 minutes), ils peuvent être réalisés deux fois par jour pendant 4 jours consécutifs, soit jusqu’à 8 tests sur 2 semaines. 5. Tests d’anxiété et d’interaction sociale : Ils durent entre 10 et 40 minutes, avec un jour de repos entre chaque session, pour un maximum de 8 tests répartis sur 3 semaines. 6. Tests cognitifs : Ils comportent entre 1 et 8 essais par jour, pendant 1 à 15 jours, dans une limite de 7 tests répartis sur 11 semaines. 7. Phénotypes dommageables : Certaines souris, en raison de modifications génétiques, peuvent présenter des troubles moteurs, des convulsions ou un retard de croissance. 8. Prélèvements sanguins : Deux prélèvements sont réalisés sur des animaux adultes vigiles, espacés de deux semaines, chacun durant moins d’une minute, afin d’analyser certains paramètres biologiques. 9. Évaluation globale : Des observations régulières de l’état physique et du comportement sont effectuées pour détecter précocement tout signe de malaise ou de maladie. 10. Interventions sous anesthésie – Chirurgie terminale : Une intervention courte (environ 5 minutes) est pratiquée sous anesthésie générale avec analgésie, sans réveil de l’animal (chez des juvéniles ou adultes).
Impact sur les animaux
La manipulation et la contention des souriceaux induisent un léger stress. Le prélèvement à la queue induit une douleur lors du prélèvement et un saignement est possible. Lors des tests comportementaux un léger stress peut être induit par la découverte d’un nouvel environnement. La séparation maternelle, peut également induire un stress chez les nouveau-nés et un abandon de la progéniture par la mère. La restriction alimentaire provoquera une sensation de faim et une perte de poids de l’animal. Le test de comportement interaction sociale peut induire des comportements anxieux et de l’agressivité chez les animaux. L’anesthésie peut induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardiorespiratoire. Les modèles de neuropathologies sont susceptibles de ressentir des douleurs allant de légères à sévères. En cas de crises d’épilepsie à un stade élevé, une fatigue, une atonie et une perte de poids peuvent également se manifester. Les troubles moteurs entraînent des difficultés de mouvement, rendant l'accès à l'eau et à la nourriture plus compliqué. Le retard de croissance affecte le développement des animaux, ce qui se traduit par un sevrage plus tardif. L’hébergement individuel peut induire un stress social
Devenir
L’ensemble des animaux qui ne sont pas euthanasiés à l’issus de ce projet rentreront en utilisation continue (N 3264) pour d’autres projets autorisés. Les souris dédiées aux tests de comportement seront euthanasiées pour réaliser des analyses histologiques. Les souris non utilisées pour des objectifs scientifiques seront pour une partie utilisée pour le maintien des élevages et pour une seconde partie euthanasiée.
Remplacement
Nos projets en neurosciences reposent sur des approches in vitro pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires dans un environnement contrôlé. Cependant, les modèles animaux sont indispensables pour analyser les interactions neuronales complexes, explorer les dynamiques cérébrales et valider les résultats in vitro dans un organisme vivant. Les alternatives aux modèles animaux, telles que les cultures cellulaires, les organoïdes cérébraux et les simulations informatiques, ont progressé ces dernières années. Ces méthodes permettent d'approfondir la compréhension des mécanismes neuronaux tout en évitant les contraintes éthiques. Les cultures en 2D et les organoïdes en 3D reproduisent certains aspects du développement neuronal, mais ne peuvent reproduire la complexité fonctionnelle et structurelle du cerveau. Malgré leurs avancées, ces alternatives présentent des limites. Les organoïdes manquent de vascularisation et d’interactions avec les systèmes immunitaire et circulatoire, tandis que les simulations informatiques, bien qu'efficaces, ne remplacent pas les connaissances acquises par l’expérimentation biologique. Ainsi, bien que les approches in vitro et informatiques réduisent l'utilisation des animaux, elles ne peuvent totalement s’y substituer.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats reproductibles. Sur la base de résultats d’expériences et de publications utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes. Le nombre d’animaux utilisé pour ce projet est de 9000
Raffinement
Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. L'acclimatation des animaux à l'expérimentateur sera effectuée à raison de 10 minutes par jour sur une période de 5 jours Pour limiter le stress des femelles allaitantes et un éventuel rejet de leurs progénitures après manipulations, les mains gantées des expérimentateurs sont imprégnées de l’odeur de la sciure de la cage avant de manipuler les petits. Les animaux subissant une restriction alimentaire, seront sortis du protocole en cas d’une perte de poids supérieure à 15 pour cent de leur poids initial et remis dans une cage d’hébergement avec à disposition un aliment enrichi . L’état des animaux est alors surveillé plusieurs fois par jour. Le raffinement des phénotypes dommageables repose sur une surveillance précoce des nuisances et l’adoption d’un hébergement adapté, avec enrichissements et manipulations douces pour certaines lignées. L’évaluation du bien-être est non invasive, basée sur des paramètres zootechniques et physiologiques. En cas de détection d’un phénotype dommageable, une prise en charge immédiate est effectuée. Les enrichissements sont ajustés au type d’animaux et les points limites définis tôt. La chirurgie est réalisée conformément aux bonnes pratiques vétérinaires, en utilisant des agents anesthésiques et analgésiques. Les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et réglementaires dans une pièce isolée du reste des autres souris.
Choix des espèces
Les équipes de recherche utilisent le modèle souris, essentiel pour les études en neurosciences en raison de sa similarité génétique avec l'homme. Les chercheurs demandant des phénotypages se concentrent sur ce modèle, qui permet d'étudier les mécanismes génétiques sous-jacents à des maladies, notamment neurodégénératives et psychiatriques. Selon les premières observations faites, les animaux pourront être utilisé dès la naissance, ou à partir du sevrage, ou à l’âge adulte.
Développement et amélioration de dispositifs médicaux pour la thérapie cellulaire
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Cochons : 40
Les porcs sont retirés du protocole en cas de douleurs sévères que les morphiniques ne soulagent pas en douze heures, de perte de poids d'au moins 20 %, d'infections résistantes, de prostration ou d'escarres. 400 souris et 40 miniporcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue parce que les biopsies prévues sont incompatibles avec la survie. Chaque animal subit deux chirurgies, l'une pour poser un implant d'hydrogel dans l'abdomen, l'autre pour le retirer, jusqu'à deux heures chez le porc, et les souris sont saignées chaque semaine de 7,5 % de leur volume sanguin. Le porteur annonce des publications scientifiques à court terme et, à plus long terme, un implant de cellules pancréatiques qui dispenserait les personnes diabétiques de traitement anti-rejet.
Objectifs
Le diabète de type 1 touche 8,4 millions de personnes dans le monde et résulte d'une auto destruction de cellules du pancréas, responsables de la sécrétion d'insuline et donc de la régulation glycémique. La greffe d’îlots pancréatiques issus de donneurs constitue une approche thérapeutique prometteuse, permettant à certains patients de retrouver un contrôle glycémique sans injections d’insuline. Cependant, son application est limitée par le manque de donneurs et la nécessité de traitement anti-rejet lourd. L’objectif de ce projet est de développer un biomatériau innovant permettant la transplantation de cellules pancréatiques fonctionnelles sans recours aux anti-rejets. Pour cela, un hydrogel a été conçu afin d’assurer la diffusion des nutriments et de l’insuline tout en empêchant l’attaque des cellules greffées. Ce biomatériau devra être compatible avec les îlots issus de donneurs. Le projet vise à : 1/ Choisir un hydrogel et un site d’implantation réaliste, 2/ Confirmer la sécurité et la tolérance du dispositif médical chez la souris et le porc, 3/ Valider dans le modèle porcin la faisabilité de la transplantation par une technique opératoire routinière chez l'Homme. Nous prévoyons d’utiliser 400 souris et 40 miniporcs. L’utilisation de porcs est extrêmement intéressante afin d’obtenir une meilleure transposition des résultats chez l’Homme ; notamment sa taille et son espace au niveau de sa cavité abdominale qui en fait un bon candidat pour cette étude.
Bénéfices attendus
A court et moyen terme, ce projet aboutira à plusieurs publications scientifiques internationales. A moyen et long terme, cette étude aboutira à la mise au point d'un implant porteur de cellules pancréatiques facilitant la greffe chez les patients diabétiques de type 1. En effet, l'implantation du dispositif se faisant au niveau abdominal à la place de l'intraveineux, cela réduit à son minimum le risque de formation d'un caillot sanguin au niveau du foie. Aussi, il pourrait permettre de réduire voir s'abstenir de tout traitement anti-rejet et offrant ainsi des soins de meilleures qualités.
Procédures
Tous les animaux de l'étude seront soumis à une procédure chirurgicale pour la mise en place du dispositif médical et une procédure chirurgicale finale afin d'extraire et d'étudier l'implant et son impact sur l'individu. Pour le porc, la chirugie se tiendra sur une durée estimée de 2 heures maximum. Pour la souris, l'implantation durera environ 15 à 30 minutes. Les souris seront prélevées chaque semaine d'un volume sanguin correspondant à un maximal de 7,5% du volume total. Ce prélèvement sera réalisé à la queue (ponction). La durée du prélèvement sera de quelques minutes chaque semaine du suivi.
Impact sur les animaux
Chez le porc, les effets indésirables aprés chirurgie peuvent inclure des douleurs abdominales, des ballonnements et des troubles digestifs, ainsi que des hématomes au niveau de la paroi abdominale. Une sensation de corps étranger ou une gêne locale liée à la prothèse peuvent également être ressenties. Plus rarement, des infections superficielles des plaies voire une infection de la prothèse peuvent survenir. A noter que la chirugie se tiendra sur une durée estimée de 2 heures maximum. Les animaux seront suivis au maximum durant 3 mois. Chez la souris, les implants sont placés par voie chirurgicale. Un risque de d'inconfort, voire de douleur est possible. Néanmoins, celles-ci seront traitées de façon adéquate par des anti-douleurs. De plus, la transplantation de cellules du pancréas pourrait éventuellement induire des baisses de glycémies majeures dans les premiers jours après la transplantation. Un suivi accru du taux de sucre dans le sang dans les premiers jours après chirurgie et un traitement au glucose pourront pallier ce problème. L'implantation durera environ 15 à 30 minutes par animal. Les animaux seront suivis au maximum durant 3 mois.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car les prélèvements de biopsies ne sont pas compatible avec la survie de l'animal
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, l’utilisation d’animaux est strictement limitée à cette étude où aucun modèle alternatif ne permettrait de répondre aux questions scientifiques posées. En amont, une série de tests in vitro sera réalisée afin de sélectionner et d’optimiser les implants d'hydrogel-candidats, réduisant ainsi le nombre d’expérimentations in vivo nécessaires. Cependant, malgré ces efforts, le remplacement total des modèles animaux demeure actuellement difficile. Les interactions complexes entre l’implant, les cellules encapsulées et l’environnement biologique ne peuvent être entièrement reproduites par des modèles in vitro ou par des approches alternatives comme les organoïdes ou les simulations informatiques. Les études sur des modèles animaux sont donc indispensables pour évaluer la tolérance, la fonctionnalité et l’efficacité de l’implant dans un organisme vivant, en tenant compte des paramètres immunologiques, vasculaires et métaboliques.
Réduction
Le protocole expérimental est conçu pour minimiser le nombre d’animaux utilisés. Les études seront réduites au maximum. De plus, les observations seront effectuées en combinant différentes analyses afin d’exploiter chaque modèle au maximum, réduisant ainsi le besoin de nouveaux groupes expérimentaux. 400 souris et 40 miniporcs sont prévus dans ce projet. Nous avons estimé avec les moyens statistiques adéquats le nombre de souris et de porcs par groupe à 10 afin d'obtenir des résultats qualitativement et quantitativement robustes. Nous utiliserons le juste nombre d'animaux, soit 10 animaux par groupe - 4 groupes expérimentaux par série (patch d'hydrogel testé) afin d'obtenir des résultats satisfaisants. 10 manipulations souris et 4 chez le porcs sont estimées dans ce projet soit un total de 400 souris et 40 porcs (40 souris * 10 séries et 10 porcs sur 4 séries).
Raffinement
Chez le Porc, afin d’optimiser le bien-être animal, des mesures de raffinement rigoureuses seront appliquées. Les conditions d’hébergement respecteront les normes réglementaires : logement individuel, cycle lumineux de 12 h et enrichissement adapté. Les porcs bénéficieront de balles, de Kongs garnis de bouillie, de luzerne et de friandises. Les procédures seront réalisées dans des salles dédiées, distinctes des espaces d’hébergement. Une prise en charge de la douleur sera assurée. Les soins seront réalisés sous avis vétérinaire en cas de complications. Un suivi quotidien, garantira une évaluation rigoureuse. Les critères de retrait immédiat incluront :Douleurs sévères non soulagées sous morphiniques (12 h),Perte de poids excessive (≥20 % chez le porc),Infections résistantes après 48 h,Prostration, absence de réaction ou escarres.En cas d’infection locale, une réintervention sous anesthésie et avec rinçage antiseptique. un traitement antidouleur pourra être renforcé. Une infection généralisée nécessitera l'usage d'antibiotiques adaptés. Un suivi minutieux de la cicatrisation assurera un rétablissement optimal, garantissant des conditions expérimentales rigoureuses et éthiques. Les souris utilisées dans ce projet seront hébergés dans des cages de 5 animaux maximum . Ils auront accès à volonté a l'eau et nourriture et traités avec soin. La chirurgie sera pratiquée sous anesthésie et traitement de la douleur. De plus, un complément alimentaire sous forme gélifié est prévu juste après la chirurgie pour une meilleure récupération. Le bien être animal sera observé́ au quotidien, et tout constat de mal-être pourra être traité à l'aide d'un arbre décisionnel construit pour ce projet. Il permettra le traitement des douleurs/mal être de façon gradée pour éviter d'atteindre un point-limite.
Choix des espèces
Il n’existe à ce jour pas de modèles permettant de contourner l’utilisation d’animaux pour ce projet. Les essais chez l'animal sont conduits sur les espèces décrites dans la littérature. Dans les phases initiales du projet, le rongeur est privilégié en première intention, car c’est une espèce qui permet de répondre à l’ensemble des questions du projet (site optimal d’implantation, fonctionnalité), tout en étant facilement accessible et relativement économique. Pour la compréhension de certains résultats, des animaux avec un systeme immunitaire affaiblit sont utilisés, afin de s’affranchir de l’effet de la réponse immunitaire sur la fonctionnalité des cellules transplantées et de n’évaluer que l’impact de l’hydrogel. La preuve de concept de l’implantabilité, du retrait et de la tolérance est réalisée chez le cochon adulte. En effet, la translation à l’homme des résultats obtenus dans les modèles rongeurs est limitée du fait de leur anatomie et physiologie particulières. Le modèle cochon adulte est plus adapté car il possède de nombreuses similarités avec l’Homme, incluant la taille, et les caractéristiques anatomiques (permettant d’évaluer la chirurgie d’implantation envisagée chez l’Homme), physiologiques et pathophysiologiques. Pour les souris, nous utiliserons des souris Adulte - minimum 7 semaines - Cela permettra une chirurgie plus aisée. Pour les porcs, nous utiliserons des animaux adultes pour d'une part se rapprocher de la réalité clinique, et d'autres part faciliter le geste chirurgical.
Etude de la dynamique de transmission de pathogènes viraux chez le Minioptère de Schreibers.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Jusqu'à 70 microlitres de sang prélevés par incision d'une veine de l'aile, soit près de 10 % du volume sanguin d'un animal de 12 grammes : 480 minioptères de Schreibers vont être capturés au filet ou au piège-harpe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque chauve-souris est mesurée, pesée, marquée par transpondeur et écouvillonnée dans la bouche, en moins de dix minutes de contention. L'objet est de chercher des traces d'exposition à des lyssavirus, coronavirus et filovirus sur deux sites français, à raison de soixante individus par session et de huit sessions réparties sur deux ans. Toutes les chauves-souris sont gardées vivantes et relâchées, le porteur rappelant que la détention de ces espèces protégées est interdite en France.
Objectifs
Les chauves-souris appartiennent au groupe de mammifères le plus diversifié après les rongeurs et sont connues pour héberger une grande diversité de micro-organismes dont des pathogènes. Il semblerait que la diversité de ces derniers soit due au grand nombre d’espèces que présentent ce groupe de mammifères. De plus un nombre de maladies infectieuses négligées ou émergentes et hautement pathogènes chez les humains résultent d’une origine fortement suspectée chez les chauves-souris (ex : virus de la rage, Ebola, Marburg, Nipah, divers coronavirus responsables du Syndrome Respiratoire Aigu Sévère). Les chauves-souris possèdent des capacités physiologiques uniques comme la capacité de vol, une grande longévité au regard de leur taille, et aussi un système immunitaire puissant qui pourrait expliquer leur capacité à survivre à des infections virales et donc potentiellement à les héberger et en constituer un réservoir. L’objectif de ce projet est de rechercher pour le Minioptère de Schreibers, et à différents moments de son cycle biologique, l’évidence d’expositions et d’infections par des agents pathogènes, en ciblant plus particulièrement 4 genres différents, le genre Lyssavirus, Alphacoronavirus, Betacoronavirus et Cuevavirus (famille des Filovirus). Cette évaluation permettra de mieux appréhender la dynamique de transmission de ces pathogènes.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mieux appréhender la circulation de 3 groupes de virus encore très peu étudiés chez le Minioptères de Schreibers. Il permettra notamment, pour chaque groupe de virus (LLEBV, WCBV, LLOV, α COV et βCOV) d’estimer si les individus ont été exposés, s’il existe une différence de leurs séroprévalences entre les saisons et entre les jeunes ou adultes. Un des virus étudié (LLOV) est à l’origine de fortes épizooties chez cette espèce (exemple de l’épizootie détectées en Espagne en 2002 et en Hongrie en 2016) et n’a encore jamais été étudié en France alors que des événements de fortes mortalités pouvant faire suspecter la présence du virus ont été observés. Alors que le virus LLOV n’apparait pas zoonotique mais est d’intérêt d’un point de vue conservation de l’espèce, les virus de la famille des Lyssavirus (LLEBV et WCBV) sont potentiellement zoonotiques. Leur étude et donc d’intérêt pour appréhender le risque de transmission à d’autres mammifères. Dans ce projet, il s’agit tout d’abord de détecter la circulation de pathogènes dans l’hôte, avec pour sites d’études, deux sites identifiés, un dans l’Est et un dans l’Ouest de la France, à la limite de répartition de l’espèce.
Procédures
Biométrie sur animal vigile (avant-bras et poids)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables induits par la capture, la manutention, la prise de sang et de salive ainsi que le marquage sont le stress et le refroidissement de l’animal si la manutention est maladroite et trop longue. Ces effets ne devraient pas durer au-delà du temps de l’expérimentation. Des système de chauffages ou installation des pochons sous les vetements des manipulateurs seront mis en place en cas de refroidissement (détécté par la baisse d’activité) des individus.
Devenir
les chauves-souris sont gardées en vie et relâchées
Remplacement
L’étude des pathogènes portés par les chauves-souris ne peut être réalisée que sur des matrices provenant de chiroptère sauvages. Les prélèvements salivaires et de sang devant être frais, ils ne peuvent être effectués que sur des animaux capturés vivants.
Réduction
Un effectif de 60 individus sera capturé, marqué et prélevé par session de capture. L’effectif nécessaire, par capture, a été estimé en fonction du taux d'individus avec présence d'anticoprs attendue afin de permettre de détecter une difference de l’exposition virale entre la session de printemps et la session d’été. Un total de 8 captures (2 sessions de capture par site et par an, sur une durée de 2 ans), pour un nombre total d’animaux prélevés de 480
Raffinement
Les captures sont réalisées par filet japonais ou harp-trap en dehors des périodes critiques pour l’animal qui sont la période de perte de poids en hiver ou la période de mise bas et de croissance des jeunes (Juin /début juillet). Le stress des animaux est réduit au maximum du fait d’une contention/manipulation rapide (< 10 minutes) pour le démaillage, mesures biométriques et écouvillonnage par des personnes compétentes et formées (les chiroptérologues pour l’ensemble des manipulations dont le transpondage et les personnes du laboratoire pour l’écouvillonnage et la prise de sang). Les animaux sont maintenus dans des sacs individuels pour leur acheminement jusqu’à la table de prélèvement. Le maintien dans un sac permet également de limiter le refroidissment de l’animal. Le volume de sang maximum prélevé est de 70µl (maximum 10% du volume total de sang en estimant qu’une chauve-souris, au même titre qu’une souris, possède environ 60ml de sang par kg de poids corporel et que l’espèce Minioptère de Schreibers pèse environ 12g). La prise de sang est réalisée par incision d’une veine du patagium et prélèvement du sang par capillarité via une pipette ou un buvard.
Choix des espèces
L’objectif du projet étant l’étude in natura de la circulation de pathogènes chez l’espèce Miniopterus schreibersii, il n’est pas possible d’utiliser d’autres animaux que ceux capturés dans la nature. De plus, toutes les espèces de chauves-souris présentes sur le territoire français sont protégées et leur détention/élévage est interdit. La capture qui aura lieu en printemps sera effectuée sur des adultes. La capture qui aura lieu en fin d’été sera effectuée sur adultes et juveniles émancipés (donc poids comparable aux adultes).
Effets d’une série de composés à visée thérapeutique en développement sur l’athérosclérose chez la souris ApoE -/- nourrie avec une alimentation enrichie en graisses
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Privées du gène de l'apolipoprotéine E, 75 souris développent spontanément des plaques dans leurs artères, effet accéléré par un régime dont 40 % de l'énergie vient des graisses. Elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées pour prélever le tronc aortique et le cœur. Sur douze semaines, chaque animal reçoit 26 injections dans l'abdomen, passe quatorze pesées, trois prélèvements à la veine de la queue et une anesthésie pour l'injection d'une sonde fluorescente, l'obésité s'installant au fil de l'étude. Les quatre molécules testées appartiennent à un client du laboratoire, dont le développement pourrait, "à terme", aboutir à la mise sur le marché d'un médicament.
Objectifs
L'athérosclérose est un phénomène caractérisé par la formation de plaques d'athérome, constituées de lipides, sur la paroi des artères, induisant un durcissement et une perte d'élasticité de ces dernières. L'athérosclérose constitue un facteur de risque cardiovasculaire majeur. En effet, la rupture des plaques d'athérome peut conduire à une mauvaise oxygénation des organes, notamment le cerveau et le coeur et favoriser la survenue de complications graves telles que l'infarctus du myocarde ou des accidents vasculaires cérébraux. Ainsi, du fait de ces complications, et malgré l'existence de traitements ralentissant son évolution, l'athérosclérose demeure l'une des principales causes de mortalité dans le monde. Le développement de médicaments permettant un meilleur contrôle du développement de l'athérosclérose fait ainsi l'objet d'intenses recherches par les laboratoires pharmaceutiques. Le présent projet vise à tester l'efficacité d'une série de 4 candidats médicaments sur le développement des plaques d'athérome chez un modèle murin développant spontanément de l'athérosclérose, notamment lorsque ce dernier est soumis à une alimentation enrichie en graisses (40% de l'énergie apportée par les graisses). Les candidats médicaments seront administrés 2 fois par semaine par voie intrapéritonéale pendant 12 semaines. L'effet de ces traitements sera observé principalement par histologie du tronc aortique à l'issue de l'étude.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés visant à prévenir et traiter l'athérosclérose. Cette pathologie reste l'une des causes prinicipales de mortalité dans le monde, il existe un besoin important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développemlent dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir, à terme, à la mise sur le marché d'un nouveau médicament.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (14 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Injections de placébo ou du candidat médicament 2 fois par semaine (26 injections; durée de l'administration : 1 minute); 3) à trois prélèvements sanguins pratiqués à la veine de la queue (durée: 5 minute/prélèvement); 4) à une anesthésie pour administration IV d'une sonde fluorescente (durée : 10 minute).
Impact sur les animaux
En termes de nuisances, les animaux seront soumis à du stress du fait des manipulation lors des pesées régulières de poids corporel ou des injections répétées du candidat médicament. Par ailleurs les animaux seront soumis à des douleurs légères et de courte durée lors des injections du candidat médicament, et des prélèvements sanguins. Enfin, le régime enrichi en graisse distribué aux animaux est de nature à induire un état d'obésité progressif au cours de l'étude.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes (tronc aortique, coeur) sont prévus après euthanasie afin d'observer la progression des plaques d'athérome chez les différents groupes traités, et de réaliser des dosages biochimiques.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur la formation et le développement des plaques d'athérome.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt mesurés sur le modèle de souris soumis à une alimentation enrichie en graisses. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les données seront analysées par un test statistique adapté.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter le stress et l'inconfort pour les animaux. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs formés et expérimentés pour ce type de pratique. Les animaux seront hébergés dans des conditions standard d'hébergement. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages et une crème analgésiante sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements. Les injections seront réalisée sur animal anesthésié. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent notamment une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques.
Choix des espèces
Le modèle de souris employé est un modèle génétique présentant une déletion du gène codant pour une protéine constitutive des lipoprotéines, structures chargées du transport des triglycérides et du cholestérol dans le sang. Cette mutation induit chez ces souris une propension à développer spontanément des plaques d'athérome, en faisant un modèle de choix pour les études précliniques. Les animaux, mâles et femelles, seront utilisés au stade adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.
Evaluation de l’interet de molécules thérapeutiques innovantes pour traiter des maladies génétiques
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
4 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit un seul type d'injection, mais celle-ci peut être répétée chaque semaine pendant vingt-quatre semaines, sous anesthésie générale, avec une douleur musculaire dans la patte et une gêne à la marche parmi les effets déclarés. La mise à mort permet de prélever muscles, cœur, cerveau, foie, reins et moelle épinière pour mesurer où les molécules se sont distribuées. Les bénéfices sont formulés comme la sélection de candidats "susceptibles" d'être utilisés un jour en clinique, et l'effectif de 4 400 souris se justifie en une phrase, par des "tests statistiques" que le texte ne détaille pas.
Objectifs
Notre équipe développe des outils moléculaires innovants pour la thérapie génique et la modulation de l’expression des gènes, avec pour objectif principal l’identification de candidats potentiels à utiliser dans de futurs essais cliniques. Nos efforts se concentrent sur des pathologies génétiques, notamment neuromusculaires et neurodégénératives. Ces maladies sont particulièrement difficiles à traiter, car elles exigent que le médicament atteigne l'ensemble du corps ou traverse la barrière hémato-encéphalique. Notre objectif est d’identifier les médicaments les plus efficaces et adaptés à chaque type d’organe, afin que ces thérapies puissent, un jour, être utilisées chez les patients.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement des maladies génétiques. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus grand potentiel de biodistribution et le moins d’effets secondaires.
Procédures
Chaque animal soumis à un seul type d'injections de molécules actives afin d’évaluer les voies les plus efficaces pour la biodistribution. Les injections se feront sous anesthésie générale, et durera au maximum 10 minutes. Un analgésique sera administré avant chaque injection. Aucun animal ne recevra plus d’une injection par jour. Toutefois, pour permettre l’accumulation progressive des molécules, et compte tenu de leur demi-vie dans la circulation, les injections pourront être répétées chaque semaine, sur une période maximale de 24 semaines. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements sanguins en état vigile. (durée du prelevement : 2 minutes, une goutte de sang par prelevement 2 fois par jour maximum, sur 48h maximum).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables généralement observés sont dus à l’injection dans le msucle. Il est possible que les animaux ressentent une douleur musculaire localisée dans la patte et une gêne dans leurs déplacements. Les injections peuvent entraîner chez les animaux : douleurs, faibles pertes de poids et risques d’infection au point d’injection.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés afin d’analyser les différents organes (muscles squelettiques, cœur, cerveau, foie, rein, cerveau, moelle épinière …).
Remplacement
La recherche en bioinformatique de candidats et les analyses réalisées sur modèles cellulaires permettent d’effectuer un premier criblage des molécules. Cependant, aucun modèle cellulaire ne peut remplacer complètement un organisme vivant. Il est donc indispensable de mener ces études dans un modèle animal, qui permet d’évaluer des paramètres essentiels tels que la biodistribution dans les tissus cibles, la demi-vie et les effets secondaires suite à l’administration de la molécule chez l’animal.
Réduction
Les effectifs nécessaires ont été calculés grâce à des tests statistiques, afin de réduire au minimum le nombre d'animaux permettant d'obtenir un effet statistiquement significatif.
Raffinement
Les animaux seront manipulés par du personnel formé et expérimenté, et les manipulations seront limitées au strict nécessaire. Avant chaque injection, les animaux seront anesthésiés et maintenus sur un tapis chauffant. De plus, toutes les interventions potentiellement douloureuses seront précédées de l'administration d’un analgésique. Des critères d’arrêt définis a priori seront utilisés afin d'éviter toute souffrance inutile. Un suivi clinique quotidien sera assuré, accompagné d’une grille d’évaluation du bien-être animal. Enfin, les méthodes d’administration des molécules (voie, volume, fréquence) ont été choisies pour être les moins invasives possibles, tout en garantissant la validité scientifique de l’étude.
Choix des espèces
Nous travaillerons sur des souris, car ce sont chez ces animaux que sont disponibles les modèles pathologiques des maladies que nous ciblons avec nos molécules, et qui pourront être utilisés dans la suite du développement d'une molécule thérapeutique. De plus, la souris est l'animal le plus couramment utilisé et décrit dans la littérature pour ce type d’expérimentation. De plus la souris et l’homme sont relativement proches d’un point de vue génétique, et les observations réalisées chez la souris peuvent donc être facilement transposables à l’homme. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines. À cet âge, les souris sont matures, en bonne santé, et ont une taille corporelle suffisante pour permettre une injection intraveineuse ou intramusculaire en toute sécurité.
Effet du composé X, administré seul ou en combinaison avec la sémaglutide, sur le poids corporel et la composition corporelle chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
56 souris rendues obèses par douze semaines de régime gras avant même leur arrivée reçoivent chacune 35 injections et 12 administrations du candidat médicament, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent seize pesées, cinq mesures de composition corporelle et trois prélèvements sanguins en boîte de contention, chaque manipulation étant décrite comme une entrave brève aux mouvements. L'enjeu est autant commercial que thérapeutique : la sémaglutide fait fondre le muscle en même temps que la graisse, et le composé testé doit lever cet obstacle à des traitements prolongés. Seuls des mâles sont utilisés, le porteur indiquant qu'inclure des femelles obligerait à doubler les effectifs, une étude chez la femelle étant renvoyée au cas où l'efficacité serait démontrée chez le mâle.
Objectifs
Le sémaglutide est utilisé comme médicament antidiabétique et anti-obésité. Son efficacité s'avère excellente, et son emploi relativement sûr. Cependant, outre la perte de masse grasse qu'ils induisent, les traitements chroniques à la sémaglutide sont également associés à une importante fonte musculaire, qui est considérée comme un effet indésirable. Le candidat médicament a été initialement développé comme un médicament visant le muscle dans le cadre de pathologies induisant une atrophie musculaire. Le présent projet vise à élargir les indications thérapeutiques potentielles du candidat médicament et de tester notamment sa capacité a compenser les effets délétères de la sémaglutide sur la masse musculaire lors d'un traitement chronique chez la souris obèse.
Bénéfices attendus
La Sémaglutide est aujourd'hui autorisée et utilisée en tant que médicament anti-obésité et anti-diabétique. Néanmoins ce composé à pour inconvénient d'induire une perte de masse et de force musculaire lors de traitements prolongés, réduisant la possibilité de son utilisation sur des périodes prolongées. Le développement du candidat médicament permettrait, en co-administration, de bloquer totalement ou partiellement cet effet délétère de la sémaglutide, autorisant son utilisation sur des périodes plus prolongées et ainsi, une meilleure prise en charge thérapeutique des troubles métaboliques chez l'humain.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (16 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration du candidat médicament (12 administration; durée : 1 minute); 3) Injections de composés (35 injections; durée : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (3 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations de traitements, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs légère et de courte durée et de stress. Enfin, le caractère obèse des lots de souris concernés sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les groupe constitués de souris non obèse a été réduit à 8 animaux, contre 10 pour les groupes expérimentaux constitués de souris obèses, compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel et la composition corporelle) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs parfaitement formés et rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (3-4 souris /cage) et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les animaux seront habitués par deux fois aux systèmes de contention utilisés pour les mesures de coposition corporelle et pour les prélèvements sanguins avant de pratiquer ces procédures. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.
Choix des espèces
Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Ce modèle est sensible aux effets anti-obésité de la sémaglutide et présente également les effets secondaires de fonte musculaire observée chez l'humain. Les animaux seront utilisés au stade adulte, âgés de 18 semaines à la réception (25 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 12 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur afin d'induire le phénotype obèse.