Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Evaluation de la réponse à un traitement associant antibiotique et molécule antimicrobienne contre les infections urinaires causées par la bactérie Escherichia coli
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Un cathéter est passé dans l'urètre de chaque souris sous anesthésie pour y injecter des bactéries qui gagnent la vessie puis remontent aux reins, après quatorze heures de privation d'eau. 3 052 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec jusqu'à six injections et six prélèvements d'urine par animal sur dix jours. Le porteur indique que les souris ne montrent pas de signes visibles d'inconfort liés à l'infection urinaire. Il précise par ailleurs qu'aucun anti-douleur ne sera administré, l'analgésie risquant d'augmenter le risque infectieux et d'interférer avec les résultats, et que les souris très voûtées, immobiles ou au poil hérissé sont mises à mort avant les autres.
Objectifs
Les infections urinaires figurent parmi les infections bactériennes les plus courantes chez l’être humain. Chaque année, environ 150 millions de cas sont recensés dans le monde. Ces infections représentent un enjeu majeur de santé publique, notamment en raison de l’importante consommation d’antibiotiques qu’elles impliquent. Cela contribue au développement de l’antibiorésistance, un phénomène préoccupant à l’échelle mondiale, reconnu comme une priorité par l’Organisation Mondiale de la Santé. La bactérie Escherichia coli, est la principale responsable des infections urinaires (dans environ 80 % des cas). En effet, si la majorité des souches sont inoffensives, certaines peuvent devenir virulentes et provoquer des infections urinaires, qu’elles soient basses (comme la cystite) ou hautes (comme la pyélonéphrite). La récidive de ces infections est fréquente et pose un véritable problème, à la fois pour la qualité de vie des personnes touchées et pour la santé publique, du fait des traitements répétés et de la consommation accrue d’antibiotiques qu’elle entraîne. L’objectif de notre projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements, en testant l’association d’un antimicrobien avec différents antibiotiques, dans le but de mieux soigner ces infections tout en limitant l’émergence de résistances et les récidives d’infection.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à déterminer l’efficacité et le devenir dans l’organisme, de nouvelles associations d’antibiotiques avec un antimicrobien, dans le traitement des infections urinaires causées par la bactérie Escherichia coli. Ces infections peuvent toucher différentes parties du tractus urinaire, c’est-à-dire les organes impliqués dans la production et l’évacuation de l’urine : les reins, les uretères, la vessie et l’urètre. Nous pensons que l’analyse directe de ce phénomène chez l’animal nous permettra d’améliorer le traitement en l’adaptant au mieux au comportement de la bactérie dans le site infecté. Les résultats de ce projet contribueront à l’élargissement des options thérapeutiques disponibles, en particulier contre les bactéries multirésistantes ou capables de persister dans l’organisme malgré les traitements actuels.
Procédures
-L’infection est réalisée en plaçant un cathéter (une petite sonde) au niveau de l’orifice par lequel s’écoulent les urines (urètre) de la souris et jusque dans la vessie et en injectant doucement 50 microlitres de bactéries qui vont infecter la vessie et remonter jusque dans les reins. Ce geste est réalisé sous anesthésie générale. Cette étape d'infection dure environ 3 minutes par animal. -Le traitement antibiotique est réalisé par des injections sous cutanées d’antibiotiques sur un animal vigile (durée du geste d'environ 15 secondes). La fréquence dépend de l’antibiotique ainsi que la durée du traitement (24 à 48 heures). - Les prélèvements sanguins sont réalisés sur animaux anesthésiés et sous analgésique. -Les urines sont recueillies au cours d’une miction spontanée ou par pression abdominale douce. -La durée de l'infection est variable de 60 heures à 10 jours. - Chaque souris fait l’objet d’au maximum : une injection pour l’infection, de 3 à 6 injections supplémentaires (ou davantage si le traitement nécessite des réinjections), de 1 à 6 prélèvements d’urine (selon la durée de l’infection : 1 prélèvement pour 60 heures, ou 6 prélèvements sur 10 jours, à raison d'un toutes les 48h), et un prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
Le passage du cathéter dans l’urètre peut entraîner une légère irritation locale, mais aucune difficulté à uriner n’a été observée chez les souris infectées. Les souris ne montrent pas de signes visibles d’inconfort liés à l’infection urinaire elle-même. Les injections répétées nécessaires à l’infection puis au traitement (sous cutanées ou intra-péritonéales) peuvent générer un stress dû à la manipulation et, parfois, une irritation locale. De plus, les souris sont privées d’eau durant les 14 heures qui précèdent l’infection urinaire. Cependant, sur cette courte période, aucun signe de déshydratation n’a été observé. Ce modèle expérimental ne provoque pas de passage de la bactérie dans le sang, ce qui évite les complications liées à une infection grave dans la grande majorité des cas. Dans de rares cas (moins de 5 %), certaines souches bactériennes peuvent entraîner chez les souris des signes d’infection plus marqués, tels qu’une fatigue importante, une perte de poids ou une baisse d’activité. La mortalité reste toutefois inférieure à 3 % et survient généralement dans les 48 heures suivant l’inoculation.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de prélever stérilement leurs organes (vessie, reins) après la mort pour analyser les bactéries qui s'y trouvent.
Remplacement
L’accès direct aux organes touchés par l’infection urinaire, comme les reins et la vessie, est très limité chez l’être humain, en dehors de ce qui peut être analysé dans les urines. Il est donc impossible d'étudier directement dans le corps humain la manière dont les traitements agissent localement, ni de mesurer leur concentration dans les tissus infectés, sans utiliser de modèle animal. À ce jour, il n’existe pas de modèle en laboratoire suffisamment complexe pour reproduire la diversité des mécanismes en jeu lors d’une infection urinaire. De même, les modèles numériques ou informatiques (modèles réalisés par simulation sur ordinateur) ne permettent pas encore de remplacer les études réalisées chez l’animal.
Réduction
Avant de mener des expérimentations sur l’animal, de nombreuses analyses en laboratoire seront réalisées afin de sélectionner les meilleures souches bactériennes et les associations les plus prometteuses entre les antibiotiques et la molécule antimicrobienne. Ces tests préliminaires permettront également de limiter le nombre de doses à tester et de vérifier que les deux traitements agissent bien ensemble de façon complémentaire. L’objectif est de réduire au maximum les conditions expérimentales et donc le nombre d’animaux nécessaires. Nous nous appuierons également sur des outils d’analyse issus de nos travaux précédents, ainsi que sur des approches basées sur des calculs à partir des données obtenues, pour limiter encore davantage les essais à mener. L’organisation des groupes expérimentaux est pensée pour obtenir des résultats fiables tout en évitant des expérimentations inutiles. Lorsque l’on utilise les mêmes conditions expérimentales pour plusieurs essais, les résultats des groupes témoins (non traités) peuvent être regroupés, ce qui réduit le nombre d’animaux utilisés. Enfin, les organes prélevés (comme les reins ou la vessie) sont conservés à très basse température (-80°C) afin de pouvoir réaliser, si besoin, des analyses complémentaires ultérieures sans avoir à répéter les expériences.
Raffinement
En ce qui concerne le raffinement, il est obtenu grâce au respect d’une acclimatation de 7 jours entre l’arrivée des souris au laboratoire et le début de l’expérimentation animale. Les conditions optimales d’hébergement des souris sont respectées : 5 souris par cage maximum. Les souris sont également hébergées en milieu enrichi avec des cotons et un tunnel pour que les animaux puissent se faire un nid, s'abriter ou se cacher. Les souris seront hébergées tout au long de la procédure en portoir ventilé avec accès à la nourriture et à l’eau. Elles seront observées au moins une fois par jour et avant chaque nouvelle injection d'antibiotique. Une grille de suivi des différents paramètres (apparence de la souris, niveau d’activité, comportement) sera remplie au fur et à mesure de l’étude. En cas d'atteinte d'un paramètre terminal (souris très voutée, immobile ou avec le poil très hérissé) l’animal est euthanasié (l’administration d’un anti-douleur pourrait augmenter le risque infectieux et interférer dans les résultats). Une courte anesthésie générale est utilisée pour permettre l’infection des souris par la vessie sans douleur. De plus, une analgésie puis une anesthésie sont administrées avant la réalisation du prélèvement sanguin.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux vertébrés dont l’anatomie et le fonctionnement des reins et de la vessie sont assez proches de ceux de l’être humain. Cela permet d’étudier de manière pertinente les mécanismes impliqués dans les infections urinaires. La souris est d’ailleurs l’espèce la plus utilisée dans ce domaine par la communauté scientifique internationale. Une étude récente a montré que les bactéries responsables des infections urinaires se comportent de façon très similaire chez l’homme et chez la souris, en activant les mêmes types de gènes lorsqu’elles sont présentes dans l’urine. Les souris utilisées dans ce projet sont adultes (8 semaines, environ 20 à 25 grammes), ce qui permet de comparer nos résultats à ceux déjà publiés dans la littérature scientifique.
Développement de modèles de Médulloblastome et étude de l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce cancer
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
5 758 souris vont être utilisées, toutes tuées, dont 3 446 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune peut recevoir deux injections par jour ou un gavage une à deux fois par jour pendant un à deux mois, après qu'on lui a injecté des cellules de médulloblastome dans le cervelet ou greffé un fragment de tumeur sous la peau. Des souriceaux subissent la même injection intracérébrale, ce cancer touchant des enfants et le porteur cherchant à en reproduire l'environnement. La tumeur cérébrale provoque perte de poids, tête penchée et troubles de la locomotion, et le porteur conclut qu'après les travaux en culture le passage par un "organisme entier" devient "indispensable".
Objectifs
Le cancer est une maladie qui touche l’ensemble de la population et qui est, encore aujourd’hui, un véritable fléau pour la société. Nous nous intéressons plus particulièrement à un cancer touchant les enfants, le Médulloblastome. Le Médulloblastome est la tumeur cérébrale maligne la plus commune en pédiatrie. Ce cancer touche entre 100 et 200 enfants chaque année en France. Actuellement, le taux de survie à 5 ans est inférieur à 80%. Les traitements existants sont la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie mais ils laissent malheureusement d’importantes séquelles. A ce jour, il n’existe aucune thérapie ciblée qui permettrait d’agir sur des marqueurs spécifiques des cellules tumorales de Médulloblastome et ainsi réduire les effets secondaires pouvant être causés par des thérapies conventionnelles avec un champs d’action plus large touchant à la fois les cellules tumorales mais aussi les cellules saines. Ainsi, une meilleure compréhension de la maladie permettrait le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Notre travail consiste tout d’abord à comprendre les mécanismes conduisant à l’apparition de ce cancer afin d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans le but d’étudier ces mécanismes, nous utilisons des modèles mimant ces tumeurs. Ces modèles peuvent s’étendre de la cellule tumorale en culture jusqu’à l’utilisation de modèles animaux. Nos dernières études nous ont permis d’identifier 5 stratégies thérapeutiques prometteuses pour le traitement du Médulloblastome. Tout d’abord, nous avons montré, par des études bioinformatiques, l’importance de différents gènes dans le développement de ces tumeurs cérébrales. De plus, nous avons mis en évidence, dans des systèmes de culture de cellules tumorales in vitro, que ces 5 stratégies thérapeutiques, basées sur l’utilisation de nouvelles molécules, induisent la mort des cellules tumorales. Il nous est maintenant nécessaire de pouvoir étudier l’efficacité de ces approches in vivo en utilisant pour modèle, la souris. Ainsi, dans le cadre de ces projets, nous étudierons, chez la souris, l’effet de différents traitements sur le développement et la croissance tumorale de différents modèles de Médulloblastome. En conclusion, notre travail pourrait apporter une avancée conséquente dans le domaine du cancer du cerveau chez l’enfant.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à améliorer notre connaissance des mécanismes impliqués dans le développement tumoral des différents sous-groupes de Médulloblastome. Et il permettra également de valider l’efficacité de nos approches thérapeutiques in vivo, avec pour finalité une éventuelle transposition à l’Homme si les résultats s’avèrent satisfaisants
Procédures
- Un premier lot de souris sera injecté avec des cellules tumorales sous la peau (durée de l’anesthésie 2min). Dans un 2ème lot, des cellules seront injectées dans le cervelet de souris adultes anesthésiées (15min). Un troisième lot de souris sera constitué de souris génétiquement modifiées. Toutes ces souris seront ensuite traitées soit par 1) injection 3 fois/semaine (1min), 2) injection 2 fois/jour (30sec), 3) gavage (30sec) 1 à 2 fois/jour, 4) injection 3 fois/semaine + gavage 1 fois/jour, 5) injection 2 fois/jour + gavage 1 fois/jour, pendant 1 à 2 mois selon la croissance tumorale. - Dans un 4ème lot, des cellules tumorales génétiquement modifiées ou non seront injectées dans le cervelet de souris adultes sous anesthésie gazeuse (15min) puis le développement tumoral sera suivi au cours du temps. - Dans un 5ème lot, des cellules tumorales seront injectées dans le cervelet de souriceaux sous anesthésie (10min). Puis, ces dernières seront traitées à raison de soit 2 injections par jour (30sec) soit 3 injections par semaine, pendant 1 à 2 mois selon la croissance tumorale. - Dans un 6ème lot, des souris anesthésiées seront greffées avec des fragments de tumeurs sous la peau (durée de l’anesthésie : 15min) - Dans un 7ème lot, des cellules tumorales seront injectées dans le cervelet de souris adultes sous anesthésie (15min). Puis, ces souris recevront un régime alimentaire modifié en acide gras ou non et un traitement par injection 1 fois/semaine, pendant 1 à 2 mois selon la croissance tumorale. Un prélèvement de sang sous anesthésie (< 1min) sera réalisé au moment de la mise à mort. Une partie des animaux des lots 2, 3, 4, 5 et 7 seront opérés sous anesthésie générale profonde juste avant leur mise à mort pour remplacer le sang par une solution de fixation (durée de l’anesthésie : 15 min). Les animaux ne reprendront pas conscience après cette anesthésie.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir un stress modéré de courte durée lors de la contention et de l’initiation de l’anesthésie. Les procédures d’injection de traitements sont susceptibles d’entraîner également un stress et une douleur légère de courte durée chez l’animal. Il est possible que certains traitements entraînent à certaines doses une éventuelle toxicité pouvant causer une perte de poids de l’animal. L’acte chirurgical permettant la greffe tumorale pourra entraîner un stress et une douleur modérée dû à l’incision du plan cutané. De plus, l’injection de cellules tumorales chez l’animal est susceptible d’entraîner un léger stress et une légère douleur de courte durée due à la piqure. Ces animaux transplantés ou greffés développeront par la suite des tumeurs, qui à partir d’un certain volume, pourront entraîner une certaine gêne, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. La greffe des cellules tumorales dans le cervelet des souris pourra entraîner un stress ainsi que des douleurs post-opératoire chez l’animal durant les 3-4 premiers jours. Suite à cette greffe, le développement de la tumeur dans le cervelet des souris entraînera lui aussi des effets indésirables, tels que la perte de poids, une tête penchée et des problèmes de locomotion.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort et des prélèvements seront réalisés pour des analyses.
Remplacement
Dans un premier temps, des méthodes alternatives telles que des analyses de données de patients nous ont permises d’établir des hypothèses de travail pertinentes en identifiant plusieurs cibles impliquées dans la tumorigenèse des Médulloblastomes. Nous avons préalablement validé ces hypothèses par des études in vitro afin de remplacer en partie l’expérimentation in vivo autant que possible, mais à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux appropriés devient indispensable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. La souris représente un modèle biologique « intégré », permettant d’évaluer une cible dans un système physiologique dans son ensemble et non pas dans un contexte restreint (in vitro). Seule l’utilisation de ce modèle permet donc d’étudier l’efficacité d’une thérapie de manière compréhensive au niveau d’un organisme entier et est donc nécessaire pour les présents projets. De plus, des coupes de cerveau obtenues à partir d’animaux sains seront mises en culture afin d’étudier ex vivo certaines questions scientifiques et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en procédure.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, dès que cela est possible, des expériences préliminaires réalisées sur un nombre restreint de souris permettront de déterminer la fréquence et les concentrations appropriées à utiliser pour les expérimentations de plus grande envergure. De plus, des coupes de cerveau obtenues à partir d’animaux sains seront mises en culture afin d’étudier ex vivo certaines questions scientifiques et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. Le nombre de souris a été choisi de façon à limiter le nombre d’animaux utilisés tout en permettant une analyse statistique adéquate et ainsi une robustesse des résultats obtenus
Raffinement
Les procédures ont été réfléchies de façon à réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. En effet, lors d’interventions chirurgicales, les souris seront anesthésiées et des analgésiants locaux et généraux leur seront administrées pré- et post-opératoire. Durant l’opération, afin d’éviter une hypothermie des animaux, ces derniers seront placés sur un tapis chauffant. De plus, un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux des souris afin d’éviter un assèchement de leur cornée qui peut être causée par l’anesthésie gazeuse. A la fin de la procédure, les souris seront transférées dans une cage propre sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil, puis un gel hydratant et nutritif leur sera fourni afin de faciliter leur récupération post-opératoire. La croissance des tumeurs induites par injection sous-cutanée sera suivie par mesure régulière du volume à l’aide d’un pied à coulisse. Concernant les tumeurs intracrâniennes, la souffrance des animaux pourra, selon les modèles injectés, être anticipée par l’utilisation hebdomadaire de techniques, non invasives, d’imagerie du petit animal, qui permettront d’évaluer leur croissance au cours du temps et ainsi permettre une mise à mort précoce des animaux si cela est nécessaire. Les souris seront surveillées quotidiennement si besoin pour détecter le plus précocement possible la douleur chez ces dernières et y remédier. En cas d’apparition de signes de souffrance (perte de poids importante, prostration…), les animaux seront mis à mort. Une grille de score a notamment été définie afin de détecter la souffrance des souris et mettre en place des soins support destinés à la minimiser, ou d’arrêter l’expérience. En cas d’inconfort visible de l’animal, un gel hydratant et nutritif sera déposé dans la cage et une prise en charge analgésique sera effectuée.
Choix des espèces
La souris est un modèle particulièrement adapté pour les expériences menées en oncologie pour valider des cibles thérapeutiques. De plus, à ce jour, uniquement les modèles transgéniques de souris ont pu récapituler les caractéristiques du Médulloblastome. Leur physiologie est proche de l’Homme et la pharmacologie pertinente pour des applications cliniques. L’utilisation de ces modèles permet également de reconstituer un environnement tumoral complexe qui peut jouer un rôle déterminant dans l’efficacité d’une thérapie. D’autre part, l’utilisation de souris immunodéficientes permet de conserver la signature de la tumeur humaine d’origine tout en l’amplifiant et de minimiser les risques de rejet. Nous utiliserons des souris adultes et des souriceaux selon l’objectif scientifique étudié. Le Médulloblastome étant un cancer pédiatrique, les souriceaux permettront de mimer le plus fidèlement possible l’environnement de ce cancer. Cependant, de par leur petite taille, les voies possibles d’administration des médicaments sont plus limitées chez les souriceaux que chez une souris adulte, empêchant ainsi l’utilisation de certaines molécules nécessaires à ce projet. De plus, l’utilisation de souriceaux implique d’utiliser des souris immunocompétentes car les souriceaux immunodéficients, étant par conséquent plus fragiles, ces derniers ne survivent pas suite à une chirurgie. Ce dernier point nous empêche alors d’étudier des tumeurs humaines qui présentent un risque élevé de rejet dans ces souris. Ainsi, certaines études seront conduites sur des souris adultes dont le système immunitaire est déficient afin de permettre une conservation de la signature de la tumeur humaine d’origine et de minimiser les risques de rejets. Nous utiliserons aussi des souris adultes immunocompétentes lors d’études réalisées sur des souris transgéniques.
Potentiel thérapeutique de l’aérosolisation des nanoparticules d’apolipoprotéine A1 enrichies en alpha-1-antitrypsine chez la souris (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
La procédure s'arrête si le seuil de douleur mécanique d'une souris descend sous 0,3 gramme, mesuré au filament de von Frey. 246 souris sont utilisées, dont 156 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Un emphysème pulmonaire leur est installé sur quatorze jours, elles subissent une biopsie de la queue à six jours de vie, puis des aérosolisations pendant lesquelles elles sont suspendues par les incisives à un panneau incliné à 45 degrés. Le bénéfice avancé, une thérapie inhalée qui remplacerait les perfusions hebdomadaires des personnes déficientes en alpha-1-antitrypsine, reste au stade de la preuve de concept.
Objectifs
Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs : EU1 et EU2. Le déficit en alpha-1-antitrypsine (AAT) est une maladie génétique rare causée par une mutation du gène SERPINA1, responsable de la production de la protéine AAT. L'AAT est principalement synthétisée dans le foie et sécrétée dans la circulation, où son rôle principal est de protéger le tissu pulmonaire contre l'action de différentes enzymes. Ce déficit en AAT est un facteur de risque au développement d'un emphysème pulmonaire, caractérisé par une dégradation progressive et irréversible du tissu alvéolaire, entraînant une diminution de la fonction respiratoire et un risque accru de mortalité. Chez les patients souffrant de cette maladie, l'administration intraveineuse d'AAT réduit la perte annuelle du tissu pulmonaire et ralentit le déclin de la fonction respiratoire. Cela étant, ce traitement n'a aucun effet sur des épisodes d'aggravations des symptôles et donc l'état de santé. Ce projet vise à évaluer un nouveau traitement reposant sur l'aérosolisation de l'AAT, vectorisée dans des nanoparticules lipidiques. Ces nanoparticules ont des propriétés protectrices (anti-inflammatoire, anti-oxydante et anti-infectieuse). Ces effets protecteurs, combinés avec ceux de l'AAT, constituent une thérapie prometteuse pour laquelle l'inhalation permettra une action directe sur les poumons. Ainsi, ce projet qui se déroulera dans deux établissements utilisateurs, a le potentiel de fournir une preuve de concept pour le développement d'une thérapie innovante pour les patients déficients en AAT.
Bénéfices attendus
Recherche médicale : il existe un besoin d'améliorer les normes de soins pour les maladies pulmonaires liées à la déficience en alpha-1-antitrypsine (AATD). L'injection intraveineuse d'AAT a montré une efficacité limitée et les injections hebdomadaires constituent une contrainte sur la qualité de vie des patients. La voie inhalée est une stratégie thérapeutique prometteuse qui améliorera l'observance et l'autonomie des patients. Des études précliniques et cliniques de ces dernières années ont démontré la capacité des nanoparticules lipidiques inhalées à délivrer localement divers médicaments dans les poumons, pour le traitement de maladies pulmonaires telles que les cancers pulmonaires, les maladies pulmonaires obstructives et les infections respiratoires. Les nanoparticules lipidiques ont permis d’atteindre cet objectif tout en améliorant la stabilité des médicaments, en réduisant la toxicité systémique et en permettant une concentration locale plus élevée du médicament dans les poumons. Ici, nos particules ont aussi un intérêt thérapeutique, en potentialisant les effets bénéfiques des nanoparticules à celle de l’AAT. Coûts des soins de santé : des traitements efficaces contre l'emphysème pulmonaire lié à l'AATD et la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO ; 3ème cause de décès dans le monde) pourraient réduire les coûts des soins de santé associés aux hospitalisations et à la gestion à long terme de ces maladies chroniques. Les perspectives du projet sont de mener un essai clinique multicentrique avec des médecins du réseau RespiFIL (Filière Maladies Respiratoires Rares) pour évaluer si l'aérosolisation des nanoparticules enrichits en AAT peut améliorer la santé des patients.
Procédures
Dans l'EU1/2 : Les animaux auront une biopsie de queue à 6 jours et seront soumis à des aérosolisations à l'âge adulte. Parmi les animaux exposés, certains recevront des nanoparticules et ou du LPS et certains auront des mesures de leur fonction respiratoire. Les procédures d’aérosolisations et d’injections intraveineuses dure environ 1 minute et la procédure de mesure de fonction respiratoire dure environ 10 minutes. Ces procédures sont réalisées sous anesthésie générale. Dans l'EU2/2 : Les animaux seront soumis à des aérosolisations de nanoparticules radiomarquées. La procédure d’aérosolisation dure environ 1 minute puis la mesure de la scintigraphie se déroule à 6h, 24h et 48h. Des prélèvements sanguins (caudales) sont aussi réalisés à ces temps. Ces procédures sont réalisées sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
- Nuisance modérée pour la biopsie de queue (douleur légère de courte durée). - Nuisance modérée pour l'instillation intratrachéale. Les souris anesthésiées sont retirées de la chambre d’induction et suspendus par leurs incisives sur un panneau en plexiglas en position couchée, avec une inclinaison d’environ 45 degrés. La durée totale de la procédure d’aérosolisation est d'environ 1 minute. - Nuisance sévère pour la mise en place de l'emphysème pulmonaire. Nous évaluerons le seuil à la douleur dans l’étude pilote en utilisant le test de Von Frey (stimuli mécaniques). Ce test mesure la réponse de retrait à des filaments appliquant une pression mécanique. Chez des souris avec emphysème, on pourrait s'attendre à une hypersensibilité mécanique (réduction du seuil). Une évaluation comportementale sera faite en complément. Si le seuil de douleur est très faible (allodynie mécanique
Devenir
Mise à mort pour prélèvements d’organes
Remplacement
La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de l’emphysème pulmonaire ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de dégradation et de fibrose du tissu pulmonaire impliquent plusieurs types cellulaires : neutrophiles, macrophages, cellules endothéliales, fibroblastes, pneumocyte de type 1 et 2 entres autres. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de l’emphysème tel que l’inflammation et le stress oxydatif. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.
Réduction
Le nombre d’animaux de cette étude se base sur des publications scientifiques ayant décrit des résultats significatifs avec des approches similaires. Chaque expérimentation sera scindée en trois expériences indépendantes. Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont significatifs avec les deux premières expériences (n=8 au lieu de 12 dans l’objectif 2.2 par exemple ; analyses statistiques : two-tailed unpaired t test ou two-way ANOVA). En effet, les résultats, s’ils sont homogènes, peuvent être significatifs avec 8 souris. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le groupe d'animaux suivant.
Raffinement
Pour garantir un environnement optimal, les animaux seront logés dans des cages offrant un espace suffisant, avec un maximum de 5 animaux par cage. Cet aménagement limitera au maximum les contraintes subies et permettra un comportement normal. De plus, l’environnement sera enrichi avec des matériaux pour se nicher et jouer, contribuant ainsi à leur bien-être. Les animaux seront observés de façon continue pendant les 30 premières minutes après l’aérosolisation, puis 3 à 6 fois par jour afin de nous assurer de leur bien-être et de ne pas laisser un animal en souffrance. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté immédiatement au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates. Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale par une personne qualifiée, conformément aux protocoles en vigueur pour minimiser la douleur et le stress des animaux. Nous observerons et analyserons divers points limites spécifiques pour évaluer leur bien-être, tels que : 1. Altération du comportement : signes d'apathie, d'agressivité, d'isolement, ou réduction drastique de l'activité normale. 2. Nutrition anormale : incapacité à se nourrir ou à boire normalement. 3. Perte de poids : surveillance régulière du poids pour détecter toute perte significative. 4. Aspect physique : poil ébouriffé, yeux fermés, respiration laborieuse, posture courbée. Si l'un de ces paramètres ou points limites est atteint, cela sera signalé immédiatement au vétérinaire référent. Celui-ci évaluera la situation et pourra décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal pour limiter ses souffrances, conformément aux règles éthiques en vigueur. Pour compléter le raffinement des procédures, une injection d’analgésique sera réalisée avant chaque intervention et chaque fois que la souris démontrera des signes de douleurs. La mise en place d’une étude pilote permettra aussi d’améliorer les manipulations de l’expérimentateur. Concernant le transport des souris de l’EU1/2 vers l’EU2/2, le transporteur agréé s'engage à réunir toutes les conditions pour assurer la sécurité des animaux et leur bien-être (véhicule climatisée avec des cages de transports agrées sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire, ajout de croquettes humidifiées et paille). Le choix d'un transport dédié uniquement à nos souris permet aussi d'assurer un trajet rapide d'environ 1 heure (80km).
Choix des espèces
La structure et la fonction du système respiratoire des souris présentent des similitudes avec celles des humains, bien que les différences existent en termes de taille et de complexité. Les souris possèdent des bronchioles, des alvéoles, et des cellules immunitaires pulmonaires similaires à celles des humains, ce qui permet d'étudier les effets des traitements inhalés. Les souris montrent des réponses inflammatoires et immunitaires comparables à celles des humains lorsqu'elles sont exposées à des agents pathogènes ou à des stimuli nocifs, permettant ainsi d'évaluer les réponses thérapeutiques des nanoparticules. Les modèles murins d'emphysème sont bien établis et peuvent être induits par diverses méthodes telles que l'exposition à la fumée de cigarette, l'administration d'élastase ou d'autres agents chimiques. Ici, les souris AAT KO reproduisent les caractéristiques clés de l'emphysème humain, telles que la destruction des alvéoles et la perte d'élasticité pulmonaire. Animaux adultes entre 8 et 10 semaines. À l'âge de 8 à 10 semaines, les souris ont atteint une maturité physiologique qui leur permet de mieux refléter les caractéristiques pulmonaires des adultes humains. Les structures alvéolaires et les voies respiratoires sont pleinement développées, ce qui est crucial pour étudier les changements pathologiques induits par l'emphysème. Les souris de cet âge possèdent un système immunitaire mature mais encore flexible, permettant une réponse inflammatoire et immunitaire comparable à celle observée chez les adultes humains. Cela est important pour étudier les mécanismes inflammatoires et immunopathologiques de l'emphysème. Enfin, à cet âge, les souris ont un niveau d'activité physique, de métabolisme et de croissance relativement stable, ce qui minimise les facteurs confondants qui pourraient influencer les résultats expérimentaux.
Evaluation de la toxicité de composés à visée thérapeutique et de solutions de resuspension chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse ou non de tumeur (Modification)
- Recherche appliquée
- Cancers
Ce que subit chaque souris dépend du composé testé, de sa voie d'administration et de la durée du traitement, avec jusqu'à quatre administrations par jour pendant huit semaines et deux micro-prélèvements sanguins quotidiens. 6 915 souris sont utilisées, dont 5 425 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, immunodéprimées ou immunocompétentes, porteuses ou non d'une tumeur greffée. La tumeur peut s'ulcérer ou se nécroser, et une injection de cellules tumorales par voie intraveineuse peut provoquer une paralysie. 725 souris sont réutilisées dans d'autres procédures et les autres tuées, au fil d'un maximum de 80 études sur cinq ans destinées à trier des composés avant des essais d'efficacité menés ailleurs.
Objectifs
Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. L’objectif de ce projet consiste à évaluer/détecter une éventuelle toxicité de composés à visée thérapeutique et de solutions de resuspension chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse ou non de tumeur. Il pourra également permettre d’identifier les cellules immunitaires ou les facteurs solubles impliqués dans celle-ci. Remarque : Des modifications de la durée des traitements, des voies d’administration et du type de molécules administrées nécessitent une modification du projet initial sans ajout d’animaux (diminution du nombre estimé d’animaux). Un maximum de 80 études sera mené sur 5 ans.
Bénéfices attendus
Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra de caractériser des composés thérapeutiques agissant sur la cible d'intérêt, et ainsi sélectionner ceux qui feront ensuite l'objet d'études d'efficacité dans le cadre d'autres projets.
Procédures
• Sur animal vigile : Greffe de cellules tumorales (1 injection, 15 s) ; Administration de composé thérapeutique (jusqu’à 4 administrations maximum 1 fois /jour pendant 8 semaines maximum, 15 s) ; Administration de molécule déplétante, activatrice/stimulatrice, neutralisante (jusqu’à 4 administrations maximum 1 fois/jour pendant 8 semaines maximum, 15 s) ; Microprélèvement de sang (maximum 2 fois/jour, 15 s) ; Administration de la solution de resuspension du composé thérapeutique (maximum 1 fois/jour pendant 8 semaines, 15 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang (maximum 4 fois, 30 s) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois /semaine pendant 8 semaines maximum, 15s) ; Administration de molécule déplétante, activatrice/stimulatrice, neutralisante (maximum 1 fois /jour pendant 8 semaines maximum, 15s) ; Prélèvement de sang terminal (1 fois, 5 min).
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère lors de l’injection des cellules tumorales. Stress et douleur légère lors de l’administration du(des) composé(s) thérapeutique(s), de(s) la molécule(s) déplétante, activatrice/stimulatrice et/ou neutralisante ou de la solution de resuspension du composé. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur (tumeur en sous-cutanée), paralysie (tumeur en intraveineux). Possibilité d’effets indésirables liés aux composé thérapeutique, molécule ou à la solution de resuspension : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.
Devenir
A l’exception des animaux pouvant être réutilisés l’ensemble des animaux sont mis à mort lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de l’étude ; Prélèvement sanguin terminal ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort ; Fin de l’étude.
Remplacement
Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.
Réduction
Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules sont préalablement testées in vitro et sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seules celles présentant la meilleure activité sont choisies pour être évaluées chez l’animal. Les conditions et le taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester sont également déterminés dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires dans les procédures impliquant une greffe tumorale. En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10 souris maximum par groupe sont nécessaires pour obtenir une évaluation, statistiquement interprétable, de l’éventuelle toxicité d’un composé thérapeutique et 5 souris maximum par groupe pour celle d’une solution de resuspension, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle, de celle du succès de l’induction et de la croissance tumorale et des signes cliniques observés. Ces études sont menées à l’aide de différents modèles statistiques. Les volumes de prélèvements de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 80 études sera mené sur 5 ans. Au cours de l’étude, les organes et/ou tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, mise à mort de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie gazeuse en combinaison avec un analgésique opioïde. Certaines injections pourront être réalisées sous anesthésie gazeuse et la taille des aiguilles utilisées sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. L’apparence/comportement de l’animal, l’aspect et le volume de la tumeur ainsi que la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou la mise à mort de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le composé, la molécule (déplétante, activatrice/stimulatrice, neutralisante) et/ou les cellules tumorales greffées pourront induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (jusqu'à 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.
Le rôle de l’intégrine dans l’hypercoagulabilité de l’hypertension pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Des rats de quatre semaines, pesant une centaine de grammes, reçoivent un traitement qui leur provoque une hypertension des artères pulmonaires. 176 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélèvement des poumons, du cœur, du foie et de la rate. Chacun subit deux échographies cardiaques sous anesthésie et une injection intrapéritonéale par jour pendant deux à trois semaines, certains recevant en plus une minipompe posée chirurgicalement. Le porteur invoque un "besoin médical critique" et des options thérapeutiques limitées, quand le projet consiste à tester chez le rat des inhibiteurs d'une protéine repérée en culture cellulaire.
Objectifs
L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie vasculaire rare et progressive caractérisée par un rétrécissement des petites artères pulmonaires, entraînant une augmentation de la pression artérielle dans la circulation pulmonaire. Dans ce projet, nous allons tester de nouveaux médicaments susceptibles de ralentir ou corriger les anomalies à l’origine de cette maladie. Pour cela, nous utiliserons des modèles expérimentaux chez le rat qui reproduisent les principales caractéristiques de l’HTAP humaine. L’objectif est de mieux comprendre comment la maladie se développe et d’identifier les mécanismes biologiques sur lesquels les traitements agissent. Cela permettra d’envisager, à terme, de nouvelles approches pour soigner les patients atteints d’HTAP.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à répondre à un besoin médical critique en explorant de nouvelles approches thérapeutiques pour l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP), une pathologie grave et complexe pour laquelle les options actuelles sont limitées. Avancées thérapeutiques : L’étude permettra d’évaluer si l’intégrine αvβ3 constitue une cible thérapeutique pertinente pour l’HTAP. L’efficacité des inhibiteurs de αvβ3 sera testée afin de déterminer leur impact sur la réduction du remodelage vasculaire pulmonaire et l’amélioration des paramètres hémodynamiques. Compréhension des mécanismes : Les résultats attendus contribueront à une meilleure compréhension des voies de signalisation impliquées dans l’action des inhibiteurs de αvβ3. En particulier, ils permettront d’analyser leur effet sur la prolifération cellulaire, l’inflammation et la dysfonction endothéliale associées à l’HTAP. Impacts translationnels : Ce projet fournira une base scientifique solide pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant l’intégrine αvβ3 dans le traitement de l’HTAP. Les résultats obtenus pourraient également ouvrir des perspectives pour élargir l’utilisation de ces inhibiteurs à d’autres pathologies impliquant des mécanismes similaires. En se focalisant sur les mécanismes fondamentaux de l’HTAP, ce projet pourrait non seulement améliorer les résultats cliniques des patients, mais aussi contribuer à l’élargissement des connaissances sur cette maladie. Ces bénéfices attendus représentent une avancée importante vers des traitements plus ciblés et efficaces.
Procédures
Dans le cadre de cette étude, les animaux seront soumis à plusieurs interventions expérimentales. Deux échographies cardiaques non invasives seront réalisées sous anesthésie générale légère, chacune durant environ cinq minutes. Ces examens permettront de suivre l’évolution de la maladie et d’évaluer l’effet des traitements. Un sous-groupe d’animaux subira une courte chirurgie (environ 15 minutes) sous anesthésie générale pour l’implantation d’une minipompe osmotique permettant l’administration continue d’un traitement. Les animaux seront surveillés durant la phase de réveil post-opératoire. Chaque animal recevra une injection sous-cutanée unique en début de protocole, puis une injection intrapéritonéale par jour pendant 2 ou 3 semaines selon la procédure suivie (à l’exception des animaux porteurs de minipompe). Chaque injection est réalisée sous anesthésie locale et dure moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Les traitements administrés ont déjà été testés et présentent un bon profil de sécurité, avec une toxicité minimale. Les effets indésirables attendus dans ce projet concernent les interventions expérimentales ainsi que les manifestations liées aux pathologies induites : • Les injections sous-cutanées peuvent provoquer une douleur modérée et transitoire au point d'injection • La chirurgie abdominale peut entraîner une douleur postopératoire modérée, localisée dans la zone opérée. • Les échographies peuvent générer un stress léger et temporaire dû à la contention et à l’anesthésie. • Les procédures terminales sont réalisées sous anesthésie générale et ne génèrent pas d’effet indésirable postérieur. • Les modèles d’hypertension pulmonaire peuvent provoquer une fatigue progressive et une réduction de la prise de poids.
Devenir
À la fin de l’étude, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie, garantissant l'absence de souffrance. Des prélèvements d'organes (poumons, cœur, foie et rate) seront réalisés afin de valider l'efficacité des traitements dans les tissus biologiques. De plus, comme décrites dans notre demande, différentes expérimentations biologiques seront réalisées au laboratoire pour démontrer les mécanismes mis en jeu.
Remplacement
Ce projet repose sur des résultats prometteurs obtenus à partir d’études in vitro sur des cultures cellulaires. Ces travaux ont permis de mettre en évidence des altérations dans des voies de signalisation clés impliquées dans le remodelage vasculaire pulmonaire. Le traitement par des inhibiteurs ciblant cette intégrine a montré une réduction significative de la prolifération des cellules musculaires lisses d’artère pulmonaire (CML-AP) induite par le Facteur de von Willebrand (vWF). Ces résultats suggèrent un rôle crucial de l’axe vWF/LRP4/αvβ3 dans la prolifération cellulaire associée à l’HTAP. Toutefois, pour valider l’impact de cette inhibition sur le remodelage vasculaire pulmonaire dans un contexte physiologique intégré, l’utilisation de modèles animaux est nécessaire. Les modèles SuHx et MCT d’hypertension pulmonaire ont été choisis pour leur aptitude à reproduire les altérations pathologiques observées chez l’Homme, notamment le remodelage vasculaire, la prolifération des CML-AP et l’élévation de la pression artérielle pulmonaire. Ces modèles permettent d’induire ces modifications et constitue une approche préclinique pertinente pour tester l’efficacité de traitements. Ces modèles expérimentaux offrent une plateforme robuste pour évaluer les effets des traitements sur la progression de la maladie, mesurer la réduction du remodelage vasculaire et déterminer les implications thérapeutiques potentielles. L’étude des interactions entre les voies de signalisation impliquées dans l’action des inhibiteurs d'intégrine fournira également des informations essentielles sur les mécanismes sous-jacents de cette approche thérapeutique.
Réduction
Les effectifs ont été soigneusement calculés en utilisant des outils statistiques avancés, en tenant compte des données issues de nos études préliminaires et des résultats disponibles dans la littérature sur l’hypertension pulmonaire. Les critères hémodynamiques, tels que la pression artérielle pulmonaire moyenne et l’évaluation du remodelage vasculaire, sont les principaux paramètres retenus pour évaluer l’efficacité des traitements. Cette approche permet de cibler les analyses sur des mesures précises et pertinentes, limitant ainsi la nécessité d’effectuer des évaluations multiples ou prolongées. De plus, les animaux témoins utilisés dans cette étude seront, lorsque cela est possible, réutilisés pour des analyses complémentaires afin d’optimiser leur usage et éviter l’expérimentation supplémentaire sur de nouveaux individus. Egalement, nous avons inclut dans la procédure 1 une étude pilote afin de déterminer le meilleur candidat médicament pour poursuivre le reste de l'étude avec une seule molécule. Cette stratégie vise à maximiser l’exploitation des données obtenues tout en réduisant le nombre total d’animaux nécessaires au projet. Par ailleurs, les résultats issus de ces expérimentations pourront être valorisés dans le cadre d’autres recherches sur l’HTAP et les mécanismes moléculaires associés, garantissant ainsi une utilisation optimale des ressources animales disponibles
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement avec des matériaux adaptés tels que du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois, leur permettant de réaliser des comportements naturels. Ils seront toujours hébergés en groupes pour éviter l’isolement, et une période d’acclimatation de 2 semaines sera respectée avant le début des procédures. Pour garantir leur bien-être, un système de surveillance basé sur des points limites sera appliqué afin de détecter rapidement tout signe de souffrance. Une attention particulière est portée à la gestion de la douleur : une analgésie est administrée avant les interventions douloureuses, notamment avant la chirurgie, et toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie adaptée (anesthésie générale pour la chirurgie, anesthésie locale pour les injections). Cela permet de réduire efficacement toute douleur ou stress potentiel. L’ensemble des procédures sera réalisé dans le strict respect des principes éthiques, afin d’assurer des conditions optimales pour les animaux tout au long de l’étude.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards et bien établis pour l’étude des maladies cardiovasculaires, notamment l’hypertension pulmonaire. Des rats âgés de 4 semaines et pesant environ 100 grammes seront utilisés, conformément aux standards expérimentaux des modèles validés d’hypertension pulmonaire. Cet âge est requis pour assurer l’induction efficace et reproductible de la maladie dans les protocoles utilisés, tout en permettant une comparaison directe avec les données existantes dans la littérature préclinique. Ce choix permet également d’optimiser la transposabilité des résultats vers des approches translationnelles ultérieures.
Inhibition de la recombinaison homologue sur la progression tumorale chez la souris (1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées est immunodéficiente et vit dans une animalerie séparée, avant d'être transportée vers celle où se déroulent les expériences. 1 404 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, avec greffe de cellules tumorales, quinze anesthésies générales et onze injections par animal. Le projet est déclaré deux fois, une fiche par établissement, chacune annonçant 1 404 souris pour tester un agent pharmacologique censé renforcer l'action antitumorale de certaines cellules immunitaires. Toutes sont tuées à la fin, pour permettre les prélèvements.
Objectifs
Ces dix dernières années, les traitements stimulant le système immunitaire (immunothérapies) ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant système immunitaire à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider à terme l’intérêt clinique d'un agent pharmacologique récemment identifié, pour lequel des résultats obtenus dans des cellules en culture sont encourageants.
Procédures
Au cours des différentes expériences, les animaux seront soumis à : -15 anesthésies générales d’une durée de moins de 20 minutes -11 injections, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 1 séance de rasage du flanc droit à l'aide d'un rasoir électrique, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes
Impact sur les animaux
- douleurs légères : injections des cellules tumorales, injections des traitements. - Stress / anxiété : anesthésies gazeuses - croissance tumorale douloureuse (douleur modérée possible), transport entre 2 animaleries du même site.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.
Remplacement
Les expériences exposées dans ce projet reposent sur un grand nombre d’expériences sur cultures cellulaires montrant un effet de la thérapie testée.
Réduction
Un suivi de la croissance des tumeurs sera réalisé par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base d'une étude statistique permettant de mettre en évidence des différences significatives, en termes de réduction de la croissance des tumeurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
L'imagerie non invasive sous anesthésie générale sera utilisée pour suivre de la croissance tumorale. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. L’atteinte des points limites définis en amont entraina une mise à mort anticipée si nécessaire. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix et de référence pour cette étude car le développement tumoral et de la réponse immunitaire sont très proches de celui de l'être humain. Dans le projet proposé les souris utilisées seront des souris âgées de 8 à15 semaines (système immunitaire mature).
La chicorée fourragère (Cichorium intybus, var. Puna II) comme alicament pour la gestion des cyathostomes chez le cheval
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Maladies animales
Pour mesurer si la chicorée fourragère réduit l'infestation des chevaux par de petits vers intestinaux, 30 jeunes équidés sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Vingt-deux d'entre eux subissent six prises de sang et six mesures de température rectale en 32 jours. D'autres passent trois périodes en boxes individuels, équipés de sacs à fèces vidés toutes les trois heures, avec pesées et mesure des quantités bues. Les retombées annoncées visent d'abord les éleveurs, coûts vétérinaires, valeur alimentaire du fourrage et consommation d'eau, et aucun cheval n'est tué, les mâles partant à l'adoption parce que la structure ne les garde pas au-delà de trois ans, les femelles restant disponibles pour de futures expériences.
Objectifs
Parmi les parasites gastro-intestinaux infestant les chevaux au pâturage, les cyathostomes (ou petits strongles) sont très fréquents et affectent toutes les catégories d'équidés, les jeunes animaux étant toutefois les plus sensibles. Ils sont responsables de retards de croissance, de diarrhées et l’émergence en masse de stades larvaires préalablement en dormance dans la muqueuse colique (cyathostomose larvaire) constitue la principale cause de décès d’origine parasitaire chez le jeune cheval. Les multiples rapports faisant état d’une efficacité diminuée des anthelminthiques de synthèse pour contrôler les cyathostomes conduisent au développement de stratégies alternatives. Dans ce cadre, des recherches récentes visant à identifier des plantes présentant des propriétés antiparasitaires vis à vis des cyathostomes ont rapporté des résultats encourageants chez de jeunes chevaux pâturant de la chicorée fourragère (Cichorium intybus, cv. Puna II). Ainsi, une réduction de 85% de l’excrétion d’œufs de cyathostomes a été mesurée chez ces individus, comparativement à leurs homologues pâturant une prairie permanente pendant la même durée (45j). Le développement larvaire des œufs qu’ils excrétaient a également été réduit d’un tiers. L’effet anthelminthique de la chicorée pourrait résulter d’un effet direct de composés présents dans ses feuilles (sesquiterpènes lactones, SL) sur les parasites et/ou d’un effet indirect induit par des modifications de l'écosystème intestinal, en particulier de la composition du microbiote. Une première investigation in vitro du rôle des SL a montré qu’ils réduisaient le développement larvaire mais que leur effet semblait limité en regard de l'amplitude de l'effet observé in vivo. Le premier objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes d'action de la chicorée cv. Puna II sur les petits strongles afin de favoriser son efficacité et d’anticiper le potentiel développement de résistance des parasites. En particulier, il s’agit d’analyser comment la consommation de chicorée par des poulains parasités module les interactions en jeu entre le microbiote intestinal et les communautés de cyathostomes. Le second objectif de ce projet est d’acquérir de premières références sur la valeur alimentaire de la chicorée chez le cheval en vue de son utilisation comme alicament.
Bénéfices attendus
À l'issue de ce projet, nous serons en mesure de mieux comprendre les effets de la consommation de chicorée (cv. Puna II) sur l'écosystème némabiome – microbiote chez le jeune cheval, en particulier comment la stabilité de ce système complexe est maintenue et régulée. Ce résultat complétera notre démonstration précédente de l’existence d'un effet anthelminthique direct, mais d’intensité limitée, exercé par les SL de la chicorée sur les cyathostomes. Nous aurons également quantifié les différences de sensibilité des espèces de cyathostomes aux propriétés anthelminthiques de la chicorée, ce qui permettra d'anticiper un potentiel développement de résistances chez ces parasites. Nos résultats contribueront à guider et faire évoluer les stratégies de traitement dans les milieux vétérinaires. En parallèle, les références originales que nous obtiendrons sur l’ingestibilité et la digestibilité de la chicorée chez le jeune cheval permettront d’éclairer les éleveurs sur les bénéfices nutritionnels associés à la consommation de cette plante soit seule, soit en association en proportion égale avec du ray-grass anglais. Nous fournirons également des connaissances sur l’intérêt potentiel de l’inclusion de chicorée fourragère dans la ration du cheval pour limiter la consommation d’eau d’abreuvement.
Procédures
Au cours de l’essai visant à analyser l’effet de la consommation de chicorée sur les interactions microbiote-némabiome et sur la réponse systémique de l’hôte, des prises de sang et des mesures de température rectale seront effectuées à six reprises sur chacun des 22 individus (J0, J7, J14, J20, J26 et J32). Au cours de trois journées (J8, J19 et J25), cinq individus du lot « chicorée » et cinq individus du lot témoin seront équipés de colliers de mesure de l'activité adaptés aux chevaux permettant d’enregistrer leur durée d’alimentation journalière. Dans le cadre de l’essai en carré latin, les quantités ingérées individuelles des trois régimes de fourrages seront mesurées tous les jours par différence entre les quantités de fourrages offerts et refusés et ce pendant toute la durée de l’essai (57j). Les quantités individuelles d’eau bue seront mesurées par différence entre les quantités offertes et refusées pendant les 5j de mesures de chacune des 3 périodes. Les fèces émis par les animaux entre 8h et 17h pendant les 3 périodes de 5j de mesures seront récoltés dans des sacs à fèces qui seront vidés de leur contenu toutes les 3h. Ces fèces récoltés sur les animaux contribueront au calcul de la production fécale journalière avec les fèces ramassées au sol et serviront à la constitution d’échantillons qui seront analyses pour leur composition chimique. Les animaux seront pesés 48h après le début de chacune des 3 phases d’habituation aux régimes (ie. tous les 19j) et en fin d’essai.
Impact sur les animaux
L’inocuité de la chicorée cv. Puna II chez le jeune cheval a été vérifiée au cours d'une précédente étude dans laquelle les animaux ont pâturé un couvert pur de chicorée pendant 45j. Au cours de l’étude destinée à analyser les effets de la consommation de chicorée sur les interactions microbiote-némabiome et sur la réponse systémique de l’hôte, une prise de sang et une mesure de la température rectale seront réalisées sur les 22 animaux tous les 6 à 7j pendant 32j (6 mesures individuelles au total : J0, J7, J14, J20, J26 et J32). Ces mesures seront effectuées par le personnel de l’EU formé (Habilitation à l’Expérimentation Animale de niveau 2 pour les personnels amenés à réaliser les prélèvements biologiques), expérimenté et connu par les animaux. La contention s’effectuera après la pesée dans la bascule, où les animaux ont l’habitude d’être pesés et manipulés. La douleur et le stress de faible intensité potentiellement générés par ces manipulations classiques d’élevage seront de courte durée (i.e. limités à la durée de la mesure). Le personnel réalisant ces actes est formé à la détection de signes d’inconfort et dispose d’une grille d’évaluation lui permettant de décider de la nécessité éventuelle de stopper la procédure.
Devenir
Dans le fonctionnement global du site expérimental, les animaux mâles ne restent sur la structure que jusqu’à l’âge de 3 ans au maximum. Ils seront donc placés à l’adoption directement après les procédures ou dans les quelques mois qui suivront. La plupart des femelles seront conservées pour le renouvellement du troupeau et seront donc amenées à être réutilisées dans le futur. En effet, Les procédures mises en œuvre n’impactent pas la réutilisation des animaux à des fins expérimentales.
Remplacement
Afin de préciser le potentiel d’utilisation de la chicorée (cv. Puna II) comme fourrage alicament pour limiter l’infestation des chevaux par les cyathostomes, il est nécessaire de se placer dans des conditions in vivo les plus proches possibles de celles de l’élevage. En particulier, nous avons besoin de mesurer les effets de la consommation de chicorée par les chevaux sur le microbiote intestinal, la communauté de cyathostomes (excrétion d’œufs et développement de ces œufs en larves infestantes) et leurs interactions. Nous devons mesurer l’ingestibilité (ingestion volontaire) de ce fourrage (offert seul ou en mélange avec des graminées) par de jeunes chevaux, d’une part et sa digestibilité in vivo qui constitue la méthode de référence pour quantifier la digestibilité des fourrages chez les herbivores, d’autre part. Dans le cas des équins, une méthode alternative d’estimation de la digestibilité de la matière sèche in vitro a été développée à partir de mesures réalisées chez des animaux nourris avec des fourrages verts de graminées et de prairies naturelles (méthode pepsine cellulase). Toutefois, cette méthode n’a pas été validée dans le cadre d’une alimentation comprenant de la chicorée fourragère. Les mesures de digestibilité in vivo que nous effectuerons pour ce projet seront couplées à des mesures de dégradabilité de la matière sèche des différents régimes par la méthode pepsine-cellulase in vitro.
Réduction
Le nombre d’individus inclus dans l’analyse des effets de la consommation de chicorée sur les interactions microbiote-némabiome et sur la réponse systémique de l’hôte (n=11 dans chacun des lots « chicorée » et « témoin ») a été limité pour des considérations éthiques et de faisabilité expérimentale, tout en respectant un nombre minimal permettant d’atteindre une puissance statistique suffisante (cf. 3.4.10). Nous nous sommes en particulier appuyés sur une étude de 2023 utilisant le modèle d’interaction microbiote-némabiome chez le jeune cheval et qui a obtenu des effets significatifs avec 10 individus par lot. Les OPG et le développement larvaire seront analysés à l’aide d’un modèle mixte avec le régime, la date et l’interaction régime × date en effets fixes, et l’individu en effet aléatoire. L’analyse des différences de composition du microbiote entre lots s’appuiera sur différentes procédures (ANOSIM, random forest) décrites dans l'étude de 2023 sur laquelle nous nous sommes appuyés pour constituer les lots. Les relations causales entre les genres de microbiote fécal et le némabiome seront déduites en utilisant la procédure multi-spatiale Convergent Cross-Mapping. Le nombre d’animaux utilisés pour caractériser la valeur alimentaire de la chicorée chez le jeune cheval dans notre carré latin (n=6) a été choisi dans l’objectif de disposer d’analyses statistiques fiables des paramètres d’ingestibilité et de digestibilité. La variabilité inter-individuelle d’ingestibilité et de digestibilité n’est pas connue dans le cas de régimes de fourrages verts incluant de la chicorée. Toutefois, le nombre d’animaux choisi pour notre essai est cohérent avec celui utilisé dans des études précédentes ayant mis en évidence des différences d’ingestibilité (e.g. carré latin 4×4 avec 4 individus) et de digestibilité (e.g. carré latin 4×4 avec 4 individus ; carré latin 6×4 avec 6 individus) entre différents fourrages conservés. Deux individus supplémentaires seront inclus pour un éventuel remplacement d’individus expérimentaux et ainsi éviter d'avoir à reconduire l'essai. Les données d'ingestibilité et de digestibilité seront analysées avec un modèle mixte incluant le régime, la période et l'interaction régime × période en effets fixes et l'animal en effet aléatoire.
Raffinement
Les animaux seront nourris avec des fourrages verts en quantité et en qualité non limitantes et recevront de l’eau à volonté. L’inocuité de la chicorée cv. Puna II chez le jeune cheval a été montrée précédemment. Les animaux seront conduits soit (i) au pâturage (essai analysant l’effet de la consommation de chicorée sur les interactions entre microbiote et communautés de cyathostomes), soit (ii) en boxes individuels conçus pour l’espèce garantissant contacts visuels et sonores et avec sortie quotidienne dans un paddock pour les besoins d’exercice et d’interactions sociales (essai visant à fournir des références sur la valeur alimentaire de la chicorée chez le cheval). La durée des essais sera réduite au minimum, de même que le nombre de prélèvements. Les manipulations sur les chevaux seront réalisées par le personnel de l’EU habilité (Habilitation à l’Expérimentation Animale de niveau 2), habitué aux mesures et connu des animaux. Elles auront lieu dans la bascule qui constitue un environnement sécurisé auquel les chevaux sont habitués. Les volumes prélevés sur animaux (prises de sang) respecteront les obligations réglementaires. Les animaux seront habitués aux nouvelles manipulations graduellement lors de séquences courtes réparties sur plusieurs semaines (e.g. port de sacs à fèces pour les mesures de digestibilité). Une grille d’évaluation d’inconfort sera utilisée pour décider d’un temps de pause lors des manipulations ou d’un arrêt total. Le personnel de l’EU contrôlera individuellement l’état des animaux au minimum deux fois par jour pour s’assurer de l’absence d’atteinte, de boiterie ou de comportement anormal (e.g. abattement, agitation, activité alimentaire anormale). En cas de besoin, les agents de l’EU promulgueront les soins adaptés à l’animal en s’appuyant sur les recommandations du Bilan sanitaire d’élevage de l’EU et y consigneront leurs actes. Si les anomalies constatées sur l’animal ne rentrent pas dans le cadre du Bilan sanitaire d’élevage, le personnel de l’EU fera appel au vétérinaire référent de l’EU. Les animaux seront pesés au minimum tous les 19j. Un animal pourra être exclu de l’essai sur avis du vétérinaire ou en cas de refus de s’alimenter, de perte de poids supérieure à 10% entre deux pesées consécutives, de fèces liquides pendant plus de 24h ou de comportement inadapté susceptible d’engendrer des blessures.
Choix des espèces
Notre projet a trait au développement de nouvelles stratégies de contrôle des cyathostomes infestant les chevaux. Ces parasites affectent la santé des animaux et engendrent des coûts économiques dûs aux traitements, aux actes vétérinaires, voire à la perte d’animaux. Les coûts associés au volet sub-clinique de la maladie sont liés à la diminution de l’efficacité alimentaire et des performances animales. Les preuves du développement de résistances des cyathostomes aux anthelminthiques de synthèse abondent à l’échelle mondiale et les molécules encore actives ont des effets toxiques sur l’environnement. Suite à des travaux récents rapportant des résultats encourageants quant à l’activité anthelminthique de la chicorée fourragère Puna II sur les cyathostomes, notre projet vise à (i) préciser les mécanismes d’action impliqués, en particulier le rôle du microbiote digestif et à (ii) fournir des références sur la valeur alimentaire de cette plante chez le cheval en vue de son utilisation comme alicament. Dans une étude précédente, les lots « chicorée » et « témoin» comportaient chacun 10 individus. Considérant le coefficient d de Cohen minimal obtenu (-1.53 ; régime × date J16), une puissance de 80 % (standard) et un risque α de 5 %, un effectif minimum de 8 individus parait nécessaire pour mettre en évidence l’activité antiparasitaire de la chicorée. Dans la présente étude qui analysera l’effet de la consommation de chicorée sur les interactions microbiote-némabiome, nous souhaitons mobiliser 11 chevaux par lot. Ce choix repose sur une récente publication utilisant le modèle d’interaction microbiote-némabiome chez le cheval qui a obtenu des effets significatifs avec 10 individus par lot. En incluant 11 individus, nous considérons la variabilité biologique et réduisons le risque de biais lié à des échantillons trop restreints. Le nombre d’individus utilisés pour mesurer la valeur alimentaire de la chicorée dans notre essai en carré latin (n=6) a été choisi dans l’objectif de disposer d’analyses statistiques fiables des paramètres d’ingestibilité et de digestibilité. La variabilité inter-individuelle d’ingestibilité et de digestibilité n’est pas connue dans le cas de régimes de fourrages verts incluant de la chicorée. Toutefois, le nombre d’animaux est cohérent avec celui utilisé dans des études révélant des différences d’ingestibilité et de digestibilité sur des fourrages secs.
Inhibition de la recombinaison homologue sur la progression tumorale chez la souris (2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 404 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal peut subir quinze anesthésies générales, onze injections dont celles des cellules tumorales et un rasage du flanc droit, la tumeur greffée pouvant devenir douloureuse en grandissant. L'objectif immédiat reste de vérifier chez la souris un effet déjà observé en culture cellulaire, le bénéfice pour les malades étant renvoyé à la validation "à terme" de l'intérêt clinique d'un agent pharmacologique. Le porteur présente l'espèce comme "le modèle de choix et de référence", au motif que le développement tumoral et la réponse immunitaire y seraient proches de ceux de l'être humain.
Objectifs
Ces dix dernières années, les traitements stimulant le système immunitaire (immunothérapies) ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant système immunitaire à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider à terme l’intérêt clinique d'un agent pharmacologique récemment identifié, pour lequel des résultats obtenus dans des cellules en culture sont encourageants.
Procédures
Au cours des différentes expériences, les animaux seront soumis à : -15 anesthésies générales d’une durée de moins de 20 minutes -11 injections, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 1 séance de rasage du flanc droit à l'aide d'un rasoir électrique, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes
Impact sur les animaux
- douleurs légères : injections des cellules tumorales, injections des traitements. - Stress / anxiété : anesthésies gazeuses - croissance tumorale douloureuse (douleur modérée possible), transport entre 2 animaleries du même site.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.
Remplacement
Les expériences exposées dans ce projet reposent sur un grand nombre d’expériences sur cultures cellulaires montrant un effet de la thérapie testée.
Réduction
Un suivi de la croissance des tumeurs sera réalisé par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base d'une étude statistique permettant de mettre en évidence des différences significatives, en termes de réduction de la croissance des tumeurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
L'imagerie non invasive sous anesthésie générale sera utilisée pour suivre de la croissance tumorale. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. L’atteinte des points limites définis en amont entraina une mise à mort anticipée si nécessaire. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix et de référence pour cette étude car le développement tumoral et de la réponse immunitaire sont très proches de celui de l'être humain. Dans le projet proposé les souris utilisées seront des souris âgées de 8 à15 semaines (système immunitaire mature).
Evaluation de candidats médicaments dans des modèles de néphropathie chez le rat et la souris
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 2520
Tester les molécules de clients industriels sur des reins malades occupe 2520 rats et 1620 souris, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux développent une néphropathie spontanément, par diabète ou par lupus, ou bien par induction chimique, puis reçoivent les composés à évaluer au fil de 55 études étalées sur cinq ans. Chaque semaine, ils passent jusqu'à vingt-quatre heures isolés en cage à métabolisme pour la collecte d'urine, subissent une vidange manuelle de la vessie, deux heures d'anesthésie gazeuse pour la mesure de la filtration rénale, des prises de sang et parfois l'implantation d'une pompe osmotique. Le porteur écrit ne connaître "ni la nature ni les effets secondaires possibles" des molécules testées, et retient un modèle de lupus dont la littérature annonce 50 % de mortalité à six mois, en gardant les animaux en vie jusqu'à sept mois.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments dans des modèles de néphropathie. Nous pensons réaliser 55 études dans ce projet sur 5 ans.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de néphropathie.
Procédures
Les animaux vont développer naturellement une néphropathie (animaux diabétiques ou ayant le lupus) ou celle-ci sera induite chimiquement. Les animaux vont recevoir des administrations de composés chimiques (inducteur de pathologie ou de candidats médicaments à tester). Ces gestes seront très rapides (moins d’1 minute) et seront réalisés par du personnel compétent pour diminuer tout stress. Les animaux seront mis dans des cages à métabolisme et isolés temporairement de leurs congénères (24H maximum 1 fois par semaine) afin de récolter de l’urine. Une vidange manuelle de la vessie pourra aussi être réalisée (environ 30 secondes pour ce geste sans douleur). Les animaux auront une anesthésie gazeuse afin de pouvoir leur « scotcher » un capteur afin d’évaluer la filtration glomérulaire pendant 2 heures et seront remis avec leurs congénères ensuite. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés au cours de l’expérimentation ainsi que des dosages de glycémie à l’aide d’un glucomètre (nécessité d’avoir 1 goutte de sang, geste durant 30 secondes). Les animaux auront une procédure chirurgicale rapide (10 minutes) que s’il y a implantation de pompes osmotiques.
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés développant spontanément des néphropathies selon le modèle étudié ou nous induirons chimiquement cette pathologie rénale. Les animaux vont donc ressentir les symptômes de cette pathologie à savoir des troubles rénaux (douleur possible) et par conséquent des troubles urinaires.
Devenir
Tous les animaux de l’expérience seront mis à mort et des prélèvements d’organes seront réalisés.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des néphropathies. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) pour certains paramètres (récolte d’urines via des cages métaboliques, mesure de la filtration glomérulaire qui sont des méthodes non invasives). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale et pour ces différents modèles, les publications scientifiques publiées, un nombre minimum de 10-15 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables selon les modèles. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence entre les groupes
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, carré de coton…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux (aspect général de l’animal, pâleur, poils hérissés, sales ou toilettage, prostration ou non, difficulté à se mouvoir, plaie…) sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Les procédures sous anesthésie seront réalisées sur plaque chauffante thermorégulée afin d’éviter toute hypothermie de l’animal. Des analgésiques seront administrés selon les protocoles expérimentaux. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps, soigné, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et réaliseraient une mise à mort.
Choix des espèces
Tous les modèles sont bien décrits dans la littérature chez le rat ou la souris. Certains modèles nécessitent l’utilisation d’animaux particuliers : Modèle de néphopathie lupique : Le modèle choisi pour cette étude est un modèle murin génétiquement modifié. Elles vont développer de manière spontanée une néphropathie cliniquement similaire à ce qui est observé dans la pathologie humaine. Dans la littérature, il est précisé qu’il y a un taux de mortalité de 50 % chez des animaux âgés de 6 mois. A moins que les animaux présentent des signes cliniques nécessitant leur mise à mort, nous les garderons en vie maximum jusqu’à l’âge de 7 mois. Modèle de néphropathie diabétique : Il existe plusieurs modèles diabétiques développant une néphropathie chez le rongeur : certains chez le rat, d’autres chez la souris. Les modèles de néphropathie diabétique chez les souris génétiquement modifiées que nous avons choisis sont largement décrits dans la littérature et leurs caractéristiques sont très proches de la pathologie humaine du diabète de type II. En accord avec ces données et avec l’objectif de notre étude, nous avons choisi ces modèles pour évaluer l’effet de candidats médicaments sur la fonction et les dommages rénaux induits par cette pathologie. Toutefois, la réalisation de ce projet avec des rats rendus diabétiques chimiquement est tout à fait envisageable et dépendra des demandes des clients et de leur préférence. Selon les modèles, différents animaux seront utilisés : - animaux âgés de 7-8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines (lupus) - des rats de 100 -125 g ou 5 semaines au début de l’expérimentation seront utilisés pour un modèle induit chimiquement en accord avec la littérature et notre expérience. - des rats de 90-100 g ou 4 semaines au début de l’expérimentation seront utilisés pour un autre modèle induit chimiquement en accord avec la littérature et notre expérience. - des animaux d’au moins 6 semaines, stade auquel les animaux ont initié un diabète de type II avec une hyperglycémie ainsi qu’une albuminurie, principales caractéristiques de la néphropathie diabétique. Cependant, selon les demandes du sponsor, l’âge des animaux pourra être différent.
Nouveaux modèles murins pour comprendre l’apparition de cancer du sang dans l’anémie de Fanconi
- Recherche appliquée
- Cancers
Des souris saines sont irradiées pendant dix minutes, sans anesthésie, pour détruire leurs propres cellules souches du sang avant de recevoir celles de souris porteuses de mutations de l'anémie de Fanconi. 540 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent ensuite jusqu'à cinq prises de sang dans la veine de la joue, également sans anesthésie, et le porteur signale perte de poids, diarrhée, mobilité réduite, toilettage négligé et sensibilité aux infections, en particulier si une leucémie se déclare. Toutes sont tuées au plus tard vingt semaines après la greffe pour prélever rate et moelle osseuse, sans que le RNT indique la dose d'irradiation reçue ni la part des animaux qui développeront la leucémie recherchée.
Objectifs
L’anémie de Fanconi est une maladie héréditaire rare, caractérisée par des malformations dès la naissance, et un défaut de la production de cellules sanguines par la moelle osseuse, menant à une quantité réduite de globules rouges, globules blancs et plaquettes dans le sang. Par ailleurs tous les patients ont une tendance très importante à développer des cancers du sang (leucémie) et des cancers solides tels que ceux de la tête et du cou. Cette maladie est causée notamment par des mutations des gènes FANC, qui participent à la réparation de l’ADN. A ce jour, les mécanismes d’évolution de la maladie jusqu’à la leucémie chez les patients atteints d’anémie de Fanconi sont encore incomplètement compris. Nous disposons de plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées présentant des mutations des gènes FANC ainsi que d’autres gènes associés à la maladie de Fanconi. L’objectif de notre projet est de développer de nouveaux modèles d’étude et ainsi démontrer que l’association de plusieurs anomalies génétiques liées à la maladie de Fanconi favoriserait une évolution en leucémie en donnant aux cellules Fanconi un risque accru à devenir des cellules cancéreuses.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’améliorer les modèles d’étude de la maladie de Fanconi chez la souris, les rendant encore plus proche de ce qui est observé chez l’Homme. Ces nouveaux modèles serviront à mieux comprendre les évènements responsables de l’apparition de cancer du sang chez les patients atteints de la maladie de Fanconi. A plus long terme, ils pourront également être utilisés pour tester des modalités de traitement à la fois de la maladie de Fanconi et de la leucémie qui apparaît chez les patients au cours de leur vie.
Procédures
La mise en place de nos nouveaux modèles d’étude consiste à réaliser des greffes de cellules souches hématopoïétiques (cellules qui lorsqu’elles se développent dans un organisme permettent de produire toutes les cellules sanguines) dans des souris saines. Pour cela, les souris saines seront irradiées (durée 10 min, sans anesthésie) afin d’éliminer toutes leurs cellules souches hématopoïétiques qui seront remplacées par celles issues de souris génétiquement modifiées (ayant des modifications au niveau de gènes impliqués dans l’anémie de Fanconi). Ces cellules souches hématopoïétiques de souris transgéniques seront injectées, quelques heures après l’irradiation, dans la veine de la queue, aucune anesthésie ou analgésie ne sera nécessaire (durée de l’injection : 30 s). Afin de suivre leur expansion et leur différenciation (production de toutes les cellules du sang à partir des cellules souches hématopoïétiques), nous réaliserons des prélèvements de sang au niveau de la veine de la joue une fois par mois (durée : 30s ; sans anesthésie). Sur la durée de l’expérience, chaque souris sera soumise à 5 prélèvements de sang au maximum.
Impact sur les animaux
L’irradiation des animaux, conduisant à l’ablation des cellules immunitaires, peut rendre les animaux plus susceptibles aux infections. Une perte de poids ainsi qu’une diarrhée au cours des 2 premières semaines peuvent être observées. Une perte de poids, une réduction de la mobilité et une négligence du toilettage peuvent être observés chez les animaux suite à la greffe des cellules souches hématopoïétiques issues de souris transgéniques Fanconi, en particulier si une leucémie se développe. Une douleur brève liée au prélèvement de sang réalisé au niveau de la veine de la joue peut être constatée lors des prélèvements mensuels, ainsi qu’un stress lié à la contention de la souris.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés au plus tard 20 semaines après la greffe. Les différents organes (rate, moelle osseuse notamment) seront prélevés afin de réaliser une analyse précise des cellules qui y sont présents.
Remplacement
Notre projet a pour but de développer un modèle murin de maladie de Fanconi, qui vienne reproduire les anomalies du sang (baisse de production, développement de leucémie) observé chez les patients de façon spontanée. D’une part, il n’existe pas aujourd’hui de modèle animal Fanconi reproduisant ces anomalies de façon spontanée. D’autre part, les études in vitro ne permettent pas de reproduire parfaitement les anomalies observées chez les patients. Les capacités très particulières des cellules souches produisant les cellules du sang, notamment leur capacité de divisions vers des cellules spécifiques de lignées (globules rouges, globules blancs ou plaquettes) ou à évoluer vers des cellules cancéreuses, dépendent notamment de leur interaction avec l’environnement où elles se développent. Il est donc indispensable d’utiliser un modèle animal vivant afin de reproduire ces conditions.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire pour documenter les variations des paramètres sanguins étudiés. Ce nombre a été déterminé grâce à des analyses statistiques afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures).
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé, afin de s’assurer du bien-être des animaux, et du bon état de leur environnement de vie (propreté des cages, disponibilité d’eau et de nourriture, enrichissements avec papier kraft, tunnel, buchette de bois). De plus, un suivi clinique des souris sera également réalisé une fois par semaine pour détecter toutes modifications comportementales (interactions sociales, posture, mobilité, respiration) et de l’apparence (poids, pelage, présence de masse tumorale) et éviter les souffrances, douleurs et angoisses. Cela sera réalisé en s'aidant d'une grille d'évaluation du score clinique et des actions seront mises en place de manière graduée en fonction de l'apparition de signes de souffrance. L'administration d'un antalgique sera réalisée en cas de signes de douleur avant l'euthanasie de l'animal si son état se dégrade soudainement.
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant. De plus, il existe des souris génétiquement modifiées présentant les modifications au niveau de gènes connus pour être altérés chez les patients atteints de la maladie de Fanconi ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. Les souris seront des souris adultes afin de maximiser la prise de greffe comme cela a été décrit auparavant dans la littérature scientifique.
Mise en place et caractérisation d’un biomarqueur d’imagerie d’ischémie-reperfusion cérébrale et IDENTIFICATION DES CIRCUITS CÉRÉBRAUX DE LA NOCICEPTION POST-AVC chez le Primate Non-Humain (PNH) EU (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
12 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun passant quatre mois et demi à apprendre une tâche alimentaire sous accès à l'eau restreint. Vient ensuite l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne, qui détruit une zone du cerveau et leur fait perdre leurs capacités motrices et cognitives, avec un isolement de quelques jours le temps qu'ils récupèrent. Le porteur ajoute par amendement des stimulations thermiques douloureuses et des jets d'air pour repérer les circuits de la douleur chronique après un AVC, tous les animaux étant tués ensuite pour analyse du tissu cérébral. L'effectif passe de huit à douze parce qu'il anticipe 18 % de mortalité liée à la procédure et prévoit donc des animaux de remplacement.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) est un déficit neurologique soudain causé par un caillot ou une hémorragie cérébrale. Le traitement le plus récent de l'AVC ischémique est la thrombectomie, visant à retirer l’occlusion par une intervention endovasculaire pour restaurer l'apport sanguin cérébral. L’étendue de la pénombre ischémique, la zone cérébrale affectée par l’infarctus, est un facteur déterminant de l'issue de l'AVC. Sauver la pénombre est crucial pour limiter les séquelles graves. Notre projet a pour objectif de valider la sécurité de la procédure HDT15°, qui consiste à incliner de 15° le corps et la tête du sujet pendant l’occlusion, pour augmenter l’apport sanguin vers la pénombre par les vaisseaux collatéraux. Cette approche, déjà validée chez le rongeur, doit être testée chez le primate avant un essai clinique. HDT15° pourrait réduire les risques de décès ou de handicaps graves. La mesure du métabolisme de l'oxygène cérébral (CMRO2) reflète l’état de la pénombre ischémique et peut servir de biomarqueur pour évaluer l'atteinte cérébrale et prédire la récupération post-AVC. Ce projet vise à valider l’utilisation de CMRO2 mesuré par IRM dans la phase aiguë de l'AVC, et à évaluer sa valeur prédictive pour la récupération. Des analyses corrélatives seront menées entre les déficits moteurs observés chez l'animal (par exemple, une tâche de prise alimentaire nécessitant dextérité) et les marqueurs d’activité cérébrale dans les zones corticales et sous-corticales afin de corréler l’intensité des déficits et la vitesse de récupération. CE MODÈLE ANIMAL UNIQUE A DÉJÀ ÉTÉ VALIDÉ POUR ÉTUDIER L’IMPACT DE L’AVC SUR LA RÉCUPÉRATION FONCTIONNELLE, QUI S’ACCOMPAGNE SOUVENT DE DOULEUR CHRONIQUE (20 % DES CAS CHEZ L’HOMME). C'EST POURQUOI NOUS DEMANDONS UN AMENDEMENT À NOTRE PROTOCOLE POUR AJOUTER UNE PROCÉDURE SUPPLÉMENTAIRE POUR ÉVALUER CE RISQUE. EN OUTRE, LA DÉCOUVERTE DE LIENS ENTRE L’ACTIVITÉ CÉRÉBRALE OBSERVÉE À LA SURFACE DU CORTEX VIA EEG ET LES MODIFICATIONS DE L’ACTIVITÉ SOUS-CORTICALE LIÉES À LA NOCICEPTION (MESURÉES PAR IRM FONCTIONNELLE ET IMAGERIE TEP) OFFRE DES INFORMATIONS PRÉCIEUSES SUR L’EFFET DES AGENTS PHARMACOLOGIQUES, COMME LE FENTANYL, QUI PEUVENT INDUIRE DES EFFETS ANALGÉSIQUES MAIS AUSSI INDÉSIRABLES. CETTE APPROCHE EXPÉRIMENTALE PERMETTRA D'ÉTUDIER DES MOLÉCULES DE REMPLACEMENT POTENTIELLES POUR TRAITER LA DOULEUR CHRONIQUE POST-AVC. CE PROJET SE DÉROULE DANS DEUX EU DIFFÉRENTS, L'UE1 POUR LE COMPORTEMENT ET L’UE2 POUR L’IMAGERIE.
Bénéfices attendus
Ce projet est conçu pour répondre à des questions en lien avec des problématiques cliniques, mais aussi pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et l’importance de la reperfusion dans la compensation et la récupération post-AVC. Ainsi, notre projet va permettre de recueillir des informations inédites concernant la procédure de l’HDT15°, un traitement non pharmacologique de première intention pour améliorer la récupération de nombreux patients atteints d’AVC. Une meilleure compréhension des mécanismes de compensation grâce à une imagerie par CMRO2 (consommation de l’oxygène) ouvrira certainement une meilleure prise en charge thérapeutique de ces patients, avec une approche de plus en plus individualisée. En combinant différents types d’imagerie, nous allons avoir l’opportunité de caractériser les marqueurs d’inflammation et de comprendre comment ces zones lésées peuvent compenser à travers l’utilisation d’autres circuits cérébraux. Cette compensation ayant lieu dans d’autres pathologies comme le coma, nos résultats seront donc également d’intérêt plus général. Afin d'être largement disponible pour une utilisation clinique dans les maladies cérébro-vasculaires, LES BIOMARQUEURS D’IMAGERIE CÉRÉBRALE QUI PERMETTENT DE PRÉDIRE LA RÉCUPERATION FONCTIONNELLE POST-AVC SERONT INTÉGRÉS DANS LES LOGICIELS PRODUITS PAR OLEA SPHÈRE ET AINSI OPTIMISERAIT L’AIDE AU DIAGNOSTIC EN SOINS INTENSIFS. L’AJOUT DE LA DEUXIÈME PROCÉDURE AVEC L’UTILISATION DE L’EEG POUR DÉTERMINER A LA SURFACE DU CRANE DES MODIFICATIONS DES CIRCUITS DE LA NOCICEPTION QUI PEUVENT ENTRAINER DES DOULEURS CHRONIQUES EST UN BÉNÉFICE MAJEUR APPORTÉ PAR L’AMENDEMENT QUE NOUS AVONS FAIT A CE PROJET. EN EFFET, LA DÉCOUVERTE DE LIENS CORRÉLATIFS ENTRE LES SIGNAUX EEG ET DES ANOMALIES D’ACTIVITÉS DES CIRCUITS DE LA NOCICEPTION PERMETTRA DE MIEUX ÉVALUER ET TRAITER CE SYMPTOME DES DOULEURS CHRONIQUES SURVENANT A DISTANCE DE L’AVC ET QUI CAUSE DES PROBLÈMES IMPORTANTS DE PRISES EN CHARGES DES PATIENTS AUSSI BIEN EN CLINIQUE HUMAINE QUE VÉTÉRINAIRE. NOUS POURRONS AINSI DÉTERMINER L’IMPACT D’AGENTS PHARMACOLOGIQUES POUVANT INDUIRE DES EFFETS ANALGÉSIQUES, COMME LE FENTANYL OU D’AUTRES MOLÉCULES EN DÉVELOPPEMENT.
Procédures
Une légère anesthésie sera réalisée pour poser le collier des animaux (sur le site EU1 : 1 heure). L’apprentissage et la réalisation de la tache alimentaire se fera sous un contrôle hydrique (SITE EU1: 4 mois et 15 jours). En fonction des performances de l'animal et de son apport hydrique venant des aliments obtenus dans la tâche, la quantité d'eau dans la bouteille sera ajustée pour donner un apport hydrique constant. Un apport nutritionnel complémentaire, composée de croquettes primates et légumes, sera dispensé dans la cage après chaque séance et sera pris en compte dans l’apport hydrique quotidien. Les jours de repos (week-end), les animaux auront un accès libre jusqu’au dimanche, ou l’apport hydrique de référence pour chaque animal sera repris. De plus, les animaux seront exposés à des stimuli nociceptifs (stimulation thermique) et somesthésiques (air puff). Les imageries multimodales TEP-IRMf-EEG seront réalisées (SITE EU2: 1/2 journée). Des imageries seront réalisées pour évaluer les lésions cérébrales et évaluer la valeur prédictive du CMRO2 ou de l’intensité du phénomène d’inflammation mesuré par IRM de diffusion ou imagerie TEP (SITE EU2: 1/2 journée par imagerie). Des prélèvements de sang seront effectués sur tous les animaux, lors des étapes d’imagerie sous anesthésie. Ces prélèvements de sang seront plus nombreux lors de l’étape d’occlusion-reperfusion (SITE EU2). Finalement un dernier prélèvement sanguin sera effectué avant l'euthanasie scientifique de l’animal (SITE EU1). A la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés par injection intraveineuse létale d’un agent euthanasiant vétérinaire suite à une sédation a la kétamine (SITE EU1).
Impact sur les animaux
La partie habituation/entraînement du projet peut induire un léger stress à l’animal au tout début de cette étape mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes. La partie du projet impliquant une intervention d’occlusion/reperfusion (étape 4) constitue une source potentielle de nuisances importantes. En effet l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, va provoquer des lésions cérébrales dans une zone localisée du cerveau. Ces lésions impliquent une perte des capacités motrices et cognitives de l’animal en post-opératoire, qui implique un isolement et un confinement de l’animal durant quelques jours, jusqu’à la récupération quasi-totale de sa motricité. CETTE CHIRURGIE SERA EFFECTUÉE LE MATIN AFIN DE POUVOIR SUIVRE L’ÉTAT DE REVEIL DE L’ANIMAL. SON ETAT SERA SURVEILLE TOUS LES JOURS AINSI QUE LES WEEK-ENDS ET EVALUE VIA DES GRILLES DE SCORE PAR L’EXPÉRIMENTATEUR. Une étude précédente utilisant ce même modèle d’AVC chez le macaque (Debatisse et al. 2021) a montré que la phase aigüe de l’AVC est la plus critique en termes d’effets indésirables sur les animaux (18% de risque de mortalité estimé). Une surveillance accrue des animaux sera donc réalisée lors de cette phase. Cette approche peut aussi induire des micro-accidents vasculaires par augmentation de la pression sanguine et de la rupture des vaisseaux cérébraux. C’est pour mesurer les risques de produire des effets indésirables, découlant de ces potentiels accidents vasculaires induit par l’approche thérapeutique testée qu’il est essentiel de valider cette approche thérapeutique de reperfusion. C’EST AUSSI POUR CELA QUE NOUS AVONS FAIT UN AMENDEMENT À CE PROTOCOLE POUR ÉVALUER PAR IMAGERIE TEP-IRM-EEG, L’EXISTENCE D’UNE POTENTIELLE DOULEUR CHRONIQUE DÉCOULANT DE L’AVC Les parties de l’étude intégrant la phase d’entraînement et les examens d’imagerie sont considérés légères et modérés tandis que l’intervention d’occlusion/reperfusion qui présente des risques de déficits lésionnels étant classée en procédure plutôt sévère, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure sévère pour tous les animaux. AUSSI, LES ANIMAUX PEUVENT DÉVELOPPER DES DOULEURS SUITE A L’INTERVENTION CHIRURGICALE VISANT A INDUIRE UN AVC. EN REVANCHE, LES STIMULI NOCICEPTIFS (STIMULATION THERMIQUE) INDUITS AUX ANIMAUX NE PEUVENT PAS INDUIRE DE FORTE DOULEUR NI DE BRULURE CAR LES TEMPERATURES NE DÉPASSERONT PAS 49°C.
Devenir
LES 6 PREMIERS ANIMAUX SERONT EUTHANASIES A J+45 POST-OCCLUSION TANDIS QUE LES 4 A 6 AUTRES ANIMAUX SERONT EUTHANASIES APRES AVOIR SUIVIS LES IMAGERIES TEP-IRM-EEG. L'EUTHANASIE DE TOUS LES ANIMAUX EN FIN DE PROTOCOLE EST ESSENTIELLE POUR VALIDER, AU NIVEAU CELLULAIRE, LES MÉCANISMES DES OUTILS D'IMAGERIE DÉVELOPPÉS DANS CE PROJET. Seulement des approches histologiques au niveau cellulaire, sur du tissu cérébral post-mortem, peuvent nous permettre de valider ces outils IRM de la CMRO2 ainsi que des processus inflammatoires et dégénératifs observés et mesurés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est nécessaire pour valider l’efficacité et l’innocuité d’un nouveau traitement de l’AVC ischémique. En effet, les alternatives non animales (in silico, in vitro ou ex vivo) ne permettent pas d’étudier la sécurité de l'angulation de la tête et du corps à 15° lors de l'occlusion, les interactions entre les déficits moteurs observés et les marqueurs cérébraux associés à l’intensité des déficits ou de la vitesse de récupération. Avant de tester cette procédure chez l’Homme, il est donc nécessaire de l’évaluer avec un modèle animal pertinent. Il est donc judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’Homme dans le cadre de l’AVC ischémique. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie TEP/IRM avec des analyses comportementales. Ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Ainsi, les informations obtenues sur le PNH seront plus facilement transposables et applicable à l’humain qui subit une perte de fonction similaire découlant d’un AVC. Enfin, le macaque cynomolgus est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale.
Réduction
Le nombre d’animaux minimum permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations mesurées grâce à un calcul de puissance est de 8 animaux. Au total, nous prévoyons 12 animaux dans le protocole. Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux pour réaliser des corrélations (n=8) chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2 à 4). En effet, en nous basant sur la précédente étude ayant utilisée ce modèle PNH d’AVC par occlusion de l’artère cérébrale moyenne, nous estimons à 18% le taux possible de mortalité suite à la procédure d’AVC. Si le nombre d’animaux atteignant un point limite s’avérait inférieur à notre prévision, dû probablement à l’effet bénéfique de l'angulation de la tête et du corps de 15° sur la reperfusion cérébrale, nous limiterons le nombre total d’animaux au nombre nous donnant une puissance statistique suffisante. Si nous réussissons à mener nos 8 premiers animaux à pouvoir faire toutes les étapes du protocole et que nous obtenons une puissance statistique suffisante, nous nous gardons la possibilité de réduire le nombre prévu de 12 à 8 animaux.
Raffinement
Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Par exemple, l’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’ischémie-reperfusion cérébrale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères, chaque sujet étant son propre contrôle. De plus, le fait que nos deux principales mesures d’imageries, l’IRM de la CMRO2 et la TEP, seront réalisées simultanément grâce à la caméra hybride, nous pourrons limiter le nombre d’examens par animaux dans cette étude. Dès leur arrivée et tout au long de l’étude, en dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés en groupes sociaux (4 ou 2), lorsque possible. Pour maximiser les effets bénéfiques de l’environnement, même durant les périodes post-AVC, les animaux seront toujours maintenus en hébergement par paire, pour limiter les effets délétères de l’isolement. Les animaux disposeront d’une quantité d’eau de boisson contrôlée et d’une quantité quotidienne d’aliment adaptée à leur poids.
Choix des espèces
L’organisation du système nerveux central est très différente selon les espèces, aussi bien au niveau macroscopique (taille des différentes structures) qu’au niveau moléculaire. Ce projet sera donc réalisé chez le macaque cynomolgus, du fait de sa proximité phylogénétique avec l’Homme et en particulier en raison des similitudes du cerveau et des comportements entre ces deux espèces. Les animaux utilisés seront adolescents car ce sont des animaux qui n’ont jamais été utilisés dans d’autres études.
ACCES-II : Modèle préclinique de rétablissement de continuité colique par anastomose colorectale écho-endoscopique : résultats à long terme sur la perméabilité des anastomoses
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Tous tués en fin de protocole pour analyse des tissus, 30 cochons miniatures vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une première chirurgie d'une heure leur coupe la continuité digestive et leur pose un anus artificiel, une seconde intervention rétablit le passage par voie endoscopique deux semaines plus tard, et une à trois anesthésies supplémentaires suivent pour retirer la prothèse et examiner le rectum. Chaque intervention est précédée d'une mise à jeun, le porteur reconnaissant que la faim et l'angoisse précèdent les deux opérations. La première phase chirurgicale sert aussi à former des internes en chirurgie, ce que le porteur inscrit à sa rubrique réduction puisqu'aucun animal supplémentaire n'y est consacré.
Objectifs
Environ 4000 patients sont opérés annuellement en France d’une intervention de Hartmann, dont 80% par chirurgie ouverte (laparotomie), souvent dans le cadre de l’urgence, pour diverses pathologies entraînant une lésion du côlon . Cette intervention consiste à reséquer la partie du côlon gauche lésée. Le rectum est ensuite refermé (et reste en place dans l’abdomen), et le côlon en partie haute est extériorisée en extracorporel via une stomie permettant l’évacuation des selles. Cette intervention est généralement réalisée dans le cas où les risques de complications sont trop importants pour réaliser dès la première chirurgie la connexion entre le côlon et le rectum (anastomose). La stomie ainsi réalisée est théoriquement temporaire et le rétablissement de la continuité digestive se fait dans un second temps qui va néanmoins nécessiter une nouvelle opération en chirurgie ouverte le plus souvent. Cependant, compte tenu de la fragilité des patients, et des risques propres à une deuxième chirurgie pour le rétablissement de continuité, moins d’un patient sur deux sera à terme candidat à cette nouvelle chirurgie, avec des risques supplémentaires. L'objectif de notre étude est de développer une méthode non invasive de rétablissement de la continuité colorectale à l'aide d'une procédure endoscopique innovante.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’une étude pilote in vivo sur modèle expérimental animal portant sur la faisabilité́ d’une nouvelle technique mini-invasive. Les perspectives sont l’établissement d’un protocole standardisé de la réalisation endoscopique d'anastomose colorectale, et l’évaluation du devenir des anastomoses colorectales confectionnées endoscopiquement après retrait de la prothèse d’apposition luminale. Les impacts attendus et les perspectives sont multiples : il s’agit en priorité de pouvoir proposer, après réalisation d’une expérimentation prospective chez l’homme en cas de succès, à des patients contre-indiqués au rétablissement de continuité chirurgicale, une prise en charge moins invasive, et de limiter le risque de réintervention pour sténose ou fistule anastomotique. Une évaluation du devenir des anastomoses après retrait des prothèses d’apposition luminale paraît indispensable, l’objectif à terme étant de proposer un rétablissement mini-invasif à des patients opérés d’une intervention de Hartmann, y compris en dehors de toute situation carcinologique ou palliative. La participation d’internes dans la première phase, permettra également d’améliorer leur formation et leur préparation aux situations réelles.
Procédures
Les animaux auront tous 2 anesthésies générales avec mise à jeun des aliments solides dans les heures qui précédent : une première procédure chirurgicale destinée à interrompre la continuité digestive et à créer la stomie ("anus artificiel") (durée environ 1 heure). La seconde intervention, deux semaines après la première, est le traitement par voie endoscopique, d’une durée de 40 minutes environ. Les animaux auront ensuite de une à 3 interventions supplémentaires non invasives, sous courte anesthésie générale, d’une durée inférieure à 30 minutes, pour l’ablation de la prothèse et la rectoscopie (examen endoscopique du rectum). La mise à mort sera réalisée en fin de projet, sous anesthésie générale préalable.
Impact sur les animaux
Du stress et de l’angoisse peuvent être présents en amont des deux interventions chirurgicales (J0 et J14), faites sous anesthésie générale : ces deux interventions sont considérées comme des procédures à degré de sévérité modérée car de la douleur peut être ressentie par les animaux à l’issue des procédures. Les procédures de contrôle endoscopique sont considérées comme des procédures à degré de sévérité légère. Une mise à jeun des solides au matin de la procédure est nécessaire pour les deux interventions de J0 et J14. De la faim peut donc être ressentie avant les interventions chirurgicales (J0 et J14) mais la boisson est autorisée ad libidum. La reprise de l’alimentation est autorisée le jour-même en l’absence d’élément évocateur de complication. Aucune mise à jeun n’est nécessaire pour les contrôles endoscopiques sous sédation simple.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure à des fins d'analyses des tissus traités pour rétablir la continuité digestive.
Remplacement
Il s’agit d’une nouvelle procédure au stade de recherche pré-clinique, n’ayant pas été réalisée chez l’Homme et ne pouvant être envisagée en l’absence d’étude de faisabilité sur modèle animal. Les simulateurs virtuels et mécaniques (Phantômes) ont démontré leur efficacité pour réduire l’utilisation du modèle animal dans l’apprentissage de l’écho-endoscopie diagnostique et de la ponction sous écho-endoscopie. Les modèles ex-vivo ont démontré leur utilité pour l’apprentissage du drainage des collections pancréatiques en suturant sur les faces postérieure et antérieure de l’estomac des morceaux d’intestin de porc remplies de gel d’échographie. Des modèles de simulation (virtuel, mécanique ou sur organe isolé) existent pour apprendre la technique de pose des prothèses utilisées dans ce projet. Néanmois, à l’heure actuelle, aucun modèle existant permet de remplacer le modèle animal vivant anesthésié. Effectivement, aucun modèle ex-vivo ne permet de reproduire le péristaltisme digestif, ni les conditions post opératoires après intervention de Hartmann. S’agissant d’une étude de faisabilité d’anastomoses, du tissu vivant est indispensable pour permettre une cicatrisation et évaluer la survenue de sténoses anastomotiques. L’objectif étant l’étude de la faisabilité de cette procédure, cela nécessite un suivi dans le temps, et ainsi l’utilisation d’un modèle animal est indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux maximum étudié a été fixé à 30 pour notre étude, s’agissant du nombre d’animaux nécessaire pour explorer les différents délais avant retrait des prothèses d’apposition luminale, tout en évitant les biais liés à la variabilité individuelle. Cet effectif est suffisant pour apporter des conclusions et permettre de détecter d’éventuelles complications associées à la réalisation des procédures et au suivi à long terme des effets de la procédure. Ces 30 animaux sont répartis en plusieurs lots de 4 à 5 animaux stables, permettant un étalement des procédures et une adaptation progressive en cas de difficultés techniques ou de complications. Il n’existe à ce jour pas d’étude dans la littérature s’intéressant à notre sujet de recherche, ce qui ne permet pas de réaliser un calcul d’effectif ou de nombre de sujets nécessaires. La participation d’internes de chirurgie en fin de cursus sous la surveillance d’un chirurgien sénior, pendant la première phase chirurgicale, permettra la formation chirurgicale aux techniques précédemment évoquées sur un modèle vivant utilisé en formation, et ce, sans utilisation d’animaux supplémentaires. Le projet d’étude présenté prévoit également l’utilisation de dispositifs innovants visant à améliorer l’efficacité de l’intervention par le rapprochement du colon et du rectum. Apporter la preuve de l’efficacité de ces dispositifs lors de cette étude dispenserait également de la réalisation d’une nouvelle étude animale.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront gardés pendant une période d’acclimatation de 5 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie et leur première entrée en procédure. Ils seront suivis quotidiennement et leur état de santé sera évalué tout au long du protocole expérimental. Leur environnement sera enrichi (ballon, jouets divers) pour leur permettre d’exprimer un spectre plus large de comportements normaux. Dans la mesure du possible, les animaux seront hébergés par groupes stables afin de favoriser les interactions. Les protocoles chirurgicaux se feront sous anesthésie générale et analgésie. L’analgésie pourra accompagner l’animal en post-opératoire pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
L’anatomie du tube digestif du porc est connue pour être particulièrement proche de celle de l’anatomie humaine et constitue le modèle de référence pour la formation et la recherche en endoscopie digestive depuis de nombreuses années. La taille de l’animal permet d’utiliser les mêmes dispositifs (endoscopes, prothèses) que ceux disponibles en pratique clinique humaine. Nous projetons d’utiliser des mini-pigs pour limiter l’impact de la croissance post-opératoire, et faciliter le suivi au long cours ainsi que les diverses manipulations (retrait de la prothèse, scanner, contrôle endoscopique) Les animaux doivent être sevrés et peser plus de 15 kg permettant l’utilisation du même matériel que chez l’humain adulte (qui est utilisé chez l’enfant de plus de 15 kg).