Recherche appliquée

Anesthésiés puis incisés trois fois dans le dos, 8 rats mâles reçoivent deux membranes de biomatériau de cinq millimètres de côté, la troisième incision étant refermée sans implant pour servir de témoin. Ils passent les vingt-quatre heures suivantes isolés, puis un mois sous observation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur juge le risque de réaction inflammatoire douloureuse "très limité" du fait des essais in vitro préalables, alors que l'étude a précisément pour objet de mesurer l'inflammation produite par ces implants. Il conclut que les étapes de validation chez l'animal ne peuvent pas être "totalement remplacées" avant le passage à l'humain, et tous les rats sont tués au bout du mois pour prélever les implants et les tissus alentour.

Objectifs

A la suite de traumatismes ou d’opérations au niveau du cerveau, la dure-mère (partie localisée entre le crâne et le cerveau) peut être endommagée. Lorsque cela arrive, des substituts artificiels de remplacement, créés en laboratoire, peuvent être implantés pour remplacer les zones où la dure-mère est lésée. Ces derniers sont cependant responsables de nombreux effets secondaires (infection, douleurs, fuite de liquide en provenance du cerveau …), qui affectent la récupération des patients. Notre équipe travaille donc au développement de nouveaux substituts, dont la composition est très proche de celle de la dure-mère naturelle, dans le but de limiter ces effets indésirables. Les études menées en laboratoire à partir de cultures cellulaires montrent que deux des substituts que nous avons créés pourraient être compatibles avec un usage chez le patient. Le travail que nous proposons aujourd’hui vise à faire une première évaluation de la compatibilité de ces matériaux dans un organisme entier. Pour cela, les deux substituts seront implantés sous la peau de 8 rats et nous analyserons l’inflammation et le devenir de ces substituts 1 mois après leur implantation. Si les résultats sont concluants, de nouvelles études plus sensibles seront envisagées, avec implantation des substituts au niveau crânien, après un retrait de la dure-mère.

Bénéfices attendus

Ces implantations permettront de confirmer une réponse biologique positive après implantations peu invasives (sous la peau) des substituts candidats et d’envisager ainsi la suite des étapes pré-cliniques avec un risque de complication réduit au minimum, ou bien de mettre à jour des effets indésirables non anticipés suite aux campagnes d’évaluation et de caractérisation in vitro, permettant alors une amélioration des substituts ou l’arrêt du projet sans recourir à plus d'animaux. A long terme, ce projet doit permettre d’améliorer le parcours de santé des patients ayant subi un intervention sur la dure-mère (baisse du risque de complication, donc baisse des coûts et hausse du bien-être des patients).

Procédures

Suite à une période d’acclimatation, chaque individu recevra sous analgésie et anesthésie générale les deux biomatériaux candidats en implantation sous-cutanée sur le dos. Les biomatériaux se présentent sous la forme de membranes carrés de 5 mm de côté et de moins d’1 mm d’épaisseur. Une troisième incision sera réalisée puis suturée sans insertion de biomatériau comme auto-contrôle. Les animaux seront maintenus en observation quotidienne pendant 1 mois puis euthanasiés après analgésie et anesthésie pour réaliser l’analyse des tissus et le devenir des biomatériaux.

Impact sur les animaux

La réalisation de l’incision suivie d’une suture entraine un faible risque d’infection indépendant du biomatériau implanté. L’anesthésie et la manipulation liées à la chirurgie peuvent entrainer du stress, tout comme l’isolement temporaire post-chirurgie (24 heures). La chirurgie elle-même entraine une douleur locale à chaque site d’implantation, qui sera prise en charge pendant et après la procédure par des analgésiques cutanés. La littérature indique pour les sutures cutanées une disparition de la douleur dans les 24h. L’implantation du biomatériau peut engendrer une réaction inflammatoire à l’origine de douleurs locales, mais ce risque est jugé très limité du fait de la caractérisation in vitro de la cytocompatibilité effectuée en amont et de la littérature sur les matériaux utilisés.

Devenir

Les animaux devront être mis à mort à la fin de la procédure pour prélever les implants et les tissus environnants, les analyser et pouvoir ainsi remplir les objectifs scientifiques de l'étude.

Remplacement

Nous cherchons à développer des biomatériaux pour soigner la dure-mère chez l'homme, des étapes de validation chez l’animal ne peuvent pas être totalement remplacées pour évaluer précisément leur comportement après implantation et leurs conséquences sur l'organisme entier, avant de passer aux études cliniques. Une importante phase d’évaluation in vitro a cependant précédé l’étude présentée ici afin de réduire à 2 les biomatériaux candidats à tester chez le rat et anticiper des résultats positifs avec confiance.

Réduction

Seuls deux substituts candidats seront évalués. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, les deux biomatériaux seront implantés sur le même animal, séparés de quelques centimètres. Une incision supplémentaire sans implantation de biomatériaux (incision contrôle) sera réalisée afin que chaque animal soit son propre contrôle. Cette approche permettra de limiter à 8 le nombre d’animaux nécessaires à cette étude. Seul des mâles seront utilisés, des différences selon le sexe n’étant pas attendues pour les phénomènes étudiés (évolution des biomatériaux et inflammation).

Raffinement

La composition et la compatibilité des substituts candidats ont été vérifiés in vitro avant implantation chez l’animal afin de limiter le risque d’effets indésirables. De plus, une amélioration des conditions d'hébergement sera mise en place par des jouets présents dans les cages et des interactions avec les soigneurs encouragées lors des inspections quotidiennes. Analgésie et anesthésie seront utilisées pendant et après la procédure, et des points limites adaptés ont été établis. Pour minimiser les biais liés au rythme jour/nuit et éviter les erreurs engendrées par de nombreuses répétitions du même geste à la chaine, les animaux seront implantés 2 par 2 chaque matin, le groupe total de 8 étant ainsi étalé sur 4 jours.

Choix des espèces

Le rat constitue une espèce peu sensible et bien référencée pour ce type d’étude, facile à manipuler (réduisant ainsi le stress) et d’une taille suffisante pour permettre l’implantation de deux matériaux ainsi qu’une incision contrôle sur chaque individu. Les animaux seront adultes (10 semaines) : les éléments évalués au cours de l’étude n’impliquent aucune notion de développement qui amènerait à utiliser des rats immatures ou âgés, le substitut développé est à visée d’utilisation chez l’humain adulte, et la taille des rats adultes permettra l’implantation de plusieurs substituts candidats sur le même individu.

Une tumeur devenue trop grosse ou une perte de poids déclenchent la mise à mort immédiate de la souris. 70 souris de huit à dix semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Des cellules de cancer du poumon leur sont injectées sous la peau, la tumeur est mesurée deux fois par semaine, et un mois plus tard commencent des séances d'imagerie magnétique sous anesthésie réparties sur trois semaines. Le porteur qualifie l'inoculation de la tumeur de "souffrance ou angoisse légère de longue durée", et annonce comme finalité d'augmenter la survie des patients traités par radiothérapie et de conduire à une "rémission totale", quand l'objet immédiat se limite à suivre où vont des nanoparticules d'oxyde de fer.

Objectifs

La radiothérapie (RT) fait aujourd’hui partie intégrante de la lutte contre le cancer. Toutefois, et en dépit des nombreux progrès récents, la principale limitation de la RT réside dans son manque de sélectivité spatiale lors de l’irradiation de la zone cancéreuse. De récentes études ont mis en évidence des propriétés radiosensibilisantes pour les nanoparticules d’oxyde de fer (IONPs). Dans ce projet nous testerons ce type d’IONPs dans un modèle de cancer du poumon. Plus précisément, nous étudierons les profils de biodistribution des IONPs après leur administration en utilisant un imageur (appelé imageur par particule magnétique ; MPI) qui permet de détecter le signal magnétique des IONPs. Nous comparerons des IONPs non fonctionnalisées et des IONPs fonctionnalisées avec un peptide spécifique des tumeurs pulmonaires. L’utilisation de ces modèles murins nous permettrait d’étudier le potentiel de nos IONPs de façon bien plus pertinente qu’un modèle in vitro eu égard des contraintes de biodistribution. Ce projet vise à améliorer l’efficacité de nanomatériaux à caractère théranostique, c’est à dire qui permette à a fois le diagnostic des tumeurs tout en améliorant l’effet thérapeutique de la radiothérapie ; théranostique = thérapeutique + diagnostique. Elles pourraient permettre le suivi de la progression du cancer en imagerie à particule magnétique tout en améliorant son traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre du test de l’efficacité de nouveaux nanomatériaux à caractère théranostique (= thérapeutique + diagnostique) dans le cadre de la lutte contre le cancer. Il est attendu que ceux-ci auront un effet thérapeutique en augmentant l’efficacité des traitements par radiothérapie, tout en permettant le suivi du développement ou de la régression des tumeurs. Cet aspect nous semble particulièrement important au vu de la haute prévalence des traitements par RT en cancérologie moderne et de ses principales limitations (dont le manque de sélectivité spatiale lors de l’irradiation de la zone tumorale). À long terme, nous pouvons donc dire que la finalité de cette étude est donc d’augmenter la survie des patients traités par radiothérapie et de conduire à une rémission totale.

Procédures

Une inoculation de cellules tumorales sera réalisée par injection sous cutanée. Cette injection se fait sous anesthésie n’excédant pas 30 minutes. Au cours des semaines suivant cette injection, un suivi de la taille de la masse tumorale est réalisé 2 fois par semaine. Cette mesure rapide ne nécessite ni mesures de contention ni anesthésie. Une fois la tumeur développée, un mois après l’inoculation, les souris seront étudiées en imagerie par particule magnétique MPI. Pour cela les souris seront anesthésiées, un agent de contraste sera administré et les souris seront placé dans l’imageur sous anesthésie, en suivant la profondeur de l’anesthésie via la vitesse de respiration et le scan d’imagerie sera effectué. Dans la mesure où cette procédure est suivie d’une imagerie, l’animal sera anesthésié pendant l’injection (cette anesthésie a une durée estimée de moins d’une heure). Des examens d'imagerie des particules magnétique auront lieu périodiquement pendant un maximum de 3 semaines.

Impact sur les animaux

L’inoculation en sous-cutané des cellules tumorales peut entrainer une souffrance ou une angoisse légère de longue durée et avoir une incidence légère sur le bien-être ou l'état général de l’animal, nous surveillons pour cela que la taille de la tumeur et la présence de signe de souffrance. L’administration des particules d’oxyde de fer (IONPs) n’est pas associée à d’effets secondaires susceptibles de porter atteinte au bien-être de l’animal. L’évolution de la masse tumorale et de la biodistribution des IONPs seront évalués par des techniques d’imagerie non ionisante et non invasive. Par conséquent, l’inconfort généré lors de cette manipulation sera limité à l’anesthésie de l’animal. Il en découle que les animaux sont susceptibles d’éprouver un inconfort et une angoisse transitoire et de faible intensité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier précisément ex vivo la localisation des particules d'oxyde de fer au sein de la tumeur.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisé sur les particules d’oxyde de fer afin de sélectionner en amont la meilleure synthèse de ces particules. A ce stade, nous devont étudier le dévenir des particules d’oxyde de fer après leur administration dans un organisme, leur intéraction avec un tissu tumoral et la capture par le système immunitaire qui impact la biodistribution. Il est impossible d’étudier ces aspects complexes d’interaction avec la biologie des particules d’oxyde de fer sans utiliser de modèle animal.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux utilisés passe par l’utilisation d’un protocole d’induction et de suivi de la masse tumorale déjà mis en place et optimisé par l’équipe des chercheurs travaillant sur ce projet. Le caractère non-invasif et non-ionisant des méthodes d’imagerie in vivo employées permet de suivre le même animal au cours du temps, plutôt que de mettre un animal à mort à différent temps pos-injection. Le nombre total de souris nécessaire pour le projet a été calculé avec un test de puissance statistiques et en estimant la perte de certains animaux. Nous avons donc réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir les informations nécessaires à l’étude de la biodistribution de nos particules d’oxyde de fer, et leur interaction avec un tissu tumoral.

Raffinement

Pendant les procédure d'inoculation des cellules tumorales en sous-cutanée, les souris seront maintenus sous anesthésie. Un analgésique est également administré 20 min avant le début de la procédure. La température de la souris est maintenue avec un tapis chauffant autorégulé à 37°C et un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux. L’application d’analgésique local est également utilisé. Après la procédure, les animaux sont suivis régulièrement et une attention particulière est porté sur la présence de signe de souffrance ou de mal être de l’animal. Si des signes clairs de souffrance sont observés en terme de perte de poids, apparence ou comportement révélateur de mal être et taille de la tumeur trop importante, l’animal est mis à mort immédiatement afin de limiter au maximum la souffrance.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée dans le cadre de ce projet est la souris âgée de 8 à 10 semaines, correspondant au stade de jeune adulte. Ce choix est justifié par des considérations scientifiques, physiologiques et éthiques. La souris possède un système immunitaire et vasculaire relativement proche de l’homme et nous savons que les phénomènes de biodistribution et d’intéraction avec le système immunitaire observés seront très similaires chez l’homme. Le stade de souris jeune adulte permet une meilleure standardisation du modèle tumoral, en assurant une réponse homogène à l'inoculation tumorale et en limitant la variabilité interindividuelle. De plus, cet âge est le plus approprié pour tolérer l'anesthésie, la croissance tumorale contrôlée et les procédures répétées (manipulations, imagerie, etc.), sans entraîner de détérioration prématurée de l’état général.

Tous tués à l'issue pour vérifier l'exposition aux molécules testées, 2 100 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une neurochirurgie de deux heures pour recevoir dans le cerveau une toxine qui détruit les neurones et reproduit la maladie de Parkinson, suivie de rétention urinaire, de perte d'appétit et de perte de poids. 900 d'entre eux vivent avec une ration limitée à 20 ou 25 grammes par jour pendant deux à six mois, en cage individuelle sur toute la durée du projet, avec trente minutes de contact avec leurs congénères par semaine dans ce que le porteur appelle une "cours de récréation". Le rat est décrit comme l'espèce "idéale" pour ce travail, en raison des similitudes entre son cerveau et celui de l'être humain, et parce que les rats adultes récupèrent plus facilement après la chirurgie.

Objectifs

La maladie de Parkinson résulte de la destruction progressive d'un réseau spécifique de neurones dans le cerveau, perturbant le fonctionnement de certains circuits neuronaux, ce qui cause les principaux symptômes moteurs de la maladie : la rigidité, la difficulté à initier les mouvements (akinésie) et les tremblements de repos. Le principal problème de cette maladie est que les symptômes moteurs apparaissent quand environ 60 à 80 % des neurones sont détruits. La maladie se détecte donc très tard, quand la plupart de ces neurones ont disparu. Les traitements actuels soulagent seulement les symptômes moteurs de la maladie sans la guérir. Bien que ces traitements soient efficaces plusieurs années, ils provoquent à long terme des effets secondaires importants (mouvements involontaires), parfois plus graves que les symptômes de la maladie elle-même. Il est donc crucial de trouver des moyens de détecter la maladie plus tôt, avant l'apparition des symptômes moteurs, pour intervenir rapidement, ralentir son évolution et améliorer la qualité de vie des patients sur une plus longue période. Pour développer de nouvelles thérapies contre la maladie, on utilise souvent des tests comportementaux. Bien qu'ils soient utiles, ils manquent parfois de sensibilité pour détecter l'efficacité de nouveaux traitements. Dans ce projet, nous proposons d'utiliser des tests fonctionnels en enregistrant directement les perturbations causées dans le cerveau. Pour cela nous allons enregistrer l'activité électrique du cerveau. Cette technique est utilisée en clinique et en recherche préclinique, ce qui permet de passer facilement de l’un à l’autre. Nous nous basons sur des études cliniques qui ont montré des changements dans l’activité électrique de certaines parties du cerveau chez les patients parkinsoniens. Nous étudions ces activités cérébrales dans un modèle animal de la maladie, le rat parkinsonien. Des études préliminaires ont montré des activités cérébrales anormales chez ces animaux, similaires à celles observées chez les patients parkinsoniens. Ces signatures électriques nous aideront à évaluer plus efficacement les nouvelles thérapies dans des tests à court et long terme.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier, sélectionner et valider de nouveaux candidats médicaments pouvant traiter la maladie de Parkinson

Procédures

Génération des rats parkinsoniens : une neurochirurgie d’environ 2 heures sera réalisée sous anesthésie générale sur un sous-groupe d’animaux de ce projet. Certains animaux vont recevoir pendant 15 jours une injection quotidienne d'un traitement anti-parkinsonien qui induira des rotations et des mouvements involontaires pendant quelques heures. Contrôle alimentaire : en dehors des phases critiques - à savoir l’établissement du modèle et la période de récupération post-chirurgicale (7 jours) - tous les animaux (900) recevront une ration quotidienne limitée de 20 à 25 g de nourriture, et ce, pendant toute la durée de l’étude à laquelle ils participent (2 à 6 mois). Tests pharmacologiques en administration de courte durée : • Des administration orales (durée : moins d’une minute par administration par animal) et des injections (durée : 30 secondes par animal) pourront être utilisées. Tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique) : les administrations pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. Différents prélèvements sanguins pourront être faits au cours des procédures expérimentales. Ils seront conduits sous anesthésie générale si nécessaire, en fonction du protocole établi dans chaque étude (durée : moins de 20 min par prélèvement, fréquence : une à deux fois par semaine maximum). Les animaux seront hébergés en cage individuelle tout le long du projet (entre 2 à 6 mois).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une neurochirurgie d’environ 2 heures durant laquelle ils recevront une injection intracérébrale unilatérale de toxine,qui induit la maladie, afin de reproduire la pathologie de Parkinson. La lésion des neurones peut engendrer une rétention urinaire, une perte temporaire de la motivation pour boire et manger causant une perte de poids (3 à 5 jours post chirurgie), une diminution transitoire du transite digestif. Les administrations de composés pharmacologiques peuvent causer un stress aigu et une douleur brève lors de leur injection. Lors d’injections répétées, un hématome ou des dommages tissulaires superficiels peuvent apparaitre aux sites d’injections (récupération en deux semaines). Les injections chroniques de molécule pour l’induction des mouvements involontaires (15 jours) engendrent des mouvements et rotations involontaires non-interruptibles, pouvant causer un stress aigu et une fatigue de l’animal (90 minutes post-injection). Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de candidats médicaments sur nos animaux, certains effets indésirables non anticipés peuvent survenir : relachement musculaire, somnolence ou excitation (quelques heures post-administration). Après implantation des électrodes, les animaux seront hébergés en cages individuelles, avec un contact social réduit (plusieurs semaines) ce qui peut engendré du stress. Des prélèvements sanguins peuvent être faits pouvant causer stress et douleur brève au point de piqure.

Devenir

Tous nos animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en effet : à l’issue de chaque procédure, il sera nécessaire de vérifier l’exposition aux nouvelles thérapies testées, à la fois chez les animaux rendus parkinsoniens et chez les animaux sains. Ceci se fera par la réalisation de prélèvements sanguins et de différents tissus.

Remplacement

Ce projet a pour but de démontrer l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques sur un modèle animal de la maladie de Parkinson. Actuellement, il n’existe aucune alternative in vitro, ni de modèle computationnel reproduisant dans leur intégralité les circuits neuronaux impliqués dans cet pathologie qui puisse se substituer à ce modèle. De plus, toute demande de mise sur le marché nécessite de prouver l’innocuité et l’efficacité du candidat médicament ou de la nouvelle thérapies testé, les tests précliniques in vivo préalables aux essais cliniques sont dans ce contexte indispensables. L’utilisation d’un organisme vivant est donc nécessaire.

Réduction

Dans le cas de nos études, chaque animal est son propre contrôle, permettant de limiter le nombre d’animaux nécessaire par groupe. Le nombre d’animaux a ainsi été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité scientifique des expériences menées.

Raffinement

Les animaux qui entrent dans ce projet ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Une injection d’analgésique sera faite avant la neurochirurgie et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Après la neurochirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages d’hébergement avec enrichissement, pour limiter tout stress dû à l’environnement quotidien. Les animaux sont rassemblés 1 fois par semaine dans une « cours de récréation » pour assurer le maintien du contact social. Les animaux d’une même étude (maximum 12 animaux par session) sont rassemblés dans une enceinte fermée sur les cotés avec litière et divers enrichissements, leur permettant une liberté de mouvement plus grande et une interaction entre congénères. Cette session dure 30 minutes. Des échelles de cotation de comportement seront utilisées afin de prendre les mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. Enfin, afin d’éviter un stress aigu de nos animaux lors des injections, les rats sont habitués à la contention par les techniciens en charge des injections les jours précédents les traitements. Afin de réduire la douleur associée à ces injections, les aiguilles sont à usage unique et les sites d’injections alternés pour éviter d’injecter au même endroit consécutivement.

Choix des espèces

Le rat est considéré comme l'espèce idéale pour ce projet en raison des nombreuses similitudes entre le cerveau du rat et celui de l'humain, notamment en ce qui concerne le circuit neuronal impliqué dans la maladie de Parkinson et ses connexions avec le reste du cerveau. Pour ce projet, nous utiliserons des rats adultes. La maladie de Parkinson étant liée à l'âge, il est essentiel de travailler sur un cerveau adulte et pleinement développé. Un cerveau mature nous permettra également un meilleur positionnement des injections intracérébrales et des électrodes. De plus, les rats adultes récupèrent plus facilement après la chirurgie.

Opérées de l'oreille interne à l'âge de deux semaines, 70 souris reçoivent une thérapie génique déposée au laser sur la fenêtre ronde, puis passent quatre mesures d'audition sous anesthésie étalées sur huit semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées après la dernière mesure, pour prélèvement des tissus de l'oreille interne. Une partie des animaux appartient à une lignée sourde par mutation, ce qui doit permettre de vérifier que la thérapie restaure l'audition avant un passage chez l'être humain. Le porteur affirme que le dépôt au laser et les mesures d'audition n'engendrent aucune douleur, et annonce des points limites définis sans dire lesquels.

Objectifs

L’oreille interne, où se situe la cochlée, l’organe permettant d’entendre, est difficile d’accès pour l'administration de médicaments. En effet, la cochlée est un organe de quelques millimètres situé derrière le tympan. La présence d’une barrière physiologique entre la circulation sanguine et les liquides de l’oreille interne limite l’accès par les voies conventionnelles telles que la voie orale ou intraveineuse. Une des extrémités de la cochlée, la membrane de la fenêtre ronde, fine et perméable, est une voie d’accès à la cochlée. En effet, il est possible de venir déposer le médicament sur la membrane de la fenêtre ronde, cette approche étant considérée conservative et peu invasive. La bioimpression assistée par laser permet le dépôt contrôlé et très précis de bioencre contenant des cellules. En adaptant la technique de bioimpression assistée par laser, il est possible de faire de l’administration de médicaments assistée par laser. Cette méthode a déjà été utilisée pour l’administration d’anti-inflammatoires sur la membrane de la fenêtre ronde chez la souris. Les résultats montrent que le médicament diffuse jusqu’aux cellules au sein de la cochlée sans effet délétère. Dans la continuité de ce projet, l’objectif est d’améliorer le procédé de dépôt ciblé pour l’administration de thérapie génique permettant la correction de surdité d’origine génétique. Nous souhaitons valider un nouveau dispositif laser conduit à l’aide d’une fibre optique et permettant le dépôt ciblé de thérapie génique sur la fenêtre ronde humaine. Des méthodes pour augmenter la diffusion à travers la membrane doivent également être validées pour améliorer le transfert de la thérapie génique. Finalement, la correction du défaut génétique et la récupération de l'audition seront validées chez un modèle animal présentant une modification génétique similaire à l'homme, touchant la production d'une protéine indispensable pour entendre.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer le dispositif d’injection et de diffusion de médicaments, et plus particulièrement de thérapie génique, dans la cochlée, avec une grande précision et sans risque de lésions, contrairement aux injections invasives développées à ce jour. L’utilisation d’une fibre et de médicaments plus volumineux nécessite une nouvelle validation du procédé de dépôt ciblé assisté par laser sur la fenêtre ronde et une diffusion dans l’oreille interne. De plus, cette étude pré-clinique est nécessaire pour ensuite passer aux essais cliniques chez l’homme. D’un point de vue technique, ce projet est une étape-clé pour optimiser la technologie de dépôt ciblé de médicaments assisté par laser conduit par fibre. Plus largement, ce projet permettra de valider l’utilisation du laser pour l'administration de médicaments.

Procédures

Les animaux seront soumis à des mesures pré-opératoires et post-opératoires de l’audition, n’excèdant pas 10 minutes. Les mesures post-opératoires seront effectuées 48h, une semaine, deux semaines et huit semaines après l’opération. Cette mesure est similaire aux mesures réalisées sur l’homme éveillé. Les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 15 minutes) et à une administration de médicaments dans l’oreille (durée de 10 à 12 minutes au total pour installer la souris, paramétrer le laser puis administrer le médicament). Un anti-douleur est également administré en pré-opératoire, et 24h après la chirurgie, pour limiter la douleur occasionnée par la chirurgie. L’administration de médicaments assistée par laser ne génèrent aucune douleur ou traumatisme chez l’animal, et sont réalisés sous anesthésie générale car cela nécessite une immobilisation complète de l’animal. Dans leur globalité, les procédure pré-opératoire et opératoire n’excèdent pas 40 minutes maximum afin de limiter la durée de l’anesthésie. Toutes ces interventions seront faites sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir du stress avant et lors des anesthésie (entre 2 et 5 minutes). Un délai de 48h minimum sera respecté entre les anesthésies pour le limiter. Des douleurs pourront être ressenties après la chirurgie durant les 2 jours post-opératoires. Les protocoles de dépôt ciblé et de mesure de l’audition n'engendreront aucune douleur. Chez les souris avec surdité d'origine génétique, la thérapie génique doit entraîner la récupération de l'audition dans les semaines suivant le traitement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort selon la procédure prévue à la fin de la dernière mesure de l'audition (huit semaines post-opératoire). Les tissus de l’oreille interne seront prélevés pour analyse quantitative et qualitative (histologie, fluorescence).

Remplacement

L’application de thérapie génique sur la membrane de la fenêtre ronde assistée par laser s’insérant dans un projet d’application clinique future, il est nécessaire de valider son efficacité (diffusion et transfert) et son innocuité (sans impact auditif) sur un modèle animal. Seules les conditions in vivo chez l’animal permettent d’évaluer l’effet de la procédure sur l’audition. Ces mesures doivent être effectuées sur des animaux mammifères qui possèdent un système auditif suffisamment proche de l’homme, et un défaut auditif génétique similaire. Aucun environnement multifactoriel ne permet de reproduire ce modèle in vitro. Néanmoins, des études in vitro et ex vivo seront réalisées pour sélectionner les paramètres laser du dépôt ciblé, de la perméabilisation, et du gel contenant la thérapie génique.

Réduction

Des tests préliminaires seront effectués sur des lames receveuses et du matériel inerte afin de fixer l’entièreté des paramètres de bioimpression (paramètres laser et composition de l’hydrogel) avant de procéder aux expérimentations animales. La méthode de perméabilisation sera décrite précisément et validée in vitro et ex vivo, avant de procéder aux études in vivo. Chaque souris sera utilisée pour l’entièreté de la procédure : mesure pré-opératoire de l’audition, chirurgie, perméabilisation et dépôt ciblé assistés par laser, et les quatre mesures post-opératoires de l’audition, afin d’en limiter le nombre. Nous utiliserons le plus petit nombre possible de souris par conditions (contrôles, validation du dépôt ciblé, délivrance de médicaments actifs). Le nombre total de 70 souris utilisées sur l’ensemble du projet permet un traitement statistique significatif des données obtenues compte tenu du degré de variabilité inter-individuelle.

Raffinement

Une analgésie adaptée sera appliquée en pré- et post-opératoire ainsi que des conditions de stabulation appropriées. Pour soulager l’inconfort et le stress des souris, nous hébergerons les souris dans une cage en groupe (5 par cage) à milieu enrichi (tunnel carton, aspen bois, fibres de papier et abri) dans un local à ventilation, température et éclairage contrôlés. Pendant les différentes procédures, l’animal sera profondément anesthésié avec une surveillance des points vitaux (fréquence cardiaque et respiration, couleur des muqueuses, température corporelle). Le stress sera réduit en manipulant régulièrement les animaux dans la semaine précédant l'anesthésie pour qu'ils s'habituent aux expérimentateurs. Le réveil s’effectuera sur couverture chauffante, uniquement avec la mère puis regroupées par 5 en respectant la composition du groupe per-opératoire. La douleur engendrée par la chirurgie sera réduite au maximum par utilisation d’analgésique et anesthésique local. L’estimation de la souffrance sera réalisée dans les 5 premiers jours par l’expérimentateur, en même temps que par le personnel de l’animalerie. Cette estimation est ensuite réalisée quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Les animaux seront surveillés concernant leurs activités et leurs comportements. Des points limites sont définis afin de respecter le bien-être animal et pourront entraîner l’arrêt immédiat des manipulations. Tous les expérimentateurs satisferont les obligations de formation en chirurgie sur rongeurs et en expérimentation animale.

Choix des espèces

L’évaluation de l’impact de la procédure sur la fonction auditive et de la diffusion et du transfert de thérapie génique dans l’oreille interne nécessite de réaliser des expérimentations sur l’animal. Les mesures de l'audition ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères car leur système auditif est trop éloigné de celui de l'homme. Chez la souris, l’anatomie cochléaire est également similaire, et la fenêtre ronde est bien accessible par voie chirurgicale. Des études présentent les voies d’accès à la membrane de la fenêtre ronde chez la souris, afin d’avoir une chirurgie reproductible et le moins traumatique possible. Par ailleurs, une lignée de souris présentant un défaut auditif génétique similaire à l’homme existe au sein de l’animalerie et nous permettrait de valider la diffusion, le transfert génique et la récupération de l’audition. Les souris utilisées auront deux semaines lors de la procédure opératoire, car les souris plus âgées présentent une structure anatomique limitant l’accès à la fenêtre ronde.

Rendre des rongeurs dépressifs pour y faire passer une quinzaine de molécules : 2 000 souris et 1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des situations stressantes de quinze minutes à quatre heures par jour pendant une à huit semaines, sont privés de nourriture ou d'eau jusqu'à vingt-quatre heures d'affilée une fois par semaine, et reçoivent des substances jusqu'à deux fois par jour. L'état obtenu est mesuré par des tests comportementaux que le porteur ne nomme pas, et la mise à mort de tous les animaux est justifiée par les effets méconnus des substances testées. Quinze molécules par modèle et par espèce doivent passer par ce criblage sur la durée du projet.

Objectifs

La dépression est une maladie psychiatrique complexe qui est actuellement reconnue comme l’une des principales causes d’invalidité et de souffrance dans le monde. Le National Institute of Mental Health (NIMH) rapporte qu’environ 12 % des Américains souffrent de dépression clinique, avec deux fois plus de femmes touchées que d’hommes. La dépression représente des milliards de dollars de coûts directs de santé et aussi indirects (baisse des revenus et perte de productivité). Les symptômes de la dépression comprennent l’anhédonie (absence de prise de plaisir), les changements de poids et des cycles de sommeil, la diminution de l’activité physique et de l’hygiène personnelle, des sentiments de désespoir ou de culpabilité et/ou des pensées récurrentes de mort ou de suicide. Des études épidémiologiques et cliniques ont indiqué que la dépression est prédictive d’un pronostic plus sévère de pathologies cardiovasculaires. L’étiologie et la physiopathologie associée de cette maladie sont mal comprises et l’hétérogénéité de la maladie due à divers facteurs (par exemple, des composants génétiques, biologiques et environnementaux, particulièrement l’exposition chronique au stress est un facteur de risque majeur) rend le diagnostic clinique difficile à définir. La dépression est principalement traitée avec des inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine. Cependant, après une période de 2 à 3 mois de traitement, les taux de rémission sont faibles et certains patients ne présentent pas de rémission après des traitements avec plusieurs antidépresseurs : la résistance à la pharmacothérapie est conventionnellement appelée dépression résistante au traitement. Les modèles animaux des troubles psychiatriques demeurent des éléments critiques dans la compréhension de la physiopathologie de ces maladies, l’identification des nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicamenteux ainsi que la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. Ce projet vise à mettre en place des modèles de stress chronique induisant des comportements anxio-dépressifs chez le rongeur et permettant d’évaluer de nouveaux traitements. Nous prévoyons évaluer environ 15 molécules différentes de chacun des modèles chez le rat et la souris au cours de la durée du projet

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'améliorer la qualité de vie des patients et de leur entourage. Un traitement plus efficace pourrait réduire plus rapidement et plus durablement les symptômes de la dépression, sa sévérité et le taux de rechute permettant ainsi une meilleure qualité de vie des patients, de maintenir un état de santé stable plus longtemps, de diminuer les taux d'invalidité . Ce projet permettra également d'avoir un impact socio-économique positif en réduisant les coûts de santé (nombre de consultations médicales, d'hospitalisations et de traitements complémentaires nécessaires).

Procédures

Les animaux sont exposés à des situations inconfortables et stressantes de 15 min à 4 heures par jour pendant 1 à 8 semaines selon les procédures de façon à induire un état depressif. Cet état est évaluer en 2 ou 3 occasions à partir de tests comportementaux dont la durée varie de 5 à 40 minutes environ. Pour certaines procédures les animaux sont privés de nourriture ou d'eau pour une période maximale de 24 heures pouvant être répétés (1 fois par semaine, maximum 8 semaines). Les administrations de substances pourront être réalisées jusqu’à 2 fois par jour (en général 1 minute par administration). La durée du traitement peut aller jusqu’à 8 semaines. Les autres interventions subies par les animaux sont la préhension (maximum 1 minute) pour le placement et le retrait dans les différents dispositifs de mesures comportementales et l’administration du traitement.

Impact sur les animaux

La répétition des situations inconfortables et stressantes vont engendrer un état de stress chronique et une modification de comportement pendant plusieurs semaines (maximum 8 semaines). Les manipulations/contentions des animaux réalisées au cours des procédures d’administrations peuvent également engendrer un stress de courte durée. L'injection des différents traitements pourra entraîner une douleur légère de courte durée.

Devenir

Compte tenu de l'induction de stress chronique, tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure. De plus, les substances d’essai dont les effets à moyen et long terme sont méconnus pourrait induire un effet délétère sur l’animal, ce qui ne serait pas compatible avec un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.

Remplacement

Dans le cadre du développement des médicaments, des tests in vitro ont déjà eu lieu avant l'utilisation chez l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité, réduisant de façon significative le nombre de substances à tester et donc le nombre d’animaux. L'impact des traitements pré-sélectionnés sur le comportement des animaux, et l'amélioration de symptômes liés aux états d'anxiété/dépression ne peut se faire que sur des animaux vigiles. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Selon les données de la littérature, il est estimé qu’un effectif de 12 - 18 animaux en standard par groupe (nombre d'animaux et groupes variables, selon l’objectif de l’étude) sera nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte des tests statistiques. Par ailleurs, des prélèvements terminaux (tissus, organes, sang) peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur et de souffrance (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, tunnels, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux ou attendus ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation faite par du personnel formé inclut une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration, l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions. Une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à postériori la catégorie éthique si nécessaire. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données.

Choix des espèces

Un certain nombre de symptômes des troubles anxieux et dépressifs comprenant l’anhédonie, apathie, troubles du sommeil, changements de poids/d'appétit, alltération psychomotrice, retrait social peuvent être facilement évaluées chez les animaux, en particulier chez le rongeur. Ainsi, divers tests ont été conçus pour mesurer ces différents aspects. L’impact de substances pharmacologiques sur le comportement de rongeurs est prédictif de leur efficacité en clinique. Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage) que ce soient des rats ou des souris, conformément à la littérature. Les symptômes d'anxiété et dépression se retrouvent plutôt chez des sujets adolescents ou adultes, aussi les traitements qui seront appliqués dans ce projet seront appliqués sur des rongeurs dont le SNC a atteint ce niveau de maturité.