Recherche appliquée

Les femelles sont tuées pour qu'on récupère leurs embryons, et les embryons pour qu'on prélève leur cerveau. 964 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 164 femelles gestantes subissent une ouverture de l'abdomen sous anesthésie, jusqu'à quarante-cinq minutes, puis vivent seules en cage de une heure à une semaine, et 800 embryons reçoivent dans le cerveau, à travers un capillaire de verre, une injection que le porteur qualifie lui-même de douleur aiguë et modérée. Sur ce total, 20 femelles et 160 embryons servent à former de nouveaux intervenants aux gestes.

Objectifs

Notre recherche est orientée vers l’étude des maladies du développement du cerveau d’origine génétique. En particulier, l’objectif principal de notre travail est de mieux comprendre, au cours de ce processus complexe de développement, les mécanismes nécessaires à la maturation des cellules souches neuronales en neurones. Ici nous souhaitons comprendre comment le contrôle de la synthèse protéique participe au développement du cerveau. Nous avons récemment mis en évidence un rôle clé des acides ribonucléiques de transfert qui sont des petites molécules adaptatrices de la traduction protéique. Cependant, il reste à étudier comment les voies moléculaires liées à ces molécules adaptatrices contribuent à la génération des neurones. Nous souhaitons donc étudier la teneur en molécules adaptatrices dans les cellules souches neuronales et les neurones à différents stades du développement du cerveau in vivo chez la souris. Pour isoler les différentes populations cellulaires présentes à des stades clés, nous nous appuyons sur une technologie dite FlashTag qui consiste en l’injection, dans les cerveaux d’embryon de souris, d’une molécule fluorescente. En mettant à mort les animaux à des temps variés après injection nous pouvons marquer différentes populations cellulaires dont la date de naissance correspond au stade auquel l’injection a eu lieu. En combinant FlashTag et le tri de cellules basé sur la fluorescence (FACS) , nous souhaitons isoler des populations pures de cellules à différents stades du développement sur lesquelles nous réaliserons un séquençage des acides nucléiques de transfert. Nous avons 3 objectifs : 1. déterminer si, au sein des cellules proneuronales, les quantités d’acides ribonucléiques de transfert varient au cours du développement 2. déterminer si, au cours de la spécialisation de la cellule en neurone, les quantités d’acides nucléiques de transfert sont différentes. 3. déterminer si, au cours de la maturation du neurone, les quantités d’acides nucléiques de transfert varient Au total, un nombre de 144 souris gestantes, soit environ 640 embryons (+512 embryons de stade inférieur aux 2/3 de gestation) seront utilisés dans cette étude. Nous ajouterons 20 femelles et 160 embryons pour la formation de nouveaux intervenants

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de comprendre la fonction du contrôle de la synthèse protéique dans le développement du cerveau.

Procédures

164 femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) unique, réalisée sous anesthésie générale et analgésie. La durée totale de la chirurgie n'excèdera pas 45 minutes. La cicatrisation peut induire une douleur modérée et une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Elles seront par la suite placées dans des cages individuelles, mais auront toujours un contact visuel et auditif avec leurs congénères pour des durées variant entre 1 h et 1 semaine selon l’objectif visé. Les souriceaux (n=640) vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (entre 1 et 5 secondes) entrainant une douleur aigue et modérée.

Impact sur les animaux

La barrière cutanée des femelles gestantes sera rompue en plusieurs endroits, il en résulte une douleur modérée lors de la cicatrisation et une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Elles seront par la suite placées dans des cages individuelles et de ce fait privées de congénère pendant quelques jours de convalescence, en gardant un contact visuel et auditif, induisant un stress léger. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin aux stades embryonnaires (E12, E13, E14, E15, E16 et E17), entrainant une douleur aigue et modérée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles sont mises à mort pour collecter les embryons ou après la collecte des nouveaux nés. Les embryons ou nouveaux nés sont mis à mort pour prélever les cerveaux.

Remplacement

L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement du cortex cérébral qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer les stades du développement auxquels nous intervenons.

Réduction

Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique avec le test adéquat. De plus, certaines expériences seront utilisées dans 2 objectifs : nous pourrons utiliser les données de l’objectif 1 dans l’objectif 2.

Raffinement

Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal, notamment avec l’ajout de nid et de tunnel dans les cages d’hébergement. L’intervention chirurgicale sera effectuée sous anesthésie générale avec prise en charge de la douleur. Nous vérifions que les animaux mangent, s’abreuvent et se toilettent normalement. La cicatrice au niveau du ventre de la mère et le site d’injection sont surveillés et en cas d’infections importantes à ce niveau, ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement. Des points limites ont été déterminés et seront appliqués.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour comprendre la fonction du contrôle de la synthèse des protéines dans le développement du cerveau. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de déterminer les stades auxquels nous intervenons. La chirurgie pratiquée dans ce projet est réalisée en routine au laboratoire sur cet animal. Les femelles gestantes seront utilisées à maturité sexuelle car elles doivent être gravides. Les embryons seront injectés à différents stades du développement du cerveau avec une molécule fluorescente. Ils seront mis à mort à des stades précis, et les cellules fluorescentes triées pour répondre aux questions des différents objectifs : 1. déterminer si, au sein des cellules proneuronales, les quantités d’acides ribonucléiques de transfert varient au cours du développement 2. déterminer si, au cours de la spécialisation de la cellule en neurone, les quantités d’acides nucléiques de transfert sont différentes. 3. déterminer si, au cours de la maturation du neurone, les quantités d’acides nucléiques de transfert varient

240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des ingrédients d'origine végétale censés réduire l'anxiété. Elles reçoivent le produit par la bouche une à deux fois par jour pendant quinze jours, puis passent une fois un test d'enfouissement défensif de vingt minutes, où l'anxiété se mesure à la façon dont l'animal enfouit un objet qu'il perçoit comme menaçant. Le porteur écrit qu'"aucune procédure n'engendrera de douleur", tout en déclarant l'ensemble du projet en souffrance modérée. Celles qui le peuvent seront réutilisées pour l'apprentissage des gestes techniques dans l'établissement, les autres tuées, au service de ce que le porteur décrit comme "un enjeu sociétal et économique majeur".

Objectifs

Les troubles anxieux et liés au stress sont particulièrement fréquents dans les pays industrialisés. Il est estimé que 13 à 22% des habitants de ces pays développeront une pathologie anxieuse au cours de leur vie. Selon l'American Institute of Stress, ce problème est à l'origine de 75 à 90% des nouvelles consultations médicales et de 60 à 80% des accidents de travail. Les traitements disponibles concernant l’anxiété et le stress présentent de nombreuses limites dues aux effets secondaires importants et/ou à l’efficacité limitée. Dans le cas de stress chronique, différents traitements médicamenteux peuvent être prescrits mais l’indication de ces traitements n’est pas toujours prioritairement l’effet anti-stress et ils ne sont pas dénués d’effets secondaires. Dans ce contexte, la recherche de nouveaux produits plus efficaces représente donc un enjeu sociétal et économique majeur.

Bénéfices attendus

L’enjeu de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements dans la lutte contre le stress et l’anxiété qui pourront être développés pour une utilisation chez l’Homme.

Procédures

Dans cette étude, un traitement sera administré une à deux fois par jour sur les 240 animaux vigiles (éveillés) par voie orale et ce jusqu'à 15 jours maximum. Un test comportemental sera réalisé une fois pendant 20 minutes sur ces 240 animaux pour évaluer les effets des traitements sur le stress et l'anxiété. Aucune procédure n’engendrera de douleur.

Impact sur les animaux

Les traitements administrés par voie orale s’effectueront sur animal vigile, l’administration ne prend pas plus de 15 secondes par animal et ne nécessitent pas une anesthésie. De plus, l’administration orale sur animaux vigiles limite le risque de fausses routes et aucune médication, analgésique ou anti-inflammatoire, n’est nécessaire et ne sera donc utilisée. Le test comportemental s’effectuera sur animal vigile sans aucune médication, analgésique ou anti-inflammatoire, pour ne pas perturber l’activité des animaux.

Devenir

Lorsque cela sera possible, les animaux seront réutilisés pour la formation aux gestes pratiques au sein de l’établissement. Tous les animaux non réutilisés seront mis à mort dans des conditions éthiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet, les études in silico (modélisation informatique) ou in vitro ne permettant pas de prédire ou d’évaluer les effets sur l’anxiété d’un traitement. Le modèle rongeur est utilisé régulièrement par les industriels pour évaluer l’efficacité de produits contre ces pathologies. La complexité des mécanismes mis en jeux ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez le rongeur. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont, et notre expérience du modèle, permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non des traitements testés.

Raffinement

Les animaux auront dans leur cage d'hébergement plusieurs enrichissements (tunnel, brique d’Aspen et papier kraft), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la phase de test comportementale. Les expérimentateurs sont formés et habitués aux évaluations comportementales et prendront toutes les dispositions nécessaires à la bonne réalisation de celle-ci. Les souris seront observées tout au long de la réalisation du test comportemental. Les traitements seront effectués sur animaux vigiles par du personnel entrainé ayant les compétences requises pour effectuer ces gestes et une observation régulière des animaux sera effectuée après la réalisation de chaque traitement. Des points limites adaptés sont fixés, si nous constatons l'atteinte d’un de ces points limites, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé régulièrement par les industriels pour évaluer l’efficacité de produits contre le stress. De plus, ce modèle est déjà très utilisé dans les tests défensifs visant à étudier les comportements de type anxieux. Dans cette étude afin d’être le plus représentatif possible nous utiliserons des souris des deux sexes. Les animaux utilisés seront des souris mâles de 10 semaines à l’arrivée au laboratoire et des femelles d'âge équivalent. Nous effectuerons notre modèle sur des souris adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles.

Anesthésiés jusqu'à cinq fois pour être mesurés et pesés, 4 320 médakas marins passent l'intégralité de leur cycle de vie, six mois, dans une eau contaminée. Douze combinaisons de polluants, de température et d'acidification sont testées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous les poissons sont tués pour doser la contamination et analyser leurs organes. Le porteur reconnaît ne pas savoir si six mois d'exposition produiront des effets modérés ou graves, aucune étude n'ayant encore couvert l'ensemble du cycle de vie. Cinq tests comportementaux de cinq à neuf minutes sont annoncés comme non invasifs, sans qu'aucun soit nommé, et la rubrique consacrée à la réduction du nombre d'animaux tient en deux phrases.

Objectifs

La production et l'utilisation de divers produits chimiques ont considérablement augmenté depuis le milieu du XXe siècle, conduisant à l'émergence de nouveaux contaminants appelés contaminants émergents. Ces substances, qui incluent des produits pharmaceutiques, des pesticides, des produits de soins personnels et des plastifiants, sont souvent retrouvées dans l'environnement aquatique en raison de leur usage intensif et d'une gestion inadéquate des déchets. En raison de leur nature diverse, ces contaminants peuvent persister, s'accumuler et interagir avec des organismes aquatiques de manière complexe. Pourtant, les effets chroniques de ces substances sur les écosystèmes marins restent encore largement méconnus. L'objectif principal de ce projet est d'évaluer la toxicité chronique de différents contaminants émergents chez un poisson marin, tout en explorant comment les conditions de changement climatique, telles que l'augmentation de la température et l'acidification des océans, peuvent modifier leur impact environnemental.

Bénéfices attendus

Les recherches présentées dans cette demande s'attacheront à identifier les effets des contaminants émergents sur les populations de poisson. Cela devrait à terme fournir des données scientifiques nouvelles sur les risques liés à ces contaminants émergents pour les écosystèmes aquatiques et ainsi permettre de mieux réglementer leur rejet et informer le public sur les risques environnementaux associés à ce type de produits, sous la contrainte du changement climatique.

Procédures

Durant le projet, chaque individu pourra subir jusqu'à cinq anesthésies pour des mesures biométriques (taille et poids), chaque intervention durant moins de 5 minutes, incluant le transfert en bac de réveil. Un sous-échantillon d'individus sera soumis à cinq tests comportementaux non-invasifs d'une durée entre 5–9 minutes répartis sur 4 jours. Une période de repos de 24 h suit chaque test, avec alimentation et maintien en bac individuel en contact visuel avec les congénères.

Impact sur les animaux

Des études précédentes ont montré l’absence de toxicité lors d’expositions aiguës ou chroniques de courte durée aux contaminants de différentes natures chez le médaka marin et d'autres espèces, bien que certains effets négatifs mais non létaux aient été observés, comme un ralentissement de la croissance (moindre gain de poids par rapport aux contrôles) et une diminution de la fécondité (réduction du nombre d’œufs produits par femelle). Cependant, aucune étude n’a encore évalué les effets des contaminants émergents en milieu marin sur l’ensemble du cycle de vie des poissons, en interaction avec des changements de température et d’acidification. Il reste donc incertain que ces expositions, sur une durée de six mois, entraînent des effets modérés ou graves. Néanmoins, certains signes précurseurs peuvent apparaître dès le début de l’exposition, permettant une réaction rapide et la mise en place de mesures correctives.

Devenir

En cours ou en fin de projet, tous les animaux seront prélevés après euthanasie pour des analyses moléculaires, des dosages de la contamination et des analyses histologiques des organes.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer les animaux dans cette étude, car nous analysons l’impact des polluants et du climat sur les poissons à un niveau individuel, ce qui nécessite des organismes vivants pour pouvoir comprendre comment fonctionne l’ensemble du système.

Réduction

Le nombre de poissons utilisés a été calculé pour être le plus bas possible tout en garantissant des résultats fiables. Nous utilisons des méthodes statistiques pour analyser les résultats et comparer les effets en fonction du sexe et de la condition des poissons.

Raffinement

Les poissons sont élevés en groupe dans un environnement adapté et observés régulièrement pour détecter tout signe de malaise (changement de couleur, difficulté à nager, etc.). Pendant certaines expériences, ils sont placés seuls pendant quatre jours, mais ils peuvent toujours voir d’autres poissons pour éviter le stress. Lors des mesures de taille et de poids, ils sont manipulés uniquement sous anesthésie pour leur bien-être.

Choix des espèces

Le médaka marin est un modèle animal qui permettra d’aborder les effets physiologiques des contaminants émergents sur les poissons osseux en milieu marin. L'espèce est caractérisée par une reproduction non-saisonnière en laboratoire, une bonne fécondité et par des cycles de vie courts qui permettent d’aborder aisément les questions des effets à long-terme impliquant des expositions de l’ensemble des stades de vie. L'exposition aux 12 conditions climatiques et chimiques commencera lors de l'installation des animaux dans leur bac de 10L (15 jours post éclosion) et se poursuivra durant l’ensemble de leur cycle de vie afin d’étudier la toxicité des différentes conditions sur les différents stades aux sensibilités différentes (croissance juvénile, maturation sexuelle). Ils seront manipulés au stade juvénile (1, 2 mois) et adulte (jusqu'à 6 mois) pour des mesures de croissance, d'évaluation de la reproduction et de comportement (maturité du système nerveux optimale) respectivement.

10 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 8 640 reçoivent des cellules tumorales sous la peau du flanc et 2 160 se les font injecter dans le foie au cours d'une chirurgie abdominale, avant des séances de plasma froid appliqué directement sur la peau, jusqu'à sept fois dix minutes, qui peuvent l'assécher jusqu'à la nécrose. S'y ajoutent quatre à cinq imageries par animal et deux à trois prises de sang. Le porteur écrit qu'on peut "raisonnablement espérer" une régression des tumeurs, affirme qu'il est impossible de recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier", et indique développer en parallèle des modèles en trois dimensions pour réduire le nombre de souris.

Objectifs

Les cholangiocarcinomes (CCA) sont un type de cancer rare qui atteint le foie et les voies biliaires. A ce jour, seule l’ablation chirurgicale apparaît comme une thérapie efficace mais elle n’est envisageable que dans 20 pourcents des cas, avec sur 5 ans un taux de survie estimé entre 15-40 pourcents. La majorité des patients ne pouvant bénéficier d’intervention chirurgicale reçoit alors une chimiothérapie. En cas de progression tumorale consécutive à cette première ligne de traitement, il n’existe à ce jour pas de thérapie complémentaire approuvée. Par conséquent, l’émergence de nouvelles approches thérapeutiques est plus qu’attendue. Les plasmas froids atmosphériques (PFA) sont des gaz faiblement ionisés, constitués d’électrons, d’espèces radicalaires et excitées et possédant des propriétés de champ électrique et de rayonnement. Les PFA constituent une stratégie physique innovante et prometteuse pour le traitement des carcinomes puisque leurs capacités à réduire la croissance tumorale a récemment été démontrée dans des études in vitro et in vivo. Cependant, le développement et l’efficacité d’une stratégie PFA sur les cholangiocarcinomes (CCA) n’ont pas encore été testés. La finalité du projet est donc d’évaluer l’efficacité de la thérapie PFA comme alternative à l’ablation chirurgicale ou comme approche complémentaire à des traitements conventionnels. L’utilisation PFA permet raisonnablement d’espérer une régression significative de la taille des tumeurs, voire même une régression importante en combinant cette approche innovante à l’approche conventionnelle de la chimiothérapie. Par ailleurs, on peut s’attendre à un « effet sélectif » du plasma, c’est-à-dire qu’appliqué sur une zone présentant des cellules tumorales et saines, le plasma pourrait favoriser la mort des cellules cancéreuses sans endommager les cellules saines. Les objectifs sont de tester l’efficacité antitumorale du PFA et de mieux comprendre les mécanismes d’action du PFA, en particulier sur le phénotype des cellules tumorales, les cellules du microenvironnement tumorale et sur les composants de la matrice extracellulaire (MEC), dans des modèles précliniques de CCA ectopique. La caractérisation des échantillons sera réalisée par des approches multiples de biologie moléculaire et cellulaire. Ce projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les tumeurs des voies biliaires ou cholangiocarcinome (CCA) sont de très mauvais pronostiques et très agressives. Les traitements sont limités, seule la résection chirurgicale est efficace mais seuls 20 à 30 % des patients sont éligibles, les autres recevront une chimiothérapie palliative. La recherche sur traitements dit innovants dans un but de traiter localement la tumeur est nécessaire pour proposer de nouvelles options thérapeutiques pouvant être proposée seule ou en combinaisons avec des thérapies systémiques déjà en place. Dans son ensemble, ce projet est de tester dans des modèles expérimentaux murins, l’effet du plasma froid atmosphérique (PFA) sur le CCA. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet antitumoral du plasma froid atmosphérique dans des modèles bien décrits de CCA représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-antitumoral s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-cancéreux applicable en santé humaine dans le cadre des cancers des voies biliaires. Au-delà du cancer des voies biliaires, les PFA pourraient jouer un rôle important dans le développement de nouvelles applications médicales. Par exemple, les résultats pourraient orienter la création de nouvelles thérapies pour d’autres cancers ou d’autres applications comme la cicatrisation des plaies et l'ingénierie tissulaire.

Procédures

- Procédure 1 (EU1). 1. Injection sous cutanées des cellules (n=8640) sur souris vigiles, durée 10 secondes/animal - Procédure 2 (EU1). 1 chirurgie pour injecter dans le foie des cellules sur souris anesthésiées et sous analgésie (n=2160), durée 15-20 minutes/souris - Traitement au plasma froid atmosphérique (EU1/EU2) sur souris anesthésiées (n=1080 procédure 1 et n=540 procédure 2) 10 minutes/souris, répété 6 à 7 fois max. - Imagerie (EU2). Anesthésie + imagerie (4-5 fois sur même souris) (n=6480), durée 15 min/souris - Prélèvements sanguins (EU1/EU2) sur animal vigile (2-3 par souris) (n=6480), durée 10 min/souris - Prélèvement terminal (EU1/EU2). A l’issue des traitements, tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés puis soumis à un prélèvement sanguin et tissulaire pour effectuer les analyses et ne durera pas plus de 10 minutes entre de début de l’anesthésie et l’euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

-le développement des tumeurs : -le modèle ectopique implique une injection des cellules sous cutanée dans le flanc/dos de l’animal ce qui peut engendrer un stress à l’animal en raison de la contention et d’une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille, et un inconfort au fur et à mesure du développement tumoral. -Le modèle orthotopique (injection dans le foie) implique une chirurgie abdominale pour injecter dans un lobe du foie les cellules tumorales, ce qui engendre donc des nuisances liées à l’anesthésie (stress thermique, risque d’arrêt cardio-respiratoire) et à la chirurgie elle-même (douleurs post-opératoires malgré la prise en charge réalisée, inflammation locale, risque de dessiccation de la plaie). - Le traitement par plasma froid. L’utilisation de ce gaz faiblement ionisé appliqué directement sur la peau de l’animal peut générer un assèchement de la peau pouvant aller jusqu’à la nécrose dans les cas les plus extrêmes (peu probable). - Pour les traitements administrés par injection au niveau de l’abdomen ou dans la veine de la queue ou par gavage, les nuisances pourraient être un éventuel durcissement abdominal ou de la queue, une inflammation de l’abdomen, queue ou gorges). Les contraintes liées au gavage sont la contention qui constitue un facteur de stress. - Les traitements seront effectués sous anesthésie (sauf pour le gavage) et impliqueront donc également les contraintes/risques liées à l’anesthésie elle-même.

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires afin de prélever le sang et les tissus pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact « biologique » des différents traitements, en utilisant les différents marqueurs de progression de la pathologie.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancéreuses. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans le développement du cancer. Le modèle animal est donc indispensable dans le cadre de ce projet.

Réduction

Le projet impliquera un total de 10800 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique G*Power a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude qui est de 15 par groupe. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyses à effectuer (les différents types de tests donnant des résultats soit qualitatifs, soit quantitatifs). D’une façon générale, les modèles seront testés avec un seuil de validité de 5%. Lorsque ces conditions ne seront pas vérifiées, des tests non paramétriques seront effectués. En parallèle des animaux, nous développons des modèles in vitro en 3 dimensions afin de tester nos thérapies, ce qui permetra de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, enrichissement). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum, le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Un analgésique, notamment la buprénorphine, sera utilisé en pré-opréatoire 20 minutes avant et post-opératoire pour limiter la douleur et garantir un bien-être optimal des animaux. Un protecteur oculaire en gel sera aussi utilisé lors de l'anesthésie pour éviter tout assèchement des yeux. Pour le transport des animaux, celui-ci est effectué dans le respect du bien-être animal (mise à disposition d'eau sous forme de gel et de nourriture) et est réalisé par un transporteur agréé.

Choix des espèces

Les cellules en culture ne permettent pas de tester des nouveaux traitements anti-cancéreux dans sa globalité. Aussi, la souris est utilisée pour mimer un cancer avec des caractéristiques de la maladie proche de celles observées chez l’homme. Plusieurs modèles animaux de cancers biliaires (ectopique ou orthotopique) existent chez la souris récapitulant les différentes formes observées chez l’homme. Les souris seront utilisées à l'âge adulte/jeune adulte : 5 à 8 semaines pour les animaux commerciaux dont 1 semaine d’acclimatation. Nous n'utilisons pas d'animaux trop vieux afin de nous affranchir des problèmes de prise de greffes dans le cas des xénogreffes ectopiques et modifications des fonctions hépatiques dues à l'âge dans le cas des greffes syngéniques orthotopiques qui pourraient interférer avec nos résultats.

Les souris de ce projet sont des femelles génétiquement modifiées, dépourvues de système immunitaire et si sensibles aux agents pathogènes qu'elles sont élevées en milieu stérile. 101 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de tissus ou dès qu'un point limite est atteint. Elles reçoivent sans anesthésie une injection intraveineuse de cellules tumorales et une de cellules tueuses reprogrammées, passent jusqu'à 12 séances d'imagerie sous anesthésie générale et subissent 6 à 7 prises de sang sans anesthésie, la tumeur pouvant provoquer une perte de poids ou, si elle atteint la moelle osseuse des membres, un déficit moteur. Le porteur n'utilise que des femelles, chez qui les tumeurs se développent selon lui "de manière plus régulière, homogène et prévisible".

Objectifs

Notre corps possède des défenses naturelles contre les maladies : le système immunitaire. Celui-ci est constitué notamment de cellules tueuses, qui peuvent éliminer des cellules infectées ou anormales. Cependant lors d’un cancer, ces cellules n’ont pas forcément la capacité de reconnaître les cellules cancéreuses. Ainsi le cancer se propage. Une nouvelle approche de thérapie cellulaire, appelée CAR-T, améliore cette capacité à cibler les cellules cancéreuses. Les cellules tueuses issues d’un patient atteint d’un cancer sont modifiées génétiquement pour que celles-ci ciblent au mieux les cellules cancéreuses. Cependant, cette approche est 100% personnalisée : longue, coûteuse et incertaine. Pour contourner ces limites, nous développons une alternative : des cellules tueuses reprogrammées « universelles » issues d’un donneur sain et non pas d’un patient. Ces cellules universelles peuvent s’adapter au système immunitaire de chaque patient sans risque de rejet, rendant le traitement plus rapide et accessible. L’objectif de cette étude est de tester ces cellules universelles dans un modèle de souris afin d’observer leur comportement et leur efficacité contre le cancer. Nous voulons notamment vérifier si une modification spécifique améliore leur action anticancéreuse en bloquant un certain mécanisme biologique. À terme, ce projet pourrait ouvrir la voie à des thérapies plus efficaces et accessibles contre le cancer, en simplifiant la production des cellules CAR-T pour une utilisation en clinique.

Bénéfices attendus

Les résultats positifs de ce projet pourraient aboutir à la mise sur le marché d'un nouveau médicament de thérapie cellulaire pour les patients en impasse thérapeutique. Ce médicament sera à la fois plus puissant et plus sûr que les traitements actuels, produit à des coûts drastiquement diminués (puisqu'il s'agit d'une thérapie cellulaire universelle) et donc disponibles à l'ensemble des patients qui en ont besoin. De plus, cela permettra d’avoir un modèle de souris pertinent pour les études des cellules tueuses reprogrammées.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injection de cellules tumorales par voie intraveineuse, sans anesthésie (1x/souris, durée ~5 minutes). Injection de cellules thérapeutiques matures ou immatures par voie intraveineuse, sans anesthésie (1x/souris, durée ~5 minutes). Injection d’un médicament afin de permettre la prise de greffe des cellules thérapeutiques immatures (1x/souris, durée ~1 minutes). Imagerie sous anesthésie générale, jusqu’à 12 fois par souris (durée ~10 minutes par session, 1x/semaine), précédée de l’injection d’un agent de détection de la tumeur sur souris vigile (jusqu’à 12x/souris, durée ~1 minute). Prélèvements sanguins, réalisés sans anesthésie (6-7x/souris, ~1 minute, 1x/2semaines) soit sous anesthésie générale (1x/souris, ~5 minutes, pour le dernier prélèvement).

Impact sur les animaux

Stress : l’ensemble des manipulations, contentions et transports peut engendrer un stress chez les souris. Douleurs légères : potentiellement présentes après injection intraveineuse (de cellules CAR-T matures, non matures) ou abdominale et prélèvements sanguins sous antidouleur. Probables maux de tête et nausée par suite du traitement avec un médicament. Altération de l’état général : possible en lien avec le développement tumoral exemple : perte de poids. Déficit moteur des membres inférieurs : possible si la tumeur atteint la moelle osseuse des membres.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car nous prélèverons des tissus post-mortem pour analyse ou si un point limite est atteint en cours de procédure.

Remplacement

Les cellules tueuses du cancer ont été étudiées en laboratoire. Cependant, la réponse du système immunitaire est très complexe, car elle implique différents types de cellules et des interactions spécifiques. Cela rend difficile d’étudier la réponse complète seulement en laboratoire. Pour cette raison, nous devons utiliser des souris pour ces recherches thérapeutiques, car on ne peut pas encore se passer d'un modèle préclinique avant les essais clinique chez l'Homme. De plus, on utilise des souris modifiées et disponibles à l'achat pour avoir un système immunitaire humain, ce qui permet de tester des cellules humaines directement applicables ensuite en essai clinique. Avant d'être testées chez la souris, les cellules ont été validées dans notre laboratoire selon nos meilleures connaissances. Nous obtenons ainsi des informations qui ne peuvent être obtenues que chez la souris et nous les utiliserons pour réduire encore davantage le recours aux expérimentations animales à l'avenir.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum sans toutefois compromettre l’analyse statistique des résultats. En effet, un outil statistique a été utilisé pour calculer le bon nombre d’animaux à utiliser. Suivre les animaux au fils du temps par des analyses répétées comme l’imagerie (grossissement de la tumeur) et le contrôle du sang entraîne une meilleure analyse de l’effet biologique, ce qui permet des expériences à haute puissance avec un faible nombre de souris.

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux grâce à un suivi quotidien des animaux afin de d’observer leur comportement, leur apparence et tous signes qui permettraient d’identifier des indications révélatrices de souffrance animale. Des points limites clairs sont définis pour arrêter le projet afin de limiter la souffrance des animaux. Un tapis chauffant afin d’éviter l’hypothermie de l’animal sera mis en place et du gel hydratant oculaire sera appliqué afin d’éviter un dessèchement lors des séances d’imagerie. Les animaux seront placés sous anesthésie générale et auront des antidouleurs adaptés. De plus, ce projet fait suite à une étude bibliographique afin de raffiner au maximum les expériences, les injections et les prélèvements. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.

Choix des espèces

Nous utiliserons exclusivement des souris femelles génétiquement modifiées dépourvues de système immunitaire. Ces modèles permettent la greffe de cellules humaines, le développement d’un système immunitaire humanisé, ainsi que la croissance de tumeurs humaines. En plus de leur grande sensibilité aux agents pathogènes, nécessitant des conditions d’élevage en milieu stérile, ces souris présentent une apparence et un comportement comparables à ceux de leurs congénères non modifiées. Le choix d’utiliser uniquement des femelles est motivé par nos observations expérimentales précédentes: chez les femelles, les tumeurs se développent de manière plus régulière, homogène et prévisible, ce qui améliore la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Des souris âgées de 4-8 semaines sont utilisées, afin d’observer si le développement des cellules humaines s’effectue de manière plus optimale en l’absence d’interaction avec les cellules immunitaires de souris.

Un gavage ou une injection par jour, jusqu'à dix semaines d'affilée : 269 souris porteuses de la mutation de la progéria vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent aussi des prélèvements sanguins et des électrocardiogrammes sous anesthésie, et des tests d'agrippement qui mesurent la perte de force musculaire. Le projet teste une molécule sur une lignée portant la mutation sur un seul chromosome, plus proche en cela de la maladie humaine que celle utilisée jusqu'ici. Le porteur retient cette lignée parce que ses signes cliniques apparaissent plus tard et restent moins sévères en début de vie, ce qui simplifie aussi la constitution des groupes.

Objectifs

Ce projet fait suite à une étude qui visait à évaluer l’efficacité in vivo d’une molécule sur un modèle murin de la Progéria (Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS), maladie génétique extrêmement rare qui se déclare dès l’enfance et conduit à un vieillissement prématuré et une mortalité précoce. Nos études ont été réalisées sur un modèle souris portant la mutation responsable de la pathologie sur les 2 chromosomes, récapitulant le tableau moléculaire et clinique de la pathologie humaine, avec notamment un tableau clinique post-natal évoluant en quelques semaines (premiers signes cliniques à 9 semaines d'âge), permettant de tester rapidement l’efficacité d’une molécule sur plusieurs paramètres. Grâce à ce modèle, nous avons pu obtenir des données pré-cliniques dans plusieurs organes d’intérêt et définir les doses minimales permettant d'obtenir un effet thérapeutique. Cela n’aurait pas été possible avec le modèle ne portant la mutation que sur un seul chromosome, qui ne présente les premiers signes cliniques qu'à l'âge de 41-42 semaines. Cependant, la mutation n'est présente que sur un seul chromosome en clinique humaine. Il nous semble donc pertinent d’utiliser le modèle souris avec la mutation sur un seul chromosome pour nous rapprocher davantage des conditions humaines. L’utilisation de ces souris présente plusieurs avantages : 1) La constitution des groupes de souris sera plus simple et rapide; 2) Le tableau clinique est moins sévère en début de vie, réduisant les impacts sur les animaux; 3) Les quantités de protéines toxiques étant moins importantes, il sera possible de comparer plus facilement différentes voies d'administration, tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires. MODIFICATION: les doses et fréquences de traitement ont été ajustées en fonction des études préliminaires pour se placer dans des conditions thérapeutiques optimales, sans aucun signe de toxicité.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra : - d’obtenir une preuve de concept in vivo que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace sur plusieurs signes cliniques prédictifs du cours de la pathologie humaine, dans un modèle de souris portant la mutation sur un seul chromosome; - d’établir une relation pharmacocinétique/pharmacodynamique de la molécule Prodrug et de comparer les résultats obtenus ceux obtenus dans la modèle portant la mutation sur les 2 chromosomes, étudié précédemment. A plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement thérapeutique de cette molécule visant à obtenir une preuve clinique de son efficacité chez l’homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de Progéria.

Procédures

Injections ou gavage oral (1X/jour ou 2X/semaine, MODIFICATION: ou 1X/semaine, sur une durée maximale de 10 semaines; durée de chaque administration: environ 1min). Prélèvements sanguins (sous anesthésie, durée 3-5 min par prélèvement). Mesure de la composition corporelle, méthode non-invasive (3 fois; durée 3 min). Test d'agrippement, méthode non-invasive (3 fois; durée 5 min). Analyse cardiaque par électrocardiographie ECG (3 fois, sous anesthésie; durée 5 minutes).

Impact sur les animaux

Le modèle animal utilisé présente de nombreux signes cliniques retrouvés dans la pathologie humaine. Les souris portant la mutation sur un seul chromosome présentent un léger décrochage dans les courbes de poids à partir de 32 semaines, puis une perte de poids plus importante à partir de 41-42 semaines, accompagnée d'une baisse de la force musculaire et d'une diminution de la fréquence cardiaque. La moyenne de survie de ces souris est de 47 semaines environ d'après la littérature. Après raffinement, notamment l'ajout de nourriture en gel, la perte de poids devrait être limitée, sachant que les procédures seront réalisées avec des animaux de moins de 42 semaines, donc avant apparition des signes cliniques sévères (à 45 semaines). Les animaux subiront des injections, induisant une douleur légère de courte durée; ou des gavages, de douleur légère de courte durée liée à la contention et pouvant potentiellement entrainer des irritations; des pesées, sans douleur hormis la préhension pour sortir l'animal de la cage (test non invasif); des prélèvements sanguins, de douleur légère, pouvant potentiellement entrainer une baisse du volume sanguin; des mesures de la composition corporelle, de douleur très légère liée à la contention (test non invasif); des tests d'agrippement, de douleur très légère liée à l'agrippement en soi sur une grille (test non invasif); et des analyses cardiaques par ECG, de douleur légère liée à l'anesthésie.

Devenir

Les animaux expérimentaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses protéiques. Les animaux utilisés pour réaliser les croisements seront gardés en vie, puis euthanasiés à l'age de 6 mois maximum.

Remplacement

Notre projet s’inscrit dans la continuité d’une étude in vitro menée sur des cellules de patients HGPS. Cependant, ce modèle cellulaire ne permet pas d’explorer l’intégralité des mécanismes métaboliques qui peuvent avoir lieu dans un organisme. Le passage au modèle in vivo est donc une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Il nous est nécessaire de disposer d'un organisme entier pour pouvoir mieux comprendre la pathologie de la progéria. Le seul mammifère modèle de la maladie qui nous permet de réaliser des essais pré-cliniques en vue d’une mise en œuvre d’essais thérapeutiques chez l’Homme est la souris. Il existe aussi un modèle de porc, cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats d’efficacité et de pharmacocinétique interprétables. Dans ce sens la cohorte destinée à l’analyse de l’efficacité précoce comporte 8 animaux par groupe. L’estimation du nombre d’animaux par groupe nécessaire a été réalisée sur le critère principal suivant : comparaison du niveau moyen de progérine entre chaque groupe de traitement. La deuxième cohorte destinée à l’évaluation de différentes voies d'administration comporte également 8 animaux par groupe. Enfin la dernière cohorte destinée à l’observation plus tardive d’un phénotype clinique mesurable comporte 10 animaux par groupe. Durant cette étude, nous allons générer des données paramétriques (poids, glycémie, paramètres sanguins, paramètres cardiaques), qui seront analysées à l'aide de tests statistiques adéquats (mesures simples ou répétées). Pour l’ensemble des cohortes, le nombre d’animaux utilisés a ainsi été optimisé pour permettre d’observer un effet du traitement.

Raffinement

Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, l’apparence physique. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas d’inflammation des yeux, les animaux seront traités avec une crème ophtalmique, 1 à 2 fois par jour pendant minimum 5 jours). En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal blessé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux par spray cutané seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés chaque semaine et observés quotidiennement. Afin de maintenir un état nutritionnel correct, nous utiliserons, si nécessaire, une alimentation sous forme de gel, facile à ingérer par les souris afin d’éviter toute malnutrition. Lors des prélèvements sanguins, une compensation du volume prélevé sera effectuée avec du sérum physiologique.

Choix des espèces

Le modèle murin est le seul modèle envisageable pour tester des approches thérapeutiques dans le cadre de la pathologie HGPS, puisqu’il s’agit d’une maladie génétique qui a été modélisée sur la souris. Le modèle que nous utilisons récapitule à la fois la mutation génétique de la maladie, ainsi que la majorité des caractéristiques cliniques et de l’évolution de la pathologie observée chez l’Homme. Une seule autre espèce génétiquement modifiée existe, il s’agit d’un modèle de porc. Cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée. Les animaux seront traités de l’âge de 5 à 7 semaines dans les études de pharmacocinétique et d'évaluation de l'effet du traitement sur la quantité de protéine toxique. Nous utiliserons des animaux de 32-42 semaines pour évaluer l'effet du traitement sur les symptomes cliniques qui commencent à apparaitre à 41-42 semaines environ, hormis un léger décrochage dans la courbe de poids qui peut être noté à partir de 32 semaines. Nous utiliserons des animaux hétérozygotes agés de 8 semaines a minima pour générer les cohortes expérimentales.

Les images produites doivent illustrer un brevet en cours de rédaction et servir de base à la création d'une startup. 66 souris jeunes adultes vont être utilisées pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe trois séances d'IRM sous anesthésie, dont une de trois heures avec injection d'un agent de contraste au fer, puis deux séances d'une heure à trois et sept jours pour vérifier son élimination. Le porteur retient trois animaux par agent testé, "le nombre minimal permettant de conclure qualitativement", et prévoit de les maintenir en vie pour les réutiliser dans un autre projet.

Objectifs

Les agents de contraste IRM sont des molécules destinées à améliorer la qualité des images en réhaussant le signal là où elles sont présentes (hypersignal). Cela permet, lors d’un examen par IRM, de mettre en évidence certaines régions difficiles à visualiser. Les agents de contraste utilisés en IRM sont majoritairement à base de gadolinium. Certains, dits « linéaires », sont instables et peuvent relarguer du gadolinium dans l’organisme, avec accumulation dans divers organes (reins, os, cerveau). Ce phénomène est lié à des complications telles que la fibrose systémique néphrogénique, notamment chez les patients en insuffisance rénale sévère. En 2017, l’Agence européenne des médicaments a recommandé de restreindre l’usage de certains agents linéaires et de suspendre de nouvelles autorisations. Depuis, plusieurs produits ont été retirés du marché, et les radiologues appliquent une vigilance renforcée. Les agents restants, bien que plus stables, restent contre-indiqués chez des populations à risque : femmes enceintes, enfants en bas âge, personnes âgées, patients transplantés ou insuffisants rénaux, et ceux nécessitant des examens fréquents. Face à ces limites, l’équipe porteuse du projet développe depuis plus de 15 ans des agents de contraste à base de fer, un élément naturellement présent dans l’organisme, doté de écanismes de régulation et d’élimination. Ces nouveaux agents sont prometteurs pour réduire le risque chez les patients sensibles, tout en offrant une efficacité diagnostique équivalente, voire supérieure. Les études in vitro ayant montré une bonne biocompatibilité, le projet entre en phase préclinique. Cette étape vise à évaluer leur comportement en IRM, leur pharmacocinétique et leur tolérance, en vue d’un futur transfert clinique.

Bénéfices attendus

Les acquisitions d’images réalisées illustreront et exemplifieront le brevet en cours de rédaction, qui constitue la base de la propriété intellectuelle nécessaire pour développer le projet et créer une startup. Ces études précliniques représentent une étape cruciale, en démontrant l’intérêt médical et la faisabilité pratique de la technologie. La preuve de concept ainsi apportée est essentielle pour obtenir les financements nécessaires au développement d’un agent de contraste destiné à l’humain, qui représente un investissement important. Par ailleurs, les images recueillies valideront pré-cliniquement la structure des molécules testées, permettant ainsi de sélectionner la molécule candidate pour la suite des démarches réglementaires et des essais en conditions de bonnes pratiques de laboratoire (Good Laboratory Practice GLP) En définitive, ces résultats favoriseront l’avancement du projet vers la phase clinique et, ultérieurement, sa commercialisation en tant que nouvel agent de contraste pour l’IRM.

Procédures

Les animaux subiront trois séances d'imagerie IRM sous anesthésie générale à l’isoflurane et une injection unique de produit de contraste lors de la première séance (3 heures); deux séances supplémentaires (1 heure) sont prévues trois et sept jours plus tard afin de vérifier l'élimination complète du produit. Cette injection sera réalisée de manière systémique 15 minutes après la procédure d’anesthésie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus, bien que rares, sont de même nature que pour une injection de produit de contraste commercial : hypersensibilité, réaction anaphylactique, allergie cutanée, vasodilatation, malaise, fièvre, nécrose tissulaire, phlébite au point d’injection. La concentration sera identique à celle que l'on injecte classiquement chez l'humain et sera strictement inférieure à la dose létale médiane mesurée sur cellules vivantes. La déshydratation de l’animal suite à la première session d’imagerie qui durera trois heures, ainsi qu’une dessication des yeux sont prévus et pris en charge par la procédure expérimentale.

Devenir

Les interventions effectuées sur les animaux sont compatibles avec un maintien en vie des animaux et ceux-ci pourront être réutilisés dans un autre projet.

Remplacement

Ce projet, à la frontière entre la recherche fondamentale (de par la totale nouveauté des concepts moléculaires développés) et la recherche appliquée (valorisée par un futur brevet), a permis la réalisation d’une preuve de concept in vitro. Dans une optique de développement du concept moléculaire vers un agent d’imagerie à destination de l’humain, effectuer des tests de biocompatibilité, de performance et de pharmacocinétique in vivo de molécules sur petit animal est une étape indispensable avant le passage chez l’Homme (essais cliniques réglementaires). Dans ce but, aucune autre procédure ne peut remplacer cette étude.

Réduction

Le nombre total estimé d'animaux nécessaire est basé sur le nombre maximum d'agents de contraste à tester avec aux plus trois animaux par agent, trois étant le nombre minimal permettant de conclure qualitativement sur l'intérêt pour l'imagerie IRM d'un agent de contraste donné. C’est la raison pour laquelle le projet n’utilisera pas d’animaux de réforme, afin de garantir une comparaison fiable des données avec le nombre limité d’animaux utilisés. Les animaux seront imagés deux fois supplémentaire pour vérifier la présence ou non d’hypersignal dans certains tissus. L’IRM étant une technique d’imagerie non-invasive, elle permet de réduire par trois le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée selon la dernière directive en vigueur. Nous placerons des boîtes percées dans les cages en guise de raffinement de l’habitat. Le transport des animaux sera effectué sur une distance d’une cinquantaine de mètres via un chariot sur roues pneumatiques atténuant toutes vibrations pour être imagés. Les animaux subiront une procédure avec un temps d’anesthésie inférieur à trois heures. Les rongeurs seront conditionnés dans un lit dédié à l’exploration anatomique, chauffé par thermorégulation par système de circulation d’eau chaude avec monitoring de la respiration et suivi de température. On injectera aux animaux une solution de sérum glucosé chauffée à température corporel : 0.5mL seront injectés après le début de l’anesthésie, puis 1mL juste avant leur réveil afin de les réhydrater. On instillera une goutte d’Ocrygel dans chaque oeil de l’animal pour prévenir de la dessication oculaire. Notre attention sera portée sur les procédures expérimentales pouvant causer un stress ou une douleur telle que l’injection intraveineuse d’agents de contraste. Les animaux replacés à l’animalerie seront suivis quotidiennement. .

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus adaptée pour évaluer pré-cliniquement les agents de contraste sur l’instrument d’IRM préclinique à disposition. Le faible volume corporel de la souris permet une imagerie précise et résolue du corps entier. En effet, l’instrument est adapté à l’imagerie de petits rongeurs en disposant d’une cavité adaptée et d’un lit adapté. De plus, le faible volume sanguin de la souris implique un faible volume d’injection et donc la production d’une quantité d’agent de contraste acceptable pour le laboratoire de chimie qui produit les AC. Les souris utilisées seront au stade de développement « jeune-adulte ». Elles seront commandées à l’âge de 5 semaines

Isolées en cage individuelle pendant deux semaines au sortir du sevrage, 512 souris subissent ensuite jusqu'à huit injections dans l'abdomen, quatre incisions de la queue pour prélever du sang et, pour certaines, deux chirurgies crâniennes de trente-cinq et quarante minutes destinées à implanter des dispositifs d'enregistrement neuronal. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélever leur cerveau. Le projet cherche à savoir si l'isolement social à l'adolescence favorise l'anxiété à l'âge adulte, en reproduisant chez la souris l'isolement dont il veut mesurer les dégâts. Trois tests comportementaux de cinq à dix minutes sont annoncés, présentés comme fondés sur des comportements innés et donc sans effet indésirable attendu, sans qu'aucun soit nommé.

Objectifs

Il a été suggéré que l'isolement social durant la période adolescente constitue un facteur de risque au développement de troubles anxieux à l'âge adulte. Néanmoins la compréhension des mécanismes impliqués reste très parcellaire en raison de la nature observatoire et corrélationelle des études épidémiologiques disponibles à ce jour. Sur la base de ces observations, notre projet a pour objectif de mettre en place un modèle murin d'isolement social durant l'adolescence, d'en analyser les conséquences comportementales à long-terme en se concentrant sur le profil émotionnel, et de relier les potentiels dysfonctionnements comportementaux à une altération du développement de l'hippocampe, une structure clé pour le contrôle des états émotionnels. La réalisation de ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de comprendre les déficits comportementaux associés à la privation sociale durant l'adolescence, et d'en aborder certains mécanismes. La compréhension de ces mécanismes devrait nous permettre à moyen terme de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement ces mécanismes, mais aussi de développer des interventions préventives visant à réduire les effects néfastes de l'isolement sur la santé mentale.

Procédures

1) Hébergement individuel: il sera d'une durée de 2 semaines et sera réalisé dans l'Etablissement utilisateur 1 (EU1). 2) Injections intrapéritonéales: elles sont au nombre de 3 à l'âge de 4 semaines et 5 à l'âge de 10 semaines. La durée moyenne d'une injection, préhension de la souris inclue est de 30-40 secondes. Les injections seront réalisées dans l'EU1. 3) Stress aigu d'une durée de 6 min ou hébergement individuel d'une durée de 24 h. Ces interventions sont réalisées dans l'EU1 et concernent des animaux différents. 4) Tests comportementaux: ils sont au nombre de 3, et durent de 5 à 10 min chacun. Ils sont réalisés dans l'EU1 ou l'EU2. 5) Prélèvements sanguins: ils sont au nombre de 4 , et durent moins de 3 min, préhension de l'animal inclue. Ils sont réalisés dans l'EU1 sur des animaux n'ayant subi aucun test au préalable. 6) Chirurgie: sur animal adulte une chirurgie de 60 min environ est pratiquée; sur animal adolescent 2 chirurgies sont pratiquées, une à 4 semaines d'une durée moyenne de 35 min et une au moins 5 semaines plus tard d'une durée de 40 min environ. Les chirurgies sont réalisées dans l'EU1.

Impact sur les animaux

1) L'isolement social peut induire un état de stress de degré modéré puisque de courte durée. 2) Les injections intrapéritonéales peuvent engendrer un léger inconfort. 3) Le stress aigu sera à l'origine d'un incomfort passager, sans conséquences à long terme. 4) Les tests comportementaux sont basés sur les comportements innés des animaux et sont donc sans effet indésirable attendu. 5) Les prélèvements sanguins nécessitent une légère incision de la queue, ce qui peut entrainer une gêne et une légère douleur très locale et de très courte durée, avec un risque très faible d'une hypovolémie / anémie en cas de saignement non maitrisé, ce que nous n'avons jamais observé par le passé. 6) Les procédures chirurgicales, comme l'implantation de dispositifs pour l'enregistrement neuronal, comportent un risque de complications telles que des infections ou des réactions inflammatoires. Elles peuvent également générer de la détresse et du stress ainsi que de la douleur postopératoire d’un degré de gravité modéré, qui sera minoré par les antalgiques administrés.

Devenir

Les souris sont toutes euthanasiées en vue de prélever le cerveau pour analyse.

Remplacement

L’étude de comportements, notamment sociaux et relatifs aux emotions, ne peut être réalisée que sur animaux vivants ce qui rend impossible leur remplacement par des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes. Pour les études comportementales, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous effectuerons lorsque cela est possible sans biaiser les résultats de l'experience plusieurs test sur les mêmes animaux.

Raffinement

Pour réduire la souffrance imposée par le protocole, les règles suivantes seront appliquées pour le bien-être des animaux: 1- En amont des tests comportementaux, toutes les souris seront habituées à l'expérimentateur par des pesées hebdomadaires. Elles seront acclimatées aux pièces de test pendant une durée d'au moins 45 min avant le démarrage des tests, et surveillées pendant au moins 30 min à l'issue des tests afin de détecter l'apparition d'une anomalie comportementale (stéréotypie, prostration, grooming excessif…). 2- Avant les chirurgies, un analgésique sera administré en sous-cutané, à titre préventif afin d’éviter la souffrance post-opératoire. 3- Les chirurgies se feront sous anesthésie générale. Durant la chirurgie, la température de l’animal sera contrôlée par une sonde durant la chirurgie, et maintenue grâce à un tapis chauffant. Un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux pour prévenir la déshydratation oculaire. Un analgésique sera injecté avant la chirurgie ainsi que 24h après. 4- Après la chirurgie, de la nourriture humidifiée sera mise à disposition au sol de la cage. L’état de l’animal et la bonne cicatrisation de l’incision dans la peau de la tête seront contrôlés quotidiennement pendant la semaine suivant la chirurgie. Des points limites ont été établis pour chaque critère avec un arbre de décision. Si l’animal perd du poids, de la nourriture enrichie humide sera fournie. Si la plaie ne cicatrise pas correctement, elle sera désinfectée et surveillée. Si la souris est en souffrance, un analgésique sera injecté. Si les anomalies persistent, le vétérinaire sera contacté afin de prendre les mesures les plus adaptées pour le bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La neurogenèse dans le cerveau adulte, qui est notre candidat mécanistique pour expliquer les effets de l'isolement social, a été largement étudiée chez les rongeurs, lesquels représentent un modèle pertinent en raison de la similitude de leurs réponses physiologiques au stress avec celles des humains. Ils permettent ainsi une exploration intégrée des effets comportementaux, neurobiologiques et génétiques du stress. Par conséquent, la souris a été choisie comme modèle principal dans ce projet car 1) il est en continuité avec les études publiées sur des modèles équivalents , et 2) il permet l'utilisation d'outils transgeniques pour valider les hypothèses que nous pourrons formuler à l'issue des études. Les animaux seront utilisés à partir du sevrage puisque notre modèle a pour objectif d'étudier l'impact de l'isolement social à l'adolescence (P21-P35) sur la vulnérabilité / résilience à développer des troubles anxieux à l'âge adulte.